TESIS
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CAMPUS XALAPA “AISLAMIENTO DE BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS PRODUCTORAS DE EXOPOLISACÁRIDOS EN UN MEDIO A BASE DE PILONCILLO.” TESIS PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA EDUCATIVA: Experiencia Recepcional Programa Educativo: Ingeniería en Alimentos PRESENTA Laura Alejandra Montiel Pineda DIRECTOR Dra. Carmen Bulbarela Sampieri CO-DIRECTOR Dr. Micloth López del Castillo Lozano Xalapa Enríquez Veracruz 2014 1 DEDICATORIA La presente se lo quiero dedicar primeramente a Dios por ser mi compañero en todo momento. A mis abuelos, Rubén Pineda García y Cándida G. Yedra Azcuaga, dos personas que aún desde el cielo me cuidan y me motivan a seguirme superando, esperando algún día llegar a ser tan grandes como lo fue cada uno, gracias por todo ese amor y sus enseñanzas, por mostrarme cuantas cosas hermosas tiene la vida. A mi madre, Sonia Laura Pineda Yedra, quién desde siempre ha depositado su confianza y amor en mí, lo cual me ha ayudado a crecer como ser humano, y hoy, como profesionista. A mi padre, Alejandro Montiel Galicia, porque siempre ha encontrado la manera de inculcarme fuerza y perseverancia ante los retos de la vida. A mis hermanas, Fabiola M. Montiel Pineda y Sandra L. Montiel Pineda, dos pequeños seres que me han acompañado desde el principio hasta ahora. A mi novio, Irving Cortes Flores una persona maravillosa que Dios puso en mi camino para compartir este logro y muchos más. A mis tíos Rubén Pineda Yedra y María de Lourdes Garcia Zertuche, por su cariño y confianza en todo momento. Finalmente, a mí, como muestra de que los sueños y las metas sí se pueden cumplir. 2 AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a Dios porque siempre he podido contar con su apoyo y bendición. A mi familia; cada uno me ha dejado enseñanzas en el transcurso de mi vida, gracias por los buenos y malos momentos, porque de cada uno se aprende, se toma lo mejor y se sigue adelante. A mi madre por esos desvelos haciéndome compañía, por tener la paciencia y la tolerancia para escucharme y darme el mejor consejo, siempre positivo, recordándome a cada momento lo capaz que soy. Gracias mamá, gracias por ser mi mejor amiga y estar para mí siempre. A mi padre por cada esfuerzo que ha realizado buscando mi mejora personal, por enseñarme el valor de las cosas, haciéndome fuerte e independiente día con día. Gracias por cada sacrificio papá. A mis hermanas por su cariño a lo largo de mi vida. Dios las bendiga. A mi novio, porque desde que lo conocí me ha brindado su apoyo, confianza y amor en todos los aspectos de mi vida. Gracias mi amor por cada enseñanza, sigamos creciendo juntos día a día, te amo. A la Dra. Carmen Bulbarela S., por todo el apoyo brindado durante este proyecto, sin usted hubiera sido complicado realizar una meta más en mi vida. ¡Gracias! A la facultad de Ingeniería Química, por los años de cobijo y permitirme laborar en sus instalaciones, culminando así mi carrera en ingeniería en alimentos. 3 INDICE DE ILUSTRACIONES FIGURA 1 ................................................................................................................ 28 FIGURA 2 ................................................................................................................ 28 FIGURA 3 ................................................................................................................ 36 FIGURA 4 ................................................................................................................ 39 FIGURA 5 ................................................................................................................ 40 FIGURA 6 ................................................................................................................ 41 FIGURA 7 ................................................................................................................ 41 FIGURA 8 ................................................................................................................ 43 FIGURA 9 ................................................................................................................ 45 FIGURA 10 .............................................................................................................. 46 FIGURA 11 .............................................................................................................. 47 ÍNDICE DE TABLAS TABLA 1. BACTERIOCINAS PRODUCIDAS POR DIFERENTES TIPOS DE BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS. ................................................................................................ 23 TABLA 2. IDENTIFICACIÓN PARCIAL DE LA CEPA M4 PRODUCTORA DE EPS AISLADA DURANTE LA REALIZACIÓN DEL PRESENTE TRABAJO. ............................................ 42 4 INDICE INDICE ...................................................................................................................................... 5 RESUMEN ................................................................................................................................. 7 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 8 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................................... 10 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 11 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................ 11 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................................... 11 HIPÓTESIS .............................................................................................................................. 12 1. MARCO DE REFERENCIA .................................................................................................. 13 1.1. BIOPOLIMEROS.................................................................................................................. 13 1.2. POLISACÁRIDOS MICROBIANOS ........................................................................................ 14 1.3. USOS DE LOS BIOPOLIMEROS EN ALIMENTOS................................................................... 15 1.4. BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS .............................................................................................. 16 1.5. CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS ......................................................... 16 1.5.1. POR TEMPERATURA .................................................................................................. 17 1.5.2. PATRÓN DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS .................................................. 17 1.6. FUNCIONES DE LAS BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS ............................................................... 19 1.6.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO ............................................................................................ 20 1.6.2. PRODUCCIÓN DE AROMAS........................................................................................ 21 1.6.3. PRODUCCIÓN DE GAS................................................................................................ 21 1.6.4. ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA......................................................................................... 22 1.6.5. PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS ........................................................... 22 1.6.6. PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDOS...................................................................... 24 1.7. CLASIFICACIÓN DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS ..................................................................... 25 1.7.1 HETEROPOLISACÁRIDOS................................................................................................ 25 1.7.2 HOMOPOLISACÁRIDOS.................................................................................................. 26 1.7.3 DEXTRANSACARASA ............................................................................................................. 30 1.7.4 LEUCONOSTOC .................................................................................................................. 31 2. METODOLOGIA ............................................................................................................... 33 2.1. MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................................................... 33 2.2. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE EPS...................................................................... 33 2.2.1. TINCION DE GRAM .................................................................................................... 