recttfo del ITINTEO en IU 8la "aaa IIeI1one!s

Articulo 2~- Dejar sin efecto la Resolu.c16n
Directoral No. O'72-8'7-ITINTEO-DG del 23
de Dlero de 1987, en cuanto a esta. Norma TOO·
mea Nac1onal, ReviSada sa reIiere.
Sustltuyen el titulo y texto de la
Norma T6cnlca Nactonal Revlsada
202.083 Leche en Polvo
Reg1strese y. comuniquese.
GUILLERMO SALAS OO~OHClB, D1reotor
General - ITINTEO.
ANEX 0
MIlk aDd milk produds.
:M!croblo1oglca1 &D&I1QI
~ON lJIBI:ClQBAL
No." 8OITil'i'1'JIiO-DG
1
J)escr1ptoreS:
Leche y productos I8cteos
A,oiI1s1s microblo16l1co
LIma. 03 de Dl.c1eJ:D,bre de 1990
OONSIDER.ANDO:
Que, por Resoluc!6n Dlrectoral No. O'l2-l'rITI~DG del ~ de mnero de 198'7, Ie apro·
beS como Nonna TtJon1ca NadOll&1 Bev1Iora e1
Proyecto de Norma 212.083 :I..iI!XmE EN POL·
roo Ensayos microbio16gioos. lMtodoa de arb1·
traje.
Que e1 ComiW.Espec1allzac10 de Leche y Pro·
d.uctos Ucteos del IDstituto de Invest1gad.6D
Teao.o1dI1ca InduStrial ., de Normas T6cDJca8
(lTINTEQ), ha procecUdo a revlaar 1& c1tada Nor·
ma T6c.n.tca Nac10nal ell sea16n reaJ1Iada e1 dfa
aD de· Marzo de 1989 secl1n CODSta en e1 acta
corresponcUente, " despU6e de uevarae a cabo
durante 30 dfas 1& dJscus16D pUblica del Proyecto
IIII.tea refertdo lin haber rec1b1do ob8ervac1olJes
de acuerdo a1 aviso pubUcado en e1 Dlarto Oftc1al "m. P!:RUANO" e1 eua 03 de Marzo de
1990, ba propuesto a 1& D1reccJDn de NormaU·
ac16n y .A8efrU1'am1ento de la 0aUd8d. dellTIN·
TEO e1 Proyecto de Norma Tlk:n1ea Nac10nal Re·
vtsada, que deblri suatttulr a la aprobeda por
Reso1uclOn Directoral 1(0. 0'12-87:-lTINTEO-
00.
Que, en op1n16n de 1a d1l'ecci6n de Norma·
lJsID16n y A.IesOramiento de 1& Ca1i4ad d1ebe
-Utuitle e1 titulo 'l teIltto de 1& citada Norma
por el propuesto por el comiW Especlaliudo,
conaervando e1 mtsmo c6dJ&0.
:DJ. armonla con 10 diapuesto par el ~
8 del Articulo 59 del Decreto :t.eg1a]atlvo 1N0. 171,
OQl1C01'daDte con el fDcIIIo 6 del Articulo ~ del
Dtatuto de11TINTJDO, aprobado par BeIIOluc.tm
8upnma No. ~-mJIND del 015 de No·
t1embre de 1981...ITJ;NTJ!XJ • el Orpn1smo N·
bUco comp;tet1te para. e1aIlorar '1 aprobar laS
Normas T6cD1cas Nacionales apl1cab1es a t.od~
10lI aector..
Dtando a 1a recomendac16n efectuacla par ]a
DIrecc16n de Nonn eUzac1<:Sn '1 ~am1ento de
.. oaudiad, • 10 e.oorda4o per e1 OODIe,to Dl·
recttfo del ITINTEO en IU 8la
IIeI1one!s
ceIe'lnd8a e1 18 ., 24i de octubre de 1&'73, sal
c:omo • 10 cUspuesto por loa artfculoa 18 3 zr
de Ja Be8Oluc16n Suprema No. 0II0-81-ilTI/IND
del 015 de NOViembre de 1981.
"aaa
S1i: R1!SV.lloLVll::
AI1fAlu1o l~ austttutr e1 ~o '1 tGto de
la Norma 'N1D1ca Nac1oDa1 ReNada • •Q83
1JDCBE ~ l'OLVO. D1IAJoB ~.
MItodoa de arbitraJe; por 01 Utulo: ~ Y
PlWDUCTOS LA~. ~ mJcrob1016l1·
COl, ., e1 teJ.to propuesto por ~ Comit6 msp,.
ctaU Z1!do, el JDJsmo quo apareoe en e1 AD8I.O
I y forrna. parte integrante de la presente Reso1Uc16n, aprob4ndose la I'JliItna • part1r de 180
fecba, como Norma 'Ncn1ca iNac10nal Rev1sacIa
con el mtsmo oOc:Ugo.
1. NOBIIAS A OONS'DLTAB
rrINTl!lO
3)2.000 LECHE Y DERIVADQS LADI'J!X)S.
Ili2xtraoci<Sn de muestras. Genera11d84es
202.031 MANTEQUILLA. ElttracctcSn de mues~
tras.
202.045 QUESOS. iI!l:I:traccl6n de muestras.
202.085 LECBE Y D!lR.lVADOS LAarEClG.
DeffDic1o.nes y c1aSlficacl6n.
202.095 LECHE EN POLVO. Extraoci6n, de
muestras.
202.000 GRASAS DE LEXlHE. Extraeei6n de
muestras.
202.097 LECH1!l ES'l1!mJLlZADA Y LEOHE
CONOEN'SADA. EEtracci6n de mues·
tras.
202.098 LEOHE CRUDA Y LEOHE PAST.I!RJR1·
ZAI>A. !I!llttracclOn. de muestras.
3)4.037 BARINA DIiJ PESdux>. Detecc16n e
Salmonella .
217.028 AZUCAR. l'4&Xlos de ensayos micro·
bio16g1co en el aZI1car refUledo.
201U81 GELATINAS. Detecci6n de Salmone·
lla y StaphylOCOCCUS aureus.
2. OBJETO Y CAMJ"O DE APLICACI01f
2.1 La presente nonna establece loa mIto·
dos de ensayo microblol6g!cos que se apUcaD
a 1& lache Y los productos l4cteo&.
2.2 Los ensayos Be apllcan a los diferentes
productos en 180 forma que se indica a continuacion:
~
iNo. 1 . Numerac16n de microorganismos aeroblOl
mes6filos.
No. 2 Numerac16D de coliformes.
:UWtodo NVP
3.2 Metodo d,e recuento en placa.
No.3 Numeraci6D de Escherichia coli.
No.4 Investlpc16n de Salmonella.
No.5 Numerac16n de St. aureus coagulasa (+)
No.6 Prueba de esteril1dadNo.7 Numeraci6n de hoDgoS (mohos).
No.8 Nw.neracl6n de levaduras.
No.9 iNumerac:l.6n de levaduras osm60Jas.
PROLOGO
A. :R.l!SE,R'iA, HISTOBIOA
La presente Norma Tecnica N~ rue
elaborade. por el Comitll Espec1a11Zado de LE·
CH;E Y PR,ODUOTOS LACI'l!lOa en reuniones
llevadas a cabo durante los mesea: de El1ero,
Febrero, Marzo, Abrll ., MayO de 1&ll8. S:U cD·
digo corresponde &l de 180 ~ w,L083 LEO.E:iB
EN POLVO. mnsayOS microbl016g1cos. M6todO
de arbitraje,
al ser deblQamente camp~
da reemplaza ~ los slgulentes NTN 202.019;
Pag. 93013
pero
IJma, Sibado 5 de EDero de 1991
4Imi~&mglDtt3iD
<£{ Peruana
.... Pudinea - No hay NTN.
- "Mousse" - No bar NTN.
Helados - 1, 2, 4, 5.
NOTA: Oualquier tipo de producto l6cteo
esterlllzado debe ser sumetldo 0 1& prueba de
esterllldad segl1n eI caso (URl' 0 apertfsl,da).
202.020: 202.021: 202.022, 202.023: 202.03'7: 202.
038, 202.039: 202.041; 202.048; 202.049; 202.050;
202.063: 202.080; 202.081: 20.2.082: 202.088: 202.089,
En su etapa de Dlscusi6n PUblica reclb16 ob·
servaclones las cuales fuel'Ql1 tratadas por el
ComiU ESpeclalizado en reunlones Uevadas a eebo en los meses de agosto, setiembre y' octu-
3. JrmDIOS DE
tubre de 1988.
Posterlormente. volvi6 a reeibfr observac1One!l
'en su segu;nda eta!Pa de Dlscusioo Pdbllca las
que fueron tratadas en reuniones llevadas a cabo
en los meses de Noviembre de 1988 Y MarrD
de 1989.
B. INSTITUOI()Nm QUE PARTIOIPARON
EN LA ELABORAOION DE LA PRESEN·
EaIa10
wcroorpnlsmos aerobl08 mes6fUos
MedIoII c1e Illa1th'o
.... A«a1' Plate COUnt,
TE NORMA TEON'IOA NAOIONAL.
