Laboratorio de Habilidades 3 - Cátedra de Microbiología, Virología y

Universidad Nacional de Rosario
Facultad de Ciencias Médicas
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología
Área Injuria
Laboratorio de Habilidades 3
Métodos directos (I)
Métodos directos. Inves gación de microorganismos: bacterias,
parásitos, hongos virus.
Observación en fresco macro y microscópicos. Observación por
coloración.
2016
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
Laboratorio de habilidades Nº 3
Objetivos
Al finalizar el encuentro el alumno debe ser capaz de:

ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o

Aplicar las técnicas disponibles en un laboratorio para incrementar la biomasa celular
microbiana a partir de las muestras biológicas
Comprender las distintas técnicas que posibilitan la identificación de agentes etiológicos
responsables de los procesos infecciosos.
Comprender la precisión y posibilidad de realizar las técnicas adecuadas, hoy y a futuro
próximo en el medio donde desarrolle su profesión.
gí
a

C
át
ed
Mapa conceptual
1
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
Cultivo
Sintético
Celular
Nutrientes
Virus
Sólidos
Líquidos
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
Enriquecidos
Diferenciales
Selectivos:
- pH
- Atmósfera
- Temperatura
- Humedad
- Tiempo de incubación
Siembra y aislamiento
Bacterias
Hongos
UFC
1.
Cultivo: Aislamiento del agente etiológico
Bacteriología
Para su desarrollo todo microorganismo necesita:
A. Requerimientos nutricionales
a) Nutrientes
Medios de cultivo
Un medio de cultivo debe poseer los nutrientes necesarios que permitan la multiplicación de
bacterias u hongos. Una de las ventajas del cultivo es que permite aislar las bacterias
presentes en la muestra clínica y aumentar la biomasa celular (incluso cuando por su escasez
no pueden observarse por microscopía). Además permite comenzar a identificarlas y luego
también hacer las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (PSA).
Los microorganismos no sólo necesitan nutrientes (fuente de carbono, nitrógeno e hidrógeno)
sino que deben estar a un pH, temperatura, atmósfera, humedad ambiente y tiempo óptimo
para la multiplicación de los microorganismos.
ed
Los medios de cultivo se pueden clasificar de distintas formas:
C
át

Por sus requerimientos nutricionales
Ej: carbono, nitrógeno, hidrógeno, factores de crecimiento (vitaminas, aminoácidos,
purinas y pirimidinas), iones inorgánicos (azufre, fósforo, potasio, magnesio, calcio, hierro,
manganeso, zinc, cobre, cobalto, selenio, molibdeno) y oxígeno.
Según el contenido nutricional clasificamos a los medios de cultivo en:
-
Simples: contienen sustancias nutritivas para el crecimiento de bacterias no exigentes
metabólicamente.
-
Enriquecidos: son medios básicos con el agregado de nutrientes como por ejemplo
sangre humana, de carnero, etc., permitiendo el desarrollo de bacterias
nutricionalmente exigentes. Ej.: agar sangre, agar chocolate, caldo cerebro corazón.
Además hay medios de cultivos especiales, que nos van orientando desde su desarrollo a la
identificación de la bacterias/s.
2
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
Diferenciales: incorporan elementos que facilitan la diferenciación de las colonias
formadas por distintas bacterias de acuerdo a alguna característica metabólica, en
base a las variaciones de color de las colonias (llevan colorantes que a distintos pH
varían su color). Ej.: agar lactosa púrpura de bromocresol (diferencia aquellas
bacterias que fermentan la lactosa de las que no).
-
Selectivos: permiten el crecimiento de un determinado tipo de bacterias, inhibiendo
el crecimiento de otras. Ej. : agar manitol salado ó Chapman (separa mezcla de
bacterias que se diferencian por su crecimiento o no en NaCl 6,5%).
-
Selectivos-Diferenciales: suman las propiedades de los dos anteriores. Ej.: Agar SS
(Salmonella–Shigella), agar CLDE y agar cromogénico.
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
-
Contienen un cromógeno incoloro que cuando una enzima microbiana específica
hidroliza un determinado enlace se libera un compuesto coloreado adquiriendo las
colonias un color determinado para cada bacteria (este color varía según la marca
comercial del medio). El agar cromogénico muy útil en la visualización de una
población mixta de bacterias. En algunos casos permite diferenciar hasta género y
especie.