34 2.2.2. PRUEBA DE CATALASA............................................................................................... 34 2.2.3. RESISTENCIA A VANCOMICINA .................................................................................. 35 2.3. PREPARACIÓN DE INÓCULO ...................................................................................................... 35 2.4. CINÉTICA DE CRECIMIENTO....................................................................................................... 35 2.4.1. DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR .......................................................................... 36 2.4.2. DETERMINACIÓN DEL PH ..................................................................................................... 37 2.4.3. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES .......................................................................... 37 5 2.5. 3. PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL EXOPOLISACÁRIDO .............................................................. 38 RESULTADOS Y DISCUSION .............................................................................................. 39 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6 AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE EPS ....................................................... 39 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE EXOPOLISACÁRIDO .......................... 40 CRECIMIENTO DE LEUCONOSTOC SPP Y PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDO.................. 43 CRECIMIENTO DE LEUCONOSTOC SPP Y CONSUMO DE AZÚCARES .................................... 44 PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDO Y EL CONSUMO DE AZÚCARES ..................................... 45 EFECTO DEL PH SOBRE LA PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDO ............................................ 48 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................................ 50 5. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 51 6. ANEXOS .......................................................................................................................... 56 6 RESUMEN El interés en la producción de exopolisacáridos a partir de bacterias ácidolácticas para la implementación en productos de la industria alimentaria ha incrementado conforme a la demanda de productos que requieren propiedades espesantes, emulsificantes o estabilizantes. El objetivo del presente fue la búsqueda de nuevas cepas de microorganismos productores de exopolisacáridos que puedan ser aplicados en la industria de alimentos. Para lo cual se realizó un aislamiento en un medio suplementado con piloncillo como fuente de carbono, encontrándose dos cepas productoras de EPS a partir del piloncillo. Se identificó parcialmente el microorganismo que presentó una mayor producción de EPS en caja. La cepa productora pertenece al género: Leuconostoc spp. Posteriormente se realizó un cinética de la producción del EPS, del crecimiento celular y de la producción-consumo de azúcares reductores. Los resultados encontrados fueron que el crecimiento celular a las 12 h de incubación contiene un recuento de 4.0 x 103 UFC/mL, mientras que la producción de EPS se incrementa gradualmente de 0.63 g/L a las 3 h hasta 16.5 g/L a las 12 h de incubación, con una velocidad de producción del EPS de 1.38 gL/h y una velocidad de generación de EPS de 43 min. A partir del crecimiento celular se compararon los azúcares reductores, estos aumentaron hasta 26.63 g/L a las 6 h, siendo éste el máximo consumo pues a partir de esa hora se observó un descenso el cual finalizo con 23.05 g/L a las 12 h con un crecimiento de 5.0 x 109 UFC/mL. El pH fue de 7.0 – 4.3 a las 12 h de incubación, cuando el pH decayó a 6.0 a las 6 h se observó el aumento en la producción de EPS. Por los resultados obtenidos es posible aislar microorganismos productores de exopolisacáridos a partir de un medio de cultivo suplementado con piloncillo como fuente de carbono, el cual podría ser utilizado como un espesante en la industria de alimentos. Palabras clave: Exopolisacáridos, bacterias acidólácticas, Leuconostoc. 7 INTRODUCCIÓN Desde el comienzo del siglo XX, se han desarrollado diversas tecnologías relacionadas con la producción de biomoléculas como las enzimas, antibióticos, metabólitos, y polímeros a partir de diversas fuentes naturales, para su uso en diversos sectores productivos como el sector agroindustrial, energético, medioambiente y diversas industrias tales como la farmacéutica y la alimentaria. En la industria de alimentos, la adición de polímeros de origen vegetal, animal y microbiano es una práctica habitual. Estos polímeros son moléculas de cadena larga y alto peso molecular que se disuelven o dispersan en agua modificando la textura del producto gracias a sus propiedades espesantes y gelificantes. También se utilizan como emulsionantes y estabilizantes, como controladores de la cristalización, para inhibir la sinéresis, para la retención de agua, como texturizantes para la encapsulación y para la formación de biofilmes. La mayoría de los biopolímeros utilizados en la producción de alimentos son polisacáridos provenientes de plantas, como los almidones, pectinas o gomas; de algas, tal es el caso de la carragenina y el alginato; de origen microbiano en el caso de goma xantana y dextrano. Estos polímeros están, en su mayoría, modificados químicamente para aumentar sus propiedades reológicas. En general, Los polisacáridos son polímeros naturales, no tóxicos, biodegradables, consistentes en unidades de azúcares o derivados de azúcares en una estructura lineal o ramificada. Las principales unidades son glucosa, galactosa y ramnosa en diferentes proporciones. En el caso de los polisacáridos de origen microbiano estos son de tipo exocelular ya que la célula los excreta hacia su superficie para cumplir diversos mecanismos biológicos en el exterior, por lo cual comúnmente son llamados exopolisacáridos (EPS). 8 Ejemplos de EPS industrialmente importantes es el dextrano producido por Leuconostoc mesenteroides, la goma xantana de Xanthomonas campestris y los EPS de la familia del gellan a partir de Sphingomonas paucimobilis. Estos EPS representan sólo una pequeña fracción del actual mercado de la producción de biopolímeros, ya que existen diversos factores que limitan el uso de estos EPS: su producción económica, ya que se que requiere un amplio conocimiento de la biosíntesis del polímero; adaptación de una tecnología de bioprocesos para la producción de los mismos; los altos costos de recuperación, y el origen no alimentario de la mayoría de los microorganismos productores. Algunos de los microorganismos tipo GRAS, (generalmente reconocidos como seguros), en particular, las bacterias ácidolácticas (BAL), propionibacterias lácticas y bifidobacterias, son capaces de producir EPS, lo cual las hace una alternativa interesante para la búsqueda de exopolisacáridos, los cuales pueden aplicarse como aditivos y espesantes en la industria alimentaria. 9 PLANTE AMIENTO DEL PROBLEM A Desde un punto de vista tecnológico, los polisacáridos constituyen productos de alto valor agregado, cuyo rango de aplicaciones se extiende cada vez más. En los últimos años se ha intensificado el interés en el uso de exopolisacáridos microbianos, principalmente propiciado por sus propiedades, al alterar el flujo del agua y la posibilidad de formar geles con las cuales se puede obtener un producto con una calidad constante y un precio relativamente estable. Anteriormente solo se producían polímeros por medio de plantas y algas, lo cual estaba condicionado a la posición geográfica y la temporada de las mismas. Su tiempo de producción oscila entre 3 y 6 meses, esto genera variaciones y la incertidumbre de contar o no con el producto, en cambio la generación de polisacáridos a partir de fuentes microbianas, es segura, ya que no está condicionada a la posición geográfica y temporada, fortuitamente el tiempo de fermentación de la misma está dada en semanas e incluso días, por lo cual la implementación de polisacáridos provenientes de fuentes microbianas es de vital importancia en la industria alimentaria, pues reduciría costos al desplazar polisacáridos de alto valor, y dependientes de condiciones externas. Por lo que el objetivo del presente trabajo es la búsqueda de nuevas cepas de microorganismos productores de exopolisacáridos que puedan ser aplicados en la industria de alimentos. 