Enfermedades metabólicas

“Las Enfermedades Metabólicas Hereditarias
constituyen un grupo de enfermedades genéticas
con
mas
de
500
patologías
diferentes,
caracterizadas por la disfunción de una enzima u
otra proteína implicada en el metabolismo
celular”
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM):
http://www3.ncbi.nlm.nih.gov:80/omim
Cromosoma
gen
mRNA
Proteína
Cofactor
(vitamina)
SUSTRATO
PRODUCTO
CONCEPTO DE EIM (1908)
OH
CH2- COOH
Ácido homogentísico
Alcaptonuria
1941
Beadle
UN GEN
Tatum
UN ENZIMA
DNA
Proteína
Nature Reviews Genetics 7 (2006)
Metaboloma
T1
T2
Diagnóstico
S1
S2
S3
metabólico y enzimático
Sustrato
1
E2/E3
E1
Enzima
S3
P
E4
Interactoma
Proteoma
Modificadores
genéticos
Factores splicing
NMD
Chaperonas moleculares
Proteosoma funcional
Gen
FENOTIPO-GENOTIPO
Diagnóstico
Genético
RNA
DNA
Nucleo
Transcriptoma
Genoma
FRECUENCIA DE ALGUNAS EMH Y TIPO DE HERENCIA
Autosómica
dominante
Autosómica
recesiva
Ligados al X
Hipercolesterolemia familiar
Huntington
Síndrome de Marfan
1:500
1:5.000
1:20.000
Fibrosis quística
Enfermedad de Tay-Sachs
Deficiencia de acil-CoA
Deshidrogenasa de cadena media
Fenilcetonuria
Enfermedad de Canavan
Mucopolisacaridosis
Jarabe de Arce
Acidemia Metilmalónica
Glucogenosis (todos los tipos)
Galactosemia
Deficiencia en Biotinidasa
1:2.500 (p. caucasiana)
1:3.000 (Judíos Ashkenazi)
1:10.000 (p. caucasiana)
1:50.000 (p. española)
1:10.000
1:14.000 (J. Ashkenazi)
1:25.000
1:40.000 (p. española)
1:226.000 (p. general)
1:48.000
1:50.000
1:62.000
1:110.000
Distrofia muscular de Duchenne
Adrenoleucodistrofia
Síndrome de Lesch-Nyhan
Enfermedad de Hunter
1:3.000
1:20.000
1:380.000 (p. canadiense)
1:111.000
PRUEBA DEL TALÓN
Oviedo
Santander Bilbao
Santiago
Pamplona
Valladolid
Barcelona
Zaragoza
Madrid
Talavera
Valencia
Alicante
Badajoz
Murcia
Granada
Sevilla Málaga
La Laguna
Palma de Mallorca
DETECCIÓN PRECOZ DE
ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS
Plan de
Centro de
Prevención de
Diagnóstico de
Minusvalías.
Enfermedades
Comunidad de
Moleculares
Madrid
(UAM)
Centro
Centro de
de
Diagnóstico
Diagnóstico de
de
Enfermedades
Enfermedades
Moleculares
Moleculares
(UAM)
1973-1985
DETECCIÓN NEONATAL
NEONATAL MASIVA
MASIVA
DETECCIÓN
( Prueba del talón)
AMINOACIDOPATÍAS
Hiperfenilalaninemias
Jarabe de Arce
Tirosinemia…
HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO
DIAGNÓSTICO SELECTIVO
DIAGNÓSTICO
SELECTIVO
( A la aparición de los síntomas)
AMINOACIDOPATÍAS
ACIDEMIAS ORGÁNICAS
DEFECTOS b-OXIDACIÓN
ENFERMEDADES PEROXISOMALES
DEFECTOS DE GLICOSILACIÓN
E. METABOLISMO PURINAS/PIRIMIDINAS
DEFECTOS EN BIOSÍNTESIS DE CREATINA
DETECCIÓN PRECOZ DE
ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS
Plan de
Prevención de
Minusvalías.