Oolitormes y D. coU•
MedlOI c1e ealtI90
caIdo laotosado--verde br11lante
bills al 2% (1) ,
Caldo lAurll suJlato triPtoIIa (2)
Agar JIlosfna uu1 de metl1eDo BMB (l)
Agoar Jl:D&) '(2)
Agar- violeta roJo bills (VBBA) (3)
LAO, VirginIa Reyna.
- OOMlTE NAOIONAL DE :Mill:I)IOAMEN·
'1'06, ALIMENTOS Y DROGAS (OONAMAD),
Edith Rojas.
,
- GLORIA SA., Rodolfo Malpartida - Juan
'Urias •
..... IN'I'lERNATIONAL ANALYTIOAL SERVICES a.A. (INASSA), Martha Angulo.
- INS1T1'UTO NACIONAL DE DESARROLLO
AGR.OtDUSTlUAL(INDDA), Rosa Rosas.
- INSTlTOTO NAC. DE NU'I'lUOION, Estbe1'
B. de Tovar.
- rrINTEO/Oficna de Instatacfones y Apoyo
TOOnfco, Lufs: Huayna.
- PAS'l'Et1RIZADORA MARANGA. I UNn.E.
CHE, 'oarmen Rosa Lozada.
..... SOOIEDAD GANADERA DEL CENTRO,
Virginia Castillo.
..... UNIV. NAC. MAYOR DE SA;N' MAlWOS.
Facultad, Parmacia y Bloqufmica, Tom.4s 01-
APLICACION DEL IlI!\8AYO DE ACUEBDO
AI. PBODU01'O
Proaucto -l!lDsayo 8 rea.'lIzar en eI produo&o Nt
Leche cruda -
1, 2.
Leche pasteurlzada. -
OB.1o peptonado, 0 trtptonado
BeactlTo de Indo!
..... C'&ldo MR-VP
..... So1ucl6n roJo de metUo
- SoIucf6n de nafto1
Bo1uclcSn de bkSr6Jddo de potaalo
.Agar cltrato
-:.Al'ar vio1eta 1010 bWa (VRBA.) para
.cuento en pJaca
reo
B8saJo
St. aureua.
HecIIoe c1e ClaBIYo
Oaldo CHoUtti Carltoni
Apr Bafrd Parker
.... Oaldo
-
fDfuSfdn de oerebro COJ'8II6n
Agar blaDOo 81 2o~
0
1'8lI'fina
..... P1as'ma coaguJaIa mTA
est6rfl
BaIa70
HoDgoI
HecIIott Ie ~
OJ:IIotraclcJlDa glucose; (OGA)
.... Agar
BaM)'O
I.evaduru
MdGit f!e bUlth'o
AgAr paps, dextrosa <PDJJ)
I, 2, 3.
Leche esterUizadB:
-t1HT-6
BDIa10
- Apertlzada - 8.
Lec'he en palvo - 1, 2, 4, 5.
Leche modiflcada - No hay NTN.
I..er-.he compuesta - I, 2, 3.
Derlvados termentados:
- Yogurt - 2, 7, 8.
- Keflr - No hay N'nN'•
..... Ottos fennentados - No hay NTN.
I[JpoUtlCOl!l
M~.lO"f
-
~ ~o
IA ~ 0
g,:.;ctt Blue
Agar trIbUili'lna
E'asayo
se.tmoneJJa
_thO
Pr&-enrfqueclmlenfo
:MecUoe tie
Quesos:
- MBdurados - 2, 3, 4, 5, 8.
- No madurados - 2, 3, ., 5, 7, 8.
..... Fundidos - 2, 3, 4, 8, 7, 8.
Derlvados grasos
......, Cremas: Pasteurizada - I, 2, a.
Esterlzada: UHT - 6.
Aportlzada - 6.
-
-
-
No. 10 Numeracl6n de bacterias lipoUtlcas.
No. 11 Numerae16n de Bacillus cereus.
Y UAUl'lVOS
NOTA: Inclu,e tamblen los med101 de eal t
tlvo alterDativos (ver Ap6nd1oe)
..... Ooordlnadora, Mercedes Candiottl Feij60.
- OIA:. PlERt7ANA DE ALlMENTOS (PERU·
cese.
om:mvo
-
Agua fosfatad'aCBufferada 0 tamponada)'
Verde brUlante a1 0.1% 0 verde de mallquIta aI O,ot~
-
C&lc!o laiotosado (1') 0
Oaldo trlptIcase; soya (OASOY) (2)
Ellsayo
EnrIqueclmlento selectlvo
Medlos de Cl1IItivo
MantequWa - 1, 2, 8, 10.
Grasa - 1, 10.
Caldo tetmtfonado wl'de brWante (I)'
Caldo ~ppaport
..... oaIdo selenlto cISt1na (3)
£Mayo
m
..... Acelte - I, 10.
Derlvados azucarados:
r: Lache condensada - I, 2, 5, 9.
- ManJarblanco - I, 2, 7, 9.
- Natwaa - 1, 2, 7, 9 ..
P08tres:
-F1anes .... No hay NTN.
.Aislam1ento selectlvo
HeI1Ios Ie ClII1fIvo
Agar wl'de brflIante rojo de tenol modiflcado (l)
PAg . 93014
,·_c
Lima, Sibado 5 de Enero de 1991
t£{ Peruano
-
-
cmwtmmWi5
Agar blsmuto sultito (1)
Agar 5a1monella-Sh1gella (~)
Para la numerac16n de 1evacfuras osm6flJaS
el medio OGA debe tener un 40% de &lUCiOsa; (I, 2, 3,) se ref1ere al orden de prio1'ldB4
en que deben usarse los pOSibles medios al·
temattvoI.
envtedas 81 laboratorio) en rerriPdacl6n & 1'10
- S90 por un mAximo de 18 h. '!J se com.ie~ e1
awWsis una va coasegWda la descongelaDJ6D
completa 0 cuando el proceso estc! Y& tea
avanzado que pennita tomar las BUbmuestraIJ
a4ecIlad88.
8.2 Sa pella. el vasa y se introc!ucen en 61
10 I mu/menos 0,1 g 0 m1 representattvol
la muestra del aUmento.
lUI. Be at\Bdeun vol$1en de ~t,
fgUaI a 9 woes la muestra COO ml) , Asf Ie obtiel'''' la rtl11V'16n 100 (pote.ncla 3 negativa~ •
6.4 Sa aglta el homogenlzado (dil 10 potencia 1 negativa) ) '!J se pipetea. una poref6n de
de 1 mI en 'l1n tubo con 9 m1 de d1Iu~te, obteni~ose la dUue16n 10 (pOtenc~a 2 negativa)
8.5 Be mezcla el Uquldo culdad.osammte 88pirando 10 veoes con una pipeta eetm11.
6.8 Be transfiere con Ia mlsma ptpeta 1 mI
& otro tubo cont<:mendo 9 ml de etIuYeD.te ,
se mezcla con UM nueva pipeta estlJriI, Be obttene la dUuel6n 10 (potenela 3 negatlva).
ae
IDayo
Pruebas bioqufm1cas
M'edIos de caHIYo
DUtritiVO inelJn8do
.... 1'81 (epr triPle de $Z'I1ear '!J hierro1
.... lAM (agar eon bierro , liS.ina)
- SDlI Jagar suUlto indoI motiUt'y)'
- Calc10 Urea
.Agar
""0
Pruebas serol6g1caa
JIedfos de C1IltIYo
- euero fls!ol6gico
.... AntiSUero 0 (poivalente)
EDIaJo
Prueba de esterUldad
Medlos de caIttvO
Agar Pla.te COunt
CaldO cerebrd co'rari6n m4s 0.1% de aJmid6n
6.7 Be repiten los pasos 6.5 '!J 8.8 batIta
el numero de diIucione.s c:le8eadM.
8.8 CoDSe1'V81
8.8.1 Leche eondensada
co~
soluble
Caldo eerebro coraz6n m4s 0,05% de clorhi·
dn!.to de elsterna m4s 0,1% de almldOn
soluble
mfU'!i6n eerebro (,()razOn maL'! 0,05%
de clor'hidrato de cisterna mAs 0,1% de
alm~d6n soluble (1)
Atl'!' !"',~ ~.&.le!'Obt('lll se~ B~er (2)
Agar .,pll'~t·lvll para &naefOblos (3)
_1'
4.
4.1
4.2
".31
4,4.
4. IS
NOl'A.- La preparaci6n '1 dilucJ6n de fa
APAT:l. ATOO
muestra se oomplementa con Ia Tabla J.
8.8.:1 Leche estetIUzada - Pre 1ncuIIiaoIdD
H~moge.'*'.M()l' apropkl.do.
BrJ.1"!'M an4utl"a PnSfbll1dad 0,1 g.
J3.'a.f!.1) de- s~a. tennoregulable.
6.8.2.1 tJBT
Autoclave.
Hilmo de est.erU1zaci6n.
4..6 J!:';tufl!,s de 1nl1\1Mcl6n f.errnoreguJable
•. 'I Contador de colonJas.
