deshechos de hoy, alimentos de mañana

Convocatoria Premio de Investigación
Instituto de Estudios Marinos para la Nutrición y el Bienestar (INESMA)
AGRADECIMIENTOS
Este Trabajo de Investigación se ha realizado en el Instituto de Fermentaciones
Industriales (IFI), y en el actual Instituto de Investigación en Ciencias de la
Alimentación (CIAL), perteneciente a la unidad asociada CSIC-UAM, bajo la dirección
de la Dra. Elena Ibáñez y el Dr. Miguel Herrero, a quienes agradezco su apoyo,
confianza, paciencia y por compartir sus conocimientos y enseñanzas.
A la Dra. Elena Ibáñez, me gustaría dedicarle además un especial agradecimiento, por
darme la oportunidad, junto con el Dr. Alejandro Cifuentes, de adentrarme en el
mundo de la investigación, y de realizar este trabajo en su grupo de investigación.
Además, quiero hacer una mención especial a la colaboración mantenida con el Dr.
Agustín Olano y la Dra. Nieves Corzo, que junto a su grupo de investigación, mucho
han contribuido a los resultados que aquí se presentan. En especial quiero dar las
gracias a la Dra. Toñi Montilla, por todos los conocimientos que ha compartido
conmigo y el interés y simpatía demostradas.
Finalmente, me gustaría dar las gracias a todo el personal del Centro de Química
Orgánica "Lora Tamayo" (CENQUIOR), lugar donde se encuentra el IFI, por la ayuda y
amabilidad con las que he contado en todo momento. Y por supuesto, a todos los
compañeros con los que comparto laboratorio, por todo lo que me han enseñado, y por
compartir conmigo buenos momentos.
Septiembre 2010
RESUMEN
El quitosano es en la actualidad uno de los biopolímeros con mayor crecimiento en número de
artículos científicos y patentes en la comunidad internacional, tanto en los aspectos científicos como
de aplicación. En el laboratorio y en la industria se obtiene principalmente del exoesqueleto de los
crustáceos (cangrejos, langostinos, langostas, camarones, centollas y nécoras entre otros), debido a la
gran cantidad de cáscaras disponibles como desechos de la industria pesquera sin uso ni valor actual.
Pese a las numerosas aplicaciones potenciales de este biopolímero, su utilización en el sector
alimentario no se ha consolidado, fundamentalmente por la necesidad de más investigación así como
por las limitaciones de solubilidad del mismo a pH neutros y básicos. El objetivo principal de este
Trabajo de Investigación titulado “En búsqueda de nuevos ingredientes funcionales procedentes del
quitosano para la valorización de los subproductos y excedentes de crustáceos”, es diseñar un nuevo
proceso de impregnación de quitosano con lactulosa en medio supercrítico con el fin de conferir al
quitosano una serie de propiedades funcionales adicionales y mejorar sus propiedades de solubilidad
mediante la formación de un complejo glicosilado, lo que aumentaría el interés para su uso en
alimentación. De esta manera, se contribuiría además al aprovechamiento de los excedentes y
subproductos de crustáceos, agregándoles un valor al generar productos útiles para su uso en la
industria alimentaria u otras. Esta es la razón por la que tiene sentido evaluar tecnologías alternativas
para su aprovechamiento, como son los fluidos supercríticos, cuya propiedad principal es la
capacidad de poder modular su poder de solvatación según las condiciones de presión y temperatura
de trabajo. Debido a esta propiedad, sumado a la consideración que reciben de tecnologías
medioambientalmente limpias, su uso se ha extendido en múltiples aplicaciones entre las que destacan
la extracción y la impregnación, recibiendo gran importancia y atención en los últimos años.
PALABRAS CLAVE
Alimentos Funcionales, Crustáceos, Quitosano, Lactulosa, Fluidos Supercríticos.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN..................................................................................................... 1
1.1. ALIMENTOS FUNCIONALES ......................................................................................... 1
1.2. QUITOSANO ......................................................................................................................... 2
1.2.1. Fuentes de quitina y obtención del quitosano ........................................................... 3
1.2.2. Caracterización química del quitosano ....................................................................... 5
1.2.2.1. Peso molecular................................................................................................. 5
1.2.2.2. Grado de desacetilación.................................................................................. 6
1.2.3. Aplicaciones y propiedades funcionales del quitosano ............................................ 7
1.2.4. Procesado y obtención de geles a partir de quitosano.............................................. 9
1.3. LACTULOSA ........................................................................................................................ 10
1.3.1. Efectos fisiológicos beneficiosos de la lactulosa ..................................................... 10
1.3.2. Solubilidad de la lactulosa en medio supercrítico.................................................... 11
1.3.3. Análisis de lactulosa por cromatografía de gases (GC) .......................................... 12
1.4. FLUIDOS SUPERCRÍTICOS............................................................................................ 13
1.4.1. Generalidades sobre los fluidos supercríticos.......................................................... 13
1.4.2. Fluidos supercríticos para la industria alimentaria .................................................. 15
1.4.3. Impregnación con Fluidos Supercríticos.................................................................. 16
2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 19
2.1. MUESTRAS Y REACTIVOS............................................................................................. 19
2.2. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE QUITOSANO................................ 19
2.2.1. Preparación de scaffolds de quitosano ..................................................................... 19
2.2.2. Preparación de microesferas de quitosano............................................................... 20
2.3. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO ............................................ 20
2.3.1. Cromatografía de Exclusión Molecular .................................................................... 20
2.3.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier...................................... 21
2.3.3. Microscopia Electrónica de Barrido.......................................................................... 21
2.4. PROCESO DE IMPREGNACIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS............... 21
2.4.1. Sistema de impregnación ............................................................................................ 21
2.4.2. Condiciones de impregnación.................................................................................... 24
2.5. CUANTIFICACIÓN DE LA CARGA DE LACTULOSA.......................................... 25
2.5.1. Preparación de la muestra........................................................................................... 25
2.5.2. Preparación de trimetil-silil derivados de oximas de lactulosa .............................. 26
2.5.3. Condiciones cromatográficas ..................................................................................... 26
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................... 27
3.1. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO DE PARTIDA ................ 27
3.1.1. Cromatografía de Exclusión Molecular .................................................................... 28
3.1.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier...................................... 29
3.1.3. Microscopia Electrónica de Barrido.......................................................................... 31
3.2. PROCESO DE IMPREGNACIÓN SUPERCRÍTICA................................................. 32
3.2.1. Experimentos realizados y condiciones de operación............................................ 32
3.2.2. Rendimiento del proceso de impregnación.............................................................. 34
3.3. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA COMPLEJO QUITOSANO-LACTULOSA... 38
3.3.1. Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier...................................... 38
3.3.2. Microscopia Electrónica de Barrido.......................................................................... 40
4. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO........................................... 41
5. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 42
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
1.1. ALIMENTOS FUNCIONALES
En los últimos años, se ha observado una creciente preocupación por la relación entre una
determinada alimentación y la influencia de ésta sobre la salud, interés que se traduce en un gran
número de publicaciones científicas. Estas investigaciones no han hecho sino demostrar las
fantásticas posibilidades que proporcionan los alimentos para proteger o promocionar la salud
(Roche, 2006). Por esta razón, actualmente los alimentos o productos alimentarios eficaces para la
promoción de la salud están centrando una gran atención, tanto desde el punto de vista del
consumidor, como para la industria alimentaria, y por tanto también, para el investigador (Sloan,
1999). Estos alimentos se vienen denominando de forma genérica alimentos funcionales. Esta
denominación fue acuñada por primera vez en Japón durante la década de los ochenta, a través del
Ministerio de Salud, preocupado por los elevados gastos en salud de la población japonesa con alta
expectativa de vida, refiriéndose a alimentos procesados que contenían ciertos ingredientes capaces
de producir un efecto fisiológico beneficioso. Es así como se creó un marco regulatorio que
favorecía el desarrollo de estos alimentos, conocidos como FOSHU (Foods Of Specific Health Use)
(Arai, 1996). En Europa, en la segunda mitad de los años noventa, un grupo de trabajo coordinado
por el International Life Science Institute (ILSI) y patrocinado por la Comisión Europea promovió
dentro del IV Programa Marco, la Acción Concertada FUFOSE (Functional Food Science in Europe)
para estimular el estudio científico de los alimentos funcionales.
Hoy en día, un alimento funcional puede definirse como aquel alimento que además de satisfacer las
necesidades energéticas y nutricionales es capaz de proporcionar algún efecto beneficioso a una o
más funciones fisiológicas del organismo, aumentando el bienestar o disminuyendo el riesgo de
padecer alguna enfermedad (Goldberg, 1996). Dentro de esta definición relativamente amplia,
conviene destacar que el alimento funcional debe ejercer su función en el organismo en las
1
Introducción
cantidades normales de consumo dentro de la dieta, manteniendo su estructura y forma equivalentes
a su análogo no-funcional. Los alimentos funcionales son, con frecuencia, alimentos tradicionales a
los cuales se les ha añadido algún ingrediente adicional que les confiere la funcionalidad descrita.