Comunidad de
Madrid
Centro de
Diagnóstico de
Enfermedades
Moleculares
(UAM)
1985
-
DETECCIÓN NEONATAL MASIVA
( Prueba del talón)
HIPERFENILALANINEMIAS
HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO
HIPERPLASIA ADRENAL CONGÉNITA
HEMOGLOBINOPATÍAS
DIAGNÓSTICO SELECTIVO
( A la aparición de los síntomas)
AMINOACIDOPATÍAS
ACIDEMIAS ORGÁNICAS
DEFECTOS b-OXIDACIÓN
ENFERMEDADES PEROXISOMALES
DEFECTOS DE GLICOSILACIÓN
E. METABOLISMO PURINAS/PIRIMIDINAS
DEFECTOS EN BIOSÍNTESIS DE CREATINA
SÍNTOMAS CLÍNICOS
HOSPITAL
Rechazo de la alimentación
Hipotonía, hipertonía
Acidosis metabólica
Olor especial
Hipoglucemia
Ataques de cetoacidosis
Letargia, coma
Vómitos con cetonuria
Anión GAP elevado
Hiperamonemia
Leuco, trombo o pancitopenia
Antecedentes de muertes neonatales
PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS
RADIOLOGÍA
HEMATOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA
PRUEBAS DE FUNCIÓN HEPÁTICA Y RENAL
DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS EN SANGRE Y ORINA
Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM)
I. ESTUDIO de METABOLITOS
§
§
§
§
§
§
Aminoácidos
Ácidos orgánicos
Lactato, piruvato, cuerpos
cetónicos
Purinas y pirimidinas
Carnitina, pterinas
Ácidos grasos de cadena muy
larga, etc...
II. ESTUDIO ENZIMÁTICO
§ Actividades enzimáticas
§ Vía metabólica de leucina, propionato,
etc...
III. ESTUDIO GENÉTICO
§ Mutaciones
§ Polimorfismos
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS
Seguimiento clínico
Tratamiento dietético
Seguimiento bioquímico
Servicios de Pediatría y Genética
Consejo genético
Sospecha de EMH basados en los síntomas clínicos
SÍNTOMAS
ALTERACIÓN
METABÓLICA
POSIBLE DEFECTO
Intoxicación aguda
Intervalos libres
de síntomas
Relación con ingesta
e intercurrencias
Acumulación de
metabolitos tóxicos
Hipotonía generalizada;
Miopatía; Cardiomiopatía
Miopatía; Cardiomiopatía
Hipoglucemia;
PDH)
Defecto en la
producción o
utilización de
energía
Def. b-oxidación de
ácidos grasos
Glucogenosis
Acidosis Láctica ALC (PC,
Def. Cadena respiratoria
Progresivos
Independientes de
ingesta e intercurrencias
Síntesis y/o
degradación
moléculas complejas
Enf. Lisosomales
Enf. Peroxisomales
Síndrome CDG
DISMORFIAS
Aminoacidopatías
Enf. ciclo de la urea
Acidemias orgánicas
Galactosemia
PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS
SÍNTOMAS CLÍNICOS
Rechazo de la alimentación, Hipotonía, Hipertonía,
Acidosis metabólica, Olor especial, Hipoglucemia
Ataques de cetoacidosis, Letargia,Coma, Vómitos con
cetonuria, Anión GAP elevado, Hiperamonemia,
Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de
muertes
neonatales,
Anión
GAP
elevado,
Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia,
Antecedentes de muertes neonatales
RADIOLOGIA
HEMATOLOGIA
MICROBIOLOGIA
PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA Y RENAL
DETERMINACIONES BIOQUIMICAS EN
SANGRE Y ORINA
Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM)
PERFIL METABÓLICO
PERFIL
METABÓLICO
ESTUDIO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO
• Aminoácidos
• Ácidos orgánicos
• Lactato, piruvato, cuerpos
cetónicos
• Purinas y pirimidinas
• Carnitina, pterinas
• Acidos grasos de cadena larga,
etc..