-sa taman ., en~. como mfnJmo, que lid
-
01.8 Mechero BUJlI!eni.
5. MATER.'IALES
&.1
TodoS
Los envases cerrados se colocan en un 1:Jafl.o
de agua a ~ 0 _ ~ por 10 min.-15 mJn.
Lue~o con las precaucaclones de aseps1a &deouada8 ee abren los envases Y Be procede tal
como se Indica desde eI p4rrafo 8 2.
los materi4tles .. lItlUzarse 80ft 108
com'Omnente empleados en baCf,eriologfa
lY d.eben ser estdrUes 'I ma.nil'uIados con
1& debida a.sepsla.
&.1.1 PJacas de Petri de vidr10 de 100 mm
:It
15
1Dm.
Is.! Jl Ptpetas baeterlolCSglO6l graduadas al cWcbnO de 1 11I1.; II ml 'I 10 mI.
5.l.3'1'lD>8 de cultivo de vidr10 de 100 mm x
13 mm: 1110 mm :I 16 mm '!J 200 mm x 18
presenten 8lteradones.
Be Bmplan, con un iUgod6n con alcohol, loll
enVlSel.
Los envasea se eometen a una temperatura
de 329 O. por 10 d. Si durante este tiempo
se observa alterac10nes (p6rdf.da del
dUcto, coagu1aci6p u otra), estos enVllS.
deben sepe.rarse para d.etenninar los de-
pro-
reotol.
6.8.2.1
Jl~
6. PBEPAlUOION Y DILtTOION DE 1JAI
l'tiUJ!S1'RA
Pe fonts una mue!ltra minima de 10 latas,
que no presenten aboJIaduras 0 detertor08 en
los oJ.erres.
Be lawn 'las latas con IOluci6n jabonosa,
enjuagindolas con e.bundante agua Y tie 8eC8II
con una toalla.
Be colOO9n laS latas sabre hojQ8 de papel de
fUtro perfecfamente Ifmpl88.
.
T.~ "..tt"'(f t'lo '1'.'1 l<>tRR se someten a una tn.
CUba.ci6n por 10 d a 5S!C para deteetar mIcroOrganf:lmos term6fi1os y la otra mitad a 3290
por 21 d para la deteeel6n de mieroorgantsmos
me66fDos.
8.1. Se comJena el examen tan pronto como se ~ de la mU8Stra. 81 no se pudlera
efectuar en la prlmera hOra despuls del muestree, Be ref11gera & ()lP C - ~ C. SI. 1M muestraI 0llt4n conge1adaB, se desoongelan en su envase orfglnal (0 en el reclplente donde fueron
Durante la Pl'Wlba de pr&-1ncub8c16n, Be
examina tv agttan las lataa oada 2 d. Y se 88paran aquelIas que muestren hinchamiento 0
pSrdfda de material. Estas latas Separadea de~ ser examlD8l1as para detenntnar los defee.
too en 1a hermetle1dad ~l eierre.
~.
8.1.4 AAS y eeuJllf de tnoculacl6n
IS.1.1S Matraoes Erlenmeyer de 250 mI Y 2000 ml
D.1.6 lD5p4tulas apropiada,s para eztens16n.
8.1.'7 OUcharas aproptadas.
5.1.8 campanu de rermentae16n.
&.1.9 PortaobJetoe de vtdrio.
P8~.
93015
LIma, Sibado l) de Enero de 1991
e: Peruano
TABLA. 1
DILtrf'ENTES 'f MBTODCS DE l1BEPARACION DB MUBS"l'B&S DB I.oEOJIES Y PRODUcros
LAC1l'EOS
Tamafiode
mueeL1'8
]a
pro4uctOS 1 m1610
JfqU1d08 de 1ache
ml
9 m1 6 90 m1 \ie ana
nada es~ri1 a1 O,1D'"
IAebe en po1vo,
suero de 1acheen
po1vo, suero de
mantequUla en
P01vo, laotosa
90 ml de e;gua ~toDad&
tmil al 0,1%
fMb,es,
10 g
10 g
pepto.
es-
to It
adtal
Se aclt6 a CfI~ ClOD per1aIJ de
vldrio esMrl1es para' tacmtar
la bomogenlzacl6n
90 mI. cle citrato de 8Od10
a12%
Be·agtfa a
90 mI. ~ soIucl6D, de Cltrato
Be 11eda a 4190
que eI V880 de 180
estA eetASm
de sodfo 111 2'10
Queso
se
90 mI.
de agua
46~O c!OD
perlM de
'rid11o eet6rlIes para facU1.
tar Ia hom~
cutda'Ddo
Ucua40ra
peptonada
esUrD a1 0,1% con 1M de
EllnulSionante
(et·: ~
80)
Flan,
natillaS,
postres, 1eche
conclensada, crema
heIados
Leches fennenta
d8S
~ de
agua
esthU a1 0,1lift
peptonada
90
10 g
Se agita a 4&:0
90 mI de solueiOn BUffer
Posfato pH 7,0 BsUril
--------------------------'!;..---'""l
Yogurt
10 g
• 1a preparacl6n cle las muestras es neeesario limit&' 1a veJoe1dac! '1 tiemPo de tuneionam1ento
de los aparato$ electrico.s en coDtacto con 180 mueet1'a problema, d8bic!o' &. que una «ICe.
aJ\'a exposIcl6n a la velocidad pOdrla. produci r lesf.operI b80terlaDa8 plr efecto m8CIl1Dlco 0
~"8do calor 10 que ooducilia; a reeuentos baJOS.
"II; P!EtOCl!lDIM1ENTO
Todas las determ1naclones Be deben nacer
por duplicado sobre 18, misma muestra preps·
racIa, utilizt\ndose acrem4s un blanco. Los reo
ultados sa expresan por g 0 fn1 fe muestra. dependiendo de 1a naturaleza del producto.
'Z.1 Numeraelon de mlcroorganismos .aereIdo8 mesMUo8
7.1.1 Se transfiere 1 ml. de la primera
diluci6n (10 potencia 1 negatdva) en placas de
Petri es~ril, sa deja fluir el contenido y se
procede en 1a misma forma con cads una.
de las sIgu1entes diluciones.
7.1.2 Be vierte
inmediatamente el Agar
Plate Count tundido y enfriado a 4590 en las
p1ae'al! ~ Petri ., Ie m«.cla. por m.ed:1o de movimlentos de valv~n seguido de movlm.1entos
clrcuIares .
7.1.3 Be deja soUdificar el med.io de eultivo,
Be invierten las placas y se ineuOOn a una tem·
peratura de 32\'0 a 8590 basta 48 h.
'l.1.. 'l'I'anBcurrldo este tiempo, se selecoio·
nan las placas correspf>ndientes que contengan
entre 30 '1 300 colonias, ut!l1zando un contador
de colonias. No confUneIr las colonias en
punta. de alfiler con pequefias partfeulas de
polvo no diSUeltos.
pag.
93016
~
eDOODtr'ar eJ. recuento por lid
total de coloDfal
'POl" plaea, par 1a 1"8CIprooa de 1a cmu.ct6.D uti·
'fJ1.1
de muestr'a lie multipUca el
l1zada.'
•
S1 todas latJ PIacas diBOD menos de 8IlJ ca& _
se infonna el nmnero de 00lonfas en 1a pIae&.
Bi no hay co1onias se expresa como Menor de
10.
'1.2 NIIDIfII'8eI6D de eoIfrOI'lllfJ8
7.2.1 Mt!todo del n'dmero
m4s probatile
(N'MP)
'7.2.1.1 Ensayo presuntivo
a) Be usa to ml del media ca1do ~
verde br1llante bUls :It% con una conoentradli5n
de 40 gIl contenic!o en tuboe de eDSayo provIs.
to. de campanas t!e tennentaal6n.
b) Se pipetea 1 ml de eRda cU1Uc16n (10
potenc1a .t, 10 palencia .2, 10 DOtenc1a -I) en
tuboI' que conttenea el me4Io de CQItiTo, atm·
lando tres tubos por cada dllucl6n. Ere 1II.c\d)a
a 3600 - ~ dUrante ,. h., 48 h.
e) "-das 181 M h lie anotiln los tubos que
mUMtNn procIucOi6n de fU., tie "oem a 18
&lltufa 108 tubos CR' nl!'glll.~. Pae!ldqs 1M 48
h Be &Dotan 108 tubas que m'l.1.4!Stren p1'Od11COf6n
de guo
d) Be escogen los tubos positlvos para e1
Lima, sabado 5 de Ellero de 1991
'E{ Peruano
en5ayo de confirmac16n, para tal fin Se selecclona la d1luc16n mas elevada en la que los
tres tubos son positivos para. producci6n de
gas y la,s slgulentes dos dilueiones JXtas altas.,
Por ejempl0. si las tres
'llltlmas positivas
fueron:
Por ejemplo, si las tres ultimas diluciones
positivas fueron;
1:10; 1:100; 1:1000 y los numeros de tubos positives en cada diluci6n 3, 2, 1 respectivamente, los resultados se reportaran como 1:10 = 3;
1:100
=2
Y 1:1000
Tabla 2).
