Licenciatura en Ciencia y Tecnología de Alimentos AAA

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Licenciatura en Ciencia y Tecnología de Alimentos
AAA - 2012
UBA
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Métodos Enzimáticos
1.
Introducción
Las enzimas son catalizadores complejos, constituidos por proteínas globulares, que a
temperatura en torno a 37 °C, aceleran las velocidades de las reacciones químicas por un
factor de 1012 a 1020 respecto de las reacciones no catalizadas. Los catalizadores industriales
no enzimáticos tienen eficiencias de órdenes de magnitud inferiores. Es la eficacia catalítica
de las enzimas a baja temperatura lo que las hace importantes para el tecnólogo de los
alimentos. Esto representa que los alimentos pueden ser procesados o modificados mediante
enzimas a una temperatura moderada, 25 – 50 °C, a la que de otro modo los alimentos
sufrirían cambio sólo lentamente.
La tremenda capacidad catalítica de las enzimas es consecuencia de la reducción de la
energía de activación de las reacciones en que intervienen. En la Tabla 1 se puede observar
el aumento en la velocidad de reacción que producen las enzimas, en comparación con
catalizadores químicos. En el caso de hidrólisis del grupo amida, por ejemplo, las velocidades
de reacción son más de seis órdenes de magnitud en presencia de enzima que en sistemas
catalizados por ácidos o bases. De la misma manera ocurre con la conversión de H2O2 en H2O
y O2. En el caso de la urea, es aún más notoria la velocidad de actividad enzimática, ya que la
diferencia es de 13 órdenes de magnitud.
Tabla 1. Velocidades de reacción de reacciones enzimáticas, en comparación con las
catalizadas químicamente.
Sustrato
Amida (hidrólisis)
Urea (hidrólisis)
Peróxido de
hidrógeno (H2O2)
Catalizador
H+
OHα-quimotripsina
H+
Ureasa
Fe+2
Catalasa
T/K
325
326
298
335
294
295
295
K M-1.s-1
2,4 x 10-6
8,5 x 10-6
14,9
7,4 x 10-7
5,0 x 106
56
3,5 x 107
Las bajas energías de activación de las reacciones enzimáticas indican que la velocidad
de reacción tiene poca dependencia con la temperatura, por lo tanto una reducción de la
temperatura tiene relativamente poco efecto sobre la velocidad de la reacción. En
consecuencia, las enzimas pueden ser bastante activas incluso a temperaturas de congelación
y resultar, por ello, importantes estimulantes de las reacciones degradativas en los alimentos
refrigerados o congelados. Uno de los fines del tratamiento térmico es desnaturalizar e
inactivar de tal modo que los alimentos no se encuentren sujetos a su continua actividad. Otra
característica importante de las enzimas, además de su poder catalítico, es su especificidad.
Los catalizadores industriales no poseen esta especificidad de reacción. La especificidad de
las enzimas permite a los expertos en la ciencia de alimentos modificar selectivamente
determinados componentes individuales y no afectar a otros. Su especificidad también
permite utilizar a las enzimas como reactivos analíticos sensibles. El análisis de los
componentes de los alimentos puede, en muchos casos, simplificarse utilizando las técnicas
enzimáticas.
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2. Aplicaciones analíticas de las enzimas.
Los métodos analíticos enzimáticos juegan hoy día un rol muy importante en el análisis de
alimentos. Ellos permiten la rápida y segura determinación de numerosos compuestos de los
alimentos en el laboratorio, incluyendo problemas analíticos que son extremadamente
difíciles, si no imposibles, para ser determinados por métodos convencionales. Los
requerimientos básicos para el éxito y seguridad en los ensayos enzimáticos están en los
reactivos y condiciones de trabajo.
2.a. Determinación de sustancias por medio de enzimas.
2.b. Determinación de actividad enzimática en un dado alimento.
2.a. Determinación de sustancias por medio de enzimas.
En este caso las enzimas son usadas como reactivos para catálisis específicas de
reacciones químicas. De manera que es una forma especial de análisis químico, en que se
dosa el sustrato de una determinada enzima. Las determinaciones enzimáticas de sustratos se
emplean en la actualidad como método de rutina, en laboratorios de investigación y
desarrollo para la determinación precisa de ingredientes de los alimentos,
Ejemplos son:
a) la determinación de componentes normalmente presentes en alimentos: glucosa en la miel
por su oxidación específica mediante la glucosa-oxidasa y la determinación de ácidos
orgánicos como el láctico y el málico con enzimas específicas: la lactato- y la malatodehidrogenasa.