• Localización del defecto enzimático
§ Identificación de mutaciones
y SNPs
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES METABÓLICAS
HEREDITARIAS
MEDICINA PREVENTIVA: Screening neonatal (NBS)
Espectrometría de Masas en Tándem (ESI-MS/MS)
Un análisis-varios metabolitos-varias enfermedades
• Aprox. 30 enfermedades simultáneamente partiendo de la
misma muestra
• rapidez y automatización: 500 muestras/ día, 2 min/ análisis
• seguridad: alta sensibilidad, especificidad y precisión
Técnicas tradicionales
Un análisis- un metabolito- una enfermedad
•
•
•
•
Fenilcetonuria
Hipotiroidismo congénito
Hiperplasia adrenal
Galactosemia
Acilcarnitinas
(LC/MS/MS)
• Enfermedades de localización mitocondrial
• degradación de aminoácidos ramificados
• b-oxidación mitocondrial de los ác. grasos
• algunas enfermedades con AO normales
> 30 acilcarnitinas
> 30 enfermedades
ENFERMEDADES DETECTABLES POR MS/MS
AA: Aminoacidopatías
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Def. CPS
Def. OTC
Citrulinemia
Argininsuccínico aciduria
Argininemia
PKU/HFA
Tirosinemia tipo I-tipo II
MSUD
Hiperglicinemia no cetósica
Homocistinuria
AO: Acidemias orgánicas
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ac. propiónica
Ac. metilmalónica
Defectos de cobalaminas
Ac. glutárica tipo I
Ac. isovalérica
Def. HMGCoA liasa
Def. Holocarboxilasa sintetasa
Metilcrotonilglicinuria
Ac. Metilglutacónica
Def. Cetotiolasa
FAO: Defectos en la b-oxidación de ácidos grasos
y ciclo de la carnitina.
•
•
•
•
•
•
•
•
LCHAD/Proteína Trifuncional
VLCAD
MCAD
SCAD
MADD
Def. transportador de carnitina
CPT I
CPT II/ carnitina-acilcarnitina traslocasa
NUEVO METODO DE CRIBADO NEONATAL EN ESPAÑA
MCAD desde el año 2007
desde el Galicia
año 2000
Pais
Vasco
Murcia desde
Andalucia
desde el
año 2008
el
año 2007
PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS
SÍNTOMAS CLÍNICOS
Rechazo de la alimentación, Hipotonía, Hipertonía,
Acidosis metabólica, Olor especial, Hipoglucemia
Ataques de cetoacidosis, Letargia,Coma, Vómitos con
cetonuria, Anión GAP elevado, Hiperamonemia,
Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de
muertes
neonatales,
Anión
GAP
elevado,
Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia,
Antecedentes de muertes neonatales
RADIOLOGIA
HEMATOLOGIA
MICROBIOLOGIA
PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA Y RENAL
DETERMINACIONES BIOQUIMICAS EN
SANGRE Y ORINA
Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares
(CEDEM)
PERFIL METABÓLICO
PERFIL
METABÓLICO
ESTUDIO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO
• Aminoácidos
• Ácidos orgánicos
• Lactato, piruvato, cuerpos
cetónicos
• Purinas y pirimidinas
• Carnitina, pterinas
• Acidos grasos de cadena larga,
etc..
• Localización del defecto enzimático
§ Identificación de mutaciones
y SNPs
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES METABÓLICAS
HEREDITARIAS
Canada
Estados Unidos
3
Alemania
11
Eslovaquia
1
Portugal
2
Arabia Saudi
1
Kingdon of Bahrain
1
Israel
1
La India
1
Qatar
1
20
Austria
2
Grecia
4
Reino Unido
4
México
2
Bélgica
3
Holanda
2
Suecia
2
Argentina
2
Bulgaria
1
Hungria
3
Suiza
2
Brasil
4
Croacia