Estos ingredientes son los denominados ingredientes funcionales.
En esta misma línea se introdujo el término de nutracéutico; estos productos son preparados que
también poseen actividad funcional beneficiosa para el organismo, pero que no respetan la
presentación y la estructura de un alimento convencional. Son comercializados en forma de
comprimidos, cápsulas y otras presentaciones no habituales en alimentos, siendo empleados
comúnmente como suplementos alimenticios (Diplock y col., 1999).
1.2. QUITOSANO
El quitosano es un polisacárido catiónico de origen natural, derivado de la quitina, compuesto de
cadenas distribuidas aleatoriamente de glucosamina (2-amino-2-deoxi-β-D-glucopiranosa) y N-acetil
glucosamina (2-acetoamido-2-deoxi-β-D-glucopiranosa) unidas por enlaces glucosídicos β(1→4) (ver
Figura 1). Por su parte, la quitina, constituida por unidades de N-acetil-D-glucosamina, es un
polisacárido blanco, duro, inelástico y nitrogenado. Los distintos tipos de quitosano difieren entre sí
según el método de obtención y la procedencia de la quitina utilizada, lo que les confiere distintas
propiedades y diversifica sus aplicaciones.
2
Introducción
Quitina
Quitosano
Figura 1. Estructura química de la quitina y el quitosano.
1.2.1. Fuentes de quitina y obtención del quitosano
El quitosano se produce comercialmente por métodos químicos o enzimáticos, mediante la
desacetilación parcial de la quitina (Kurita, 2006). La purificación de la quitina se lleva a cabo en dos
pasos fundamentales: la separación de las proteínas o desproteinización y la separación del
carbonato de calcio y otras sales minerales o desmineralización (ver Figura 2).
Desproteinización
Quitina
Desacetilación
parcial
Quitosano
Desmineralización
Exoesqueleto crustáceos
Figura 2. Esquema simplificado de la obtención de quitina y quitosano a partir de caparazones de crustáceos.
La quitina, considerada el segundo biopolímero más abundante en la naturaleza después de la
celulosa, es el principal componente estructural de los caparazones (exoesqueleto) de crustáceos, alas
de insectos y de la pared celular de algunos hongos y algas. La producción industrial de quitosano
3
Introducción
prácticamente se basa en el tratamiento de las conchas de diversos tipos de crustáceos (cangrejos,
langostas, camarones, centollas) debido a la facilidad de encontrar estos materiales como desecho de
las plantas procesadoras de estas especies. En la Figura 3, se muestra un esquema simplificado del
aprovechamiento de crustáceos.
Crustáceos
Carne
Desechos de proteínas
Conchas
Productos congelados
Alimentos
peces
Quitina
Productos enlatados
Cremas y Salsas
Quitosano
Figura 3. Esquema simplificado del aprovechamiento de crustáceos.
Los crustáceos (Crustacea) son un extenso subfilo de artrópodos, con más de 67.000 especies. Los
crustáceos son fundamentalmente acuáticos y habitan, tanto en el medio marino, salobre, como en
agua dulce, desde zonas costeras hasta zonas más profundas y desde los trópicos hasta las aguas
árticas. El cuerpo de los crustáceos está dividido normalmente en tres regiones: cabeza, tórax y
abdomen. Normalmente los primeros segmentos del tórax se unen a la cabeza formando lo que se
conoce como cefalotórax. El abdomen puede ser alargado o ensanchado según sean del tipo
Macruros o del tipo Branquiuros (ver Figura 4). Poseen además antenas, antenulas y pinzas.
4
Introducción
Langosta roja (Eunephrops bairdii)
Cangrejo buey de mar (Cancer pagurus)
Figura 4. Crustáceo tipo Macruro (izquierda) y tipo Branquiuro (derecha).
Por tanto, aunque los recursos marinos constituyen por sí mismos una riqueza natural única,
podríamos decir que los caparazones de crustáceos esconden unas propiedades extraordinarias,
debidas al quitosano.
1.2.2. Caracterización química del quitosano
Los estudios de caracterización del quitosano se centran fundamentalmente en la determinación del
grado de desacetilación y su distribución de pesos moleculares, lo que nos permitirá conocer tanto la
composición de las cadenas que lo forman como sus dimensiones. Ambos parámetros tienen una
gran incidencia en las propiedades del polímero.
1.2.2.1.
Peso molecular
El peso molecular del quitosano representa una media de los pesos de las moléculas presentes en su
estructura. Su determinación, se puede llevar a cabo empleando diferentes metodologías basadas en
técnicas cromatográficas (Nguyen, 2009), medidas de dispersión de luz (Tsaih, 2003) y de viscosidad
(Okuyama, 2000). La cromatografía de exclusión molecular (SEC) o de permeación en gel (GPC),
técnica empleada en este trabajo, consiste en pasar una disolución diluida de quitosano a través de
una columna rellena de un gel rígido poroso, de tal forma que las moléculas más grandes penetran
5
Introducción
ligeramente en los poros del gel y fluyen más rápido, mientras que las pequeñas realizan un recorrido
mayor a través de la estructura porosa del relleno y retrasan su avance por la columna,
produciéndose así, una separación por tamaño molecular.
El quitosano se comercializa generalmente en forma de tres tipos de productos: bajo, medio y alto
peso molecular, con valores medios de 120, 400 y 600 kDa, respectivamente.
1.2.2.2.
Grado de desacetilación
El grado de acetilación (AD) se define como el contenido de residuos N-acetilglucosamina presentes
en la cadena polimérica de quitosano, expresado en tanto por ciento. El porcentaje de grupos amino
libres indica el grado de desacetilación (DD). En el caso del quitosano comercializado, este valor
habitualmente se sitúa en el rango del 70 - 95%, siendo difícil alcanzar rendimientos de desacetilación
superiores sin que se degrade la estructura polimérica.
La determinación del grado de acetilación puede realizarse mediante diversas técnicas (Kassai, 2009),
entre las que se pueden mencionar la espectroscopia infrarroja (Brugnerotto y col, 2001; Baxter y
col., 1992), la resonancia magnética nuclear (Duarte y col., 2001), la potenciometría (Qin y col.,
2003), la espectroscopia UV mediante el método de la primera derivada (Tan y col., 1998), el
dicroísmo circular (Domard y col., 1987) y el análisis elemental (Kasaai y col., 2003). En este trabajo
sólo se menciona la Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR) por ser la que
se ha empleado. Este método nos permite relacionar las absorbancias de dos bandas de absorción
determinadas con el porcentaje de acetilación del quitosano. La selección de las bandas de absorción
involucra una señal que depende del grado de acetilación (normalmente una de las bandas amida) y
otra que sirve de referencia interna para corregir las posibles diferencias de concentración.
El método de Brugnerotto y colaboradores (2001) ha sido usado con frecuencia en la literatura. En
éste, el grado de acetilación se calcula por la siguiente ecuación [1]:
AD (%) = 31.92 × (A1320 / A1420) − 12.20
donde A1320 y A1420 son las absorbancias del pico correspondiente a la banda amida III y de la banda
tomada como referencia, respectivamente.
6
Introducción
1.2.3. Aplicaciones y propiedades funcionales del quitosano
El procesado de productos de la pesca como los crustáceos, genera gran cantidad de residuos que
ocasionan graves daños al medioambiente. Entre estos residuos, se encuentran importantes
volúmenes de quitina, lo que, unido a su lenta capacidad de degradación, ha estimulado una
investigación centrada en el estudio de los posibles usos de esta sustancia, buscando por un lado, la
eliminación del problema medioambiental, y por otro, una explotación económica beneficiosa. La
producción de un biomaterial renovable, como es el quitosano, a partir de la quitina se puede
considerar de gran interés ecológico. Por otra parte, las propiedades físico-químicas y biológicas del
quitosano junto con la posibilidad de procesarlo de diferentes formas, lo convierten en un excelente
material con múltiples aplicaciones en el campo de la alimentación, la agricultura y la biotecnología,
la medicina y la farmacia, la industria textil y del papel, etc. (Kumar y Majeti, 2000), como se muestra
en la figura 5 de forma esquemática.
Medicina
Agricultura
Antifúngico
Cirugía
Protección de semillas
Oftalmología
Estimulador del crecimiento
Odontología
Industria Alimentaria
Farmacia y Cosmética
Aditivo Alimentario:
Conservante
Antioxidante
Estabilizante
Dosificación de fármacos
Aplicaciones
del Quitosano
Cremas y lociones
Tratamiento del cabello
Envases activos
Encapsulación de nutracéuticos
Industria del papel
Industria Textil
Brillo
Formación de fibras
Fortaleza
Adsorción de colorantes
Resistencia al agua
Estabilizador del color
Figura 5. Aplicaciones del quitosano.