También se han elaborado técnicas de análisis enzimáticos para la determinación analítica
especifica de ácido cítrico, ácido glutámico, ácido pirúvico, ácido glucónico y glucono-deltalactona, colesterol, sorbitol y diferentes glúcidos en alimentos;
b) para determinar la naturaleza y concentración de sustancias extrañas en los alimentos,
como antisépticos, antibióticos, pesticidas u otros tóxicos.
c) como así también en la evaluación de productos del metabolismo de microorganismos
(como por ejemplo piruvato, lactato y amonio en leche, o succinato en huevo).
Requerimientos:
•
•
•
Disponibilidad de la enzima.
Detección sencilla, usualmente por formación de un producto coloreado o con
absorbancia al UV.
Transformación cuantitativa del sustrato. Para ello es necesario estandarizar
condiciones o parámetros de control tales como temperatura, tiempo de reacción, pH,
concentración de enzima, etc.
Ventajas de este tipo de método
•
•
•
•
•
•
Rapidez (en general requiere pocos pasos de preparación de la muestra).
Alta especificidad
Sensibilidad
Precisión.
Instrumental sencillo.
Pocas interferencias
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•
Condiciones suaves de reacción.
Limitaciones del método:
*
*
No todas las sustancias a analizar son posibles sustratos enzimáticos.
Disponibilidad de la enzima.
2.b. Medición de actividad enzimática.
Desde el punto de vista analítico, la valoración de la actividad enzimática en los alimentos
puede aplicarse para diferentes fines:
a) Como indicador del estado higiénico y de conservación de un alimento al determinar la
actividad dé alguna enzima producida por microorganismos, por ej., la prueba de la reductasa
y catalasa en leche y jugos;
b) para controlar tratamientos tecnológicos en alimentos que han sido sometidos a altas o
bajas temperaturas, como en el caso de la fosfatasa, peroxidasa y aldehído-reductasa, que se
usan para el control de pasteurización y esterilización de leche y de la prueba de la ureasa
residual en soja, para demostrar la destrucción total de sus componentes antibiológicos. En el
proceso de "blanching, blanqueado o escaldado", el test de peroxidasa es fundamental.
c) Medidas continuas de actividades enzimáticas durante el tratamiento, el almacenamiento y
en los procesos enzimáticos de maduración pueden suministrar importantes informaciones
sobre fenómenos biodinámicos que ocurren en los alimentos;
d) Evaluar aptitud para un fin dado. Ej: actividad diastásica (amilásica) en harinas.
Límite de detección y sensibilidad
Generalmente los términos límite de detección y sensibilidad se emplean indistintamente. Sin
embargo, el límite de detección es la mínima cantidad de analito detectable, que es aquella
cantidad necesaria para generar una señal que es de una magnitud de dos desvíos estándar por
encima de la señal del blanco (solución que contiene todos los componentes excepto el
analito).
La pendiente de la curva de calibración (señal vs. concentración de analito) se define como la
sensibilidad del ensayo; esta pendiente describe cuán de sensible es el ensayo a cambios de la
concentración de analito. Si la curva de calibración es no lineal, la sensibilidad es función de
la concentración.
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3.
Cinética de las Reacciones Enzimáticas
3.a. Cinética del estado estacionario
La reacción puede interpretarse como la unión de la enzima con el sustrato a través del
sitio activo, que es el responsable de la especificidad de la reacción.
La teoría cinética de Michaelis-Menten de la acción enzimática propone la
combinación reversible de la enzima (E) con el sustrato (S), formando un complejo
intermediario ES, el cual se descompone irreversiblemente para producir productos (P) y la E
libre.
k1
E+S
k3
ES
P+E
k2
k1, k2, k3. constantes de velocidad de cada una de las etapas de la reacción global.