Por su consistencia
Líquidos: semeja un caldo casero (como el caldo de una sopa en la cocina doméstica)
filtrado y esterilizado. Contiene agua, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono,
factores de crecimiento esenciales, oligoelementos y sales minerales. Se fraccionan en
tubos o frascos-botellas estériles.
-
Sólidos: son medios líquidos a los que se le incorpora una sustancia gelificante como el
agar-agar (es un extracto de algas marinas azules). Tiene una consistencia semejante
al dulce de batata. Una vez esterilizado, al enfriarse se solidifica, luego es almacenado
hasta su uso. Cuando necesitamos el medio, éste se funde por calentamiento, se
fracciona en tubos o en placas de Petri estériles según necesidad. Al enfriar de nuevo
queda solidificado. Estos medios de cultivo están en el comercio en polvo, ya
hidratados o fraccionados en placas y microtubos.
C
át
ed
-
3
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
La mayoría de las bacterias que nos injurian desarrollan en
condiciones óptimas entre 20-40 ºC, llamándose por esta
característica bacterias mesófilas. Hay otras bacterias que se
denominan termófilas (ej: Campylobacter jejuni con temperatura
óptima de crecimiento a 42 °C), o criófilas (crecen entre 0 y 10 °C).
Los hongos crecen a 37 ºC y algunos también lo hacen a 28 ºC.
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
Para lograr la temperatura constante durante la incubación se
utilizan estufas de cultivo con termostatos.
gí
a
b) Temperatura de crecimiento
c) Potencial de hidrógeno (pH):
Generalmente tanto las bacterias como los hongos son
neutrófilas (pH óptimo de crecimiento 7). Pero hay algunas
que desarrollan mejor a pH 4 (bacterias acidófilas, ej.
Lactobacillus spp.) y otras a pH mayor que 7 (bacterias
basófilas, ej. Vibrio spp). Es por ello que los medios de
cultivo, ya sean sólidos o líquidos, deben tener su pH
ajustado y óptimo para la mayoría de las bacterias que se
quieren recuperar.
d) Atmósfera
En función de la necesidad de oxígeno se clasifican en:
-
aerobias estrictas: desarrollan en atmósfera de O2.
-
anaerobias facultativas: son aerobias pero se adaptan para crecer en atmósfera escasa
de O2 o en ausencia de él.
-
anaerobias estrictas: el O2 es letal.
-
Microaerófilas: crecen en bajas conecntraciones de O2.
ed
e) Humedad
C
át
Los microorganismos para su desarrollo requieren 90-99% de humedad en su ambiente de
desarrollo.
f) Tiempo de incubación
En la mayoría de las bacterias que injurian al ser humano puede observarse su crecimiento
entre las 24-48 hs de incubación (velocidad de generación entre 15 y 20 minutos). Algunas,
como las micobacterias, tienen una velocidad de generación muy larga y se llega a visualizar
las colonias a partir de los 20 hasta 60 días.
Los hongos recuperados de infecciones humanas tienen distintas velocidades de generación,
por lo que el desarrollo de elementos levaduriformes lo veremos a partir de las 24-48 hs.
hasta 5 días; en el caso de los dermatofitos hasta 15 días y en los hongos profundos hasta 30
días aproximadamente.
4
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
El diagnóstico presuntivo que el profesional médico coloca en la solicitud de examen es de suma importancia. Orienta al microbiólogo para que realice la toma de muestra en el momento oportuno, la conserve y transporte en forma adecuada. Luego realizará las observaciones microscópicas y utilizará los medios de cultivo, atmósfera, temperatura, pH y tiempo necesario para obtener los microorganismos de más probable desarrollo. Para continuar luego con el estudio de identificación y sensibilidad antimicrobiana. B. Siembra y aislamiento
C
át
ed
Asa: constituye un elemento básico en
microbiología para la siembra. Consta de un
mango (mango de Koler) de 20 cm, en cuyo
extremo lleva adosado un filamento de platino o
nicrom. Estos metales tienen la propiedad de
alcanzar rápidamente temperaturas altas cuando
se lo expone a la llama de un mechero y de
enfriarse de nuevo rápidamente. También las
hay en el comercio estériles descartables.