=
1. E1 NMP "" 150 wer
'1.2.1.2 DlSayo de coDt1rDl8c1on
se mezela bien el contenido de los tuOOs postllvos y se extienda, con una asa de Kolle, una
asada. de cada tubo en la superflcie de placa.s
conteniendo agar eosina azul de metUeno
(EMB) 0 agar ENtDO 0 agar violets. rojo bills (VRBA) y se Incuba a. 35 ·0 - 37 ~c durante
~
h
Q
48 h.
1"J.'r'~eba
d)
IMVIO.
d.1) Prueba, de Iadol (KOVACS, 19%8)
Sa inoculan tubos con caldo peptonadO 0
triptOllado a: partir de eulUvos puros, Be Jncuban los tubos a 35 ·C - 37 ·C por 24: h.
Be adiciona. 0,2 mI. - 0,3 ml, sie reactivo de
Indol a cada tuba y se agita:
Se deJan los tubos en reposo par 10 min
Y Be observa los resultados. Un color rojo oscuro en la superflcie constituya una. prueba. po1l1tiva. Un eo1or naranJa Indica la. presencia
probable de escatol y puede ser reportado comQ una reacc16n positiva.
d.2).Prueba c1e1 Bojo de .Hetlla (LJ'l1TOV.l961)
Be inoculan tuOOs con Daldo MR-VP a partir de cultivos puros. se jneuban los tubas
&35 ·C-37·Cpor 5el..
Be pipetea por aeparado, 1 ml, de cads cultivo a un tubo de prueba. V9oCI~ y se a.d1cl0n3.
I) iOtas de soluci6n Rojo de Mettio. Se agita.
U.1.3 Leetura
a) Se efectUa la lectura segUn el agar em-
pleado; en agar EMB las colonras de cohtormes presentan coor negro 0 con centro negro
o la formacl6n de colon1as mucosas rosadonaran,ja. En agar ENDO son colonias rojas roo
deada:s de halo rojo. En 8.iar VRBA son colowas rojo oscuro COIl un cllametro mayor de 5
mm.
Se anota como Rojo de MetH:> positivo la
aparici6n de un color rojo, como negativo, la
a.parici6n de un color amarillo.
.
d.3\ Prueba de Voges·Proskaaer
1963; LEVINE, 1916),
(LJUrOV,
t5e inocula So partir de cultivos purOB, tubos
cop Caldo MR-VP )- se tncuban a 35-37.0 por
"8 h.
b) Be anota el numero de tubos connrmados de cada diluci6n, como baetenes coliformea positivo.
c) se detenn1na para cada una de las tres
diluciones selecciQnad.a.S, el nl1mero de tubos
que dieron un resultado conf1rma.torio de co.:formes. Referirae lila Tabla 2 del NMP y anotar el NMF! baalindoae en loa niveles de dilu·
ci6n de la muestra. y el numero de tubas positivos confirmados de cada diluc16n seleccionada.
se agitan los tUbas, sa deja;n en reposo por
2 h. - 4 h. Y Be observan 1'>8 resultados. Be
anota el desarrollo de un color rosado e. carmesl como pruebe. positiva.
d.4) Prueba de Citrato de
1923; SIMMONS,
Por ejemplo, 8i en el modelo dado en el
punto 7.2.1.1 d), todos loa tubos positivos en
w.s tres diluciones seleccionadas (1:10; 1:100 y
1'1000) conducen a. resultados confirmatoriOlS
positivos para bacteriaa coliformes. aiendo los
valores para cada diluci6n 3, 2 Y 1 respectiva,·
mente; para. obtener el NMP de bacterlas co·
llformes por gramo de muestra, se va. a. la Tabla 2 Y results. ser 150.
'1.2.U
Se plpetea, por separado, 1 mI. de cada. cuttivo a un tuba de ptueba vaefo, se ad1clona 0,6
mi. de soluci6n de Dattol y 0,2 ml, de soluc16n
d~ 1'.idr6x1do de potasio.
N~i6n
de Escherichia coU
a) Se aiSla, par IIepara<lO, una asada. de
cacla tuOO gas positivo del ensa.yo presunti·
vo de coliformes (7.2.1.1 d), sobre una. plac a
de agar EMB, 0 agsr ENDO 0 agar VRBA.
c) Be ineuban las plaCas
invertldas por
24 h. a. 44 ·C m4sjmenos 0,1 ·C.
el Be selecciona una colonia t1pica de ca·
da plaCa para. Uevar So ca:bo la
Proeoc. del
IMVIC, con la t1nal1dad de confirmar 1a pre·
almCla de Escherichia coli.
PAg.
Sodio
{KOSEK.
:L9Z6)
Be inoculan los tuOOs de Agsr Oitrato con
c61ulaa de cultivo puro.
A fin de sembra,r un 1n6c.:ula pequefi,o, Be
usa una aguJa recta.. La transferencia de nu-
trientes con el inOculo podria invaUdar Ie. prue·
ba.
Se incuban los tUbos a 37 ·0 ...,; 3'1 0C por
48 b.
Be anota como positivo un crec1m1entQ viSi·
ble acompa;ftado de un cambio de color dQ4 medio del verde al azul.
• Con los resultados obtenid06 en 180 prueba.
IMVIC se consulta la Tabla 3 Y luego la Tabla.
2 para obtener el NMP de m. coho
7.2.2 M6todo de reouento en placa.
'1.2.2.1 Be coloca 1 mi. de cada, cWuclon en
placa:s de Petri ester1les.
93017
Lima, Sabado 5 de Enero de 1991
t£{ Peru-ana
7.2.2.2 Be ai'1ade a cada placa, conteniendo
el in6culo, 10 ml, - 15 mI. de agar violeta ro
jo bills (VRBA) a una. temperatura de 44,5
oQ + D,S.
7.2.2.3 Se mezc1a e1 contentdo de la placa,
con movimiento de bala:nceo y de rotacicn. Se
deja que solidifique la mezela (5 min. a 10 min)
sobre W16 superficie niveIada. A continuaci6n,
se afiade otros 3 ml, a. 4 mt. del medio f~dido,
de tal modo que se forms una ~apa. que cubra
18 superflcie del medIo solidificado, evttaado
sst 1a formaci6n de colonlas superflcia.1~s..
7.2.2.4 Se invierten y S9 Incuban las placas
durante 24 h a 35 "0-37 00.
7.2.2.5 Se consfderan como bactel'ias coltfonnes solamente las colomas rojo oscuro que
miden D,S mm. 0 mas de diimetro y q'.le se
encuentren presentes en placas que eontengan entre 20 'J 200 colonias. Sf as posible, se
selecclona para e1 reeuento solamente aquellas
placas con no m4s de 150 de estes colonias. 6e
multiplies. el n'limero de colonlas por 1a dilucim correspondfente para. obtener e1 numero
de bacterias coliformes por gramo 0 ml, de
muestra.
medic que las rodea varia. entre el rosaceo a
rojo. En eO! agar bismuto sulfito son pardas,
grises "i negras; Y presentan a veces un brtllo
metalico. En medio que las room es, por 10
general, oscuro al principio, volvtendose mas
tarde negro a medida que aumenta el perlodo
de incubaci6n.
7.3.7 Las colonias sospechosas de Salmonella (ver Nota) se someten a las siguientes
pruebas de diferenciaci6n rbtoqutmfca) en tu·
bas conteniendo los respectivos medios. ••
NOTA_ Be puede someter a confirmacf6n
cualquier colonia sospechosa pues el reconoclmiento de Salmonella- es en gran parte un proDlema de experiencia, ya que la apariencfa de
las colonias puede vanar en algo no 8610 de especie sino tambien en funci6n del media 'aWl·
zado,
* Se recomienda semsrar en tubas de agar
nutritivo e inclinado e Incubar It 35 oC-37 00
por 24 h. si es que se va a Continuar con 1a
prueba de ccnfirrnaci6n serol6gica.
7.3.7.1 TSI (agar triple de azliC3.r y blerro)
a) Se inocula en agar TSr. Be incuba a. 35
7.3 Deteccf6n de Sa.lmonel...
°C-37 °C por 24 h.
7.3.1 Para el caso de lech'} en polvo sa
muestrean 60 unidades de 25 go. cada una y se
mezclan. A partir de esta mezela se toman 16
unldades de 100 g, ca.da. una, pam el anali·
sis.
b) Los cultivos sospechosos de Salmonella
presentan reaccion alcalina en el agar inclinado
del medio (color rojo, lactosa y saearosa negativos) y reaccion acida en la columna de agar
(color amarillo, fermentaci6n de gtucosa) con 0
sin producci6n de H2S (ennegrectmlento del
media).
Luego por cada muestra de 100 g. que sa
analiza, sa adiciona 900 mI. de agua fosfatada
bufferada es~rit. Be adlciona.20 ml. de soluci6n de verde brillante al 0,1% como fnhibidor,
s6lo en el caso de muestras muy contamfna:daB.
7.~.2
Para el caso de quesos, heIados
U
otro,
se toms. 25 g. del producto para 225 mI. de
caldo de pre-eIlrlquecl:miento
CASOY).
