laboratorio nº 3 enzimología

UNIVERSIDAD MAYOR
Facultad de Medicina
Escuela de Enfermería
Bioquímica
LABORATORIO Nº 3
ENZIMOLOGÍA
I. - INTRODUCCIÓN
A) ESPECTROFOTOMETRIA:
Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría de
absorción, como la medida de la atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una
radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro
del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos
amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación
ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por encima de los
800 nm.
La energía de una onda electromagnética está dada por la ecuación: E = hν, donde h es la constante de
Planck y v es el número de onda (el recíproco de la longitud de onda λ).
La energía de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones π y electrones no enlazantes desde su
estado basal a un nivel energético mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molécula
que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este
tipo de electrones se encuentran en moléculas conjugadas (moléculas que poseen dobles enlaces
separados por un enlace simple). La conjugación aumenta la longitud de onda de la absorción al disminuir
la diferencia energética entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado
absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto número de enlaces
conjugados, como el β-caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la
absorción de luz se denomina cromóforo.
Si una luz blanca pasa a través de una solución que contiene compuestos que actúan como cromóforos,
ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solución se debe a la
luz transmitida.
La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser
utilizada para su identificación y cuantificación, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de
absorción característico, por lo tanto la comparación del espectro de este compuesto puro con los
espectros de compuestos conocidos permitirá su identificación.
Leyes de la absorción de energía radiante
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es
absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de
afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo
luminoso recorre a través de la solución.
La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la
sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión
matemática para esta ley es:
A=εlc
Donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante
para cada sustancia a cada longitud de onda λ. Cuando la concentración, c, es expresada en moles por
litro se denomina “coeficiente de extinción molar” y cuando es expresada en gramos por litro
“coeficiente de extinción específico”. El término “l” representa el espesor de la capa absorbente y está
en unidades de cm.
AUTORES: Alejandra Moreno O., Maribel Arnes S.
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Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas
estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son
reproducibles, el término “l” de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que ε, es
también constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces
que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración:
A=kc
(k = ε l).
La absorbancia es adimensional, presenta valores entre 0 y 2 unidades de absorbancia o densidad
óptica, dentro de cuyo rango generalmente se cumple la Ley de Lambert - Beer
Características de un espectrofotómetro
La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro:
Estos equipos contienen los siguientes componentes básicos:
Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector
de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio
define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un
diámetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida después de su paso
por la celda es cuantificada por un detector.
Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de
transmitancia (%T). La relación entre ambos es:
A
=
2 - log % T
La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la
relación existente entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.
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%
Transmitancia
100
80
60
40
20
concentración (g/l)
Absorbancia
concentración (g/l)
La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se
desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa
longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de
las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los
componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la
absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se
calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión.
Curvas de calibración
Una curva de calibración relaciona las A ó %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los
trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea
posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de
concentraciones que se van a encontrar en la práctica.
La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento
fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin
embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe
expresar el resultado final.
Ejemplo: curva de la Hemoglobina.
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B) ENZIMAS:
La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus
propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas
reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas
biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas.
¿Qué es catálisis? ¿Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción
química simple:
A +
B
⇔
C + D
Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que
sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo a la misma
velocidad. Esto es lo que conocemos como equilibrio químico y podemos expresar su constante de
equilibrio:
Keq =
[C ] [D ]
[A] [B ]
Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la
que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio.
Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy
pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar.
La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la
teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de
moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas
chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra
suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para
formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se
requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos
representar mediante:
B*
A
C
Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera:
B*
Donde B* es el estado
de transición
A
C
En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de
manera que la energía de activación requerida sea menor:
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B*
E ACTIVACIÓN
A
Donde ES es la unión de
la enzima con el sustrato
ES
C
Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato.
El cambio de Energía libre ó ΔG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el
estado inicial (sustrato) y el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de
energía libre es la distancia entre el estado energético del sustrato y la del producto. Note que, con o
sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos y el ΔG es el mismo, por lo que la
termodinámica de la reacción no ha cambiado.