1
Italia
11
Turquia
3
Chile
2
Francia
4
Malta
1
Colombia
2
España
229
Macedonia
1
Ecuador
1
Venezuela
2
Australia
3
Cuba
1
Nueva Zelanda
1
Marruecos
1
Tunez
2
PERFIL METABÓLICO
• AUTOANALIZADOR DE AMINOÁCIDOS
• CROMATÓGRAFO DE GASES-ESPECTRÓMETRO DE MASAS
• ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM
• CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA RESOLUCIÓN
• ESPECTROFOTOMETRÍA
PERFIL METABÓLICO DE FENILCETONURIA
Fenilalanina
Ác. Fenilpirúvico
Ác.2-OH-Fenilacético
Ác. Fenilláctico
Ác. Fenilpirúvico
Ác. 2-OHFenilacético
Ác. Mandélico
Tirosina
Patrón Interno
Ác. Fenilláctico
Ác. Fenilacético
Ác. Fenilacético
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO Y DIFERENCIAL HPLC
Guanosina trifosfato (GTP)
PI
GTP-CH
Neopterina
Dihidroneopterina trifosfato
PTPS
NEOPTERINA
BIOPTERINA
6-Piruvoil- tetrahidropterina
PRIMAPTERINA
SR
Phe
Tetrahidrobiopterina
(BH4)
DHPR
PI
NEOPTERINA
q-Dihidrobiopterina
PCD
Deficiencia de PAH
Pterinas en orina
Pterina-4aBIOPTERINA
Carbinolamina
Oxidación
PACIENTE
previa al
CONTROL
análisis
Biopterina
PAH
Tyr
Trp
Tyr
TH
L-DOPA
Dopamina
HVA
Primapterina
Arg
TPH
NOS
Deficiencia
5-OH-Trp en DHPR
Citrulina
+
Deficiencia
NO
Serotonina en PAH
5HIAA
DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO
Cromosoma
gen
mRNA
DIAGNOSTICO
GENÉTICO
Proteína
DIAGNOSTICO
ENZIMATICO
Cofactor
(vitamina)
Perfil
metabólico
SUSTRATO
PRODUCTO
PERFIL METABÓLICO DE
ACIDEMIA PROPIÓNICA Y ACIDEMIA METILMALÓNICA
Ác. Metilcítrico
Propionil-CoA
Tiglilglicina
Patrón Interno
Propionilglicina
Ác. 3-OHPropiónico
PCC
(2 picos)
Metilmalonil-CoA
Succinil-CoA
Ác. 3-OHPropiónico
MCM
Patrón Interno
Ác. Metilmalónico
Ác. Metilcítrico
(2 picos)
IDENTIFICACIÓN DEL DEFECTO ENZIMÁTICO
ACIDEMIA
METILMALóNICA
Plasma membrane
cblF
OH-Cbl(III)
Cbl(III)
Lysosome
cblC
Cbl(II)
Cbl(II?)
cblD
Restablecimiento via
oxidación del [1-14C]
propionato mediante
fusión celular somática
cblH?
cblA
Propionyl-CoA
MMAA
Cbl(II)
PCC
D-Methylmalonyl-CoA
MMAB
Adocbl
L-Methylmalonyl-CoA
Cbl(I)
cblB
Succinyl-CoA
Mut
(MCM)
Cytosol
Mitochondria
2 ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
Gen
Grupo
MUT
mut 0
mut-
COMPLEMENTACIÓN
CELULAR
1
MMAA
MMAB
cblA
cblB
Act. MCM (+AdoCbl)
-
-
+
+
Resp. B12 in vitro
-
+
++
-/+
Síntesis AdoCbl
+
+
-
Resp. B12 in vivo
-
-
90%
40%
SÍNTOMAS CLÍNICOS
Rechazo de la alimentación, Hipotonía, Hipertonía,
Acidosis metabólica, Olor especial, Hipoglucemia
Ataques de cetoacidosis, Letargia,Coma, Vómitos con
cetonuria, Anión GAP elevado, Hiperamonemia,
Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de
muertes
neonatales,
Anión
GAP
elevado,
Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia,
Antecedentes de muertes neonatales
PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS
RADIOLOGIA
HEMATOLOGIA
MICROBIOLOGIA
PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA Y RENAL
DETERMINACIONES BIOQUIMICAS EN
SANGRE Y ORINA
Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM)
PERFIL METABÓLICO
• Aminoácidos
• Ácidos orgánicos
• Lactato, piruvato, cuerpos
cetónicos
• Purinas y pirimidinas
• Carnitina, pterinas
• Acidos grasos de cadena larga,
etc..