(lactosado
0
]a
Urea.
a) Se siembra en 'Corma a:bunclante en el
caldo urea.
b) Be incuba a. 35 QC,........a7 00 por 24 fl.
c) La reacci6n positive. se manifiesta por
el vi~aje del indicador a rosado fntenso. .
7.3.7.3 Agar de hierro y Uslna (LIA)
7.3.3 Se incuba a 35 ~7 'C por 18 h. a
24h.
7.3.4 Se
7.3.7.2 Hidrol1sfs de
lleva 1 mI. del cultivo anterior
a 10 mI. de caldo 1letmtionado verde brillante
(aldo Rappanor 0 caldo selenito cistina) 0
Qien 10 mI. del cu1tivo a. 100 mI. de uno de
los caldos de enriquecimiento selectivo para el
caso de la lache en polvo. Be incuba a. 43 ~
+ 0,1 \'0 por 24 b.
a) Se sie~bra, en estrfa., en 1a: superficie
inclinada del agaJ,' y por picadura en el fondo.
b) Be ineuba a 35 0C -
37 0C por U h.
(0
7.3.5 A partir de lOB cu1tiws 1IJCubados sa
reaUzan aislamlentos en pllllCas con agar verde
brillante rojo de fenol modiffcado y agar biSmuto sulfito. Be incuba a 35 °C-37 00 durante 24 h. en caso del agar verde brillante rojo
de fenol mod1ffcado y 48 h. en caso &l1 agar
bismuto sUlfito.
7.3.6 AI cabo de este tiempo, sa examfnan
las placas. Las colonfas sospechosas de Salmo·
nella en agar verde brillante rojo de fenol son
incoloras, de un color fntermedio entre el rosa
y el fucsia 0 entre transll1cidas y opacas y el
PAg.
c) Un color pUrpura con produccf6n de
Ii vecas de gas, fndican una reacci6n po'
sitiva. Un color amarillo indica. una: reacc16n
negativa..
8H2 y
7.3.7."1 Agar 81M «SU1flto·Indal·HoWity)
a)
agar
Be siembra, par pfcadura profunda, en
sm.
b) Be incuba a 35 ·C-37 !O por 24 h.
c) La. reaccl6D positiva de Be,lmonella sa
maniffesta por preSencia de turbfder; homog6·
nea (movilidad), formacf6n del sulturo de hidr6geno (color negro). AI agregar el Teactivo
de KOVACS no sa forma el anfIlo raJa en 18
superficfe (indol negatlvo).
93018
Lima, S8.bado 5 de Enero de 1991
'E,{ Peruano
7.3.8 8i las pruebas bioqufmicas Indican
presencia de 8e.lmonella se precede a connrmarlas mediante las pruebas sero16~cas.
em., para dar condiciones de ann.erobiO&ls en
los tubos. Para el mismo fin sa puede util1zar
una jarra de annerobiosls.
7.3.8.1 Sa ensaya, primero el antisuero con
culttvos testlgos a tin de comprobar 6U dica·
cia.
7.4.4. Los tubas se Incuban a 3590 durante 24 h. a. 48 h.
7.3.8.2 En una: 13.m.ina. porta-objetos se coIoea una. gota de suero fisiol6gico esteril y a este se le adtctona, con una. aguja. de inocula.ci6n,
una porci6n de Is oopa. pura que sa ha aislado
del agar nutritivo, luego se le adiciona una
gota d.e suero polivalente ("0). Si se observa
la reacctdn de aglutanaci6n as salmonella posttiva.
7.3.8.3 Se considerara como una pruc!J!l negativa si no se produce aglutinaci6n. ~t"s
cultivos deberan probarse tambien con antrsuero polivalente H <flagelar).
37·C.,
7.4.5 Con una pipeta
Pasteur es~ri1 se
transfiere un in6culo de los tubas que muestren
ennegrecimiento. del medio a placas de Agar
Baird Parker, previamente secas. Se extiende
el culttvo hasta sequedad de lao superfieie del
agar empleando Is. esp4tula de Digralsky.
7.4.6 Se mcuOOn las placas en posicion in·
vertidas 35'!C. - 37~C., durante 30 h. a 48 h.
7.1:7 Pasadas las 30 h. de lncubacion, las
cololI~;n
d:picas (nunea menor de
5)
se some-
ten a la pruebs. de la coagul88a. son cotomes
negra s, br.Ilaatas, conozas y rodeadas por zoo
nas elaraa que contrastan con el medio opaco.
7.3.9 Cuando sea necesarto, sa lleva. a cabo
la tipificaci6n en instituciones especiaJizadas
en este tipo de analisis. El nombre de esta
instituci6n debe ser Ineluido en el informe del
ensayo.
7.3.10 Para. efectos de Interpretar resultados soore Detecci6n de Salmonella ~ ttenen
es cuenta las consideraciones siguientes:
7.3.10.1 61 no se detecta 8e.lmonella despues del atslamlento en piace, a partir de los
medios de emiquecimiento se in:Grro.a. "Ausencia en x g" 0 "No se detect6 S~"J.Qnella. en x
K del material exa.minado",
7.3.10.2 Si se detecta 8almonella del\pue&
del a.isIamiento en place. en ambos medias de
enriquecimienta se in!orma "Se detecto saimonella en x g del material examlnado", Si 5610
se d.etecta en uno de los m.edios es convenlente contmuar con el procedimiento.
7.3.10.:J En caso de que se h3ya. reaJizado
la tipifica.ci6n serol6giea se informs. "lA Bal·
monella identifica.da pertenece
tipo.s:
8
los siguiente.s
'204 Numeracioo de estafiiococos coagulasa
pe;tsitivos (NMP).
probable.
Metodo
del
numero
mas
7.4.1 Be toms Con tma. pipets., por tripll·
ca.do, 1 mL de cada una de las diluciones (10·1,
10·2 Y 10-3) preparados como se indica en el
capItulo 6 segUn e1 caso, y se transfieren a tu·
bos conteniendo 19 mI. de caldo de enriqueeimiento para estafilococos, segUn Giolitti ~i
canton!,
'1.4~
'M.9 Prueba de 180 eeagula.sa (cont1nnaci6n)
7.4.8.1 Be hace subcultfvos a. pertir de las
colonias tipicas en caldo in!Us16n de cerebro
corazon y se ineuban las 51embras durante 24
h. a 3590. - 37?0.
7.4.8.3 Sa aiiade 0,1 mi. de los sub·cultlvos
resuItantes a 0,3 ml, ~. pla$l!la . coaguIasa.
Eli ...'A ell tubes pequeiios"'y se Incuban a 35'0.
-
37°0.
7.4.8.3 A las 4 h. se examinan los . tuOOs
para: verificar 51 el medio aparece eoo.gulado,
en caso que sea negative, se continlla la mcubaciOn basta. 24 horas.
24 h. La tormaci6n de coagulo bien visible es
demostrativo de producci6n de coegulasa.
7.4.8.4 Se anota el resultado en cuanto una
reaccion es positiva ya. que el co8gu10 puede
dtsolverse mas tarde.
7.4.9 Se determina e1 nlimero mas probable
de estatilococos coagulasa positivos,
anotando el nlimero de tubos oontirmados de
cada diluci6n. refer1dos a la Tabla del Nlimero
mas Probable (Tabla 2).
(NMP)
7.4.10 Be exi>resa el nlimero m4s probable
por gramo 0 mI de muestra.
7.5 Numeracl6n de hoDgos y iewduras
7.5.1 Se coloca por duplicado en placas de
Petri esteriles 1 mI del in6culo de la serie de
diluciones, 1uego se adiciona aproximadamente
15 cm3., del media esteril (OOA) mantenido a
la temperatura de 45 ~C ± 1 ~C.
.
Los tuj)os con el caldo mencloDado
7.4.1. deben ser previamente regener8ldo8 a
lO()oC durante 2.0 min. y enlriados a tem,Jc.
7.5.2 Se deja solidifiear y se incuba a 22
2 ?O de 3 d a 5 d.
e1 medIo de cultiyo haya side preparado e1 mi6.
mo dJa de! ensayo.
7.5.3 Be seleecionan las pla.cas que contengan de 30 a 100 co10nias y se cuenta separa~
n:.ente colonias de hongos y levaduras.
'1.4.3 Be adiciona agar blanco al 2% 0 parafina esteril hasta una altura de 2 em. a 3
7.5.4 Se ca.lcula e1 nlimero y se informa c0mo el nlimero de hongos y levaduras por ml 0
gI'11Illo respectivamente.
<iSl
ratura ambiente. A excepciOn del caso en que
93019
~C
T,[ Peru-ana
ras de pre.incubaci6n basta por '12 h y se
procede a la lectura correspondiente.
7.6 Prueba de esterl1ldad
7.6.1 Para produetos UIlT
7.6.1.1 Se siembra 0,1 ml del produc~l previamente incubado (6.8.2.1) sobre el agar Plate Count.
7.6.1.2 Be incuba a 32.c por 48h.
7.6.1.3 Transcurrldo este tiempo y utWzando un contador de colonlas se procede a la lec-
tura.
'1.6.1.4 Be lnforma el resultado del nmnero
de microorganismos mes6fllos, aerobios f fa-.
cultatlvos vlables.