10 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Obtener exopolisacáridos a partir de bacterias ácidolácticas en medios enriquecidos con piloncillo, que puedan ser de interés en la industria de Alimentos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Ajustar un medio de cultivo para la determinación de la producción del polisacárido a partir de piloncillo. Aislar y purificar bacterias ácidolácticas que producen polisacáridos en el medio de cultivo con piloncillo. Determinar la cinética de producción del polisacárido en relación al crecimiento del microorganismo productor y del consumo de piloncillo en el medio de cultivo. 11 HIPÓTESIS Es posible aislar bacterias ácidolácticas que produzcan polisacáridos a partir de un medio de cultivo suplementado con piloncillo, los cuales pueden ser utilizados como espesantes en la Industria de Alimentos. 12 1. MARCO DE REFERENCI A 1.1. BIOPOLIMEROS Los biopolímeros son macromoléculas sintetizadas por diversos procesos biológicos, entre los más importantes se encuentran las proteínas, el ADN y los polisacáridos. Los polisacáridos son moléculas de carbohidratos poliméricos compuestos por cadenas de monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. Estos pueden tener estructuras lineales o ramificadas. Las funciones de estas moléculas son muy diversas, entre las principales son de almacenamiento como el almidón y el glucógeno, estructural como la celulosa y la quitina. Los polisacáridos son estructuras homogéneas cuando se forman por una sola unidad repetitiva, o heterogéneas cuando la estructura contiene dos o más unidades de repetición. Dependiendo de su estructura y el tipo de enlace, estas macromoléculas pueden tener distintas propiedades, pueden ser amorfos o incluso insolubles en agua. Cuando los monosacáridos en un polisacárido son del mismo tipo, el polisacárido se denomina homopolisacárido o homoglicano, pero cuando más de un tipo de monosacáridos está presente en la estructura se les llama heteropolisacárido o heteroglicano (Matthews, 1999). Las gomas son polisacáridos con características hidrofílicas o hidrofóbicas, que, usualmente, tienen propiedades coloidales, con la capacidad de producir geles o soluciones viscosas al combinarse con el solvente apropiado, esto es, tienen la función de agentes espesantes o gelificantes y estabilizantes de emulsiones (Dziezak, 1991, Pasquel 2011). Son exudados de plantas o ficocoloides (a partir de algas), y se diferencian entre sí por su composición y solubilidad. Los polisacáridos en la industria alimentaria se les consideran como gomas. En la actualidad son de interés los polímeros de origen microbiano. Los polisacáridos obtenidos de fuentes microbianas tienen ventajas sobre las extraídas de plantas o de algas, pues su producción no depende de las condiciones climáticas, 13 contaminación marina o fallas en la cosecha, los productos son poco variables en calidad y su producción puede ser controlada (García et al., 2004). 1.2. POLISACÁRIDOS MICROBIANOS Las bacterias convierten diversas fuentes de carbono en varios tipos de polímeros con propiedades químicas y físicas diferentes. Aunque las bacterias pueden sintetizar muy pocos polímeros intracelulares, el rango de polímeros extracelulares que pueden sintetizar es muy amplio, y la mayoría de ellas pueden sintetizar varios tipos de polímeros. Principalmente las bacterias pueden sintetizar cuatro tipos de polímeros: polisacáridos, poliésteres, poliamidas y polianhidridos inorgánicos (como los polifosfatos). Los polisacáridos bacterianos se subdividen en exopolisacáridos (xantana, dextrano, alginato, celulosa, ácido hialuronico y ácido colanico), los cuales son secretados o sintetizados extracelularmente por enzimas ancladas en la pared celular; los polisacáridos encapsulados (antígeno K30) y los polisacáridos intracelulares (glicógeno) (Rehm, 2010). Los polisacáridos microbianas tienen un elevado costo de producción, por el capital y la energía utilizada en el proceso, sin embargo, debido a su gran capacidad para formar geles con pequeñas cantidades, su producción es altamente redituable (García et al., 2004). Estos ya se producen comercialmente por medio de fermentación a gran escala, con un volumen de producción mundial anual de aproximadamente de 100,000 tons para los polisacáridos dextrano y xantana. Los polisacáridos producidos por bacterias de mayor importancia en la industria alimentaria son la goma de xantana, la goma gellan, las gomas celulósicas, las pectinas y el dextrano (Bhavani et al., 2010). 14 1.3. USOS DE LOS BIOPOLIMEROS EN ALIMENTOS El uso de polisacáridos en la industria alimentaria ha ido incrementando con el paso del tiempo, pues desde un punto de vista tecnológico constituyen productos de alto valor agregado y cuyo rango de aplicaciones se ha ido extendiendo cada día más. Ya que los polisacáridos realizan al menos tres funciones en el procesamiento de alimentos: emulsificantes, estabilizantes y espesantes. Además algunas también son agentes gelificantes, formadoras de cuerpo y agentes de suspensión. Es por esto, que el uso de fuentes microbianas se ha vuelto líder en el área de alimentos, gomas como la xantana, debido a sus excelentes propiedades reológicas es utilizada como aditivo para estabilizar emulsiones aceite/agua, estabilizar la espuma generada en los procesos de producción de cerveza e inhibidor de cristales en alimentos congelados. Otro claro ejemplo es el uso del dextrano, que funciona como agente espesante y estabilizante en confitería, jugos, mermeladas, etc. Algunos usados como prebióticos, son grandes fuentes de fibra, intensifica la dureza en productos cárnicos, retiene la humedad en productos de confitería, suelen producirse películas biodegradables y películas para recubrimiento de frutas y hortalizas. (Moosavi-Nasab, 2010., Shukla, 2011). 15 1.4. BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos conformado por diferentes géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas comunes. Tienen forma de cocos y bacilos Gram positivos, no esporulados, no móviles, anaerobios, anaerobios facultativos, microaerofílicos o aerotolerantes. Bioquímicamente son catalasa, oxidasa y bencidina negativas, no reducen los nitratos a nitritos. Son caracterizadas por la conversión de su fuente de carbono, azucares fermentables, a ácido láctico. Este grupo de microorganismos son ácidotolerantes, algunos miembros pueden crecer a pH de 3.2, sin embargo la mayoría se desarrollan a pH entre 4 y 4.5 (Parra, 2010). Existen factores que afectan su velocidad de crecimiento en los medios de fermentación; además de los nutrimentos y pH ácidos (pH < 5), la temperatura es un factor importante, así como las condiciones ambientales, por ser quimorganotróficos solo crecen en medios complejos (Vitamina B, péptidos, bases púricas y pirimídicas así como diversos aminoácidos). Los carbohidratos fermentables y alcoholes pueden funcionar como buena fuente de energía para formar principalmente ácido láctico mediante la degradación de hexosas a lactato (homofermentativas) y productos adicionales como acetato, etanol, CO2, formato y succinato (heterofermentativas) (Sánchez, 2005). 1.5. CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS Su clasificación abarca los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenoococcus, Vagococcus, y Weisella. Según su temperatura óptima de crecimiento, se clasifican en: termófilos y mesófilos y en base a su patrón de fermentación de carbohidratos y ruta 16 biosintética: Heterofermentativas (producen ácido láctico y otras sustancias) y Homofermentativas (solo producen ácido láctico) (Patel et al, 2012). 1.5.1. POR TEMPERATURA Termófilicas: Se encuentran las bacterias del tipo Lactobacillus y Streptococcus, su temperatura óptima es de 40 – 45°C, con un tiempo de incubación de 2 – 4 horas y una acidez final de 0,9% de ácido láctico. Estas cepas suelen ser utilizadas en la creación de yogurt y quesos madurados. Mesófilicas: En este grupo se encuentran las bacterias de tipo Lactococcus y Leuconostoc, su temperatura óptima de crecimiento es 20 – 25°C, con un tiempo de incubación de 18 – 20 h y una acidez final de 0,8% de ácido láctico. Estas cepas suelen ser utilizadas para kumis y quesos semi–madurados (García, et al., 2004). 1.5.2. PATRÓN DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS Homofermentación: El grupo de bacterias lácticas homofermentativas está compuesto por los géneros Lactobacilli y la mayoría de las especies de Enterococci, Lactococci, Pediococci, Streptococci, Tetragenococci, y Vagococci; las cuales por medio de la ruta Embden – Meyerhoff – Parnas convierten 1 mol de glucosa en dos moles de ácido láctico (85%), ya que contienen las enzimas aldolasa y hexosa isomerasa, pero carecen de la enzima fosfocetolasa. Solo producen ácido láctico. (Parra, 2010). El siguiente listado describe las características de la especie a la que pertenecen BAL homofermentativas (Bernal B. S et al, 2003). 