ESTUDIO
ESTUDIOENZIMÁTICO-GENÉTICO
ENZIMÁTICO Y GENÉTICO
• Localización del defecto enzimático
• Identificación
de mutaciones
Identificación
de
y SNPs
mutaciones y SNPs
DIAGNÓSTICO DEENFERMEDADES METABÓLICAS
HEREDITARIAS
IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES CAUSANTES
DE EMH
SECUENCIACIÓN
MLPA
C C
C
7
C
8 1 C2 9 C
10
3
C
4 11 C 5 12
C
13
6
C C
C
EXON 5
MICROSATELITES
GENE SCANNING (HRM)
GENOTIPADO
MUTACIONES/SNP
FENILCETONURIA (PKU)
Missense
Deleción
Splicing
Silenciosas
Nonsense
Inserciones
62%
13%
11%
6%
5%
2%
> DE 500 MUTACIONES
800 PACIENTES GENOTIPADOS
Cromosoma 12
q22-q24.1
http//:www.pahdb.mcgill.ca
ACIDEMIA PROPIÓNICA
Valina
Isoleucina
Treonina
Metionina
AG de cadena impar
Colesterol
PCCA
PROPIONILCoA
Cr
13,q32
PCC
BIOTINA
MISSENSE
145 PACIENTES GENOTIPADOS
SPLICING
NONSENSE
INS Y DEL
D-METILMALONILCoA
L-Metillmalonil-CoA
PCCB
Succinil-CoA
Ciclo de Krebs
Cr.
3, q13.3-q22
ISOLATE METHYLMALONIC ACIDURIA (MMAuria)
NM_000255
MUT
MMADCHC
Cr 4, q31.1-2
NM_172250
MMAA
L-METHYLMALONYL-CoA
Cbl(II)
Cr 12, q24
65 PACIENTES GENOTIPADOS
MMAA
ATR
Adocbl MCM
Adocbl
NM_052845
MMAB
Succinyl-CoA
c.349-1g>a
c.290G>A
Cr 6, p21
NM_015702.1
MMADHC
gDNA
kb
Cr 2
1
3
2
0.51
4.8
ATG
4
2.5
6
5
2.9
0.6
7
4.5
8
0.9
JARABE DE ARCE
AA RAMIFICADOS
Valina
Isoleucina
Leucina
cetoglutarato
glutamato
BCKDHA
Aminotransferasa
(BCAT)
a-CETO-ACIDOS RAMIFICADOS
CoA-SH
CO2
BCKDHB
Forma activa
E2
E1
E3
Fosfatasa
Cinasa
BCKD
Complejo
Forma inactiva
E2
E1
45 PACIENTES GENOTIPADOS
DBT
DELECION
NONSENSE
INS Y DEL
Duplicación
No identificadas
E3
Fosforilado
ACIL-CoA DERIVADOS
MISSENSE
CENTRO DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES MOLECULARES
Laboratorio de
Bioquímica
Molecular
Laboratorio de
Genética
Molecular
HPLC
Real-Time PCR y
High resolution melting
DGGE
Genotipado de SNP´s
CCI
GC/MS
MS-MS
ESPECTROFOMETRÍA
SECUENCIACIÓN
IEF, SDS-PAGE
MLPA
Cultivo celular
Perfil transcriptómico
Técnicas enzimáticas
(RT-PCR y qRT-PCR)
radiactivas
www.cbm.uam.es/cedem/
Investigación
Nuevas tecnologías
diagnósticas
Bases moleculares
de EMH
Aproximaciones
terapéuticas
específicas de
mutación
APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS EN EMH
BASADAS EN EL FENOTIPO
CORRECCIÓN
METABÓLICA
BASADAS EN EL GENOTIPO
CORRECCIÓN
GENÉTICA Y
FARMACOLÓGICA
MEDICINA GENÓMICA
PREVENTIVA Y
PREDICTIVA
CORRECCIÓN METABÓLICA BASADA EN EL FENOTIPO
Chr 13
Cromosoma
DNA
Restricción del sustrato (DIETA)
cDNA
Terapia enzimática
Proteína
Suplemento del Cofactor
Transplante de órganos
Cofactor
(vitamina)
q32.3
Antioxidantes (Estres oxidativo)
SUSTRATO
PRODUCTO
TRATAMIENTO DIETÉTICO
APLICABLE A TODAS LAS EMH
DONDE EL SUSTRATO SEA EXÓGENO
• AMINOACIDOPATÍAS
• ACIDEMIAS ORGÁNICAS
• DEFECTOS HIDRATOS DE CARBONO
• DEFECTOS DE b-OXIDACIÓN…
Restricción del sustrato
(DIETA)
DIETA
Restricción
Phe de la dieta
FUENTES ENDÓGENAS
Inhibición de
la Síntesis
FENILALANINA
Eliminación del Sustrato
Sustitución
del Enzima
PAH
COENZIMA (BH4)
APOENZIMA MUTANTE
Suplementación
Farmacológica
Trasplante
de Organos
TIROSINA
Suplemento
del Producto
TRATAMIENTO DIETÉTICO EN FENILCETONURIA
NH2
HOOC
+O2
L-Fenilalanina
• RESTRICCIÓN DE LA PHE DE FORMA INDIVIDUALIZADA y
SUPLEMENTACIÓN con TIROSINA.