'1.6.2 Para produetos
~
'1.6.2.1 A partir de 6.8.2.2 una vez transeurridos los tlempos de preincubaci6n, sa desmfectan las tatas con alcohol al 70%, dejando algunos ml de alcohol sobre la parte que sa va a
abrlr (opuesta a las claves de identlflcaci6n).
7.6.2.2 Se flamea r4.pidamente y con un abrldor previamente esterWzado, se abre la lata
basta que por la abertura sa pUeda introduclr
la pipeta esterllizada.
El producto se constdera que cumple con
la prueba de esterllidad comercla1 cuando
m4xlmo un tubo de la baterla de los aerob10s presenta desarrollo conflrmado.
b) 4DMrobIo8
Be inocula 1 ml de cada uno de los euitlvos indicados en '1.6.2.3 0 en igUal &11-
mero de placas de Petri esteriles' y se les
adlciona de 15 ml a 25 ml de agar Bm
adicionado de cistelna. y de almid6n funifido y tempIado alrededor de 50 '0.
Se mezcla por medio de mov:lmlento de
vaiven seguidos de mov.1mientos clrn:U:lres; Be dejan solldificar, se colocan en poslci6n invertlda dentro de una jarra de
anaerobiosis y se incuban a las tem:,l'!r3turas de pre-ineubac16n, hasta por '43 b.
Luego Be precede a la lactura correspondlente.
7.6.2.3 De cada lata se membra una serle de
3 tubos para aerobios y otra serle de 3 tubes
para anaerobios.
El prOducto Be consldera que cumple con
prueba de esterllidad comercla1 cuando
nlng11n tubo de la baterla de los anaerobios presenta desarroUo.
a) Para la deteccl6n de aerobios, se transflere con una pipeta esterll 3 ml de leche en
cada uno de los tubas de ]a ser:Ie conteniendO
2'1 ml de caldo cerebro coraz6n adicionado de
almld6D.
NOTA.-Todos los medios de cult1vo IIqull!os. deben ser *ecientemente
preparados, esterllizados y ..ternperados entre 2O\'C y" 4O'1C.
b) Para 1& deteccl6n de anaerobios, se
traDafiere con una pipeta esteril 3 ml de leche
en cada uno de los tubOs de ]a serle conteDiendo 2'1 ml de caldo cerebro coraz6n sdlclonado de clstefna y de almid6n. Luego se coloca
en una jana de anaerobiosts, y sl no se cuenta
con ella, se adlciona a cada tuOO una capa de
:I m1a 3 ml de paraflna est6r1L
7.6.2.4 Be incuban las serles de tubas lnd1cados en '1.6:U a y '1;6.2.3 b por 72 h a ]a mlsma temperatura de pre-incubacl6D de cada la-
ta.
'1.6.2.5 Para ]a comprobaCi6n del desarrollo
bacterlano se procede de la sIgu1ente manera:
a)
AerobJos
]a
El procedlmlento ,descrito
de
'1.6.2.1 a '1.6.2.5 Be de~ realizar en
una c4mara 0 ambi,mte est6ril .,
paralelamente sa
con un blanco:
~be
trabaJar
'l.'l NumeraclcSn de UpoJitlcos
7.'1.1 Be usa el medio Sjplrit Agar adlcIoDado del reactlvo lipasa 0 tambi_ el agar trlbutlrlna adlcionado del reactlvo glicerln trlbutlrato.
7.7.2 Be trabaja con dlluclones 0 Be toma
10 ml de ]a prlmera dUuci6n y se Ie adlclOna
90 ml del medio fUndldo y atempera<1o a 45 'lO
Be homogenlza y luego Be vlerte en 4 CS 5 placa8.
7.7.3 Be lneuba a 30 ~ durante'll Do
Be inocula 1 ml de cada uno de los cultlvos indicados en 7.6.2.3. a en IgUaI n1lmero de placas Petri esteriles y lie adlclona
de 15 ml a 20 ml del medio Plate Count
Agar, f1incUdo y temperado alrededor de 45
.c.
Be mezela por medlo de movlmlento de
vaivcm, seguldo de movlmlentos c1rcUlares;
se deJa solidiflcar y se recubre con aproxlmadamente 5 ml del medio esWrll; Be deja
soUdWcar y se Incuban las pJacaa en poslc16n invertlda a las mismas temperatu-
Pag.
7.7.4 Al cabo de este tlempo, Be IProcede a
la lectura de las cqlonlas de germenes con BOo
Uvldad UpolItlca. Be escogen aquellas plaCM que
presenten entre 20 y 200 colonias.
7.7.4.1 SI se emplea el medio Sjph'it Blue
Apr adlcionado del reactlvo lipasa, se cueotan
las colonias de color azul rodeadaS de una ZOna de precipitac16n azul claro.
'1.7.4.2 81 Be emplea e1 media agar tributt.
J'ina, adicionado del reactlvo de gUcerln trlbu-
tirato, las colorUas Be encuentran rodeadas de
un halg transparente.
93020
Lima, Sibado 5 de Enero de 1991
NORMAS LEGALES
1£( Peruano
S. INFORMB DEL ENSAYO
'l.1 Foil el fnforme del
Be debe indl- .
CIlZ' el resultado obtenido. Be debe tambhin
ensa.,o
mencionar eua1quler eoncUc16n de operae1~ DO
eapeclficada en esta norma 0 sefta1a4a como
opClcma1 as1 comO cualquier cf1'CUDSt&,nc1a que
pueda haber fnfluido en el resuttado.
8.2 A .rectos de comparar resultedo.s de enIaJ08 Jlevados a cabo IPOr labOratorios' dUerentel, en el lDforme se debe tndlcar en forma . .
pec1a1:
C8ntidad de muestra ensai8da.
Temperatura 1 tiempo de pre.Jncubac1&i
1/0 incubacl6n apUcad08.
-
Oantldad de
I. ANTEQ:DBN'I'II'
9.1 APHA. CODlpencUum 01 methodI
tor- GI8
microbIological examination of foods. Edlto~
Marvin Speck. 1978. USA.
9.2 HeltJemann , :R; Mar8IIa11, T. aDd SIDltll,
P. :R. MicrbblOlog:[ca1 methods for ClOD08Iltrated
milk and dJ7 mta.
Q.3 lOMBI'. IIlcroorpnfjpnoe de loll AUmentos. Vol. t. 'NcDIcaI de ADQIIII IIIcrobIoo
l6gicos. Editorial AcrIbfa. DsIdL
9.4 ISOITO M/80 9 NI02 P 1IIlerobloloafe.
DIrectives Generaelspour 18 recherche ~ SUo
pbylOCOC!CWl aureu8.
9.5 ISO/TO WSo 9 R ZIP UIcI'obloJolfe.
Directives Gene1'ales IIOUI' Ja ~ del
satmoneDA.
1'rINTJCO _.019; _ _ . . . .; . . .
9.6
-.ocs:
muestra ensayada.
8.3 En el informe se debe fnclulr todOI los
detaUea para 18 complete ldent1ficacf6n de 18
taueatra.
-.0&1: _ .
_.a.I3; 2&037; 2O'J.oa&; • •
2O/J.08O: 8.083: _ • •.G81:- . . . .
'-.089.
_.088;
9.'1 :Ratto, Marfa AlfDa: et at. 00Dtr01 MIaIobloI6BfCO de Leche ., ProcIuct.oI Uct.eos. .....
dos Recomend8doI. 1983. LlDIa-IWd.
'IAI! LAB
Nl7MERO MAS PROBABLE (NMP) POR GRAMO DE MUEST.RA
CONl'l4N'ZA
Y' 95%
DE
L1MI'1'I'S DB
UsaDdo tres mhos con po1'Olones de 0, 1 r. 0, 01 r y 0,001 r;
~
Nlimero de tubos poslUvos
0,01
0,1
0,001
NMP
Por g
NMP
Menor.
Lfmlte
Mayor a
f
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
8
3
8
3
S
S
S
3
8
3
8
0
0
1
0
0
1
1
2
0
0
0
0
1
4
'1
'1
11
0
1
0
11
9
i0
1
1
2
",
:a
II
1
2
2
210
3
3
8
0
240
2
1100
1
480
)2400
I
1
•
1
2
0
1
2
0
1
1
3
3
3
11
28
23
39
64
43
'15
120
93
150
0
0,5
(0,5
(0,5
1
14
15
1
0
1
2
0
0
0
1
1
(3
3
3
0
1
II
10
4.
'1
15
8
13
20
21
23
38
88
88
.."
ft
"'1
1I.50
120
130
880
'1
210
30
330
880
380
14
15
80
85
36
'11
150
(40
4'10
aoo
1
24.00
4800
( - ) = Mayor y Menor
INTERPRETACION ESTADISTICA
y progratna computarizado ha sldo dlvulgadoi en
Todas las conslderaclones estadfstlcas es·
t4n Involueradas en los limItes de confianza da·
dos en esta Tabla. La Interpretac16n estrlcta de
estos lImItes, es que sl siempre se aflrma que
la densldad verdadera de los microorganlsmos
descansa entre estos lImItes, entonces el 95%
de tales aflrmaclones sal'll correcto.