7
Introducción
Entre las propiedades físico-químicas del quitosano se incluyen la reactividad, la solubilidad y la
biodegradabilidad. El quitosano es altamente reactivo debido fundamentalmente a los grupos amino,
que son los que le confieren el carácter catiónico, y a los grupos hidroxilos que posee en su
estructura (Acosta y col., 1993). Dicho carácter catiónico, lo hace único entre los polímeros de
origen natural, pudiendo interaccionar con compuestos cargados negativamente tales como
proteínas, polisacáridos aniónicos, ácidos grasos, ácidos biliares y fosfolípidos (Agulló y col., 2003),
formando derivados que amplían enormemente su campo de acción.
De igual modo, la presencia de grupos amino con valores de pKa de 6,5 a lo largo de la cadena de
quitosano aumenta su capacidad hidrofílica permitiendo una cierta solubilidad de esta macromolécula,
en contraste con la quitina, en disoluciones acuosas de ácidos inorgánicos como el clorhídrico,
bromhídrico, yodhídrico o nítrico y orgánicos tales como fórmico, acético, oxálico y láctico.
La biodegradación del quitosano, química o enzimática, tiene lugar mediante la hidrólisis de los
enlaces glucosídicos que unen las unidades de N-acetilglucosamina y glucosamina. La degradación
química se refiere a la degradación ácida catalizada por ejemplo por las condiciones ácidas del
estómago. La degradación enzimática puede ser catalizada por enzimas hidrolasas entre las que se
incluyen la quitosanasa, la quitinasa, la lipasa, la glicosidasa y la lisozima (Kean y col., 2010). Sus
productos de degradación son oligosacáridos o monosacáridos, metabolitos naturales que son luego
absorbidos y pueden ser incorporados a las rutas metabólicas de glicosaminoglicanos o
glicoaminoproteínas, o bien, excretados.
Además, otras propiedades a mencionar son su acción floculante derivada del carácter catiónico del
quitosano, y su viscosidad, que le proporciona capacidad espesante, gelificante y emulsificante
(Speiciene y col., 2007).
En cuanto a sus propiedades biológicas, con interés en el ámbito de la alimentación destaca su
actividad antimicrobiana frente a bacterias, hongos y levaduras (Rabea y col., 2003), su capacidad
antioxidante (Kamil y col., 2002), hipocolesterolémica e hipolipidémica (Ormrod y col., 1998),
8
Introducción
hipoglucémica (Miura y col., 1995), antihipertensiva (Park y col., 2003), inmunológica (Okamoto y
col., 1997) y antitumoral (Qin y col., 2002).
1.2.4. Procesado y obtención de geles a partir de quitosano
Una de las particularidades del quitosano que hacen que tenga, como se ha comentado
anteriormente, una amplia gama de aplicaciones, es la posibilidad de modificar su estructura
mediante diferentes procesos. De interés para el presente trabajo es la preparación de hidrogeles y
aerogeles, que se comentan a continuación.
La preparación más simple de hidrogeles consiste en disolver quitosano en una disolución ácida
diluida. Posteriormente, se puede precipitar añadiendo la solución de quitosano en una disolución
alcalina de hidróxido sódico o amoníaco. Si se añade con una jeringa se obtienen esferas de un
diámetro proporcional al tamaño de la jeringa (Valentin y col., 2003). El hidrogel así obtenido, se
puede neutralizar lavando con agua hasta neutralidad, y se transforma en un alcogel sustituyendo el
agua residual por un disolvente con menor polaridad (etanol, metanol, acetona…) mediante
inmersión en una serie sucesiva de mezclas diluidas con cantidades crecientes de alcohol.
El secado de un hidrogel puede resultar en un xerogel o un aerogel en función del método de secado
utilizado. Un xerogel es un gel seco que se ha encogido considerablemente durante el secado,
mientras que un aerogel es un gel seco que ha mantenido el volumen poroso de la matriz hidrogel
(Valentin y col., 2007). Mediante liofilización se mantienen en parte las propiedades del hidrogel, sin
embrago, la estructura secundaria se altera en gran medida debido al crecimiento de cristales de hielo
durante la congelación. Si se lleva a cabo una congelación rápida (-80ºC) se consigue una mejor
conservación de la estructura de los geles. Otra forma de secar el hidrogel es mediante CO2 en
condiciones supercríticas (Okano y col., 2009). El flujo de CO2 se hace pasar a través de la muestra
con el fin de eliminar los disolventes orgánicos (Rinki y col., 2009).
9
Introducción
1.3. LACTULOSA
La lactulosa (4-o-β-D-galactopiranosil-D-fructosa) fue el primer carbohidrato utilizado como
ingrediente prebiótico en alimentos, siendo capaz de estimular las bifidobacterias presentes en el
tracto gastrointestinal. Se trata de un disacárido semisintético obtenido a partir de la isomerización
alcalina de la lactosa (componente que se encuentra en alta concentración en la leche y en el
lactosuero) empleando diferentes catalizadores.
En la Figura 6 se muestran las estructuras bidimensionales de la lactulosa y su isómero, la lactosa.
Lactosa
Lactulosa
Figura 6. Representación bidimensional de la lactulosa y la lactosa.
1.3.1. Efectos fisiológicos beneficiosos de la lactulosa
La lactulosa es el ingrediente prebiótico de mayor consumo en el mundo, se comercializa en
soluciones acuosas con distintos grados de pureza, para el tratamiento del estreñimiento, de la
hiperamonemia, de la encefalopatía hepática y de infecciones intestinales (Schumann y col., 2002).
La lactulosa también ha mostrado su eficacia en el incremento de la absorción de calcio y magnesio
(Olano y Corzo, 2009).
10
Introducción
Según se muestra en la Figura 7, la lactulosa presenta baja absorción en el intestino delgado (ya que
no es hidrolizado por los enzimas específicos de la mucosa intestinal) y llega al intestino grueso
donde es degradada por la flora microbiana. Fermenta en el colon transformándose en ácidos láctico
y acético, proveyendo al intestino grueso de una fuente de carbono junto con el desarrollo de un pH
bajo que favorece el crecimiento de un gran número de bifidobacterias.
↑ Presión
osmótica
↓ pH
Lactulosa atraviesa el estómago
y el intestino delgado
0.25 – 2 % Absorbido
Lactulosa en el colon
Acción
inmunológica
↓ Degradación bacteriana
de la urea
↓ tiempo de tránsito
en el colon
Cambios en el
metabolismo bacteriano
Suministro
de energía
Suministro
carbohidratos
↑ Metabolismo carbohidratos
↓ Degradación proteínas
Crecimiento
bacteriano
↓ Ruptura
aminoácidos
Figura 7. Mecanismo principal de acción de la lactulosa (Schumann y col., 2002).
1.3.2. Solubilidad de la lactulosa en medio supercrítico
Dado el carácter polar de los carbohidratos, su solubilidad en CO2 supercrítico es limitada. Esto
hace que sea necesaria la utilización de modificadores, principalmente etanol, que ayuden a aumentar
la solubilidad de la lactulosa en medio supercrítico.
En la tabla 1 se muestran los datos experimentales de solubilidad de la lactulosa en diferentes
condiciones supercríticas usando como modificador etanol/agua (95:5 v/v), expresados en términos
de masa y como fracción molar, obtenidos por Montañés y colaboradores (Montañes y col., 2009).
11
Introducción
Estos y otros datos sobre el fraccionamiento selectivo de carbohidratos mediante la tecnología de
fluidos supercríticos se obtuvieron a partir de una serie de experimentos llevados a cabo en nuestro
grupo de trabajo, y se recogen de forma más amplia en la Tesis Doctoral titulada “Aplicación de la
tecnología de fluidos supercríticos a la purificación de carbohidratos prebióticios”, presentada en la
Universidad Autónoma de Madrid el 6 de Noviembre de 2009.
Tabla 1. Solubilidad de la lactulosa en SC-CO2 con etanol/agua (95:5 v/v) como modificador (Montañes y col., 2009).
T (ºC)
P (bar)
60
60
60
100
100
100
100
200
300
100
200
300
modificador
(ml/ min)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
60
60
60
100
100
100
100
200
300
100
200
300
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.1224
0.0488
0.1045
0.1622
0.0805
0.3678
1.5633
0.6233
1.3347
2.0716
1.0282
4.6976
60
60
60
100
100
100
100
200
300
100
200
300
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.1017
0.0345
0.4799
0.2249
0.0877
0.2301
1.2950
0.4392
6.1092
2.8634
1.1170
2.9292
Solubilidad de la lactulosa en SC-CO2
mg/ g disolvente
Fracción molar (105)
0.2508
3.2154
0.0465
0.5962
0.1311
1.6802
0.4058
5.2026
0.0487
0.6756
0.1984
2.5436
1.3.3. Análisis de lactulosa por cromatografía de gases (GC)
Muchos son los métodos que se emplean para la identificación y cuantificación de la lactulosa y de
otros carbohidratos, pero sin duda las más empleados son los cromatográficos, por ser los más
sensibles y precisos. De esta manera, mediante cromatografía de gases (GC) se puede lograr una
adecuada cuantificación de la lactulosa presente en una muestra, de forma reproducible y con límites
de detección muy bajos.