• Componentes de la dieta en cantidades normales, según edad
• Requerimientos proteicos (ESPGAN en neonatos: 2.8g proteinas/100Kcal
• Comprobación del equilibrio calórico de la dieta: 100-120 Kcal/Kg/día ( de
las que el 10% las aportan las proteinas; 50-60% los carbohidratos y 30-40%
las grasas)
• Suplementar con vitaminas y minerales. (Con carnitina solo en caso se
deficiencia)
(BH4)
Fenilalanina
Hidroxilasa
(PAH)
NH2
SEGUIMIENTO BIOQUÍMICO Y CLÍNICO DEL TRATAMIENTO
OH
•
Control Phe plasmática (Niveles de phe terapeúticos < 6mg%).
• Revisiones clínicas periódicas
(control estatuponderales, Evaluación desarrollo psicomotor, test de IQ).
HOOC
L-Tirosina
Tratamiento para toda la vida
Restricción del sustrato
(DIETA)
PROGRAMA DE DETECCIÓN PRECOZ EN ESPAÑA
FENILCETONURIA
AÑO DE INICIO
NIÑOS ANALIZADOS
CASOS DETECTADOS
INCIDENCIA
HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO
1969
1978
11.219.602
10.660.863
1258
4563
1 : 9237
1 : 2336
Datos hasta Diciembre 2009. Cobertura del programa 99.9%
TRATAMIENTO DIETÉTICO
Nº de pacientes (n= 165)
40
< 1 mes PKU
35
> 2 años PKU
30
> 10 años PKU
25
HPA
20
15
10
5
0
>120
110-120
90-109
80-89
50-79
Cociente inteligencia
Anales de la Real Academia de Farmacia (1999) 65, 271-304 Premio Científico 1998
Restricción del sustrato
(DIETA)
<50
Suplemento del Cofactor
BIOTINA DE LA DIETA
Unida a proteínas
Libre
BIOTINIDASA
Lisina o
Lisilpéptidos
BIOTINIDASA
BIOTINA
CICLO
DE LA
BIOCITINA
HOLOCARBOXILASA
SINTETASA
SINTETASA
APOCARBOXILASAS
(PCC, MCC, PC, ACC)
BIOTINA
Degradación
proteolítica
HOLOCARBOXILASAS
PROTEÍNAS
LÍPIDOS
CARBOHIDRATOS
Catabolismo de
aminoácidos
Síntesis de
ác. grasos
Gluconeogénesis
ENFERMEDAD
DE JARABE
DE ARCEDE ARCE
TRANSPLANTE
HEPÁTICO
: JARABE
Val Leu Ile
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE MSUD
L-transporter
Cytosol
Val Leu Ile
BCAT-1
Aminoacidos
BCKAs
Leucina
BCAT-2
Val Leu Ile
BCAT-2
orina
sangre
BCKA
transporter
MCF
Isoleucina
BCKAs
Valina
BCKAD
L-Aloisoleucina
Acetoacetic acid
Succinyl-CoA
Acetyl-CoA
patognomonico de MSUD
Transplante de órganos
Evolución del transplante hepático en pacientes con MSUD
LEUCINA plasmática
1400
PRE (4 g PAVB)
(µ mol/L)
POST(60 g PAVB)
1200
1000
800
600
400
200
0
1
2
3
4
5
6
ALOISOLEUCINA plasmática (µ mol/L)
PRE (4 g PAVB)
POST(60 g PAVB)
600
500
400
300
200
100
0
1
Dra Martínez-Pardo
2
3
4
Transplante de órganos
5
6
ESTRES OXIDATIVO Y APOPTOSIS
PROTEÍNAS IDENTIFICADAS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL
MÁS INTERESANTES ESTÁN IMPLICADAS EN:
ESTRES OXIDATIVO
ACIDEMIA
METILMALONICA
Plasma membrane
cblF
mGPDH
MnSOD
OH-Cbl(III)
Lysosome
Cbl(III)
cblC
Cbl(II)
Cbl(II?)