Las células bacterianas o fúngicas, tomadas con
el asa del material a estudiar, se van
Asas para siembra y aislamiento
depositando sobre la superficie del agar
seleccionado, según la muestra, cubriendo toda la placa de Petri teniendo la precaución de no
pasar por encima del trazo ó estría anterior. También se siembran en medios líquidos para
incrementar el número de células bacterianas (aquí no se obtiene aislamiento) obteniendo
mayor biomasa celular que la existente en la muestra original (enriquecimiento).
Siembra de muestra líquida a medio líquido 5
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
Siembra de muestra líquida a medio sólido C. Incubación
Una vez sembradas, las placas, deben llevarse a la estufa, en cuyo interior existe la
temperatura adecuada para el crecimiento óptimo de la mayoría de las bacterias, que es a
35-37 ºC durante 24-48 hs. Existen también microorganismos que desarrollan a 28 ºC
especialmente los hongos dimórficos termales. Para esto se debe tener otra estufa de cultivo
regulada a esa temperatura.
Atmósfera de incubación
ed
Para realizar los cultivos en aerobiosis,
basta con poner las placas en el interior de
la estufa, cuya atmósfera es igual a la del
medio ambiente. En estas condiciones
crecen las bacterias aerobias estrictas y las
anaerobias facultativas.
C
át
Algunas bacterias a pesar de ser aerobias
crecen mejor en una atmósfera de oxígeno
reducida, a ésta la logramos en forma
casera colocando las placas sembradas en
el interior de una lata de metal con un
tapón de algodón o gasa humedecido con
agua corriente (humedad 99%) y una vela
encendida. Al apagarse la vela se logra en
Incubación en aerobiosis
su interior una atmósfera reducida en
oxigeno con un 5-10% de CO2. Así se lleva a la estufa de cultivo para que esté a la
temperatura de 37 °C
6
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
gí
a
Existen en el comercio estufas de cultivo que poseen en su interior una atmósfera de CO2
provista por conexión externa.
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
Para incubar las siembras en anaerobiosis estricta, se colocan en jarras o sobres (bolsas
plásticas) que cierran herméticamente. Por una reacción química, producen H2 para atrapar
las moléculas de O2 atmosférico que hay en el interior formándose H2O, dejando así el
ambiente donde están las placas libres de O2.
D. Desarrollo
C
át
ed
Cada célula bacteriana o fúngica da lugar, durante el
tiempo de incubación, a miles de bacterias -Unidad
formadora de colonias (UFC)- que dan origen a
una colonia constituida cada una por un solo tipo de
células idénticas a las que da origen.
El tamaño de las colonias suele ser de distintos
diámetros (0,1 a 3 mm aproximadamente), visible a
simple vista.
Si el medio de cultivo sembrado es líquido, se observa enturbiamiento
del medio en todo el tubo o en un sector (fondo o superficie).
7
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
Micología
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
El cultivo en micología también se realiza en
medios artificiales. Los cultivos pueden producir
esporas que se liberan al aire y pueden inhalarse,
es por ello que los medios, salvo para casos
específicos, no se fraccionan en placas de Petri
sino habitualmente en tubos de ensayo en los
que el agar se solidifica inclinado y cuya boca
estrecha dificulta un poco la difusión de las
esporas.
Los hongos son microorganismos heterótrofos y
aerobios estrictos pudiendo ocasionalmente ser
microaerófilos que desarrollan sobre una cantidad
de sustratos merced a enzimas hidrolíticas
Los medios usuales de bacterias permiten el crecimiento de los hongos, sin embargo en
micología se utilizan medios selectivos como el Sabouraud, muy rico en glucosa y cuyo pH
bajo (5,6-7,2) dificulta el crecimiento de diversas bacterias sin inhibir a los hongos.
Para incrementar este carácter selectivo frente a las bacterias se puede añadir al medio de
Sabouraud diversos antibióticos, como cloranfenicol ó gentamicina o antifúngicos como la
cicloheximida que inhibe hongos saprofitos.
Como no se utilizan placas (para evitar la desecación del medio), se siembran varios tubos
de cada muestra por agotamiento.
Cuando se manipulan muestras probablemente contaminadas con hongos filamentosos o
cultivos de los mismos se debe manipular dentro de una cabina de seguridad
(preferentemente Clase II – tema a tratarse en Laboratorio de Habilidades N° 5) con todas las
recomendaciones que ello implica.