12
Introducción
Dado que los carbohidratos son compuestos no volátiles, es preciso llevar a cabo una derivatización
como paso previo al análisis por cromatografía de gases. La formación de trimetil-silil derivados de
oximas de la lactulosa es un método de derivatización muy eficaz que permite que las distintas
formas anoméricas de los azúcares reductores aparezcan en el cromatograma en forma de dos picos
(Shippee y col., 1992).
Las columnas capilares son hoy en día las más utilizadas para la cuantificación de la lactulosa y otros
azúcares por cromatografía de gases, y entre ellas las compuestas por metilsilicona o polisiloxanos
con un porcentaje variable de grupos polares fenil o cianopropil. Así, el uso de columnas con una
composición de 95% de metilsilicona y 5% de grupos fenilo (HP-5 MS) ha sido descrito
previamente para este tipo de análisis (Soria y col., 2010).
Dependiendo del tipo de fase utilizada, soporte y gas portador, la lactulosa eluye en un rango de
temperaturas comprendido entre 200 y 260 ºC.
1.4. FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
1.4.1. Generalidades sobre los fluidos supercríticos
Un fluido supercrítico es una sustancia con propiedades intermedias entre dos de las tres formas de
de agregación de la materia que se conocen comúnmente: sólido, líquido y gas. Concretamente, un
fluido supercrítico posee densidades similares a los líquidos, viscosidades en el mismo rango que los
gases, y una difusividad intermedia entre ambos estados, como se puede apreciar en la Tabla 2,
viéndose favorecidas sus propiedades hidrodinámicas y la capacidad de transferencia de materia.
Tabla 2. Densidad, viscosidad y difusividad de diferentes fluidos tipo.
Densidad (g/ml) Viscosidad (g/cm×s) Difusividad (cm2/s)
Gas
10-3
10-4
10-1
Líquido
1
10-2
10-6
Fluido supercrítico
0,2-0,9
10-4
10-3
13
Introducción
En un diagrama de fases clásico como el de la Figura 8, en el que se presenta la relación de los
estados sólido, líquido y gaseoso en función de la temperatura y la presión, se observan las curvas de
fusión, sublimación y vaporización, las cuales muestran las zonas de coexistencia de dos fases, y un
punto de coexistencia de los tres estados, el llamado punto triple (PT). El cambio de estado se asocia
a un cambio brusco de densidad y, para que se produzca, es necesario un aporte extra de energía
denominado entalpía de cambio de estado. Sin embargo, este cambio de densidad no se produce por
encima del llamado punto crítico (PC) por tanto, se podría definir este punto como aquel por
encima del cual no se produce licuefacción al presurizar, ni gasificación al calentar.
Figura 8. Diagrama de fases sólido/líquido/gas.
PT: punto triple, PC: punto crítico, Pc: presión crítica, Tc: temperatura crítica.
En la sucesión de imágenes de la Figura 9, se observa que si un gas se calienta por encima de cierta
temperatura (Tc), por más que se comprima éste no alcanza el estado líquido. Esta misma
observación fue la realizada por Charles Cagniard de la Tour, quien en 1822 definió el punto crítico
por primera vez.
14
Introducción
Figura 9. Desaparición de las fases en el punto crítico.
Por tanto, una sustancia se puede considerar como un fluido supercrítico cuando se encuentra por
encima de su punto crítico, definido tanto por su presión como por su temperatura críticas (Luque
de Castro y col., 1993). Entre las sustancias más comúnmente empleadas en condiciones
supercríticas se encuentran el dióxido de carbono, el argón, el metano, el etano, el propano, el
butano, la acetona, el agua, el amoniaco, el etanol y el metanol. De esta manera, el dióxido de
carbono (CO2) alcanza las condiciones supercríticas (SC-CO2) cuando se encuentra a temperatura y
presión superiores a 31ºC y 72 bar, respectivamente. Sin embargo, para alcanzar el punto crítico del
agua se necesitan unas condiciones mucho más extremas, 375ºC de temperatura y 215 bar de
presión.
1.4.2. Fluidos supercríticos para la industria alimentaria
Para que un fluido pueda emplearse como disolvente en la industria y, especialmente, en la industria
alimentaria, debe poseer una serie de propiedades adicionales, como son baja o nula inflamabilidad y
toxicidad, no ser agresivo con el medio ambiente, poseer condiciones críticas moderadas, ser
gaseoso en condiciones de presión y temperatura ambiente (no dejando ningún tipo de residuo en
las preparaciones alimentarias), tener una alta capacidad disolvente, ser fácil de obtener con elevada
pureza y tener un bajo precio (Rozzi y col., 2002). De entre los fluidos supercríticos más estudiados,
el que mejor cumple con todas estas propiedades es el dióxido de carbono (CO2), con la salvedad de
su apolaridad que, en principio, limita su poder solvente para sustancias polares, como los
carbohidratos. Una de las posibilidades para superar esta limitación es el empleo de cosolventes
15
Introducción
declarados GRAS (Generally Recognized As Safe) (etanol y agua) que actúen como modificadores
dotando al medio supercrítico de mayor polaridad.
Así, el dióxido de carbono supercrítico junto con el empleo de una mezcla de etanol y agua como
cosolvente se podría utilizar para la obtención de nuevos ingredientes funcionales a partir de la
impregnación de quitosano con lactulosa, objeto de estudio en este trabajo.
1.4.3. Impregnación con Fluidos Supercríticos
El interés por la tecnología de impregnación supercrítica en matrices poliméricas se deriva de la
oportunidad de utilizar las propiedades de los fluidos supercríticos para la preparación de nuevos
materiales poliméricos con propiedades y beneficios adicionales. La ausencia de tensión superficial
permite a los fluidos supercríticos la rápida penetración dentro de los poros de matrices
heterogéneas. La alta difusividad del dióxido de carbono, permite que se produzca una transferencia
de materia mucho más favorable, así como una distribución homogénea del aditivo en el núcleo de
la matriz polímerica, lo cual es una de las principales ventajas del proceso. Además, dichos fluidos
pueden difundir fácilmente fuera del polímero, una vez que la presión se reduce a valores
ambientales, por lo que no dejan residuos de disolventes en la muestra de polímero impregnado.
De este modo se han desarrollado un amplio número de trabajos que emplean la tecnología de
fluidos supercríticos utilizando CO2 (SC-CO2) en la obtención de derivados de quitosano. Como
ejemplo cabe destacar la preparación de derivados de quitosano con azúcares reductores tales como
glucosa y maltoligosacáridos, en los que se logra una mayor transformación que por métodos
convencionales (Yalpani y col., 1993). También, se han realizado numerosos estudios sobre la
impregnación de quitosano mediante fluidos supercríticos para su aplicación en la encapsulación de
principios activos y posterior liberación controlada de fármacos como la dexametasona (Duarte y
col., 2009), la indometacina (Gong y col., 2006), el flurbiprofeno o el maleato de timolol (Braga y
16
Introducción
col., 2008). Estos estudios se han empleado como punto de partida para abordar la impregnación de
quitosano con lactulosa u otros carbohidratos prebióticos, objeto de estudio en la presente memoria.
El proceso de impregnación con fluidos supercríticos se lleva a cabo empleando un dispositivo
como el que se muestra de forma esquemática en la Figura 10.
Figura 10. Equipo de impregnación supercrítica (Duarte y col., 2008).
El equipo consta básicamente de un saturador (S) y una celda de impregnación (I), colocados dentro
de un horno que mantiene la temperatura, medida mediante un termopar (T). La presión del sistema
se mide con un transductor de presión (P). El saturador se carga con una pequeña cantidad del
aditivo mezclado con arena de mar o cuentas de vidrio para mejorar la transferencia de masa, y la
celda de impregnación se llena con el polímero. La mezcla de CO2 y modificador se calienta a la
temperatura deseada y una vez alcanzada la presión de trabajo, se introduce en el saturador. Una vez
disuelto el soluto, el fluido resultante se introduce en la celda de impregnación donde se encuentra el
polímero a impregnar, que se expone a esta solución durante un tiempo predeterminado seguido de
la despresurización lenta del sistema. El proceso se puede llevar cabo en modo dinámico o estático,
según se encuentre la válvula de salida del flujo de CO2 abierta o cerrada.
Es importante distinguir entre dos mecanismos de impregnación de aditivos en matrices poliméricas
mediante el empleo de fluidos supercríticos (Kazarian y col., 2000). El primer mecanismo implica un
17
Introducción
simple depósito del compuesto cuando el fluido sale de la matriz polimérica hinchada. Según
Kazarian, esta situación consiste en su mayor parte en un soluto con una solubilidad relativamente
alta en el fluido y es específica para la impregnación llevada a cabo en una matriz sujeta al
hinchamiento bajo la exposición al fluido supercrítico. El segundo mecanismo, no específico de los
fluidos supercríticos, corresponde a las interacciones químicas entre el soluto y la matriz.