La velocidad de formación del producto está dada por:
d [P ]
= k 3 [ES ] = v
dt
(1)
donde v es la velocidad de formación del producto. La concentración del complejo enzimasustrato es inicialmente cero pero rápidamente alcanza un nivel máximo, si la concentración
inicial de sustrato es mucho mayor que la de la enzima y luego declina lentamente. Entonces
en un instante dado la [ES] es aproximadamente constante, por lo que podemos aceptar que
existen condiciones de estado estacionario (Fig. 1)
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Por lo tanto
d [ES ]
= k1 [E ][S ] − k 2 [ES ] − k 3 [ES ] ≅ 0
dt
(2)
Reordenando esta ecuación se obtiene:
[E ][S ] = k 2 + k 3
[ES ]
k1
= KM
(3)
en donde KM es la constante de Michaelis-Menten. La concentración total de enzima [E0] esta
dada por:
[E0 ] = [E ] + [ES ]
(4)
Combinando las ecuaciones (3) y (4), obtenemos
[ES ] = [Eo ][. S ]
K M + [S ]
(5)
La velocidad de formación de producto seráv=
k 3 [E o ][
. S]
(6)
K M + [S ]
Puede calcularse experimentalmente de la pendiente de una curva de progreso, es decir, de la
pendiente de una representación de [P] en función del tiempo de reacción (Fig. 2). A medida
que transcurre una reacción enzimática, la línea de progreso va haciéndose curvilínea. Esto
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significa que la velocidad de formación de producto desciende durante el curso de la reacción
a causa de la depleción del sustrato. En la ecuación (6) se observa que v se hace cada vez más
pequeña a medida que disminuye la [S]. Existen otras razones para que v disminuya a lo largo
del tiempo. Si la reacción es reversible su funcionamiento en el sentido inverso va creciendo
en importancia al progresar la reacción e irse acumulando el producto. Por otra parte, el
producto de la reacción puede inhibir a la enzima. Se acostumbra a tomar como valor de v la
pendiente inicial de la curva de progreso (Fig. 2).
Si se obtienen valores de vo (velocidad inicial) a diferentes concentraciones de sustrato
y se representan luego frente a [S], se obtiene una hipérbola rectangular, como predice la
ecuación (6) y muestra la Fig. 3. A medida que aumenta [S] lo hace también v,
significativamente a concentraciones de sustrato bajas y lentamente cuanto más altas sean
éstas. Cuando [S] >> Km, la velocidad de formación de producto alcanza un valor máximo, al
que se denomina Vmáx; manteniendo constantes las condiciones de reacción (pH, temperatura,
concentración de cofactores, de enzima, etc). Decimos entonces que E se encuentra saturado
de S. Como norma general una concentración de 20 x Km de S se considera suficiente para
obtener una aproximación válida de Vmáx. En estas condiciones:
v = k 3 [E0 ] = Vmáx
(7)
Se comprueba en esta ecuación que Vmáx es independiente de [S], es decir, que la
reacción es de orden cero con respecto al sustrato. Por otra parte, Vmáx es de primer orden con
respecto a la enzima. Para un sistema enzimático dado puede lograrse aumentar Vmáx
incrementando la [E0], pero no aumentando [S0].
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Se observa también de la ecuación (6) que a bajas concentraciones de sustrato, la
reacción es de orden 1, tanto [S] como para la [E].
La constante de Michaelis-Menten (KM) constituye una medida de la afinidad de la
enzima por el sustrato (a menor KM, mayor afinidad, mayor velocidad de reacción). Cuando
la [S] es igual a KM, el término v se hace igual a Vmáx / 2. Esta constante expresa, por tanto, la
concentración de sustrato necesaria para semisaturar a la enzima. Si KM es grande, se precisa
una gran cantidad de S para saturar a la E; si KM es pequeña, basta una pequeña cantidad de S
para saturarla. La mayoría de las reacciones enzimáticas que utilizan sustratos no muy
complejos muestrean valores de KM entre 10-5 y 10-2 M.
Los dos parámetros más importantes en la teoría de Michaelis-Menten son KM y Vmáx.
Suelen determinarse por la representación de Lineweaver-Burk. Si tomamos la inversa de la
ecuación (6), obtenemosK
1
1
1
= ( M ).
+
v VMÁX [S ] VMÁX
(8)
que, al representar 1/v en función de 1/[S], corresponde a la ecuación de una recta en la que el
punto de intersección en el eje vertical vale 1/Vmáx, la intersección con el eje horizontal es 1/KM. Las representaciones de Lineweaver-Burk permiten obtener fácilmente KM y Vmáx.