17 Thermobacterium - Especie del género Lactococcus - Bastones alargados, aislados o en cadenas cortas. - Termófilos (temperatura optima entre 40 a 48°C). - Acidificantes muy enérgicos, hasta el 2.7% de ácido inactivo o levógiro. - Actividad caseolítica notable. Streptobacterium - Especie del género Lactococcus. - Bastones cortos en cadenas. - Acidificación muy lenta pero marcada (mayor de 1%), acido inactivo o dextrógiro. - Actividad caseolítica. Streptococcus: - Formas esféricas en cadena. - Acidificación rápida (mayor al 1%) - Poca actividad caseolítica. Heterofermentación: Este grupo está compuesto por los géneros Leuconostoc, algunas especies de Lactobacilos, Oenococci y Weissella. por la falta de las enzimas aldosa y hexosa y la presencia de la fosfocetolasa no puede utilizar la ruta EMP por lo cual emplean la vía de la hexosa monofosfato o de la pentosa. Dependen de la fosfocetolasa para metabolizar azúcares y ácido láctico, del cual se obtiene grandes cantidades de ácido acético y/o etanol con la generación de CO2. Producen el 50% de ácido láctico mediante la fermentación de 1 mol de glucosa el cual forma 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2 (Parra, 2010). Las siguientes especies están incluidas en este grupo, se mencionan algunas características propias de las mismas (Bernal B. S et al, 2003). 18 Bifidobacterium - Especie del género Lactobacillus bifidus - Bastones que se ahorquillan en los cultivos viejos - Producen ácido acético en proporciones elevadas y ácido láctico dextrógiro - Son anaerobios Betabacterium - Especie del género Lactobacillus - Tienen forma de bastón. - Producen poco ácido (0.5% máximo) en forma de una mezcla de ácidos, láctico, acético, succínico, etcétera. - No actual sobre la caseína, ácido láctico inactivo. Betacoccus - Especie del género Leuconostoc - Formas esféricas semejantes a los estreptococos, pero el ácido láctico producido es levógiro. - Se producen de los vegetales en descomposición, remolachas, etcétera. - Fermentan las pentosas y descomponen pectinas. - Fermentación viscosa con la sacarosa y producción de mucilago. 1.6. FUNCIONES DE LAS BACTERIAS ÁCIDOLÁCTICAS Las BAL y sus metabolitos producen de manera natural agentes antimicrobianos (también llamados biopreservadores), como lo son los ácidos orgánicos, diacetilos, acetoínas, peróxido de hidrogeno, reuterina, péptidos anti fúngicos, bacteriocinas etc, por su procedencia suelen aplicarse en los alimentos “Generalmente Reconocidos como Seguros”. Por ser reconocidas como GRAS, este tipo de bacterias son candidatas para la producción segura de exopolisacáridos (EPS) funcionales, los cuales son polisacáridos de cadena larga de ramificaciones de unidades repitentes de azúcares, principalmente glucosa, galactosa y ramnosa, los cuales contribuyen a 19 la textura, reología, sabor, percepción sensorial y estabilidad final del producto. Tienen efecto anti – tumor, anti – úlcera, efectos inmuno – estimulatorios y una disminución de niveles de colesterol en la sangre. En la producción de probióticos tienen efectos fisiológicos que incluyen la reducción del pH en el intestino, producción de algunas enzimas digestivas y vitaminas, reconstrucción y construcción de microflora intestinal normal después de desórdenes causados por diarrea, terapia de antibióticos, y radioterapia, suspensión de infecciones bacteriales, eliminación de carcinogenésis y mejoramiento de la absorción de calcio (Bourgeois, 2010., Sánchez, 2005). Una de las formas de obtener prebióticos es por medio de las fermentaciones, mismas que representan una de las técnicas de conservación de alimentos más antiguas que existen. La fermentación supone la transformación microbiana de un producto mediante el catabolismo de los carbohidratos, proceso en el que se forman ácidos orgánicos, alcoholes y/o CO2. Esto origina una modificación de las características organolépticas de las materias primas, obteniéndose una amplia gama de productos fermentados como el yogur, queso, mantequilla, embutidos, encurtidos, productos de panadería y diversas bebidas fermentadas (MoosaviNasab, 2010). 1.6.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Una de las funciones más importantes y relevantes en el crecimiento de las BAL es la formación de ácidos. Los sustratos son los carbohidratos simples, como la glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa. Producción de ácido propiónico: el ácido láctico es transformado en ácido propiónico y acético con producción de CO2, es utilizado en las queserías para la formación de los ojos. 20 Fermentación de ácido cítrico: el ácido cítrico es transformado en productos aromatizantes como la acetoína y el diacetilo, los cuales proporcionan al alimento de aroma, sabor y un poder antimicrobiano, suele ser utilizado en la producción de mantequillas y quesos. Producción de ácido láctico: Producto de la fermentación natural que ocurre en la mantequilla, quesos, cerveza, leche cortada, entre otros. Es utilizado como acidulante o inhibidor de esporas bacterianas en alimentos como dulces, panadería, bebidas no alcohólicas, sopas, productos lácteos, gelatinas, mayonesas etc., (Sánchez, 2005., Parra, 2010., Patel et al, 2012). 1.6.2. PRODUCCIÓN DE AROMAS Las BAL contribuyen al desarrollo del aroma de los productos fermentados mediante la producción de determinados compuestos (alcoholes, cetonas o ésteres) que actúan modificando las características organolépticas del producto. Así, la producción de diacetilo es necesaria para un correcto desarrollo del aroma en productos como la mantequilla y algunos quesos y leches fermentadas, mientras que el acetaldehído es el principal responsable del aroma del yogur. Otros volátiles como el ácido acético o las metilcetonas pueden propiciar el desarrollo de aromas en diferentes variedades de quesos (Sánchez, 2005., Parra, 2010., Patel et al, 2012). 1.6.3. PRODUCCIÓN DE GAS Unas de las producciones secundarias de las BAL es la producción de CO2 el cual se produce mayormente en microorganismos heterofermentativos como producto de la fermentación de azúcares. Sin embargo, también existe esta producción en tipos homofermentativas como consecuencia del metabolismo del citrato. Este tipo de subproducto es deseable en quesos donde es necesaria la presencia de cavidades aireadas para permitir el desarrollo de mohos (Sánchez, 2005., Parra, 2010., Patel et al, 2012). 21 1.6.4. ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA El sistema proteolítico de la mayor parte de las BAL consta de una única proteinasa extracelular con actividad caseinolítica, diversos transportadores de aminoácidos, transportadores de di- y tripéptidos y un transportador de oligopéptidos. El sistema se completa con aminopeptidasas y endopeptidasas intracelulares que intervienen en el último paso de la degradación, liberándose los aminoácidos esenciales para el desarrollo de las BAL. Un ejemplo de esto es la degradación de las proteínas de la leche que constituye uno de los principales procesos durante la maduración de los quesos, interviniendo en la textura final del producto como consecuencia de la degradación de la trama proteica del coágulo, así como en el desarrollo de aromas y sabores por la liberación de péptidos y aminoácidos a partir de la caseína de la leche, que actúan como precursores del aroma (Sánchez, 2005., Parra, 2010., Patel et al, 2012). 1.6.5. PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS Algunas BAL son capaces de producir bacteriocinas. (Tabla 1). Estos compuestos son péptidos de síntesis ribosomal que inhiben el crecimiento de otros microorganismos y no producen la muerte de la cepa productora. Su papel biotecnológico en la industria alimentaria es relevante, puesto que muchas presentan un amplio espectro de actividad frente a microorganismos patógenos y alterantes, y se utilizan como bioconservadores. Las bacteriocinas se clasifican en tres grupos: • Clase I (Lantibióticos). Son péptidos pequeños (<5 kDa), termoestables y que presentan aminoácidos inusuales en su composición, que se originan por modificaciones postraduccionales. En función de su carga y conformación 22 estructural, se subdividen en dos tipos, A y B, al primero de los cuales pertenece la bacteriocina más conocida, que es la nisina. • Clase II (No lantibióticos). Péptidos con un tamaño inferior a 15 kDa, termoestables y que no contienen aminoácidos modificados en su estructura primaria. Se subdivide en las clases IIa (péptidos activos frente a Listeria), IIb (formadas por dos péptidos diferentes) y IIc (no incluidas en ninguna de las anteriores). • Clase III. Proteínas de más de 15 kDa que están constituidas por aminoácidos no modificados y que son sensibles al calor. Tabla 1. Bacteriocinas producidas por diferentes tipos de bacterias ácidolácticas. Bacteriocina Microorganismo productor Nisina Lactococcus lactis subsp lactis Pediocina PA-1 Pediococcus acidilactici y Lactobacillus plantarum WHE92 Pediocina JD Pediococcus acidilactici JD1-23 Sakacina A Lactobacillus sake 706 Sakacina P Lactobacillus sake LTH673 Curvacina A Lactobacillus curvatus LTH1174 Mesentericina Y105 Leuconostoc mesenteroides Plantaricina E/F Lactobacillus plantarum C11 Lactococcina A Lactococcus lactis subsp cremoris Lactococcina B Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4 Lactacina F Lactobacillus johnsonii Divergicina Carnobacterium divergens LV13 Helveticina Lactobacillus helveticus Gonzales et al, 2013. 