El proceso de impregnación con fluidos supercríticos se rige por las relaciones de la termodinámica
y la transferencia de masa, que dependen, de una manera compleja, de la presión del fluido
supercrítico y de la temperatura de trabajo. La presión y la temperatura no sólo afectan a la
solubilidad del soluto de interés en el dióxido de carbono, sino que también influyen en el grado de
adsorción del polímero, es decir, en la cantidad de dióxido de carbono que puede disolverse en la
matriz polimérica. La transferencia de materia también dependerá en cierta medida de la preparación
de la muestra, especialmente de la estructura del material y del tamaño de partícula.
La eficacia de la impregnación resulta de un complejo mecanismo que implica interacciones entre el
soluto (aditivo), el portador (fluido supercrítico y modificador) y la matriz polimérica (Duarte y col.,
2007). La fuerza relativa de todas las interacciones binarias (aditivo – SC-CO2, polímetro – SC-CO2,
y aditivo – polímero) contribuirá a la distribución definitiva del soluto entre la fase móvil y el sólido.
Como ejemplo, un aditivo con una baja solubilidad en el fluido supercrítico, pero con una fuerte
interacción con la matriz podría impregnarse en gran medida; por el contrario, un soluto con mayor
interacción con el disolvente en comparación con la matriz será difícilmente impregnado. Por tanto,
considerando la complejidad asociada al proceso de impregnación, será necesario optimizar las
condiciones del mismo en función del soluto a impregnar, el fluido supercrítico (y cosolvente)
empleado y la matriz polimérica.
18
Materiales y Métodos
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. MUESTRAS Y REACTIVOS
El quitosano, la lactulosa (>98% de pureza, calidad HPLC), el patrón interno empleado en el análisis
por cromatografía de gases (fenil-β-D-glucósido), y los agentes derivatizantes (hidrocloruro de
hidroxilamina, hexametildisilazano, y ácido trifluoroacético) fueron suministrados por la empresa
Sigma-Aldrich.
El quitosano utilizado, de bajo y mediano peso molecular, está en forma de polvo procedente del
caparazón de crustáceos, fundamentalmente cangrejos.
En cuanto a los disolventes utilizados, el ácido acético glacial y el hidróxido sódico fueron
proporcionados por Panreac Química, el etanol por BDH Prolabo, el metanol por Sigma-Aldrich y
la piridina por Merck, todos ellos de grado analítico.
El agua ultrapura (18.2 MΩcm de resistivilidad y 1–5 ppb de carbono orgánico total (TOC)) se
obtuvo en el laboratorio mediante un sistema de purificación Milli-Q Synthesis A10 de Millipore.
Finalmente, el nitrógeno y el dióxido de carbono licuado fueron suministrados por Praxair, y la lana
de vidrio lavada químicamente por Panreac Química.
2.2. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DEL QUITOSANO
El quitosano comercial se ha procesado de dos formas distintas, según los métodos que se describen
a continuación, obteniendo una matriz susceptible de impregnación bien en forma de scaffolds o en
forma de microesferas.
2.2.1. Preparación de scaffolds de quitosano
Los scaffolds de quitosano se prepararon a partir de una disolución al 1% (p/v) de quitosano (bajo
peso molecular) en ácido acético al 1% en agua (v/v). La disolución total se obtuvo por agitación a
19
Materiales y Métodos
temperatura ambiente durante 6 h. A continuación, la disolución obtenida se dializó utilizando una
membrana de diálisis con tamaño de poro de 3500 Da con el fin de llevar a cabo una purificación. El
tiempo de dialización fue de 48 h, cambiando el agua 2 veces al día. Posteriormente, el gel obtenido
se congeló a -80ºC y se liofilizó a 4ºC con el fin de eliminar completamente el disolvente (Duarte y
col., 2009) mediante un liofilizador Labconco Modelo 79480.
2.2.2. Preparación de microesferas de quitosano
Las microesferas de quitosano se prepararon a partir de una disolución al 1% (p/v) de quitosano
(mediano peso molecular) en ácido acético al 2% en agua (v/v). A continuación, la disolución
obtenida se precipitó gota a gota mediante una bureta, en una disolución alcalina de hidróxido
sódico al 5% (p/v). Una vez obtenidas las microesferas de quitosano, se neutralizaron lavando con
agua hasta neutralidad (Okano y col., 2009), y se deshidrataron mediante inmersión en una serie
sucesiva de mezclas etanol/agua con cantidades crecientes de alcohol (10, 30, 50, 70, 90, 100%)
durante 15 minutos cada una de ellas. Para llevar a cabo la separación de las microesferas de
quitosano de cada uno de los tres disolventes utilizados (hidróxido sódico, agua y etanol), la mezcla
se centrifugó a 10.000 r.p.m. durante 15 minutos en una centrífuga Beckman Coulter Avanti J-26
XP. Posteriormente, el hidrogel así obtenido (ver Figura 8) se secó mediante CO2 en condiciones
supercríticas mediante el extractor de fluidos supercríticos de escala analítica que se describe en el
siguiente apartado, a una presión de 74 bar y una temperatura de 32 ºC durante 2 horas, con el fin de
eliminar el disolvente orgánico empleado en la preparación (Valentin y col., 2003).
2.3. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO
2.3.1. Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC)
El peso molecular promedio de los dos quitosanos empleados en este trabajo, se determinó por
Cromatografía de Exclusión Molecular. El equipo utilizado estaba compuesto por una bomba de
20
Materiales y Métodos
gradiente HPLC Dionex, dos columnas de exclusión molecular TSKgel Tosoh Bioscience de 30 cm
de longitud y 7.8 mm de diámetro interno (G5000PWXL y G4000SWXL), colocadas en serie, y un
detector de índice de refracción Shimadzu RID-10A. Los valores de peso molecular se determinaron
después de una calibración del sistema.
2.3.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR)
Las muestras de quitosano fueron preparadas para su análisis por espectroscopia infrarroja en forma
de pastillas de Bromuro Potásico (KBr). Las pastillas se prepararon moliendo en un mortero una
pequeña cantidad de quitosano con 100 mg de KBr y prensando la mezcla hasta obtener una pastilla
compacta. Posteriormente, se analizaron en un espectrómetro de infrarrojos con transformada de
Fourier Perkin Elmer Spectrum One.
2.3.3. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)
Las muestras de quitosano antes y después de la impregnación se observaron mediante un
microscopio electrónico de barrido Phillips, modelo XL30, a 25 kV. Previo al análisis por
microscopia electrónica, las muestras se recubrieron con 4 nm de oro paladio para proporcionar la
conductividad necesaria, a 50 A° en una atmósfera de argón, utilizando un metalizador Polaron,
modelo SC7640. Las micrografías fueron tomadas a 50, 200 y 800 aumentos (50x, 200x, 800x).
2.4. PROCESO DE IMPREGNACIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
2.4.1. Sistema de impregnación por fluidos supercríticos
La Figura 11 muestra el diagrama del sistema de impregnación por fluidos supercríticos empleado
para llevar a cabo los experimentos.
21
Materiales y Métodos
(1) Botella de CO2, (2) Bomba de CO2 de doble pistón, (3) Reservorio de modificador, (4) Bomba de
modificador, (5) Puntos de lectura de presión, (6) Válvula on/off para CO2, (7) Válvula on/off para
modificador, (8) Válvula antirretorno, (9) Baño calefactor, (10) Válvula on/off para la mezcla CO2 /
modificador calefactada, (11) Horno, (12) Celda de acero inoxidable, (13) Válvula de microregulación,
(14) Válvula on/off , (15) Celda de expansión, (16) Medidor de flujo másico, (17) Ordenador.
Figura 11. Esquema del sistema de impregnación supercrítica empleado.
El sistema está basado en un extractor Suprex PrepMaster (Thar designs, Pittsburg, EE.UU) de
escala analítica (ver Figura 12) con varias modificaciones. Posee un horno termostatizado calentado
por convección de aire donde se coloca la celda de acero inoxidable con la muestra de quitosano y la
lactulosa. El CO2 se bombea al sistema empleando la bomba del equipo Suprex PrepMaster.
El modificador se introduce en el sistema mediante una bomba Suprex, después de la cual se coloca
una válvula antirretorno (Swagelok CHS2-BU-10), para evitar la entrada de CO2 y el consiguiente
daño del sistema de bombeo. Los dos fluidos se mezclan en un dispositivo diseñado especialmente
para favorecer el mezclado de ambos, a la vez que garantiza que el fluido alcance la temperatura de
impregnación previo a su entrada en la celda, mediante el paso del fluido por un tubo de acero de
dimensiones apropiadas en forma de espiral situado en un baño de glicerina a la temperatura de
22
Materiales y Métodos
trabajo. A la salida de la celda de impregnación se encuentra una válvula micrométrica (Swagelok
SS4-BU-VH) que se emplea para el control fino del flujo a través de la celda.