Estos parámetros también pueden ser obtenidos representando v vs. [S] (Fig. 3), pero con
menor precisión. Existen también otras expresiones matemáticas para el cálculo de KM.
4. Factores que influyen en la velocidad de la reacción
4.a. Influencia de la temperatura
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En toda reacción química al aumentar la temperatura se incremento la velocidad de la
reacción. En las reacciones enzimáticas se debe tener en cuenta que al aumentar la
temperatura se desnaturaliza la enzima, y por lo tanto se inactiva disminuyendo la velocidad.
Por lo tanto existe una temperatura óptima de reacción que permite que la velocidad sea
la máxima posible. La temperatura influye en forma directa sobre la velocidad de la reacción
y a través de su influencia sobre otros factores (el pH de las soluciones buffer, las curvas de
absorción, la concentración óptima de los reactivos y la constante Km dependen de la
temperatura). Por ejemplo un aumento de temperatura en 1 °C conduce a un incremento de
aproximadamente el 20% de la actividad. Por lo tanto para comparar datos es fundamental la
estandarización de las condiciones.
4.b. Influencia del pH y de la composición de las soluciones buffer.
Análogamente debe establecerse una relación de compromiso entre el valor de pH
óptimo y la inhibición de la enzima. Al modificar el pH se modifica el estado de ionización
de la molécula de enzima, y por lo tanto se modifica la intensidad de las interacciones
enzima-sustrato, pero también se modifican las interacciones de la cadena proteica
cambiando la conformación de la enzima, lo que conduce a su inactivación.
La concentración y la naturaleza del buffer también son importantes ya que éste puede
inhibir a la enzima y la actividad enzimática puede modificarse con su concentración.
4.c. Activadores e inhibidores
Se los denomina efectores. Las determinaciones deben realizarse en ausencia de
inhibidores (detergentes, metales pesados) y deben contener concentraciones suficientes de
los activadores que requiera la enzima (ATPasas requieren Mg++, amilasas requieren Cl-).
4.d. Coenzimas
Las coenzimas son sustancias que cuando se unen con la enzima la transforman en una
enzima activa.
coenzima + enzima inactiva
enzima activa
Las coenzimas representan el centro activo o parte del centro activo de la enzima, de
manera que participan directamente en la catálisis pero no se regeneran sino que se
transforman estequiométricamente.
Las más utilizadas son NADH, NADPH (en sus formas oxidadas o reducidas).
NADP+ nicotinamida adenina dinucleótido fosfato.
NAD+ nicotinamida adenina dinucleótido.
5. Determinación de la actividad enzimática
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Cuando quiere determinarse el nivel enzimático en un alimento de una dada enzima,
no se mide la concentración enzimática (masa de enzima por masa de producto) porque lo
que interesa es la cantidad de enzima útil como catalizador, es decir interesa determinar la
actividad catalítica o actividad enzimática. Además las enzimas se encuentran en
concentraciones muy pequeñas, difíciles de determinar y a veces tampoco se conoce su masa
molar.
La actividad catalítica se mide en U/l o U/g o en mU/ml o mU/mg (unidades
enzimáticas por litro o gramo, miliunidades enzimáticas por mililitro o miligramo).
La unidad enzimática internacional (I.U.) es la cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 μmol de sustrato por minuto (en las condiciones determinadas de la prueba:
T, pH, concentración de sustrato, etc.) I.U. = μmol/min. La actividad específica se define
como las I.U. por unidad de masa (bajo dadas condiciones de pH y T), generalmente se
expresa en I.U. por mg de enzima sólida y es una medida de la pureza. En el sistema
internacional S.I. la unidad es el Katal que es la cantidad de enzima que consume 1 mol de
sustrato por segundo.
5.1. Determinación directa
Este método presenta la medición del:
-
Descenso de la concentración de sustrato.
Aumento de uno de los productos
Cambio de concentración de coenzimas.
Las determinaciones de actividad enzimática se realizan con una concentración de
sustrato saturante, de esta manera la reacción es de orden cero, y la velocidad inicial de
reacción es proporcional a la concentración enzimática. Cuando se consigue estar en esta
zona de orden cero, la velocidad de aparición del producto es lineal con el tiempo.