Los hongos levaduriformes dan lugar a colonias semejantes a las bacterianas, cremosas, pero
más opacas de 2 a 5 mm de diámetro. Los hongos filamentosos dan lugar a colonias mayores
(5-15 mm), vellosas, algodonosas o pulverulentas, de vistosos y variados colores, que deben
ser observadas en el anverso y reverso, donde puede verse si el pigmento difunde al medio.
Parasitología
C
át
ed
El cultivo en parasitología generalmente se utiliza en el ámbito experimental. En la
confirmación del diagnóstico clínico de parasitosis, en nuestro medio se intenta realizarlo con
algunos parásitos (Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, Leishmania, amebas, etc.), pero
el costo/beneficio y la complejidad en su realización no aumentan ni la sensibilidad ni la
especificidad del método, por lo que las observaciones en fresco por campo brillante y las
coloraciones siguen siendo muy eficaces.
Más adelante, en los laboratorios 5 y 6 veremos que en algunos casos se recurre a la detección
antigénica, a la detección de ácidos nucleicos (todavía no muy utilizados en la Parasitología
clínica diagnóstica) o a la detección de anticuerpos para el diagnóstico desde el laboratorio
microbiológico.
Concluyendo, las técnicas de cultivo quedan restringidas en esta especialidad a laboratorios con
alto grado de especialización (fundamentalmente en investigación básica y aplicada).
Virología
El diagnóstico por cultivo de virus tradicionalmente se ha considerado muy complejo,
laborioso y caro, debido a la imposibilidad de efectuar un examen directo por técnicas sencillas
de microscopía óptica (fresco o coloración) y el aislamiento por cultivo en medios sintéticos. El
cultivo en esta especialidad debe necesariamente efectuarse en líneas celulares. Otro
8
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
inconveniente del diagnostico virológico es que la serología requiere el empleo de técnicas de
cierta complejidad y aporta resultados a veces tardíos.
Sin embargo, esto se ha ido modificando por la aplicación de técnicas relativamente
asequibles y eficaces. La introducción progresiva de pruebas para la detección de antígenos
suplen en parte del diagnóstico efectuado por aislamiento en cultivos celulares, así como la
utilización de técnicas genéticas han incrementado las posibilidades actuales de diagnóstico.
gí
a
No obstante, el aislamiento de los virus se puede realizar por inoculación de los productos
patológicos a cultivos celulares, a embrión de pollo o a ratón lactante (estos dos últimos no
utilizados actualmente).
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
 Cultivo en líneas celulares
Las células se multiplican in vitro si encuentran las condiciones similares a las que existen in
vivo. Se requiere para ello de medios ricos en sustancias nutritivas, pH, osmolaridad, iones
inorgánicos, fuente de carbono, oxigeno y CO2. Se trabaja bajo cabina de seguridad biológica
(clase II) para evitar contaminaciones.
Las células se introducen en el frasco con todos los suplementos necesarios para su
multiplicación hasta formar una monocapa de células. Sobre ellas se inocula el material
biológico a estudiar. Las líneas celulares (HeLa, Mc Coy, etc) utilizadas para la propagación de
los virus se adquieren comercialmente. Según sean los virus que se pretenden aislar se utiliza
el tipo de células.
El material clínico a inocular debe ser tratado previamente con antimicrobianos para evitar
contaminaciones con bacterias u hongos que pudieran invalidar el cultivo celular.
Los cultivos celulares en los que existe replicación vírica sufren diversas alteraciones que
permiten detectarla. Son fácilmente observables como zonas focales de necrosis y
desprendimiento de células del tubo o frasco que se ven a simple vista. Otras veces estas
alteraciones morfológicas celulares no son tan evidentes y tienen que realizarse observándose,
en microscopio invertido. Los cultivos celulares están en desuso para microbiología clínica.
 Inoculación en animales de experimentación
Esta técnica ha sido empleada para el aislamiento de virus que no se propagan bien en
cultivos celulares. Se puede realizar en embrión de pollo de un huevo fecundado de 10 días
(gripe) (A) o por inoculación intracerebral en el ratón lactante (Coxsackie) (B)
B
C
át
ed
A
 Otros
Las técnicas de biología molecular, como las de detección de Antígenos o las de detección de
ácidos nucleicos son las que se emplean hoy en la práctica diaria, debido a su sencillez,
eficacia, especificidad, menor riesgo en la manipulación, etc., superando así a las pruebas
convencionales que someramente acabamos de describir. Algunas ya están en desuso y otras
terminarán por estarlo.