La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado
(o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de
Bioquímíca ha definido la unidad de enzima como: “la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de 1 μmol (micro mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas”
En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo
enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento
lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la
cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que
se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de
enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas.
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La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la
zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la
reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas
es denominada análisis de la curva de progreso.
Existen distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática, entre otros:
a) Concentración de enzima
b) Concentración sustrato
c) Temperatura
d) pH
e) Inhibidores
Efecto de la Concentración de enzima:
Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distinta
concentraciones de ésta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo los
otros factores ambientales constantes (temperatura y pH), se establece que la actividad enzimática
es directamente proporcional a la concentración de la enzima.
Efecto de la Concentración de Sustrato y velocidad de la reacción:
La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de
Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de
sustrato:
k1
E
+
S
k3
ES
E +
P
k2
Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k3 es insignificante y que lo
importante son los valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial, la cantidad de P es
ES, es también despreciable. Las
despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa, E + P
constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante:
Km =
k2 + k3
k1
Donde k1, k2 y k3 son constantes de velocidad
La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación:
V =
[S ] V max
[S ] + Km
Donde
V = velocidad de la reacción
Vmax = velocidad máxima
[S] = concentración de sustrato
Km= constante de Michaelis-Menten
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Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de una
enzima, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es
inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km,
indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad.
La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su
sustrato. Al graficar V / [S] se tendrá:
Gráfico de Velocidad de Reacción versus Concentración de sustrato
De este gráfico se desprende que la Km corresponde a la concentración de sustrato a la que se obtiene
la mitad de la velocidad máxima.
Se pueden distinguir dos fases en la reacción.
•
•
Una primera fase, en que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la
concentración de sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas concentraciones
de sustrato, por lo que la enzima no está saturada de sustrato, de manera que si
aumentamos la concentración de sustrato, la velocidad aumenta.
En la segunda fase, la velocidad de la reacción se vuelve independiente de la concentración
de sustrato, es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por el
sustrato, de manera que aunque aumentemos la concentración de sustrato, la velocidad se
mantiene constante.
Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. Como no es una
representación lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk, proponen
un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la concentración de sustrato
(1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico:
AUTORES: Alejandra Moreno O., Maribel Arnes S.
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A este gráfico, también se le conoce como de Dobles Recíprocos.
Efecto de la temperatura en la Actividad Enzimática
En la mayoría de las reacciones químicas, un aumento de temperatura causa aumento en la
velocidad de la reacción, y por ende el número de colisiones efectivas entre las moléculas dado que
aumenta la energía cinética de las moléculas participantes de la reacción. Sin embargo, en el caso de
las enzimas, hay que considerar su naturaleza proteica, ya que se sabe que un aumento de temperatura
produce desnaturalización de las proteínas, lo que se ve traducido en un brusco descenso de la
actividad enzimática.
Para cada enzima hay una temperatura óptima. Para la mayoría de las enzimas de los
mamíferos, es de 37 ºC. Para algunas enzimas microbianas, en particular para las bacterias termófilas,
la temperatura óptima puede ser superior a los 65ºC.
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Efecto del pH en la Actividad Enzimática
Al igual que en el caso de la temperatura, las enzimas poseen un pH o un rango de pH óptimo, en
el que su actividad es máxima. Valores mayores o menores a este rango de pH provocan disminución de
la actividad. Esto se explica por el hecho de que algunos radicales de los aminoácidos cambian su
polaridad a distinto pH, cambiando la conformación de la proteína y de esta manera podemos afectar
sitios que son críticos para la actividad enzimática.
El pH óptimo de la actividad de una enzima, refleja, generalmente, el ambiente celular en el
cuál se encuentra la enzima. Por ejemplo, la Pepsina que hidroliza algunos enlaces peptídicos de
proteínas durante la digestión estomacal, tiene un pH óptimo cercano a 1,6 (el rango de pH estomacal
fluctúa entre 1 y 2). Por otra parte, la Glucosa - 6 - fosfatasa del hepatocito, tiene un pH óptimo
cercano a 7,8 (el pH intracelular del hepatocito es cercano a 7,2).