Reclentemente, un tratamlento estadfstlco
late cualquler m1mero de m1lltlplos puede ser
usado para cuaIquler n11mero de muestras y cUluelonesi ., el prograDia l'llpldamente produclrl
promedl6s de NMP y de lImItes de conffanza
a cualquler nlvel de slgnlflcact6n. Aunque procedimlentos para tales manlpulaclones fueron
conocldos antes del Pr0«ram8 en menct6n. late
factlltanl el uso de m1Utiplos de ~ Impares y el promedlar dlversos valores de NMP.
PAg. 93021
Lima, Sabado 5 de Enero de 1991
i£( Peruano
TABI.A
a
INTERPRETACION DE IA PRUEBA DEL IMVlO
Prueba
Eschel'1nchta coll Tipo I (Tiplco)
del
PI'IIeba
delrojo
Indol
de..mo
+
10. APENDICB
A. M)ed1os de eultlvo
tea
desh1dratada reconstituido en Is. forma ind!cada en el envase.
A 3 Agar EosJua azul de meWcao
• (EMB de Levine; Levine, 1921).
Composlcl6n:
Peptona
Lactosa
Fosfato dlpot4s1co
Eosina amarilla (sol. ocuosa
2% m/v)
Azul de metfleno (sol. acuosa
0,25% mlv)
mas menclonadas,
A.l Agar blsmuto sultlto
(ModWcado por Wilson y Blair)
CompoeJcI.6nc
Glucosa
Fosfato d1s6d1co
Sulfato ferroso
Indlcador BJsmuto Sulfito
Verde BrWante
Agar
ISg
109
4g
0,3 g
8g
0,025 g
20g
SUspender los companentes en un 1100 de
agua dest1lada, mezclar bien y calentar basta
ebulllcl6n con agitaci6n frecuente para. dOO1ver las sustanclas solubles. 8e rorma un preclpitado que no llet'llo a dfsolverse. Enfr1ar tasta
45~?C y distrfbuir en placas de Petri en
oantldades de 15-20 mI. No esterUizar. La salectlv1dad del med10 dfsminuye 48 bs. despu~s
de su preparac16n,
El medio mdste en el comereto en fonna
deah1dratada. Prepararlo slgu1endo las mstruedones del envase.
~ 2 Agar EDdo
Ooml1081d6D:
Peptona
log
Lactosa
10,
1l'oSfato dipot4s1co
3.51
Sulfito s6dico
2,5 g
Pucsfna b4s1ca
0,4 g
A~
Agar
Prepand6u.:
6g
PreparacI6D:
PrelJaraeI4D:
-
+
Para la preparac16n de los diferen
medios de cultivo se debe consultar las Normas
Ttkn1cas Naclonales 2()4. oa7; 207 .028 y 209.181.
Los medios de cultivo cuya preparac16n se
1DdIca a continuacl6n no apareeen en las nor-
Extracto de came
Peptona o. pal1petoua
Prueba
de VogesProskaaer
15g
E1 med10 debe US8!'Se el m!smo dfa de su
preparaci6n. AfiaCUr todos los componentes, excepto el sulfito s6dico y la rucsina b4s1ca a 1 I.
de .a gua dest~, cillentar basta ebUl11c16n para
consegulr la dIsolucl6n compIeta., d1strlbuir en
cantldades de 100 mI. y estlrWzar a l21~O. du-o
rante 15 min. Imnediatemente antes de utlll.
zarlo, fundir el agar y afiadir a cada. 100 mI.,
1 mI. de una soluc16n de fucsina Wsica al 4'$'
(en alcohol etDlco del 95%) y 2,5 mI. du UDa
801ucf6n acuosa de sUlfito s6d1co nl 10% ('La,
solucl6n de SU1t1to debe prepararSe inmediatamente antes de su usa). Mezclar bien y dlstrl.
bulr en cantidades de 16-20 mi. en placas dQ
Petri. pH f1nal del medlo, ".5.
magar Endo exlste en el comercfo en forma
PAg.
10 I
10 ~
21
15g
109
Afiadfr los Jngred1entes a. 955 m1 de e.gua
destilada, Oalentar hasta ebulllc16n para consegu1r la dJsoluci6n coinpleta. AutocIavar a 121'lO.
dul'ante 15 minutos. E1 pH f1Jml deber4 ser
Eldste en el comerdlo en forma desh1drata.
da, prepararlo slguiendo ~ mstrucclones del
.,.1.
envase,
A.4 Agar manltol, yema de hllevo.
'POUmlxfna, 1"0,10 de renol (MYP)
(Mossel y cot, 1967)
Composlcl6u. del med10 buec
Extracto de carne
1 g
Peptona
10 g
d-Manito1
10 g
Cloruro s6d1co
10 g
Rojo de reno;
Agar
0,025 g
15 r
Prepa.raco,l6n del med!o completo:
Aiiadfr los componentes So 890 mI. de agua.
destllada, mezclar bien y calentar a ebulllcl6n
basta disoluc16n co:npleta. J::nfrIar a ~~.
y ajustar el lJH del medio a 7.2 + O .~ . Repa.r~ en vollimenes de 90 mI. y esterU1zar a 121'10.
durante 15 minutos. EpfrJar a 45?C. y ~
a 90 ml, de medio base, 10 ml, de emU1s16n de
yema de huevo (prepararla en la forma seftala.
da en el medio 3 0 utllizar un producto comerctat adecuado) y 1 ml, de soluc16n aouosa al 0,1%
de sul!ato ' de poIlmlxina B esterW,z"do por fUtracl6n. Elt1ste en el comercto en torma ~t­
drata!fa, prcpararlo s1gulendo las fnStrucc10nes
del
envaae.
A,S Agar &rlhuUrlDa
Compostd6Q del med10 base:
Reptooa especial
Extr&cto de leva.dura
.A(ar
1'repuar.t6n:
Suspender los lXlgredlentes en un
destilada, mezclar bllm y cale,ntar a
!!Mfa tUsoluc16n completa. AJustar el
Dtstrlbu.Ir· en w1Wnenes de 100 mI. .,
93022
~ !
8 f:
~r
1 d'3 stua
ebU1l1cl6D
pH a 7.1lI.
esterD1zar
Lima, Sabado 5 de Enero de 1991
,£{ Peruano
a
121~C. durante 15 min. Enfrlar a 80~C. y afiadir a 100 ml. de medic base, 1 g. de tributirina
(gUcerlna trIbutirato) neutra, caelntada a 80,0
Mezclar homogeneamente mediante movimlentos oscllatorlos. Despu~s del enfriamiento, el
medlo de cultivo debe presentar turbldez }:o·
mogenea. 5egUn Richards Y Sadex pueden utilizarse tambien, en lugar de trlbutirina, otros
gllrerldos como Trlolafna y trilinoleina.
Existe en el comerelo en forma deshldratada. Prepararl0 sigulendo las Instrucclonss del
envase.
A.6 Agar vloleta roJo bUls (VBBA)
Composlcl6D:
Extracto de levadura
Bg
Peptona
7g
Oloruro s6dlco
IS t
Sales blUares N11m. 3
1,6 AI
Lactosa
10 I
Rajo neutro (sol. 1% mlv)
3 ml
OriStal VIolete (sal ocuosa 0.1% m[v)
Agar
15 It
Preparad6n:
Afiacfir los componentes a un I. de AgUa
destlIada, calentar a ebuIllol6n basta t1Isalucl6u
eompleta, enfmr a 50-609C, ajustar Ia reacckSn de tal forma que el pH desput!s de la es terlllzacl6n sea de 7,4, dlstrlbuir al medto y
esterfIlzarl0 a 121~ durante 15 min.
A.7 caIdo cIe enrfqueclmlenfo para
Staphy10c00l'iU ser6n GlclIlttl ., Cantohl
COmpOslcl6n:
is,
1G g
Trlptona
Extraeto de carne
5g
Extracto de !Gw.dura
5g
CIoruro de lItlo
Mamol
5;
Cloruro s6dleo
1,2 g
Olleina
3g
Plruvato de sodlo
Preparacl6n 'del medlo cODllPleto:
D!solver los lngredlentes en un 1. de agUa
destllada y ltjustar el pH a 6.9. Repa~lr en cantldades de 19 mI. en tubos de prueba de 20 z 200
rom. y esteriIlzar a 1159q durant~ 20 min.
En esta forma, el medlo puooe 5$ :" conser.
vado a. 4!C. durante 10-12 d. Antes del uso,
regenerar pI medlo por calentamiento a 100 ~
en bafio de agua por 20 min . Enfrhr, a1lc{onar
0,1 ml. de una solucl6n al 1% (mN) de ~lu·
rlto de TlOtaslo ester'lIzada. por filtrac'6n a ~da
tUbo. Estc medio extste en el comerefo en f(lr.
ma deshldratada; prepararlo slgulen.do las Ind1caclones del envase .
A.S Ca1do laetosado verde brUlante bills
"Or
Z% (CLVBB)
Oompostcl.6n:
Peptona
10 g
Lactosa
10 ~
BJUs de buey desecada
20 g
Verde brllIante (sol. aeuosa al 0,5% m/v'
2,66 ml.