cblD
cblH?
MMAA
cblA
Propionyl-CoA
APOPTOSIS
Cbl(II)
PCC
D-Methylmalonyl-CoA
MMAB
Citocromo c
MUERTE CELULAR
L-Methylmalonyl-CoA
cblB
Adocbl
Succinyl-CoA
Mut
(MCM)
NEUROPATOLOGÍA
Cytosol
Cbl(I)
Mitochondria
E. Richard et al. Journal of Pathology,2007 (in press)
EVALUACIÓN DEL PROCESO DE APOPTOSIS MEDIANTE
CITOMETRÍA DE FLUJO EN PACIENTES CON MMA
% annexin V-positive
apoptotic cells
ANÁLISIS DE ANEXINA V
250
Annexin V
fluorescence
Pt 13
Pt 11
200
150
Pt 9
100
Control
50
0
control
patient 9
patient 11 patient 13
Cell lines
ANTIOXIDANTES ?
caspase 3 activity
(% control)
ANÁLISIS DE CASPASA 3
ANÁLISIS DE CASPASA 9
Control
250
200
150
100
50
0
Pt 11
Caspase 9
fluorescence
Pt 13
Pt 9
control
patient 9 patient 11 patient 13
Cell lines
Los pacientes con MMA tienen un porcentaje de células apoptóticas
más elevado que los controles. El proceso de apoptosis tiene lugar
mediante la vía mitocondrial
ANTIOXIDANTES (ESTRES OXIDATIVO)
TERAPIAS ESPECIFICAS DE MUTACION
BASADO EN LOS MECANISMOS MOLECULARES DE CADA VARIANTE ALÉLICA
DIANA
TERAPEÚTICA
1 MUTACIONES
MISSENSE
APROXIMACION TERAPEÚTICA
• Terapia con chaperonas químicas o moleculares
• Cofactores y vitaminas
• Estimulación de la expresión génica
(estatinas, bezafibrato)
2 MUTACIONES
PTC
3
MUTACIONES
SPLICING
• Read-through de mutaciones PTC
(tratamiento con aminoglucosidos)
• Terapia génica antisentido
• Factores splicing factors, proteinas SR, drogas.