II.- OBJETIVOS
- Aprender a usar correctamente el espectrofotómetro
- Conocer y aplicar los principios básicos de la espectrofotometría
- Construir una curva de calibración
- Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la Invertasa.
III.- PARTE EXPERIMENTAL
PRIMERA PARTE: CURVA DE CALIBRACIÓN
1. Material de estudio
Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan
la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la
sacarosa, la llamó Ferment inversif. Más recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa,
sacarasa y O-fructofuranosidasa.
El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos, glucosa y fructosa.
En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en
detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor
de los productos.
AUTORES: Alejandra Moreno O., Maribel Arnes S.
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2. Curva de Calibración (ó Curva Estándar)
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
TUBOS
Reactivos
Glucosa y Fructosa
0,05 M
Sacarosa 0,6 M
H2O destilada
3,5-DNS
1
2
3
4
5
6
Blanco
Patrón 1
Patrón 2
Patrón 3
Patrón 4
Patrón 5
-
0,2 mL
0,4 mL
0,8 mL
1,2 mL
1,5 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
2,0 mL
1,8 mL
1,6 mL
1,2 mL
0,8 mL
0,5 ml
2,0 mL
2,0 mL
2,0 mL
2,0 mL
2,0 mL
2,0 mL
2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC.
3) Enfríe los tubos.
4) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de
onda
Para el uso del espectrofotómetro siga las siguientes instrucciones:
l. Encendido de lámparas:
1.1.- Lámpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido instantáneo
1.2.- Lámpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nm aprox), encienda el equipo 30 min antes
de usarlo
2. Oprima la tecla MODE para accionar el modo absorbancia, A
3. Ajuste la longitud de onda utilizando las flechas arriba o abajo.
4. Vierta una pequeña porción del blanco (Tubo de ensayo N°1) en una celda o cubeta
5. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras
6. Oprima la tecla 100 %T para llevar a cero absorbancia
7. Saque el blanco y devuelva el líquido al tubo de ensayo.
8. Sacuda la cubeta sobre papel absorbente y vierta una pequeña porción del siguiente tubo de
ensayo
9. Inserte la muestra a medir en el portaceldas, cierre la puerta del compartimiento.
10. Lea la medición de absorbancia en la pantalla.
11. Repita el procedimiento desde el punto 7
Importante: las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1 cm de espesor) deben estar
escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es
conveniente secarlas con papel corriente por el carácter abrasivo de éste sino con un papel
suave.
AUTORES: Alejandra Moreno O., Maribel Arnes S.
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5) Anote las lecturas en la siguiente tabla:
CURVA DE CALIBRACIÓN
Blanco
Patrón 1
Patrón 2
Patrón 3
Patrón 4
Patrón 5
0,0
10
20
40
60
75
Producto (μmol)
de Glucosa y Fructosa
Absorbancia
6) Realice un gráfico (curva de calibración), Absorbancia versus concentración de producto
SEGUNDA PARTE: EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
Procedimiento:
1) Desarrolle el siguiente protocolo:
TUBOS
Reactivos
Buffer Acetato 0,1 M
pH 4,7
Sacarosa
0,6 M
Invertasa
Temperatura de
Incubación (5 minutos)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
1
1b
2
2b
3
3b
1 mL
2 mL
1 mL
2 mL
1 mL
2 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
-
1 mL
-
1 mL
-
3ºC
Ambiente
99ºC
Registre la temperatura ambiente con un termómetro.
Adicione 2 mL de 3,5-DNS a cada uno de los tubos.
Desarrolle color calentando durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC.
Enfríe los tubos.
Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo
utilizando el tubo “blanco” ( tubo 1b)
Mida la absorbancia del tubo 1 y anote las lecturas en la siguiente tabla.
Repita el procedimiento 6) y 7) para las otras temperaturas
Anote las lecturas en la siguiente tabla.
1
Absorbancia
2
00000
3
00000
10) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración (práctico
N°3 primera parte) para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla:
Temperatura
3ºC
Ambiente
Producto (µmol)
11) Grafique temperatura versus Producto
12) Determine el efecto de la temperatura sobre la actividad de la Invertasa
AUTORES: Alejandra Moreno O., Maribel Arnes S.
99ºC