23 Las BAL también pueden sintetizar en menor cantidad otras sustancias con efecto inhibitorio, como el peróxido de hidrógeno, CO2, diacetilo y productos de reacciones secundarias como el hipotiocianato o el tiocianato. (Sánchez, 2005., Parra, 2010., Patel et al, 2012). 1.6.6. PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDOS Algunas BAL tienen la capacidad de sintetizar EPS que son polisacáridos de cadena larga producidos extracelularmente principalmente por bacterias y microalgas. Consisten en unidades de azúcares o derivados de azúcar principalmente glucosa, galactosa, manosa, galactosamina, N-acetilglucosamina y N-acetil ramnosa. Desempeñan un papel vital en la protección de microorganismos en condiciones adversas como la desecación, la falta de nutrientes, la presencia de compuestos tóxicos, la existencia de bacteriófagos y el estrés osmótico. Estos compuestos ayudan a los fenómenos de formación de biofilmes o biopelículas principalmente en la adhesión inicial y el firme anclaje de las bacterias a superficies sólidas, el secuestro de cationes, el reconocimiento celular y la patogenicidad. Los EPS suelen ser utilizados en la mejora de la reología, la textura, la estabilidad y la palatabilidad de productos lácteos fermentados, en problemas como baja viscosidad, fractura de gel o de alta sinéresis (separación de suero) características que se encuentran generalmente en la producción de yogurt. El queso fabricado bajo la influencia de los EPS presenta humedad, suavidad, cremosidad, mientras que el queso sin EPS se vuelve seco y granular. En conclusión los EPS, no solo mejoran la calidad sensorial del alimento, sino también prolongan la vida útil del mismo (Bhavani, 2010., Patel et al, 2012). 24 1.7. CLASIFICACIÓN DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS Los EPS de BAL se dividen en homopolisacáridos, los cuales están compuestos por un único tipo de monosacárido y hay un único enzima implicado en su síntesis, y los heteropolisacáridos, que están constituidos por dos o más tipos de monosacáridos, que pueden llevar unidos otras moléculas, y en su síntesis y polimerización están implicados varios enzimas. (Aznar, et al; 2012). 1.7.1 HETEROPOLISACÁRIDOS Su biosíntesis y secreción se producen en diferentes fases del crecimiento así como la cantidad y el tipo están reguladas por las condiciones del mismo. Estructuralmente pueden ser viscosos o mucosos, la composición de sus monómeros y variación en sus enlaces glucosídicos depende del medio de crecimiento y condiciones de cultivo como pH, temperatura, oxigeno, entre otros; Los medios que contienen hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, bases de ácidos nucleicos y sales minerales son adecuados para la proliferación de los HEPS, los componentes complejos como el extracto de levadura, extracto de carne y la peptona, interfieren con el monómero y la estructura de los HEPS (Sánchez, 2005., Patel et al, 2012). 1.7.1.1 KEFIRÁN El Kefirán es un heteropolisácarido soluble en agua producido por Lactobacillus kefiranofaciens, L. kefirgranum, L. parakefir, L. kefir y L. delbrueckii subsp. L. bulgaricus. El kefirán tiene proporciones aproximadamente iguales de glucosa y galactosa. Mejora las propiedades viscoelásticas de los geles lácteos ácidos. Su capacidad para formar películas transparentes comestibles aún está siendo investigada (Patel et al, 2012). 25 1.7.2 HOMOPOLISACÁRIDOS Los homopolisacáridos son moléculas formadas por la unión de unidades de un único monosacárido, sintetizados por diversas enzimas. La fructansucrasa produce fructanos como el Levano y de tipo Inulina, de la misma manera la glucansucrasa produce glucanos como el alternano, reuteran y dextrano (Patel et al, 2012). 1.7.2.1 LEVAN Polisacárido con viscosidad intrínseca relativamente baja, no gelifica ni se hincha en agua a temperatura ambiente. Las bacterias ácidolácticas que lo producen son Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, Lactobacillus sanfranciscensis LTH 2590 y L. reuteri LB 121. En L. sanfranciscensis LTH 2590 se ha encontrado la existencia de efectos prebióticos, las investigaciones han llevado a la conclusión de que podría utilizarse como un adhesivo ecológico o un bioespesante en alimentos (Patel et al, 2012). 1.7.2.2 DE TIPO INULINA Son fructanos o fructooligosacáridos. Lactobacillus johnsonii NCC 533 produce alta inulina de sacarosa mediante el uso de una enzima inulosucrasa. Streptococcus mutas JC2, Leuconostoc citreum CW28 y Lactobacillus reuteri 121 son otras BAL que producen inulinas. La inulina no es ingerible y funciona como prebiótico en alimentos funcionales, tiene tendencia a gelificar en soluciones acuosas por lo cual conserva la textura en los alimentos y los hace mayormente estables (Patel et al, 2012). 1.7.2.3 ALTERNANO Las cepas productoras de alternansacarasa son Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 1355, NRRL B- 1501 y NRRL B- 1498. El alternano tiene alta solubilidad, baja viscosidad y una gran resistencia a la hidrolisis enzimática. La enzima 26 alternanasa extracelular, despolimeriza el alternano produciendo oligosacáridos, estos oligosacáridos son utilizados como edulcorantes de bajo índice glucémico en confiterías y como prebióticos (Patel et al, 2012). 1.7.2.4 REUTERAN Es un glucano soluble en agua producido por reuteransacarasa es producido por la cepa Lactobacillus reuteri LB 121, L. reuteri ATCC 55730 y L. reuteri 35-5 debido a su solubilidad se utiliza panadería (Patel et al, 2012). 1.7.2.5 DEXTRANO Los cultivos de BAL como Streptococcus, Acetobacter o Leuconostoc, en medios que contienen sacarosa son capaces de generar polisácaridos. Sin embargo la dextransacarasa, (una enzima extracelular secretada por Leuconostoc mesenteroides hidroliza la sacarosa y produce dextrano (Figura 1), un homopolisácarido de alto peso molecular (106–109 Da) compuesto por una cadena lineal de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos α(1-6) en las principales cadenas y α(1-2), α(1-3) y α(1-4), el grado de ramificación en las cadenas varía según el origen de la dextransacarasa, la enzima que sintetiza al dextrano (Patel et al, 2012). Las moléculas de dextrano son solubles en agua formando fluidos con comportamiento newtoniano y presentan una viscosidad que cambian en función de la concentración, la temperatura y la masa molecular. La hidrolisis ácida de dextrano genera fracciones con una masa molecular definida. Esta propiedad junto con su baja inmunogenicidad ha permitido su uso en numerosas aplicaciones clínicas y farmaceúticas, por ejemplo como extensores de plasma sanguíneo y en cromatografía. 27 Figura 1. Estructura química del dextrano. La temperatura es un parámetro que afecta la actividad de la dextransacarasa, que, siendo activada desde los 5 °C, su actividad óptima está entre 25 y 30° C. El pH óptimo de la enzima productora de este EPS es de 7.0, el cual va disminuyendo durante el proceso fermentativo hasta llegar a un pH de 4.2 o 4.3. Cuando el pH cae a valores de 5,0 a 5,5; las células en crecimiento convierten el exceso de sacarosa hidrolizándola en dextrano y fructosa (Santos et al, 2000). Figura 2. Formación del dextrano a partir de la hidrólisis de la sacarosa La síntesis de dextrano se realiza por fermentación bacteriana o enzimática (Figura 2); las cepas de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F y NRRL B-640 son las utilizadas a nivel industrial para la producción de este polisacárido, ya que produce un 95% y un 97% de dextrano soluble. (Patel, Kasoju, et al., 2010). La fermentación bacteriana se realiza utilizando azúcar comercial como sustrato en concentraciones aproximadas al 5% (Santos, Texteira, et al., 2005) y en fermentaciones enzimáticas pueden llegar a ser alrededor del 20% de sacarosa y 28 se obtiene una concentración de dextrano de 20 g/L. (Rodríguez, Hanssen., 2007., Falconer et al., 2011). La purificación del dextrano se lleva a cabo una vez que el polímero se ha dejado de producir; el cual se precipita del medio de fermentación con un enjuague de alcohol, el cual puede ser metanol o etanol y se purifica mediante una precipitación adicional, después de la redisolución en agua, en caso de tener restos celulares, estos se eliminan por medio de la centrifugación. El proceso de purificación puede llevar dos o tres enjuagues con metanol o etanol y agua (Naessens, Cerdobbel, Soetaert W. et al., 2005., Purama et al., 2008). La producción de este polímero ha llamado la atención en la industria alimentaria por ser de bajo costo y de purificación rápida y eficiente, las cuales son características deseadas en el desarrollo de nuevos productos. 