Para llevar a cabo la medida y el ajuste del flujo de CO2 (gas) que circula por el sistema, de forma
precisa, está adaptado un medidor de flujo másico (EL-FLOW F-111C) controlado por ordenador.
Figura 12. Equipo de extracción supercrítica de escala analítica Suprex PrepMaster y
esquema simplificado de funcionamiento.
Puesto que el dispositivo utilizado en este trabajo no dispone de saturador, el proceso de
impregnación se ha llevado a cabo poniendo tanto la lactulosa como el quitosano en la celda de
impregnación. Como se muestra en la Figura 13, la lactulosa se colocó en la celda separada de la
matriz de quitosano mediante lana de vidrio, de tal manera que el flujo de CO2 entre en contacto en
primer lugar con la lactulosa y posteriormente con la matriz de quitosano. De la misma manera, la
lana de vidrio se empleó para evitar la salida y contaminación de la muestra, colocándola en cada
uno de los extremos de la celda.
23
Materiales y Métodos
Lana de vidrio
Lactulosa
Scaffolds de quitosano
Microesferas de quitosano
Figura 13. Distribución de la muestra de quitosano (en forma de scaffolds o microesferas) y de la lactulosa en la celda.
2.4.2. Condiciones de impregnación
Todas las impregnaciones se llevaron a cabo a 100 bar de presión, 100 ºC de temperatura y 0.2 ml/
min de modificador etanol/agua 95/5 (v/v). Estas condiciones dieron lugar a una solubilidad de la
lactulosa en el fluido supercrítico de 0.4058 mg/ g disolvente.
La cantidad de quitosano y lactulosa que se colocó en la celda de impregnación guardó una
proporción de 1:0.1 pero varió en función de la forma en que estaba procesado el quitosano de
partida; dicha cantidad fue 500 mg de quitosano y 50 mg de lactulosa para los scaffolds de quitosano
y 1 g de quitosano y 100 mg de lactulosa en el caso del procesado en forma de microesferas. Esta
variación en las condiciones de impregnación entre ambos quitosanos se debió a que las
microesferas tienen una relación peso / volumen muy superior a los scaffolds de quitosano.
Al finalizar cada uno de los experimentos se comprobó que la cantidad de lactulosa se encontraba en
exceso, observando el remanente de lactulosa en la celda de impregnación.
Los experimentos se realizaron empleando dos modalidades de trabajo: estático y dinámico.
El modo de trabajo general seguido en todos los experimentos realizados en estático, combina un
corto periodo de estabilización del sistema (en modo dinámico) y el periodo de impregnación
propiamente dicho en estático. Una vez alcanzadas las condiciones experimentales de presión y
24
Materiales y Métodos
temperatura, el disolvente de impregnación (consistente en una mezcla de CO2 y modificador) se
hace pasar a través de la celda a un flujo de 1.2 g/ min durante 20 minutos, para asegurarnos que el
porcentaje de modificador en la celda sea del 6% (ps). Posteriormente comienza el proceso de
impregnación en modo estático durante 1 o 3 horas, y por último se despresuriza. El flujo de
despresurización de CO2 se regula haciendo pasar el flujo de salida de CO2 por un capilar de sílice
fundida de 75 µm de diámetro y una longitud de 50 cm, acoplado en el dispositivo de
despresurización del equipo. Dicho flujo oscila entre 1 y 0.6 bar/ min. Para los experimentos en los
que se realizaron ciclos de impregnación, se repitió el mismo procedimiento de impregnación
(durante 1 hora) y despresurización, 3 veces, pero en cada ciclo, se renovaba la cantidad de lactulosa,
y se tomó parte de la muestra impregnada para su posterior análisis y caracterización.
En los experimentos realizados en modo dinámico, el disolvente de impregnación se hizo pasar a
través de la celda a un flujo de 1.2 g/ min durante 60 minutos, siendo el flujo de despresurización de
3 bar/ min.
2.5. CUANTIFICACIÓN DE LA CARGA DE LACTULOSA
La cromatografía de gases se ha empleado para cuantificar la cantidad de lactulosa impregnada en la
muestra de quitosano, y estudiar así el rendimiento de la impregnación.
2.5.1. Preparación de la muestra
De la muestra de quitosano obtenida en los diferentes experimentos de impregnación supercrítica se
separaron 200 mg y se añadieron 5 ml de agua milli-Q con el fin de disolver la lactulosa impregnada.
A continuación se adicionaron 200 µL de una disolución al 10 % (p/v) de fenil-β-D-glucósido en
metanol/agua (70:30, v/v) como patrón interno. La mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 10.000
r.p.m., previo ajuste del pH a condiciones alcalinas (7 - 8.5) para facilitar la precipitación del
quitosano. Una alícuota del sobrenadante se traspasó a un matraz de corazón y se evaporó a
sequedad en un rotavapor Büchi Labortechnik AG R-210 a 40 ºC.
25
Materiales y Métodos
2.5.2. Preparación de trimetil-silil derivados de oximas de lactulosa
Las oximas de los carbohidratos se formaron añadiendo a las muestras previamente llevadas a
sequedad, 200 µL de hidrocloruro de hidroxilamina en piridina (2.5 %, p/v) y calentando la mezcla a
70 ºC durante 30 minutos. Posteriormente, las oximas obtenidas en el paso anterior se sililaron con
hexametildisilazano (200 µL) y ácido trifluoroacético (20 µL) y se mantuvieron a 50 ºC durante 30
minutos (Sanz y col, 2004). La mezcla de reacción se centrifugó a 10.000 r.p.m durante 2 minutos.
Los sobrenadantes se inyectaron en el cromatógrafo de gases o se almacenaron a 4 ºC para su
posterior análisis.
2.5.3. Condiciones cromatográficas
Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gases Agilent 7890A (ver Figura 14) equipado con
un inyector automático con divisor de flujo (split/splitless) (1:40) y un detector por ionización de
llama (FID), utilizando nitrógeno como gas portador. Los trimetilsilil éter y las trimetilsilil oximas se
separaron usando una columna capilar de sílice fundida HP-5 MS adquirida de Agilent J&W
Scientific, de 30 m de longitud y 0.32 mm de diámetro interno. La temperatura del horno fijada a
180 ºC, se elevó a 276 ºC a una velocidad de calentamiento de 3 ºC/ min. La temperatura del
inyector y del detector fue de 280 y 325 ºC, respectivamente. El sistema de integración y adquisición
de datos estaba controlado mediante el software MSD Chemstation proporcionado por Agilent
Technologies.
Figura 14. Cromatógrafo de Gases Agilent 7890A.
26
Resultados y Discusión
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL QUITOSANO DE PARTIDA
Como se ha comentado anteriormente, el quitosano comercial se procesó de dos formas distintas, en
forma de scaffolds y en forma de microsesferas. Posteriormente, ambos fueron caracterizados
mediante Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC), Espectroscopía Infrarroja con
Transformada de Fourier (FT-IR) y por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM).
En la Figura 15 se puede observar una muestra de los scaffolds de quitosano obtenidos. Se trata de
una matriz porosa con un peso molecular promedio de 150 KDa y un grado de desacetilación del
90%.
Figura 15. Scaffolds de quitosano.
En cuanto a las microesferas de quitosano, se obtuvo un aerogel como el que se muestra en la Figura
16, con gran superficie por unidad de peso, un peso molecular promedio de 385 KDa y un grado de
desacetilación del 85%. De igual modo, en la misma figura se muestra el hidrogel obtenido.
27
Resultados y Discusión
Figura 16. Microesferas de quitosano: hidrogel (izquierda), y aerogel (derecha).
El cambio del quitosano de bajo peso molecular al de mediano peso molecular en el caso del
procesado en forma de microesferas, fue necesario al comprobar que con el primero las
microesferas no se formaban adecuadamente en el paso de precipitación en el hidróxido sódico.
3.1.1. Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC)
Puesto que cuando hablamos de un polímero, no nos referimos a un solo peso molecular, sino a una
distribución de pesos moleculares, fue necesario un análisis de la muestra por Cromatografía de
Exclusión Molecular (Size Exclusion Chromatography, SEC), para conocer este dato con mayor
exactitud. De esta manera, podemos asegurar una cierta reproducibilidad en posteriores
experimentos, puesto que puede haber diferencias significativas entre el peso molecular del
quitosano de unas partidas comerciales a otras.
A partir de los análisis realizados, se obtuvo un gráfico como el de la Figura 17 que nos describía la
distribución de pesos moleculares alrededor del peso molecular promedio. Es decir, el pico nos
proporciona información sobre el número de moléculas de quitosano con peso molecular promedio
y qué cantidad tienen peso superior o inferior al promedio.