La laboriosidad y costo económico del diagnóstico virológico clásico ha hecho que ésta sea un
área donde las nuevas técnicas han encontrado un campo fértil para su aplicación.
9
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
2. Identificación de microorganismos
Introducción
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
La práctica de la microbiología clínica además de lo ya trabajado en los laboratorios anteriores
contempla: la identificación de los agentes etiológicos responsables de los procesos infecciosos,
asignándole el género y especie que corresponda a un aislamiento microbiano con el mayor
grado de certeza que le sea posible; como así también la detección de la sensibilidad a los
antimicrobianos (AMB), a fin de lograr la aplicación de una terapia eficaz; el conocimiento de las
implicancias patogénicas/patológicas y la evolución microbiológica/clínica del proceso infeccioso
en estudio.
Por lo tanto para llevar a cabo todo esto, el laboratorio de microbiología cuenta con distintos
métodos. Estos métodos pueden ser fenotípicos, es decir basados en las características
“observables” de los microorganismos (como su morfología, crecimiento, desarrollo y
características bioquímicas/metabólicas), o bien moleculares, que se basan en la detección de
antígenos (inmunológica), proteínas (proteómica), biomarcadores (metabolómica) ó genes
específicos (genómica).
Cualquiera sea el método de tipificación, este debe cumplir con tres requisitos esenciales:
 Poder de tipificación: ser capaz de catalogar cualquier aislamiento en un tipo
determinado.
 Poder discriminatorio: ser capaz de discriminar entre aislamientos no relacionados.
 Reproducibilidad: ser capaz de brindar resultados reproducibles entre diferentes
ensayos y estables para un aislamiento obtenido de diferentes orígenes.
A la hora de evaluar un método de tipificación, además de considerar estos requisitos, se
considera también la posibilidad y sencillez de realización junto con la interpretación de
resultados, ya que es fundamental para la identificación de los microorganismos, que la
metodología empleada sea “precisa y posible”.
Según cuál sea el microorganismo en cuestión (bacterias, hongos, parásitos o virus), la
metodología y necesidad de realización varían.
Métodos Fenotípicos
A. Biotipo
a) Medios de agar cromogénicos
C
át
ed
Estos medios están basados en reacciones enzimáticas que le
otorgan un determinado color a la colonia de
microorganismos sembrada en él, con lo que se puede
predecir cuál es el microorganismo crecido.
Por ejemplo, en agar cromogénico, cuando las colonias
adquieren un color morado (según marca comercial), es
posible que se trate de Escherichia coli.
En agar Chromoagar Candida (según marca comercial), el
crecimiento de una colonia de color verde, hace pensar en una probable Candida albicans.
b) Por pruebas bioquímicas o metabólicas

Pruebas convencionales
En estas pruebas metabólicas se comparan las características observables de bacterias
desconocidas con aquellas de cultivo tipo (cepas de referencia/cepas de colección). La
10
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
confiabilidad de la identificación realizada es directamente proporcional al número de
características similares encontradas. En microbiología clínica, la experiencia y asociación entre
el microorganismo, el sitio y tipo de infección es de gran ayuda en el inicio de la identificación.
El estudio se inicia con la certeza de que el aislamiento es puro. Continua en las
características “observables” de los microorganismos, como ser su morfología, desarrollo,
propiedades bioquímicas / metabólicas. En el proceso de identificación microbiana se
deben lograr un conjunto de pruebas de forma secuencial, en función del género o de la
especie bacteriana que se pretende identificar, del origen del aislamiento microbiano y de la
factibilidad de las mismas. Siempre se deben buscar características fenotípicas
estables.
Pueden establecerse 3 niveles en el camino hacia la fenotipificación microbiana, que no
necesariamente se deben alcanzar todos para completar el proceso de identificación:
I nivel: Se debe tener en cuenta la procedencia del material clínico y los datos del paciente.
Se realizan todas las pruebas rápidas y sencillas de realizar, que pongan en evidencia las
características del microorganismos en cuestión: tinción de Gram u otras tinciones para
averiguar la morfología; hemólisis en agar sangre, producción de esporas, crecimiento en
diferentes atmósferas de incubación y en varios tipos de medios de cultivos (selectivos y no
selectivos). También se realizan pruebas bioquímicas como ser las pruebas de la oxidasa o
catalasa que ponen en evidencia enzimas preformadas.