1.7.2.6 USO DEL DEXTRANO En la industria de alimentos se utiliza el dextrano por su propiedad de formar soluciones altamente viscosas como agente espesante o gelificante, texturizante y estabilizante en emulsiones como el helado, jarabes, mermeladas, jugos etc. En panadería la adición de 2% de dextrano mejora la suavidad, textura, volumen y absorción de agua en la harina aproximadamente del 12%. (Bhavani A., Nisha J., 2010) En confitería: suele ocuparse como estabilizante, al evitar la cristalización, mejorar la retención de humedad, aumenta la viscosidad y la duración del sabor (Bhavani A., Nisha J., 2010). En helados: se ha demostrado que en mezclas que contienen 2–4% de dextrano, confiere una alta viscosidad, la cual es una característica fundamental en el producto. Alimentos congelados y secos: otorga un recubrimiento en forma de película, que protege a los alimentos de oxidaciones y cambios químicos, ayuda a preservar textura y sabor, potencia aroma. Debido a la demanda creciente de comida rápida y productos congelados el dextrano podría utilizarse como conservador (Shukla et al. 2011). 29 1.7.3 DEXTRANSACARASA La dextransacarasa es una enzima glucosiltransferasa producida por la cepa Leuconostoc mesenteroides B 512-F que cataliza la transferencia de un residuo de glucosa, proveniente de la sacarosa, hacia cadenas de glucosa o bien a otras moléculas aceptoras teniendo como productos principales la síntesis de polímero llamado dextrano (Purama et al., 2008) La producción de la enzima dextransacarasa está regulada por el pH inicial del medio de cultivo, la temperatura de crecimiento del microorganismo productor, la fuente de carbono. El pH inicialmente de 7.0 disminuye por acción del ácido láctico producido hasta alcanzar valores inferiores a 5.0 al final del proceso. Fortuitamente, pasa así en la secuencia requerida, por el óptimo de crecimiento (7.0), el óptimo de síntesis de la enzima (6.0 – 6.9) y el óptimo de actividad (5.0 – 5.4). El proceso dura más de 16 horas y la temperatura se mantiene entre 26 y 29°C, ya que aunque el óptimo de crecimiento del Leuconostoc mesenteroides y la enzima son de 30°C, la dextransacarasa no es muy estable a esta temperatura (Naessens et al., 2005). El tipo de fuente de carbono utilizada es muy importante pues de esta dependerá la producción y el rendimiento de la enzima así como los métodos de purificación tales como ultrafiltración, fraccionamiento por polietilenglicol, sal, glicerol y la precipitación con alcohol, que se han estandarizado y utilizado con éxito para la purificación de dextransacarasa (Vettori et al., 2012). 30 1.7.4 LEUCONOSTOC El género Leuconostoc son bacterias en forma de cocos que se disponen en pares o en cadenas. Su metabolismo es de tipo heterofermentativo, produciendo ácido láctico, CO2, etanol y/o ácido acético como consecuencia de la fermentación de los azúcares. No son capaces de producir NH3 a partir de arginina, lo que los diferencia de los lactobacilos heterofermentativos, y su temperatura óptima de crecimiento varía entre los 25 y 30º C. Gracias a su capacidad para metabolizar el citrato, Leuconostoc es de gran interés como componente en los cultivos iniciadores, para dar lugar a una serie de compuestos, como el diacetilo, acetaldehído y acetoína, responsable del aroma y sabor de determinados productos fermentados, como la mantequilla, leches fermentadas y quesos, además tiene un efecto antimicrobiano (Kitaoka et al., 1999., Mulet, 2010). Tienen un efecto inhibidor de bacterias patógenas, gram negativas psicrofílas y gram positivas, debido a su producción de bacteriocinas, péptidos de síntesis ribosomal que inhiben el crecimiento de otros microorganismos y no producen la muerte de la cepa productora, en este caso, Leuconostoc. Funciona como regulador del aroma en productos donde la producción de acetaldehído es excesiva, lo cual puede originarse por la aparición de un defecto denominado como “manzana verde” o “yogurt-like” cuando la relación diacetilo:acetaldehído es menor de 3:1 el Leuconostoc tiene la capacidad de metabolizar el exceso de acetaldehído a etanol, corrigiendo ese problema (Capeka et al, 2011., Purama et al., 2009). En algunos tipos de quesos, es deseable la aparición de pequeñas aberturas u “ojos”, estos ojos son producidos por el CO2 liberado por el Leuconostoc como consecuencia de su metabolismo heterofermentativo de los azucares o bien por el 31 citrato presente en la leche, en leches fermentadas carbonatadas, el CO 2 proporciona la efervescencia deseada en estos productos. En quesos azules produce cavidades que son necesarias para el desarrollo de mohos además de inhibir posibles contaminantes sensibles a este gas. (Naessens et al., 2005). 32 2. METODOLOGI A 2.1. MEDIOS DE CULTIVO Para aislar bacterias productoras de EPS o EPS (+), se utilizó un caldo de aislamiento (MBP, medio base con piloncillo) el cual contenía 150 g/L de piloncillo, 5 g/L de extracto de malta, 5 g/L de extracto de levadura, 15 g/L de K2HPO4, 0.01 g/L de MnCl2, 0.01 g/L de NaCl y 0.05 g/L de CaCl2 a pH 7,0. (Modificado de Onilude et al 2013). El medio antes de ser esterilizado se centrifugó por 15 min a 2500 rpm para eliminar ciertos residuos sólidos que contenía el piloncillo. Se esterilizó a 121 °C durante 15 min. Cuando se requería se agregó 2 % de agar. Para la conservación de las cepas en congelación se utilizó caldo MRS DIFCOTM adicionado con 10% de glicerol y 10% de leche en polvo (MRS/GL, medio MRSglicerol-leche), el medio se esterilizó a 121 °C por 15 min. Para el mantenimiento de las células en fresco y para la medición del crecimiento celular se utilizó MRS adicionado con 2 % de agar. 2.2. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE EPS En la búsqueda de bacterias EPS (+) a partir de sacarosa, se adquirieron muestras de pequeños frutos (níspero y uvas), los cuales fueron obtenidos de mercados de la Ciudad de Xalapa Enríquez, Veracruz y Guadalupe Victoria, comunidad del estado de Puebla. Para realizar el aislamiento se hizo un lavado de los frutos (2-3 frutos) en un tubo de centrifuga con 40mL de solución salina (0.9 M), mediante agitación manual por aproximadamente 30 s. Posteriormente se retiraron los frutos y el líquido restante se centrifugó a 5000 rpm por 30 min, en una centrifuga HERMLE Z 300. El sobrenadante se eliminó y se vaciaron 35 mL de caldo de aislamiento. El medio se 33 incubo a 30 °C de 24 a 72 h observando el crecimiento cada 12 h. al momento que se observó crecimiento se sembró una alícuota del medio de incubación por estriado en placa. Los cultivos se hicieron por duplicado en dos medios: medio de aislamiento y medio base a 30 °C de 24 a 72 h. Las colonias que presentaron crecimiento con mucosidad semi/transparente fueron reportadas como positivas. A las cepas positivas se les realizó una tinción de gram y pruebas bioquímicas básicas para la determinación del género y fueron conservadas en congelación a 80°C en caldo MRS/GL. 2.2.1. TINCION DE GRAM Para la realización de la tinción de Gram se depositó en un portaobjetos limpio una gota de agua destilada, y sobre ella se depositó una muestra de una de las colonias de la cepa a analizar con ayuda de un asa de siembra. La muestra se mezcló con la gota de agua y se fijó a la flama de un mechero. Posteriormente se cubrió con la solución de cristal violeta durante 1 min, se enjuagó ligeramente con un chorro de agua y se aplicó el mordiente de yodo durante 1 min, se desechó y se lavó al chorro de agua. Con el portaobjetos inclinado, se agregó gota a gota una solución de alcohol acetona y se lavó con agua. Por último se cubrió con safranina durante 20 s, se desechó y se lavó con agua. El portaobjetos se dejó secar al aire, se le colocó encima de la muestra una gota de aceite de inmersión y se observó al microscopio con el objetivo de inmersión (100X) (McFaddin, 2003). 