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Química Orgánica II
Ácidos Nucleicos
Trabajo Práctico de Laboratorio 6
Tema: Ácidos Nucleicos
Los nucleótidos se unen entre sí en el ADN y el ARN
por enlaces éster fosfato entre el componente de fosfato de
un nucleótido y el componente de azúcar del nucleótido
siguiente. Las bases nitrogenadas que constituyen parte del
ADN son: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T).
O
N
N
CH2 O
N
Una característica importante de las bases
nitrogenadas es su carácter aromático. Ello les confiere la
capacidad de absorber luz en la zona ultravioleta del
espectro en torno a los 260 nm, lo cual puede aprovecharse H2C
para determinar el coeficiente de extinción del ADN y
calcular la concentración de los ácidos nucleicos.
N
O
O
O
O P
O
NH2
NH2
R
O
P
O
O O
Otra de sus características es que presentan
tautomería o isomería de grupos funcionales. En las bases
nitrogenadas se dan dos tipos de tautomerías: tautomería
lactama-lactima, donde el hidrógeno migra del nitrógeno al
oxígeno del grupo oxo (forma lactama) y viceversa (forma
lactima), y tautomería imina-amina primaria, donde el
hidrógeno puede estar formando el grupo amina (forma
amina primaria) o migrar al nitrógeno adyacente (forma
imina). La adenina sólo puede presentar tautomería aminaimina, la timina y el uracilo muestran tautomería doble
lactama-lactima, y la guanina y citosina pueden presentar
ambas.
NH
O
N
O
R
R1
O
HN
-
CH2 O
O
N
R
O
O P
O-
NH2
N
N
O
CH2
N
O
O
O P O
O
N
R
-
R= H/OH
R1=H/CH3
Fig. 1. Representación de la
estructura covalente de los ácidos
nucleicos.
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Ácidos Nucleicos
NH2
NH
N
N
N
H
N
N
H
O
N
H
HN
N
H
N
H
H2 N
N
N
H
HN
OH
HO
N
H
N
H
N
HN
N
H
N
N
O
N
O
OH
N
N
OH
HN
N
OH
N
HN
O
N
H
HO
N
O
N
N
HO
N
H
O
HN
HN
N
HN
O
NH
NH2
NH
N
H2 N
N
H
N
NH2
O
N
HN
N
HO
N
Fig 2. Formas tautoméricas predominantes
Por otro lado, y aunque se trate de moléculas no polares, las bases nitrogenadas
presentan suficiente carácter polar como para establecer puentes de hidrógeno, ya que
tienen átomos electronegativos (nitrógeno y oxígeno) que presentan carga parcial negativa,
y átomos de hidrógeno con carga parcial positiva, de manera que se forman dipolos que
permiten que se formen estos enlaces débiles. Estos puentes se forman respetando una
estricta complementariedad: A sólo se aparea con T mediante dos puentes de hidrógeno, y G
sólo con C mediante 3 puentes de hidrógeno. Dado que en el ARN no existe T, la
complementariedad se establece entre A y U mediante dos puentes de hidrógeno. La
complementariedad de las bases es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes
implicaciones debido a que permite procesos como la replicación del ADN,
la transcripción de ADN a ARN y la traducción del ARN en proteínas.
El modelo de estructura en doble hélice del ADN fue propuesto en 1953 por James
Watson y Francis Crick en su artículo denominado “Molecular Structure of Nucleic Acids: A
Structure for Deoxyribose Nucleic Acid” que fue publicado el 25 de abril de 1953 en la revista
Nature. Esta labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, que
compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedió por sus descubrimientos en relación
con la estructura molecular de los ácidos nucleicos y su significación para la transmisión de la
información en la materia viva.
En rigor, Chargaff en 1940 fue quien descubrió que, en el ADN, las proporciones de
purinas eran idénticas a las de pirimidinas, la "equimolecularidad" de las bases ([A]=[T],
[G]=[C]); con esta información y junto con los datos de difracción de rayos X proporcionados
por Rosalind Franklin fue que trabajaron Watson y Crick propusieron para proponer el modelo
de la doble hélice de ADN.