Agar sangre Catalasa Oxidasa C
át
ed
Gram II nivel: Con las pruebas realizadas en el primer nivel, se logra situar provisoriamente al
microorganismo en estudio dentro de los principales grupos de importancia médica, y a
partir de aquí, se pueden seguir realizando otras pruebas correspondientes para alcanzar el
BIOTIPO. Estas son pruebas bioquímicas/metabólicas (evaluación de una enzima
preformada, inhibición del crecimiento, vía y utilización de hidratos de carbono, etc.) que
llevaran a individualizar el posible género y especie a la que pertenece el microorganismo en
11
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
estudio. Para ello, los resultados de las pruebas se confrontan con una tabla de tipificación
microbiana, de la cual surge el género y la especie (la mayoría de las veces).
III nivel: Si la identificación no se hubiera podido completar aún, se puede emplear un
mayor número de pruebas bioquímicas secundarias, mas específicas, que permitirá
identificar con un alto grado de precisión la mayoría de las bacterias clínicamente
significativas.
gí
a
Cabe destacar que las pruebas que se utilizan para definir los distintos biotipos se seleccionan
por simplicidad de realización, interpretación, reproducibilidad y capacidad discriminatoria.

ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
Limitaciones del proceso de biotipificación
Resultados erróneos en las pruebas primarias (I nivel) pueden conducir a una identificación
equivocada.

Es laborioso y más lento que otros métodos (24- 48 hs)

En ningún caso estos métodos de identificación fenotípica pueden proporcionar una certeza
absoluta. Solamente indican cuál es el género y/o la especie y/o biotipo al que la bacteria
identificada tiene mayor probabilidad de pertenecer.
Ejemplo:
Macroescala Paneles cromogénicos comerciales
ed

Microescala Fermentación de diferentes azúcares en microescala con revelador de pH rojo fenol. Ara (arabinosa); Glu (glucosa); Galac (galactosa) y Xyl (xilosa); (+) reacción positiva; (‐) reacción negativa C
át
Existen varias marcas comerciales y modelos de paneles. Por ejemplo:
Panel cromogénico comercial con sus pruebas metabólicas reveladas El panel contiene 20 microtubos con sustratos deshidratados (cada uno correspondiente a un
tubo de la macroescala) que permiten determinar la presencia de distintos productos del
metabolismo del microorganismo en cuestión, entre 20 o más pruebas.
12
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
Se le asigna a cada tubo un número de acuerdo a la prueba bioquímica estudiada, y se llega a
un número de 7 dígitos que se vuelca en una base de datos que indica el/los microorganismos
con la probabilidad de certeza de su biotipificación.
Ficha de trabajo para asentar el resultado de las lecturas del revelado de las pruebas metabólicas del panel cromogénico y obtener a un número de código. Pueden ser utilizados para bacterias (aerobias, anaerobias, cocos Gram positivos, bacilos Gram
positivos y negativos, etc.) y hongos del género Candida.

Por sistemas automatizados
C
át
ed
Los sistemas automatizados de identificación y estudio de sensibilidad ofrecen como principal
ventaja la disminución del tiempo requerido en la obtención de los resultados; sin embargo, son
de mayor costo que los sistemas manuales convencionales que estuvimos viendo hasta ahora, y
se han descrito restricciones técnicas a su uso para determinados microorganismos y
antimicrobianos.
B. Antibiotipo
El antibiotipo es un método que se basa en el comportamiento que poseen determinados
antimicrobianos contra una determinada bacteria especifica, es decir, sirve para “chequear” el
biotipo que estamos estudiando, según el patrón de sensibilidad antimicrobiana (AMB) que
este posea. Esto significa que si, por ejemplo, sabemos que la bacteria es naturalmente
resistente a un determinado AMB, debemos encontrar este resultado en la prueba de
sensibilidad que realicemos sino puede estar equivocada la identificación (género y/o especie).
También se puede observar determinados mecanismos de resistencia que están presentes en
algunas bacterias y en otras no.
13
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
Este estudio se realiza con la misma metodología que las pruebas de sensibilidad
antimicrobiana, que observaremos en el Laboratorio n° 4 (Pruebas de sensibilidad AMB).