2.2.2. PRUEBA DE CATALASA Para esta prueba se tomó con un asa de siembra una colonia de un cultivo puro de 10-24 h de crecimiento de la colonia a analizar. La muestra se colocó en un portaobjetos, y se le agregó una gota de peróxido de hidrógeno al 30% sobre el cultivo y se observó la formación de burbujas (liberación de gas). La prueba resulta catalasa (+) si presenta formación de burbujas y catalasa (-) en caso contrario (McFaddin, 2003). 34 2.2.3. RESISTENCIA A VANCOMICINA Se realizó un cultivo de la cepa M4 en 10 mL de caldo MRS hasta tener una concentración de 0.5 en la escala de McFarland (equivalente a 1.5x 108 UFC/mL), a 600 nm; una vez alcanzada dicha concentración la suspensión bacteriana se estrió en una caja con agar MRS y se le colocó un sensidisco con 30µg de vancomicina (. Se incubo a 30°C durante 24 h. El crecimiento en el área de propagación se examinó para determinar la pureza del cultivo después de la incubación. la sensibilidad a la vancomicina se determinó como positiva si se presentaba alguna zona de inhibición (no crecimiento alrededor del disco) (Rouff, et al; 1988). 2.3. PREPARACIÓN DE INÓCULO Para determinar la producción del EPS durante el crecimiento del microorganismo se inició con la preparación del pre-inoculo, para lo cual se tomó una asada del microorganismo EPS (+) y se inoculó un tubo con caldo MBP estéril, éste se incubo a 30°C por 24 h. 2.4. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Para la determinación de la curva de crecimiento del microorganismo y de la curva de producción del EPS, se realizó una cinética en 400mL de MBP a pH 7.0, durante 12 h. El medio de cultivo fue inoculado al 10% a partir de un pre-inóculo de 24 h. Se realizaron muestreos cada 3 h, para la determinación de UFC/mL (por el método de dilución seriada) y pH por el método potenciómetrico. Por cada tiempo se tomaron 10 mL para la cuantificación del EPS producido (por método gravimétrico), y la determinación de azúcares reductores (por el método de Miller, 1959). 35 2.4.1. DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR Para obtener las unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL) se realizo mediante el método de diluciones seriadas, tomando 1 mL del cultivo cada 3 h durante 12 h. Las diluciones se realizaron en solución salina isotónica (0.9 M). El sembrado en cajas Petri se realizó colocando 1 mL de la dilución correspondiente y vaciando agar MRS a una temperatura de aprox. 50° C (Figura 3). Una vez solidificado el agar con la muestra, se colocó en la estufa a una temperatura constante de 30°C. Este procedimiento se hizo por duplicado. Figura 3. Procedimiento para el conteo de UFC/ml 36 2.4.2. DETERMINACIÓN DEL PH El pH fue determinado mediante con un potenciómetro de la marca Denver Power provisto de un electrodo de vidrio, para lo cual previamente se calibró el equipo con buffer pH 7. Para la medición de las muestras se tomaron 10 mL de cada muestra, las cuales primeramente se dejaron enfriar de 30° C a 20±1 °C y posteriormente se insertó el electrodo en la muestra, dejando 2-3 min hasta que la lectura permaneció constante. Al sacar el electrodo de la muestra se enjuagó primero con agua destilada, después con una solución de benzaldehído al 4 % para eliminar los microorganismos residuales que se quedaban adheridos al electrodo y por ultimo con agua destilada para eliminar restos del desinfectante. 2.4.3. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES El método de Miller se basa en la determinación de azúcares mediante el reactivo DNS, el cual tiene la capacidad de oxidar azúcares reductores dando resultados colorimétricos que pueden medirse a longitud de onda de 540 nm. Para la preparación de la solución DNS se disolvieron 10 g en 50 mL de NaOH 2 M. Paralelamente, 75 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado fueron disueltos en 12.5 mL de agua destilada. Las dos soluciones fueron mezcladas y se aforo a un litro. Primeramente se preparo una curva de calibración con fructosa. Por lo cual se prepararon soluciones de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2 1.5 mg/mL por dilución de un stock de fructosa en solución de 4 g/L, usando agua destilada y frascos volumétricos de 100 mL. Se graficó [azúcares reductores] contra absorbancia (Anexo I). 37 Para la medición del consumo o aparición de azúcares reductores durante la cinética de crecimiento y producción del EPS, primeramente se tomó 1 mL del medio fermentado a cada tiempo de muestreo y se precipitó el EPS con 1 mL de etanol al 96% frio. Se centrifugó por 10 min a 8000 rpm. A partir del sobrenadante se tomaron 100 µL y se diluyeron 1:20 con agua destilada. Posteriormente se tomaron 0.5 mL de la muestra diluida que se mezcló con 0.5 mL de reactivo de DNS. Las muestras se llevaron a baño de agua hirviendo por 15 min, se dejaron enfriar durante 15 min y finalmente se le agregó agua destilada para leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. 2.5. PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL EXOPOLISACÁRIDO Para determinar la producción del EPS durante la cinética de crecimiento se tomaron muestras de 10 mL del medio de cultivo, los cuales primeramente fueron centrifugados a 10,000 rpm durante 20 min a 4 °C en una centrifuga (Hermle Z 300), para eliminar las células en suspensión. Posteriormente se agregaron 10 mL de etanol al 96% a 4 °C a cada muestra y se agitaron por inversión suave durante 3 min, para lograr la precipitación del EPS. A continuación, las muestras se centrifugaron a 8,000 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante resultante fue envasado en pequeños frascos, etiquetado y congelado a -80 °C para realizar la determinación de azúcares reductores. Al precipitado resultante se le agregaron 10 mL de agua destilada, se agitaron mediante un agitador (Yellow Line) de 5 a 10 min hasta lograr la re suspensión y disolución del EPS y se dejaron en reposo durante 24 h. transcurrido ese tiempo se añadieron 10 mL de etanol al 96% a 4 °C, se agitaron y se centrifugaron a 8,000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se elimina y los precipitados se dejaron secar en una estufa BINDER a 40 °C durante 24 h, para finalmente pesar los precipitados obtenidos. 38 3. RESULTADOS Y DISCUSION Este trabajo se realizó en el laboratorio 34 de la Facultad de Ingeniería química y Ciencias Químicas de la Universidad Veracruzana. 3.1. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE EPS Se encontraron 6 microorganismos de los cuales 2 produjeron colonias viscosas semitransparentes en un medio suplementado con 15% de piloncillo; dichas cepas se nombraron como M3 y M4. Ambas colonias presentaron diferencias en cuanto a la producción de EPS en caja, por lo cual se decidió trabajar la segunda parte del estudio con la cepa que produjo más polímero (Figura 4). Figura 4. Crecimiento de la cepa M4 en medio suplementado con 15% de piloncillo . 39 3.2. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE EXOPOLISACÁRIDO Para la identificación de la cepa EPS (+) bacterias se realizó por medio de una tinción de Gram, en la cual se observaron cocos ligeramente ovoides, Gram (+) (Figura 5). La reacción ante el peróxido de hidrógeno para demostrar la presencia de la enzima catalasa fue negativa. En cuanto a la prueba de sensibilidad a la vancomicina, la cepa mostró ser resistente a la concentración de vancomicina utilizada para la prueba. La cepa presenta también una heterofermentación ya que durante el crecimiento se observó la disminución de pH debido a la producción de ácidos y la formación de espuma debida a la producción de CO2 (Figura 6) (Manual Bergey´s, 1994; Jofré, et al; 2006). La producción de EPS fue otro parámetro utilizado para la identificación parcial del microorganismo, ya que no todas las BAL producen este tipo de metabólitos. Para la identificación de la cepa encontrada se realizó una comparación de los datos obtenidos con los de aquellos microorganismos que esta reportado que producen EPS a partir de sacarosa (Tabla 2). Por lo que a partir de estos resultados se nombrara a la cepa M4 como Leuconostoc spp. Figura 5. Tinción de gram de la cepa m4. 40 Figura 6. Formación de burbujas de co 2 en el medio de cultivo suplementado con piloncillo, después de 12 h de crecimiento de la cepa M4. Figura 7. Precipitación con etanol del EPS producido por la cepa M4. 