Preparael6n:
Dlsolver 1a Peptona y In Lactosa. en 500 mt.
de agtla destflada y afiadfr Ill. bllis de buey dlBuelta en 200 ml. de agua destilada. Completar
el volumen basta aproxiJnadamente 975 mI. con
&gUa destilada y ajustar el pH a 7.4. Aiiadlt
al verde brillante completar el volume,1 total
Julsta un 1., agltar y nItTar si es nece;;ar!') por
algod6n . Distribuir en vol\imenes de 10 mI. en
tubos contenlendo tubos de rermentacion Invertldos (75' x 10 rom) Y esteriUza;r a 121 90
durante 10 min.
Existe en el eomercio en forma deshldrata·
da, prepararlo en la forma Indlcada en a1 envase.
A.9 C':ldo MR-VP (BA>jo de MeIDo seJtdn
Voges-proskauer)
<:lomposlcl6n:
5g
Proteosa peptons.
~I
Glucosa
5g
Fosfato dlpottisico
Preparael6n:
Mad!r los componentes a un L de AgUa
destllada, calentar suavemente agitando eon
frecuencla basta dtsoluct6n compIeta, diStributr
volumenes de 5 ml. en tubes de cultlvo yesterilizar a 121 ~C durante 15 min.
Eldste en el comercfo en fonna deshfdratada; prepararlo slgnlendo las Instrucclones del
envasa.
.1..10 Caldo tetratfonato -verde brlDaDte
mocJ1ftcadG \'Or KauffmaDD
Composkl6n del mecJlo bue:
Triptosa 0 proteosa pePtona
Sales blUares
Carbooato eli1cfco
T1osulfato s6dlco
Pre!''l,racl6n tel medlo baBe:
Afiadlr todos los componentes 11 un I. de
agua destllada y mezcIar para disolver los rnaterlales soIubles . Enfrlar y conservar, st es
necesarlo, a s--.3 ~. El m1smo dia. en que e1
medlo va a u tillzarse, afiadlr por lltro, 2 mI.
de una solucl6n acuosa esterll R1 0.5% de verda
brll1ante pTev1amen~ esterlUzada poT eb!~l1lc16n
durante 10 mm, y, 20 ml . de una solucf6n de
yodo, agltar 1entamente para mezclar, resuspender e1 preclpftado y dist~lbulr a.s~ptlcamente
en In forma necesarla. El medio no debe ealentarse despues de la adlcl6n del ~odo.
Soluet6n de yodo: Para prepararla, disOlver
5 II de yoduro de potaslo y 6 g de yodo ertstellzado en 10 mI. de agua destUade. esterU en
un frasc{l f'sterU. Dllutr hasta 20 m1. con agt1a
destllada, est~ril y conservar en la oscurldad.
E1 enldo tetratlonato ex1s~ en et comercfo
en forma deshfdratada; prepatarlo slguietldo
las instrucelones del envase.
A.ll Ca.ldo tripton,ado
Disolver 10 g de trlptona en un Utro de
agua destllada, distrlbulr en porclones de 5 ml
en tubos de 150 x 15 mm . y esterlItzar a 121 9C
durante 15 min.
A.12 }\fedio selectJvo para ana.erobfos (para
prueba c1e .esterI1ldad)
Composicl6n:
Extraeto de levadura.
5g
3g
Extraeto de came
Trlptona
15 g
Glueosa
0,5 g
CLNa
2, ~ It
NaHPO. 2H 0
2,5 g
Cisterna HOI
0, I) g
Agar
15 tl
A&'UR
1,000 k'~
S'e dfsuelven todos los lngredlentes en el
ngua. Se ajusta el pH a 7,1 + 0.1 . Se esterillza
a 121 ~C por 20 min.
"Pk~.
93023
Li.DJa.,
sa~Q
5 de Enero de 1991.
1£( Peruano
A.13 Agar iDtusi6n cerebro coraz6n
Compostc16n :
InfUS16n de- cerebro de temero .• .•.. •...
200 ml
Infusi6n de coraz6n de vacuno ... ... •.
Peptona 0 proteosa peptona ••• .•• ••• '"
Oloruro s6tUco ••. •••
••••••.•••••
Fosfato c:'Us6d1co
•.. •.. ••• ••• ••
Glucosa ••• ••. •••
•
.
Alar ,..
2501D1
10 8
6 8
3,6 8
I
a
•.• •.•• ..••.••.....•
Agua
15 I
650 ml
Adicl0J1l9'lo en una proporc1Qn .de O,Q5o/e
Adicionarlo en una proporcii60 de 0.1~
-
Clorhidrato de cistefna '" •.. •.• •••
Alm1d6n soluble
... ... .• .... . ....
ci6n del agar y del c1orhidra,to de cJstefDa; J se
prepara de la manera siguiente:
Be adiciona 180 infusi6n de cerebro de temero
Be adiciona 1& lnfusi6n del cerebro de teme.
ro y la infusi6n de coraz6n de vacuno a 650 m1
de agua destilada, 1uego se adiclonan los otros
Ingredientes. Se reparte eo tubas, vol11meDea de
5 ml Y se esterillza a 121 ~ durante 15 mIa. El
pH final debe ser 7,4. Para obtener los meJores
resultados, se util1za. el medio e1 mlsm.o dfa de
su preparaci6n; en caso contrario, se hiene 0 se
trata 801 vapor el medio durante algUnos mInutos y se enfria antes de usarlo.
f 1& lnfusl6n de coraz6n de vacuno a 550 ml.
de agua destilada, luego se adiclODlU1 los otros
lngredientes, se calienta a ebulllci6n con agita·
ci6n basta disoluci6n completa y se esterillZa a
121 -o durante 15 min.
Existe en el comercio en forma deshidratada,
y se prepara siguiendo las tnstrucciones del
envase.
NOTA.- Para el caso del caldo cerebro
coraz6n mas 0,05% de clorhidrato de cistefna
mas 0,1% de almid6n solubre es la misma composici6n exceptu4ndose 180 8odici6n del agar. As!.
mismo, para e1 caso del caldo cerebro cora.z6n
mas 0,1% de almid6n soluble se excepttia 180 adfJ1.14 Agar para aneroblos
ComposIcl6D:
Existe en el comerclo en forma deshldrata·
da y se prepara slguiendo las instrucclODe8 del
envase.
serUu Brewer
a
Extracto de levadura ... ... ... . .....
Triptona ...•• . .•.
Proteosa igual peptona. . . .. . . •.
Dextrosa
.
C1oruro s6dico.. •
.. .•
Agar
II-
0,(lO3 8
1000 ml
.
PREPARACION
Be d1suelven los componentelJ 8Xl 1 000 mi.
de agua destilada frla, y se caIienta basta ebuUlcl6n para diso1ver e1 medio por comp1eto. Se
distribuye en frascos y se esterWza en el eutoclave durante 15 min a una presi6n de 15 Ib
(121 ~C). Be reparte e1 medio en c4pSUlas petri
empleando 50 - 75 ml. del medio en c4pSUlas
petri de 95 mm x 15 - 20 mm. Para obtener
mejores resultados se utUizan tapaderas poroBaS en las c4psUlas que contlenen el medio duo
A~5
20 •
I 8
..
.
. ..
'"
I
8
10 8
10 I
e8
.
Tioglicolato s6dico '" .. . . .. •.
Sulfoxllato de formaldehido s6dico .. .
Rasazurlna certificada
. ..
Agua
a
rante 180 solldWcaci6n a fin de obtener una au·
perficie seea, Se inocUla 180 superf1c1e del mecUo
por frotis 0 veteado. Be cubre Ia ClI.psQJa ~.
CUlada con una tapadera de cApsUla PETRI
anaenobia de Brewer. Es esenc1al qu8 81 anU10
de precinto dentro de Ia tapadera bags un per.
fecto contacto con e1 media. Este precinto DO
debe romperse antes del final del perlodo de In·
cubac~6n. Pueden bacerse la!I pJacas colocando e1
lnoculante en la c4psula meacl4ndolo can e1 media antes de que se solidifique. La reaccl6n. fl·
nal del medio sem de un pH de 7,3.
caklo Laurtl sulfato trlp&osl
CoDqJOstcl6n:
'l':riptoS80, triptona 0 trtptlcas .. .• ••.• ••
20 ir
a I
3,'m Ir
I,'m 8
Lactosa
.
Fosfato dlpot4sico ••. •.. •. • . •• ••• •.•
Fosfato monopot4sico •.. ... •" ••• ••••
Cloruro s6d1co
..
..
Lauril sulfato s6dlco • ..
• •
..
a
8
0,1 8
PRENBACION
fermentac16n Invertldos (75 :It 10 mm) '1 Be g.
terWza a 121 ~ durante 15 min. pH f1nal 6.&
Be disue1ven los componentes en 1 1 de agua aproxln:1adQmente. Exlste en el comerclo en for·
destllada, se distrtbuyeo en vo1mnenes de 10 m1 rna deshidratada; y se prepara siguiendo las 1DI.
en tuOOs de 150 x 15 nun, contenlendo tubas de trucclones del envase.
Pag.
93024