C. Fagotipo
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
El fagotipo es el resultado de la tipificación de un aislamiento bacteriano mediante su
sensibilidad a la lisis por bacteriófagos (virus bacterianos), dentro de una misma especie
bacteriana (ej: Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa). Los
distintos géneros y aún especies bacterianos llevan muchas moléculas en su superficie
(glicolípidos, proteínas, proteoglicanos). Los bacteriófagos entran a las bacterias en forma
género específica mediante la unión de receptores en la envoltura que pueden o no coincidir
con estas moléculas de dicha envoltura. La fagotipicación utiliza un conjunto "universal" de
bacteriófagos para miembros de un mismo subtipo de cada especie de un género bacteriano,
por lo tanto todos los laboratorios llevan a cabo la técnica con el mismo conjunto de
bacteriófagos. La utilización con fines epidemiológicos implica considerar que aislamientos
clínicos en una misma época (p. ej en un brote de una enfermedad infecciosa bacteriana)
pertenecerán al mismo fagotipo. El ensayo se realiza enfrentando a un cultivo bacteriano con
los distintos bacteriófagos y observando si los mismos pueden infectar y destruir a las bacterias
en cuyo caso se observaran zonas de lisis (traslúcidas).
C
át
ed
Esta técnica ya no se utiliza en el laboratorio clínico de rutina, pero era muy utilizada en la
década de 60-70 con propósitos epidemiológicos o de investigación, no de identificación
bacteriana. En las actualidad se utiliza conjuntamente con los métodos de serotipificación y
genotípicos de manera de aumentar la discriminación entre cepas causante de brotes.
Métodos moleculares
Estos métodos han aparecido como procedimientos alternativos complementarios a los
fenotípicos. Se pueden dividir en dos: métodos inmunológicos (detección de Ag y/o Ac) y las
“ómicas” (proteínas, biomarcadores, genes). La metodología se verá ampliada en los
laboratorios 5 y 6.
A. Serotipo – Serovariedad – Serogrupo (Métodos moleculares inmunológicos. Detección de antígenos de superficie)
En las bacterias las estructuras antigénicas son muy numerosas adquiriendo relevancia las que
se encuentran en la parte más externa de ellas: antígeno K (cápsula); antígeno H (flagelos);
14
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 3 - 2016
LPS (lipopolisacáridos); antígeno O; proteínas de la membrana externa, ácido teicoicos,
exopolímeros, etc. Estas moléculas antigénicas han permitido subclasificar bacterias de un
mismo género y/o especie. Tienen importancia a nivel epidemiológico, por ejemplo la
recuperación de Vibrio cholerae de un aislamiento de una muestra clínica serogrupo O1 u O 139
implican patogenicidad y los restantes no. Otro caso: Escherichia coli O157:H7 (serogrupo O157
y serotipo H7) asociada al síndrome urémico hemolítico.
ra
de
Fa M
cu ic
lta ro
w d d bio
w
w e C log
.m i ía
ic en , V
ro ci ir
fc as ol
m M og
un é ía
r.c di y
om cas Pa
.a U ras
r NR it
ol
o
gí
a
Así, un serotipo determinado es una subpoblación de un microorganismo infeccioso que se
diferencia de otras subpoblaciones de la misma especie por medio de un antígeno. Por ello, las
respuestas inmunitarias frente a un serotipo de un microorganismo pueden no proteger frente a
otro serotipo del mismo género y especie.
Los términos serotipo y serogrupo son usados en conjunto con números, letras o números
romanos. Ej: Escherichia coli O157 H7; Streptococcus agalactiae (beta hemolítico grupo B Ia).
Las técnicas de detección en el laboratorio de microbiología clínica se desarrollarán en el
Laboratorio de habilidades Nº 6.
B. “ÓMICAS”
Este es un neologismo proveniente del inglés que en biología molecular se utiliza como sufijo
para referirse al estudio de la totalidad o del conjunto de algo, como por ejemplo, genes,
proteínas, lípidos, metabolitos o incluso las relaciones entre ellos. Se valen para su desarrollo de
otras especialidades muy interrelacionadas como ser bioinformática, tecnologías rápidas,
ingeniería de micromatrices y automatización.
En microbiología, el término “omicas” hace referencia a un nuevo “lenguaje” de los genes, que
da lugar hoy por hoy a 4 distintas disciplinas divididas en genómica, transcriptómica,
proteómica y metabolómica.
C
át
ed
En este momento se ha implementado la identificación de microorganismos por la técnica de
detección del perfil de proteínas, “huella peptídica” característica y específica de cada
microorganismo (proteómica) que veremos con más detalle en el Laboratorio Nro. 5.
15