41 Tabla 2. Identificación parcial de la cepa M4 productora de EPS aislada durante la realización del presente trabajo. Microorganismo productor de EPS Forma Tinción de Gram Prueba de catalasa Prueba de vancomicina Tipo de fermentación Lactobacillus Bacilos + - Heterofermentativo Bacilos + - Heterofermentativo Bacilos + - Bacilos + - reuteri Lactobacillus fermentum Lactobacillus parabuchneri Lactobacillus Heterofermentativo plantarum Lactobacillus facultativo Bacilos + - Heterofermentativo sakei facultativo Leuconostoc Cocos mesenteroides en pares + - + Heterofermentativo + - - Homofermentativo + - - Homofermentativo + - + Heterofermentativo o cadenas cortas Streptococcus Cocos mutans en cadenas Streptococcus Cocos salivarius en cadenas Cepa M4 Cocos 42 3.3. CRECIMIENTO DE LEUCONOSTOC SPP Y PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDO En un cultivo de Leuconostoc spp en un medio suplementado con 15 % de piloncillo se inicio con una densidad celular de 3.0 x 105 UFC/mL, alcanzando a las 12 h de incubación un recuento de 4.0 x 10 3 UFC/mL, no se observó el inicio de la fase estacionaria temprana. La velocidad de crecimiento exponencial (expresada como tiempo de generación, G) fue de 43 min. La figura 8 muestra el efecto del tiempo de incubación sobre la producción del EPS por Leuconostoc spp. Se encontró que la producción se incrementa gradualmente de 0.63 g/L a las 3 h hasta 16.5 g/L a las 12 h de incubación, con una velocidad de producción del EPS de 1.38 gL/h. Figura 8. Crecimiento de Leuconostoc spp en UFC/mL (- -♦- -) y producción de EPS en g/L (▬▲▬) 43 En estudios de producción de dextrano realizados con diversas cepas de L. mesenteroides se ha observado que la máxima producción de este exopolisacárido se observa hacia la parte final de la fase exponencial. En un estudio realizado se observo que la máxima producción de dextrano de la cepa L. mesenteroides PCSIR-3 ocurrió a las 18 h comparado con 12 h en la cepa L. mesenteroides NRRL B-512F. En el 2013, Onilude, et al; observaron un comportamiento similar con una cepa de Leuconostoc spp aislada a partir de desechos de caña de azúcar, determinando una producción inicial a las 4 h de 0.8 g/mL (8.0 g/L) de EPS hasta un máximo de 8.0 g/100mL (80.0 g/L) a las 20 h de incubación, y posteriormente desciende hasta 6.0 g/100 mL (60.0 g/L) a las 48 h, y una velocidad de 4.5 gL/h, a una temperatura de 25 °C. 3.4. CRECIMIENTO DE LEUCONOSTOC SPP Y CONSUMO DE AZÚCARES Se comparó el crecimiento de Leuconostoc ssp contra el consumo de azúcares determinado por la concentración de azúcares reductores en el medio de cultivo, al ser la sacarosa (disacárido no reductor) el principal componente del piloncillo al inicio del crecimiento no se observó una concentración importante de azúcares reductores (0.27 g/L). Sin embargo a las 3 h de crecimiento del microorganismo se cuantificó la aparición de azúcares reductores (10.36 g/L) indicando que la sacarosa era hidrolizada, apareciendo en el medio, fructosa y glucosa (monómeros de la sacarosa), los cuales fueron cuantificados en conjunto y reportados como concentración de azúcares reductores. Los azúcares reductores aumentaron hasta 26.63 g/L a las 6 h; esto es, a la mitad de la fase exponencial de crecimiento y posteriormente se observa un descenso de estos hasta las 12 h donde se cuantificaron 23.05 g/L, (5.0 x 109 UFC/mL) (Figura 9). 44 Figura 9. Crecimiento de Leuconostoc spp en UFC/mL (- -♦- -) y consumo de azúcares reductores en g/L (▬■▬). 3.5. PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDO Y EL CONSUMO DE AZÚCARES A partir de las 6 h de crecimiento se observa un aumento en la producción de EPS a Leuconostoc spp, mientras que la aparición de azúcares reductores en el medio de cultivo inicia desde las 3 h. como un incremento en la concentración de azúcares reductores pasando de 0.27 g/L a 53.26 g/L. En una segunda fase, (6 h posteriores) se observa un ligero decremento de la concentración de estos azúcares de 53.26 g/L a 46.87 g/L. A la vez que se observa un aumento en la producción del EPS durante esta segunda fase. (Figura 10). 45 Figura10. Relación entre la producción de EPS (▬▲▬) y el consumo de azúcares (▬■▬) por Leuconostoc spp. Forsyth y Webley en 1950, observaron que cuando L. mesenteroides produjo dextrano a partir de sacarosa se originaron grandes concentraciones de azúcares reductores al inicio de la fermentación, principalmente se obtuvo más fructosa que glucosa. Estas concentraciones disminuían conforme la fermentación avanzaba aumentando la cantidad de dextrano, el cual se producía únicamente a partir de glucosa y no a partir de otros monosacáridos. Rodríguez y Hanssen, en 2007, hicieron una comparación similar, donde examinaron residuos agroindustriales (cascaras de piña, naranja y cachaza de caña) por medio de análisis fisicoquímicos arrojaron un porcentaje de consumo de 63,57. La cinética de consumo de sacarosa presentó dos zonas bien definidas desde la hora 0 hasta la hora 10, que mostro un descenso en la concentración, y se observó un pico y una segunda fase desde la hora 10 hasta la hora 18, cuando el consumo de la 46 sacarosa se hizo más acentuó debido al consumo doble entre el microorganismo y la enzima libre que polimeriza en el medio. Lappan y Floger, en 1994 observaron que en un medio de cultivo suplementado con sacarosa y glucosa, las células consumen casi toda la sacarosa antes de empezar a consumir la glucosa, y la concentración de glucosa aumenta y aparece fructosa en el medio de cultivo, esto como resultado del metabolismo de la sacarosa para el crecimiento del microorganismo y la producción de EPS. (Figura 11). Figura 11. Mecanismo de utilización de la sacarosa por Leuconostoc mesenteroides productor de EPS (Lappan y Floger, 1994). 47 3.6 EFECTO DEL PH SOBRE LA PRODUCCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDO Durante el crecimiento de Leuconostoc spp se observó una disminución del pH del medio de cultivo, el cual paso de pH 7.0 al inicio de la fermentación hasta llegar a 4.3 a las 12 h. Cuando el pH decayó hasta 6.0 aproximadamente se observa un aumento exponencial de la producción de EPS a partir de las 6 h de iniciada la fermentación hasta las 12 h (Figura 12). Figura12. Relación entre la disminución del pH del medio de cultivo (▬▲▬) y la producción de EPS (▬ ♦ ▬) por la cepa Leuconostoc spp. El intervalo de pH óptimo para el crecimiento celular de Leuconostoc spp es 6.0 a 6.9. Por lo tanto, se espera que el nivel más alto de producción de enzimas y de metabólitos se presente en este rango de pH. Sin embargo, Tsuchiya, et al., (1952) y Barker et al. (1993) Mostraron que cuando el pH decae a un valor en el intervalo de 5,0 a 5,5 la enzima dextrasacarasa es más activa y transforma la sacarosa en EPS. Resultados similares obtuvo Lazic, et al.,(1993) el cual realizaron fermentaciones con pH controlado entre 6.7 y 5,5; quienes encontraron 48 que a un pH de 5.5 es una condición favorable para la producción de EPS y reducir el tiempo de fermentación. 49 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACI ONES En el presente trabajo fue posibles aislar microorganismos nativos de la región que producen exopolisacáridos en un medio suplementado con piloncillo como fuente de carbono. Se aislaron dos cepas EPS (+): M3 y M4 con diferente producción del metabolito, ya que la cepa M4 fue la que produjo en mayor cantidad el EPS, por lo cual fue identificada como Leuconostoc spp. La cepa de Leuconostoc spp aislada en el presente trabajo utiliza la sacarosa del piloncillo como fuente de carbono y para la producción del EPS, realizando primero una hidrólisis de la sacarosa, para después aprovechar la glucosa para la formación del polímero, produciendo 17.5 g/L de EPS a partir de piloncillo en 12 h de fermentación. Se recomienda ampliar el estudio de producción de EPS ya que en la literatura se ha encontrado que algunas cepas de microorganismos productores de EPS tienen su mayor producción después de las 12 h de crecimiento del cultivo. Así mismo se sugiere utilizar otras fuentes alternativas de sacarosa como melaza o residuos de frutas para comparar el rendimiento de producción de EPS con la fuente presentada en este trabajo (piloncillo). El uso de reactivos con alto grado de pureza como componentes para medio de fermentación en la producción de dextrano impone alto costo en la industria; sin embargo, se logró demostrar que es posible la producción de exopolisacáridos utilizando fuentes de carbono locales y económicas, como lo es el piloncillo. 50 5. BIBLIOGRAFÍ A 1. Aznar, R; Dueñas, M. T; Jiménez, R; López, P; y Ruas-Madiedo, P. (2012) Exopolisacáridos de bacterias lácticas ¿me quieren o no me quieren?. Red Española de Bacterias Lácticas. http://redbal.iata.csic.es. 2. Bernal B. S., Gallegos D. C., Ibarra E. I. et al. (2003). Introducción a la tecnología de alimentos. Editorial Limusa, 2da edición. 3. Bhavani A. L., J. Nisha. (2010). Dextran - the polysaccharide with versatile uses. International Journal of Pharma and Bio Sciences. 1, 569 – 573. 4. Bourgeois, C. M; Acribia, S.A. Arpent, J. P. L. Microbiología alimentaria 2, Editorial 5. Capeka P., Hlavonova E., Matulová M. (2011). 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