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Ácidos Nucleicos
H2N
O
NH
NH2
N
N
N
N
O
N
N
HN
N
N
N
N
H2N
O
O
T=A
GΞC
Fig. 3. Apareamientos de bases nitrogenadas a pH 7
A valores de pH extremos las bases nitrogenadas se protonan o se ionizan perdiendo la
posibilidad de aparearse mediante la misma cantidad de interacciones puente de hidrógeno
que lo hacen normalmente a pH fisiológico.
O
NH
H2N
N
NH
N
HN
O
NH2
N
N
N
HN
N
N
N
O
O
H2N
NH2
O
N
N
Apareamientos a pH 3
O
H2N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
O
OH
N
H2N
Apareamientos a pH 11
Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5’-P (fosfato) y 3’–
OH (hidroxilo) en la desoxirribosa. Las dos cadenas se disponen en direcciones inversas
antiparalelas.
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Ácidos Nucleicos
El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos sólo se han
observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformación que adopta el ADN
depende de su secuencia, la cantidad y dirección de superenrollamiento que presenta, la
presencia de modificaciones químicas en las bases y las condiciones de la solución, tales como
la concentración de iones de metales y poliaminas. Estructuralmente las diferencias están
basadas en las conformaciones del anillo del azúcar y del enlace N-glicosídico. De las tres
conformaciones, la forma "B" es la más común en las condiciones existentes en las células. La
forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, más amplia que la "B", con una hendidura
menor superficial y más amplia, y una hendidura mayor más estrecha y profunda.
Fig. 4. Estructura secundaria del ADN B
La forma "A" ocurre en condiciones no fisiológicas en formas deshidratadas de ADN,
mientras que en la célula puede producirse en apareamientos híbridos de hebras ADN-ARN,
además de en complejos enzima-ADN. Los segmentos de ADN en los que las bases han sido
modificadas por metilación pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la
forma "Z". En este caso, las hebras giran hacia la izquierda, lo opuesto a la forma "B" más
frecuente. Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por proteínas específicas
que se unen a ADN-Z y posiblemente estén implicadas en la regulación
de la transcripción.
Posibles conformaciones de la ribosa y/o desoxirribosa: el
azúcar puede presentar forma de “sobre” o forma E de "Enveloppe"
cuando uno de los carbonos queda por fuera del plano, o forma de
“media silla” o forma T de "Twist" cuando dos de los carbonos quedan
por fuera del plano y en lados opuestos. Además, para cada uno de
estos carbonos la conformación puede ser "endo", si el carbono está
dirigido hacia donde lo está el carbono 5', o "exo", si está dirigido hacia
el lado opuesto. Los únicos carbonos que pueden dar lugar a estos
plegamientos son los carbonos 2' y 3'.
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En el caso del enlace N-glicosídico puede aparecer la conformación "anti" si la parte más
voluminosa de la base queda alejada del azúcar, o la conformación "syn" si el plano de la base
nitrogenada está dirigido hacia el azúcar. La conformación "anti" es más estable que la
conformación "syn".
NH2
NH2
NH2
NH2
N
N
N
N
N
N
N
N
HO
HO
H
H
H
H
OH
R
Sym
H
H
H
H
OH
O
O
H
O
HO
HO
O
O
H
N
N
N
O
N
H
OH
R
H
H
H
Sym
H
H
OH
H
H
Anti
Anti
Fig. 5. Conformaciones del enlace N-glicosídico en Adenosina y Citosina
En el ADN-B la conformación que adopta el azúcar es E C2'-endo y anti para el enlace Nglucosídico de todas las bases.
El ADN A es una doble hélice dextrógira, con un surco menor poco profundo y un poco
más amplio que el surco mayor, que es más profundo. En comparación a la doble hélice del
ADN-B, ésta es más abierta, tiene mayor diámetro y una disposición de las bases nitrogenadas
más alejada del eje de la hélice. Las bases nitrogenadas están muy inclinadas respecto de la
horizontal, más próximas entre sí y localizadas
más simétricamente respecto al centro. La
conformación que adopta el azúcar es E C3'-endo
y anti para el enlace N-glucosídico de todas las
bases.