28
Nº moléculas
Resultados y Discusión
Tiempo
Peso Molecular
Figura 17. Típico gráfico obtenido por Cromatografía de Exclusión Molecular.
En la interpretación de este tipo de gráficos, es importante tener en cuenta que las moléculas con
mayor peso molecular, tienen un menor tiempo de retención que las de bajo peso molecular, por lo
los valores de peso molecular aumentan de izquierda a derecha.
3.1.2. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR)
La espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR) nos permite por un lado identificar los grupos funcionales presentes en la muestra y por otro
lado determinar el grado de acetilación del quitosano.
En un espectro de infrarrojo (IR) como el de la Figura 18, se pueden apreciar las bandas características
del quitosano a 3450 cm-1 (tensión del grupo -OH), a 3292 cm-1 (tensión del grupo N-H), a 2919 y
2862 cm-1 (tensión del grupo C-H), a 1655 cm-1 (amida I), a 1580 cm-1 (amida II), a 1417 cm-1 (grupo
CH3), a 1313 cm-1 (amida III), a 1154 cm-1 (tensión asimétrica del enlace C-O-C), a 1082 y 1032 cm-1
(vibraciones propias de su estructura piranósica) y a 896 cm-1 (tensión C-H de los grupos
anoméricos). La figura muestra además las líneas base utilizadas para el cálculo del grado de
desacetilación del quitosano por el método de Brugnerotto y colaboradores (2001).
29
1655
1580
1417
1313
1154
1082
1032
896
2919
2862
3450
3292
Transmitancia (%)
Resultados y Discusión
Longitud de onda (cm-1)
Figura 18. Espectro de IR de una muestra de quitosano (Brugnerotto y col., 2001).
A continuación se presentan los espectros de IR correspondientes a los scaffolds y microesferas de
quitosano obtenidos en esta investigación (Figuras 19 y 20). En ellos se puede observar una gran
correspondencia con las bandas características obtenidas por Brugnerotto y colaboradores (2001).
Figura 19. Espectro de IR de una muestra de los scaffolds de quitosano obtenidos en este trabajo.
30
Resultados y Discusión
Figura 20. Espectro de IR de una muestra de las microesferas de quitosano obtenidas en este trabajo.
El grado de desacetilación calculado a partir de la relación entre las bandas de absorción a 1320 cm-1
y 1420 cm-1 (ecuación [1]) (Brugnerotto y col., 2001), dio un valor del 90% en el caso de los scaffolds
de quitosano y del 85% en el caso de las microesferas de quitosano.
3.1.3. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)
Otra forma de caracterizar los scaffolds y las microesferas de quitosano obtenidos fue mediante su
análisis por Microscopia Electrónica de Barrido (Scanning Electron Microscopy, SEM).
En la Figura 21 se muestra una de las micrografías obtenidas de la matriz de quitosano procesado en
forma de scaffolds, antes de ser impregnado, en los que puede observar su estructura laminada.
31
Resultados y Discusión
Figura 21. Micrografía SEM de scaffolds de quitosano (800x).
Para el caso de las microesferas de quitosano, las micrografías de la Figura 22, muestran su
estructura superficial.
Figura 22. Micrografías SEM de microesferas de quitosano (50x y 800x).
3.2. PROCESO DE IMPREGNACIÓN SUPERCRÍTICA
3.2.1. Experimentos realizados y condiciones de operación
Los experimentos realizados y las condiciones de operación empleadas para la impregnación tanto
de los scaffolds como de las microesferas de quitosano, se muestran resumidas en las Tablas 3 y 4,
respectivamente.
32
Resultados y Discusión
Tabla 3. Experimentos realizados y condiciones de operación, en los scaffolds de quitosano.
Temperatura
(ºC)
Presión
(bar)
Modificador
(ml/min)
Tiempo
(min)
Modo de
trabajo
Flujo (bar/min)
despresurización
100
100
0.2
60
Estático
1
100
100
0.2
180
Estático
0.6
100
100
0.2
60
Dinámico
(1.2 g/ min)
3
Tabla 4. Experimentos realizados y condiciones de operación, en las microesferas de quitosano.
Temperatura
(ºC)
Presión
(bar)
Modificador
(ml/min)
Tiempo
(min)
Modo de
trabajo
Flujo (bar/min)
despresurización
100
100
0.2
60
Estático
1
100
100
0.2
60 (x 3 ciclos)
Estático
1 (x 3 ciclos)
100
100
0.2
60
Dinámico
(1.2 g/ min)
3
Como se ha comentado anteriormente, para todos los experimentos realizados se utilizaron las
condiciones en las que se conseguía una solubilidad de la lactulosa en el fluido supercrítico de 0.4058
mg/ g disolvente; estas correspondían a una temperatura de 100 ºC y 100 bar de presión. El fluido
supercrítico consistía en una mezcla de CO2 a un flujo de 1.2 g/ min y 0.2 ml/min de modificador
etanol / agua 95:5. Estas condiciones se determinaron a partir de los datos de solubilidad de la
lactulosa en medio supercrítico obtenidos en los trabajos llevados a cabo por Montañés y
colaboradores (2009), y se tomaron como las más adecuadas teniendo en cuenta las condiciones de
presión, temperatura y densidad del fluido más favorables para que se produzca la impregnación, así
como la selección de unas condiciones de operación que permitan mantener una alta solubilidad de
la lactulosa en el fluido supercrítico.
33
Resultados y Discusión
Por otra parte, se probó tanto el modo de trabajo estático como el dinámico, con el fin de evaluar el
rendimiento en ambos procesos de impregnación. En un primer momento se pensó que se podría
obtener un mayor rendimiento en el proceso dinámico, por la mayor cantidad de fluido supercrítico
que se haría pasar a través de la celda de impregnación. Sin embargo, experimentos llevados a cabo
sobre la impregnación de fármacos en matrices poliméricas, por el grupo de investigación dirigido
por el doctor Herminio de Sousa, demostraban tener un mayor rendimiento cuando el proceso se
llevaba a cabo en modo estático (Duarte y col., 2007; Duarte y col., 2008), al explicar que la
impregnación se produce cuando el sistema se despresuriza lentamente, y vuelve a la presión
atmosférica. De esta forma, se conseguía además, una dispersión del aditivo a lo largo de la matriz
polimérica, mucho más homogénea. Teniendo en cuenta estos experimentos, el flujo de
despresurización conseguido para nuestro caso concreto, se consideró el adecuado.
Otra de las variables estudiadas fue el tiempo de contacto. A tal fin, se realizaron experimentos
durante 60 y 180 minutos. En el caso de los scaffolds de quitosano, las 3 horas de impregnación se
llevaron a cabo de forma continua, sin embrago, en el caso de las microesferas, se realizaron 3 ciclos
de impregnación de 1 hora de duración cada uno, con sus consiguientes 3 ciclos de despresurización.
3.2.2. Rendimiento del proceso de impregnación
En este trabajo se ha definido el rendimiento de la impregnación como la cantidad relativa de
lactulosa impregnada en el quitosano, expresado como la relación entre el peso de la lactulosa y el
peso del quitosano.
Puesto que se podría considerar que partimos de una matriz heterogénea en cuanto a estructura y
composición, previo al análisis por cromatografía de gases fue necesario homogenizar la muestra, así
como analizar una gran cantidad de la misma. De esta manera, los datos de la cantidad de lactulosa
obtenidos son representativos del total de muestra de quitosano impregnado.
34
Resultados y Discusión
En la Figura 23 se muestra un cromatograma correspondiente a la cantidad de lactulosa impregnada
en el quitosano en uno de los experimentos realizados. Se obtuvieron los picos correspondientes al
fenil-β-D-glucósido (patrón interno) y a las oximas de la lactulosa. Como puede observarse, no
existen interferencias y estos picos se cuantifican sin dificultad. Tras el análisis de la cantidad de
lactulosa presente en cada muestra, se analizó la lactulosa residual, resultando no ser en ninguno de
los casos una cantidad significativa, por lo que se concluyó que el método propuesto fue lo
suficientemente eficaz.
Patrón interno
(fenil-β-D-glucósido)
Lactulosa
Figura 23. Cromatograma obtenido por GC correspondiente a la lactulosa impregnada en quitosano.
Es importante resaltar que el método de análisis de lactulosa por cromatografía de gases empleado
se utilizó para cuantificar la lactulosa impregnada en el quitosano por el mecanismo de depósito, es
decir, aquella lactulosa que no ha reaccionado y se encuentra de forma libre.
Sin embargo, de la estructura química de la lactulosa y el quitosano se puede inferir que se establecen
posibles interacciones entre el grupo carbonilo de la lactulosa y el grupo amino del polímero, para
dar lugar a la formación de bases de Schiff. Para cuantificar la lactulosa que ha reaccionado, se
podría hacer una determinación del porcentaje de grupos amino libres que tiene la muestra de
35
Resultados y Discusión
quitosano antes y después de la impregnación. A parte de las técnicas mencionadas anteriormente
para el cálculo del grado de desacetilación, diversos autores han utilizado a tal fin el método de la
Ninhidrina (Curotto y Aros, 1993; Prochazkova y col., 1999).