MMAA
MMAA NM_172250
4.9
B12
in vivo
effect
p.Q133X/p.Q133X
4X
+
p.R145X/p.R145X
3X
+
p.R145X/p.R145X
6,7X
+
p.R145X/p.R145X
5X
-
p.R22X/pR145X
4X
+
p.E199fs/p.E199fs
4X
oral B12
p.Q120X/p.L272fs
3X
oral B12
p.P151fs/p.S189fs
2X
+
1.0
MMAA qRT-PCR
C
logRQ
B12
in vitro
effect
Genotype
2.8
Normal levels of
MMAA mRNA
READ-THROUGH OF PTC: TREATMENT WITH ATALUREN®
• Read-through of PTC: treatment with
ATALUREN®
Supresión de paradas prematuras: Selección de
mutantes susceptibles de ser tratados con agentes
“read-through”
Jarabe de Arce: Pacientes BCKDHB con parada prematura
GENOTIPO DE
PACIENTES
Nº Pacientes
identificados
con el mismo
genotipo
[p.L85S] + [p.E163X]
1
[p.E163X] + [p.E163X]
3
[p.E163X] + [p.R168H]
1
[p.R168H] + [p.R324X]
1
[p.P200X] + [p.P200X]
1
[p.P200X] + [p.Q267X]
2
[p.Q267X] + [p.F35fs]
1
[p.R285X] + [p.R285X]
1
[p.Y383X] + [p.Y383X]
1
Tratamiento con antibióticos
aminoglucósidos
Geneticina
WT
p.R324X 0,25
0,50
(mg/mL)
Gentamicina
5
10
(mg/mL)
Sistema de transcripción-traducción “in vitro”
NH2
+O2
HOOC
L-Fenilalanina
(BH4)
L-Phe (mmol/L)
TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO CON COENZIMA
BH4: TESTS DE SOBRECARGA (ENSAYO CLÍNICO)
1800
BH4
12562
12528
10637
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
1
2
3
4
6
8
12
16
20
24
Tiempo (h)
PAH
NH2
HOOC
L-Tirosina
OH
RESPUESTA
POSITIVA A BH4
RESPUESTA
NEGATIVA A BH4
RESPUESTA
LENTA A BH4
Reducción de niveles
de Phe > 30%
( a las 8 horas)
con respecto a los
niveles en el
momento de la
sobrecarga
No hay reducción
de los niveles de
Phe
Reducción de niveles
de Phe > 30%
( a las 12-16 horas)
con respecto a los
niveles en el
momento de la
sobrecarga
L.R. Desviat et al. Mol Genet Metab (2004)
Tratamiento con Cofactor
BH4
FENILCETONURIA: MUTACIONES ASOCIADAS A
LA RESPUESTA DE BH4
Oligomerization domain
Regulator domain
Catalytic domain
LOS PACIENTES QUE RESPONDEN SON AL MENOS
PORTADORES DE UNA MUTACION MISSENSE CON
ACTIVIDAD RESIDUAL
GENOTYPE-SPECIFIC THERAPIES: COFACTORS AND VITAMINS
TERAPIA ANTISENTIDO APLICADA A MUTACIONES
INTRÓNICAS QUE ACTIVAN PSEUDOGENES
U1
U2
GTΨΨAT
U1
GTΨΨAT
AON
U2
GTΨΨAT
Exon 11
A
....CA G
A gtgagt c
ag
gt
Exon
11 11
Exon
AON
76 bpExonExon
12
Exon 11 76 bp
Exon 11
0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
GTΨΨAT
Exon 12
ag
12
Exon 12
Exon 12
10 11 15 25
Exon 11
Exon 11
Días
TERAPIA ANTISENTIDO
76 bp
Exon 12
Exon 12
EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD Y CANTIDAD DE PROTEINA:
ACIDEMIA PROPIÓNICA
PROPIONYL-CoA
PCC
PROPIONIC ACIDEMIA
Propionyl coA carboxylase
Activity
pmol/min/mg
Val
Ile
Thr
Met
Odd-chain fatty acids
Cholesterol
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
c
D-METHYLMALONYL-CoA
L-Methylmalonyl-CoA
0
10
20
PCCA patient
0
10
20
PCCB patient
µM AON
En ambos cosos la actividad es próxima al
control
- AMO
+AMO
control
Succinyl-CoA
MCCA
PCCA
Krebs cycle
A. Rincón et al. Am. J. of Hum. Genet. (2007) 81:1262-1270.
RESTABLECIMEINTO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:
ACIDEMIA METILMALÓNICA
Val
Ile
Thr
Met
Odd-chain fatty acids
Cholesterol
METHYLMALONIC ACIDEMIA
MMA PATIENT WITH MUT MUTATIONS
PCC
D-Methylmalonyl-CoA
L-METHYLMALONYL-CoA
Cbl(II)
MMAA
ATR
Adocbl
MCM
Adocbl
Succinyl-CoA
Krebs cycle
MethylmalonylCoA mutase
activity
14
nmol C propionate /mg
PROPIONYL-CoA
7
6
5
100%
4
3
2
1
0
healthy
control
0
10
15
20
µM AON
LOS TRANSCRITOS SON
EFICIENTEMENTE TRADUCIDOS EN
PROTEINAS FUNCIONALMENTE
ACTIVAS
A. Rincón et al. Am. J. Hum. Genet. (2007) 81:1262-1270