El ADN Z es una doble hélice levógira, con
un surco menor estrecho y profundo y un surco
mayor imperceptible. En comparación ADN-B, la
doble hélice tiene menor diámetro y es más larga,
la unidad estructural son dos pares de bases. Las
bases están muy poco inclinadas respectoa la
normal (9º). La conformación del azúcar es E C2'endo para las pirimidinas E C3'-endo para las
purinas, mientras que el enlace glicosídico es anti
para pirimidinas y syn para purinas.
A
B
Z
Fig. 6. Comparación de las estructuras de ADN A, B y Z
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Ácidos Nucleicos
Propiedades químicas de los ácidos nucleicos
En medio ácido
suave
es
posible
obtener los ácidos
apurínicos a partir de
ADN de acuerdo a la
siguiente
reacción
general:
O
O
NH
NH
N
O
N
O
O
O
H
H
O
O
H
H
H
N
N
O
O-
P
N
N
O
A través del
análisis del mecanismo
de reacción es posible
racionalizar por que la
unión N-glicosídica que
se
hidroliza
corresponde a las bases
púricas y porqué sólo
se hidrolizan
las
mismas de muestras de
ADN y no de ARN en
estas condiciones.
O
NH2
H
O
H
H
O
H
P
H
O-
O
OH
O
H
O
H
H
O
H
P
O
NH2
H+
H
N
O-
N
H
suave
O
O
NH2
H
H
O
H
P
H
N
O-
N
O
O
O
O
O
H
H
O
H
O
H
O
H
H
N
NH
O
O-
P
N
O
N
NH2
H
H
O
H
H
O-
P
O
OH
O
O
H
H
O
H
O
P
H
H
H
O
O-
H
H
O
H
H
O-
P
O
O
Análisis del mecanismo de hidrólisis en medio ácido sobre 2`desoxinucleósidos
¿Cuál es el N más básico de una base púrica?
H
NH2
La posición de protonación se justifica por la posibilidad de plantear
estructuras contribuyentes al híbrido de resonancia del ácido conjugado que
explican que aún tratándose de un átomo de nitrogéno sp2 resulta más
básico que la amina primaria, que en este caso sustituye en la posición 6 y
que aparentemente presenta hibridación sp3.
N
N
H
N
N
HO
H
O
H
H
OH
R
H
NH2
NH2
N
N
N
N
HO
N
N
N
N
HO
H
O
H
O
H
H
OH
R
H
H
H
H
OH
R
H
H
Acido conjugado de adenosina
H
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Ácidos Nucleicos
Habiendo definido la posición más básica es posible plantear el mecanismo de
hidrólisis ácida de nucleósidos púricos sobre estructuras en conformación sym.
La proximidad espacial del oxígeno anular de la desoxirribosa con el nitrógeno
protonado de la posición 3 de la base púrica que se encuentra en conformación sym justifica el
planteo de un mecanismo de hidrólisis de nucleósidos con protonación de oxígeno anular que
implica la ruptura del enlace entre el carbono anomérico y el oxígeno anular en la etapa lenta
de la reacción.
NH2+
NH2
NH2
N
N
N
N
N
N
HO
N
N
HO
N
N
H
O
HO
OH
H
H
OH
R
H
H
N
N
OH
H
H
OH
R
H
H
H
H
OH
R
H
H
O
H
H
NH2
NH2
N
N
N
N
N
H
N
HO
HO
OH
O
H
H
OH
H
H
(H, OH)
H
H
H
OH
R
N
N
HO
OH
O
H
H
OH
R
H
O
H
H
R
Así mismo a la luz de este mecanismo es posible justificar la mayor labilidad del enlace
N-glicosídico en nucleósidos de 2´-desoxirribosa y de ribosa.
La etapa determinante de la velocidad de reacción es la protonación del oxigeno
anular y su consecuente ruptura del enlace sigma con el carbono anomerico.
Debido a que la basicidad del oxigeno anular en los 2´-desoxirribonucleosidos se ve aumentada
por la ausencia del efecto inductivo del OH en posición 2´ , se favorecería la protonación del
oxigeno anular comparada con los ribonucleosidos.