En las dos siguientes tablas (Tabla 5 y 6), se muestran los rendimientos de impregnación
conseguidos para los experimentos realizados, tanto para los scaffolds como para las microesferas de
quitosano, expresados en tanto por ciento (%). Se trata de rendimientos adecuados si consideramos
que la cantidad máxima de lactulosa que se podría impregnar no es muy elevada puesto que los
experimentos se han realizado a escala analítica en el laboratorio. El rendimiento aumentaría al
escalar el proceso a planta piloto debido a que la cantidad de lactulosa disponible con respecto a la
cantidad de quitosano que se encuentra en la celda de impregnación sería más favorable,
conduciendo a apropiadas concentraciones para su futura aplicación en la industria alimentaria.
Tabla 5. Rendimientos de impregnación y condiciones de operación, en los scaffolds de quitosano.
Tiempo
(min)
Modo de
trabajo
Flujo (bar/min)
despresurización
Rendimiento de
impregnación (%)
60
Estático
1
0.40
180
Estático
0.6
1.45
60
Dinámico
(1.2 g/ min)
3
0.65
Tabla 6. Rendimientos de impregnación y condiciones de operación, en las microesferas de quitosano.
Tiempo
(min)
Modo de
trabajo
Flujo (bar/min)
despresurización
Rendimiento de
impregnación (%)
60
Estático
1
0.50
60 (x 3 ciclos)
Estático
1 (x 3 ciclos)
0.65
60
Dinámico
(1.2 g/ min)
3
1.90
36
Resultados y Discusión
En el presente trabajo se observa que, a igual tiempo de contacto (60 minutos), los experimentos
realizados en modo dinámico conducen a un mayor rendimiento de impregnación que sus
correspondientes en modo estático. Por otro lado, como sería de esperar, un aumento del tiempo de
la impregnación, se correlaciona con un aumento en el porcentaje de lactulosa impregnada en la
matriz polimérica. Según Duarte y colaboradores, la cantidad de aditivo impregnado se puede ajustar
en cierta medida hasta los valores deseados al cambiar el tiempo de contacto de la impregnación
(Duarte y col., 2009). En cuanto a los ciclos de impregnación realizados en las microesferas de
quitosano, no se observo un gran aumento en el rendimiento al triplicar el proceso. Sin embargo, si
que se observaron diferencias en cuanto al aspecto de la muestra obtenida tras el segundo y tercer
ciclo, a partir de los cuales se observo un cierto pardeamiento de algunas de las microesferas, lo que
podría indicarnos que se ha producido algún tipo de interacción. Del análisis por cromatografía de
gases de las microesferas pardeadas, se dedujo que en ellas se depositaba mucha mayor cantidad de
lactulosa que en las que no se observaba tal pardeamiento.
Por tanto, de los resultados obtenidos en este trabajo, se puede concluir que el mayor rendimiento
de impregnación se consigue trabajando en modo dinámico y con largos tiempos de contacto. Esta
diferencia con el mayor rendimiento obtenido en el proceso en modo estático en los experimentos
realizados por el grupo de investigación anteriormente mencionado, dirigido por el doctor Herminio
de Sousa, podría explicarse debido a que el mecanismo que controla el proceso de impregnación es
diferente. De acuerdo con sus resultados, el principal mecanismo de impregnación estudiado es por
interacción química (Duarte y col., 2009), sin embargo, para el caso concreto presentado en este
trabajo se ha evaluado fundamentalmente el mecanismo de impregnación por depósito.
Por otro lado, los resultados que aquí se presentan muestran que las microesferas secadas con SCCO2 son más adecuadas para su utilización en la tecnología de impregnación con fluidos
supercríticos, comparados con los scaffolds de quitosano secados por liofilización. En esta forma de
37
Resultados y Discusión
preparación del quitosano (como microesferas) y utilizando la tecnología de fluidos supercríticos
como forma de secado, los grupos amino libres del quitosano se encuentran más expuestos y con
mayor accesibilidad, siendo, por tanto, más reactivos y por ende más fácil su interacción con los
grupos carbonilo de los azúcares reductores (Zarzycki y col., 2009; Valentin y col., 2007).
3.3. CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO QUITOSANO - LACTULOSA
Una vez obtenido el quitosano impregnado con lactulosa es necesaria su caracterización de modo
que nos permita establecer en un futuro, una relación entre su estructura y sus propiedades
funcionales. Por otro lado, esta caracterización, nos puede ayudar a complementar los resultados
obtenidos mediante el análisis por cromatografía de gases. Para ello, se han utilizado las técnicas de
Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR) y Microscopía Electrónica de
Barrido (SEM). En el caso concreto de la FT-IR, dicha caracterización se utiliza además como paso
inicial del estudio del rendimiento del proceso de impregnación por el mecanismo de interacción.
3.3.1. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FT-IR)
En las Figuras 24 y 25 se muestran los espectros de infrarrojo obtenidos para los scaffolds y
microesferas de quitosano impregnados con lactulosa, en comparación con los espectros resultantes
del quitosano de partida.
38
Resultados y Discusión
Figura 24. Comparación de los espectros de IR de los scaffolds de quitosano antes (negro) y después (verde)
del proceso de impregnación.
Figura 25. Comparación de los espectros de IR de microesferas de quitosano antes (negro) y después (verde)
del proceso de impregnación.
39
Resultados y Discusión
De los espectros obtenidos para las matrices de quitosano impregnadas con lactulosa se puede
deducir la formación de bases de Schiff., cuya banda de absorción característica se sitúa a un número
de onda en torno a 1630, como resultado de las posibles interacciones entre el grupo carbonilo de la
lactulosa y el grupo amino del polímero. Dicha banda será más evidente a medida que se aumente la
dosis de carga de lactulosa.
Por otra parte, el grado de desacetilación calculado a partir de la relación entre las bandas de
absorción a 1320 cm-1 y 1420 cm-1 (ecuación [1]), para el caso de los quitosanos impregnados, dio un
valor más bajo al de sus correspondientes matrices de quitosano de partida. Estos datos nos indican
que el porcentaje de los grupos amino libres presentes en la muestra ha disminuido y por tanto, se
puede estar produciendo algún tipo de reacción.
3.3.2. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)
En cuanto a las micrografías obtenidas mediante Microscopia Electrónica de Barrido de las matrices
de quitosano después de la impregnación (Figura 26), no se observan diferencias significativas con
las micrografías del quitosano de partida.
Figura 26. Micrografías SEM de scaffolds y microesfereas de quitosano después de la impregnación (800x).
Por tanto, el análisis SEM realizado nos indica que la lactulosa no se deposita en la superficie de la
matriz, siendo posible que se encuentre en la mayor parte del scaffold, entre las láminas del
quitosano, o en el interior de la estructura de las microesferas.
40
Conclusiones y Perspectivas de Futuro
4. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO
La conclusión más importante que se puede obtener de este trabajo de investigación es que en las
condiciones experimentales utilizadas se ha logrado la impregnación de quitosano con lactulosa. Por
tanto, los resultados presentados apoyan la potencialidad de la impregnación empleando fluidos
supercríticos y su posible uso en la industria alimentaria. De esta manera, una amplia caracterización
del quitosano a través de las diversas técnicas disponible a tal efecto, permitirá conocer de una forma
más completa la estructura y propiedades biológicas de las matrices de quitosano antes y después de
la impregnación con carbohidratos prebióticos, con el fin último de que puedan ser empleados con
éxito como ingredientes alimentarios con propiedades funcionales específicas.
Los ensayos realizados se pueden utilizar como punto de partida para abordar el estudio de la
impregnación de quitosano con otros carbohidratos prebióticos como la lactosa, la tagatosa, y la
galactosa, de los que se tienen datos de su solubilidad en los fluidos supercríticos, o bien la
impregnación de quitosano procesado de otras formas, como en membranas, películas y fibras. Para
obtener un elevado rendimiento de impregnación, se podría pensar en realizar un estudio de la
cinética de impregnación, así como el escalado del proceso del laboratorio a planta piloto.
En definitiva, mediante este novedoso proceso de impregnación se ha corroborado las posibilidades
del empleo de los fluidos supercríticos como técnica medioambientalmente limpia para obtener
compuestos con potencial actividad funcional. Sin embargo, es necesario continuar la investigación
para desarrollar un procedimiento óptimo de formación de complejos glicosilados de quitosano, los
cuales constituyen una interesante vía de investigación con un prometedor futuro para la industria
alimentaria. Como resultado de estas investigaciones, los subproductos y excedentes de la industria
pesquera se podrían convertir en un material muy valioso, que daría lugar por un lado a una fuente
de riqueza, y por otro a la eliminación de un problema ecológico.
41
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