Complementariamente a lo discutido en párrafos anteriores el ARN es más lábil en
medio básico que el ADN, obteniéndose como producto de su hidrólisis una mezcla de
nucleósidos monofosforilados en las posiciones 2´y 3´. Este comportamiento experimental
puede racionalizarse a través del siguiente mecanismo de reacción:
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Ácidos Nucleicos
N
NH
O
N
CH2 O
N
NH2
O
O
N
O
NH2
NH
H2C
N
OH
N
NH2
N
CH2
O
O
O
N
OH NH2
O
O P O O
O
N
O
O
H2 C
O-
O P
OO
CH2
N
O
O
O
NH2
N
P
N
O
O
O-
O
O
OH O
HN
O-
CH2 O
O
N
OH
O
O P
HO-
O
-
N
O
O
N
O-
CH2
O
NH2
O
N
P
O
O
O
O
O
O
P
O-
HO
N
O-
N
O
N
N
O
O
NH2
N
CH2
O
O
O
CH2
O
O-
NH2
P
O-
N
HO
N
N
N
CH2 O
N
OH
O
O P O-
O-
O
O P
O
O
O
-
P
O
O
O-
-
HO
N
OH
O
CH2 O
O
O P O
O
OH
N
N
OH
CH2O
N
HOH
O
O
P OO-
NH2
N
HN
NH
N
NH2
O
O
NH2
NH2
N
HN
HN
O
N
O
CH2
O
O P
OO
N
CH2 O
N
H
O
O P
NH
OH
HO
CH2 O
O
N
HO
CH2O
O
OH
O
O P O
O
O
N
OH
P OO-
N
N
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Ácidos Nucleicos
Extracción y caracterización de los constituyentes de los ácidos nucleicos
Objetivos: Caracterizar químicamente los componentes de ácidos nucleicos extraídos a
partir de tejido vegetal
Materiales
Buffer de Lisis celular: 40mL de agua, 5 mL de Detergente, 1 cucharadita de NaCl
Material Vegetal: ½ banana
Agente precipitante: Etanol al 96% bien frío
Desarrollo de la técnica:
Colocar el material vegetal en el tubo falcon, luego agregue el buffer de lisis celular y
homogenizar con varilla de vidrio. Colocar el tubo con el material homogenizado en
centrifuga durante 10 min. a 5000 rpm. Filtrar el sobrenadante con un algodón y embudo,
colectarlo en un nuevo tubo falcon. Sobre éste último agregue el etanol frío en una
proporción 2:1 (etanol:filtrado). Espere unos segundos y comenzará a ver como se precipita
el ADN en el alcohol, el ADN tiene una apariencia de mucus blanco y fibroso. Dejar reposar
unos minutos, y centrifugar 10 min. a 5000 rpm. Luego de este último proceso descarte el
sobrenadante con la ayuda de una varilla de vidrio. Resuspender el pellet obtenido en 10 mL
de agua a fin de comenzar a trabajar sobre ésta macromolécula (ADN).
CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS COMPONENTES ESTRUCTURALES DEL ADN
HIDROLISIS ÁCIDA DE ADN
Coloque el ADN obtenido en un erlenmeyer, agregarle 30 ml de H2SO4 al 10% y calentar
a baño maría durante 30 minutos. En caso de excesiva evaporación agregar agua destilada.
Reconocimiento de azúcares. Reacción de Molisch.
A 5 ml de la solución anterior, agregar 4 gotas de solución de α-naftol, agitar y añadir
por las paredes del tubo 3 ml de H2 SO4 concentrado. Observar los resultados.
Caracterización de fosfatos:
Colocar 3 ml de la solución en un tubo de ensayo y alcalinizar con NH4OH. Acidificar con
HNO3 concentrado y agregar luego, 3 ml de molibdato de amonio al 30%. Calentar y observar
los resultados.
Caracterización de bases púricas:
A 3 ml de la solución agregarle NH4OH hasta la reacción alcalina y luego, gota a gota,
solución de AgNO3 al 10 %. Observar los resultados.