Es conveniente registrar la aparición de producto y no la disminución de sustrato, ya
que éste se encuentra en altas concentraciones iniciales para asegurar saturación, y será
menos sensible determinar la variación de su concentración que la del producto. Se trabajará
a pH, T, y [buffer] óptimos.
En la Fig. 4 se muestran las curvas de progreso a diferentes valores de [E0] Tales
curvas son lineales inicialmente, pero finalmente se tornan curvilíneas; por las razones que se
explicaron anteriormente. La pendiente inicial de la curva de progreso, equivale a la Vmáx
para cada [E0] ya que se está trabajando siempre a saturación de la enzima ([S0] >> Km).
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Las pendientes iniciales de cada curva de progreso pueden ser representadas frente a los
correspondientes valores de [Eo] para obtener una curva patrón para la determinación de
actividad enzimática, (Fig. 5). Las curvas que relacionan la velocidad de formación del
producto con la concentración de enzima son especialmente útiles en su tramo lineal. En éste
la pendiente es:
dvo
[P]
= cons tan te =
dE o
t1
(9)
donde vo es la velocidad inicial de formación de producto. La ecuación (9) indica que v0 es
proporcional a [E0]
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Al determinarse la actividad catalítica de una enzima, deben observarse las siguientes
normas:
•
•
•
•
•
Es preferible medir las velocidades iniciales empleando técnicas de seguimiento
contínuo.
Las determinaciones de enzimas suelen efectuarse con [S] 20 veces Km. Esto asegura
la máxima velocidad de reacción.
Las condiciones de reacción deben ser constantes y han de ser descriptas al informar
los resultados.
Debe determinarse la velocidad de la reacción en ausencia de enzima, empleando una
preparación enzimática inactivada por calentamiento.
Debe determinarse también la cantidad de enzima utilizada, de forma que pueda
calcularse la actividad específica, ya que la enzima puede constituir sólo una pequeña
parte del total.
5.2. Análisis a tiempo fijo:
Tiene la ventaja que ahorra tiempo y dinero. Pero se debe tener la precaución de tomar
el tiempo fijo cuando se está seguro de que la curva de progreso es lineal durante cierto
período de tiempo. Si dentro de ese período medimos [P] en un momento dado, t1, el cociente
[P]/t1 = vo (velocidad inicial de formación de producto) Esto es lo que simplifica el análisis.
No es necesario medir una serie de valores de [P] a lo largo del tiempo. Pero es preciso
reiterar que la curva de progreso debe ser lineal durante el tiempo elegido, t1. Si es curvilínea,
[P]/t1 no será igual a vo.
5.3. Análisis con enzimas acopladas
A veces no es conveniente o resulta imposible determinar directamente el producto de
una reacción enzimática. Sin embargo, el citado producto puede servir como sustrato para
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una segunda enzima, de forma que se obtiene un segundo compuesto que puede ser medido
convenientemente. En este caso, puede llevarse a cabo un análisis con enzimas acopladas. El
sistema enzimático a ensayar se acopla con una segunda enzima, que sirve como indicadora
para la primera. En esta situación tendremos:
E1
E2
A
B
C
Siendo A el sustrato para E1, la enzima a ensayar, B el producto de la acción de E1
sobre A y también sustrato de E2, la enzima acoplada o indicadora. C es el producto de E2. El
objetivo es seguir la velocidad de formación de C para determinar la actividad enzimática de
E1.
La velocidad de la reacción de la enzima indicadora debe ser, por lo menos, 100 veces
mayor que la de aquella cuya actividad se quiere medir. La reacción indicadora puede ser
también de naturaleza química en vez de enzimática, siempre que el producto de la primera se
convierta cuantitativamente y rápidamente en una segunda especie.
Para poder emplear una segunda reacción como indicadora es necesario que se cumplan
dos condiciones básicas:
•
•
La velocidad de desaparición de A debe ser de orden cero respecto de A y la reacción
debe ser irreversible.
La velocidad de formación de C debe ser de primer orden respecto de B y esta
reacción también debe ser irreversible.
Si la velocidad de desaparición de A es de orden cero respecto de A e irreversible, ésta es
función solamente de [E1]. Se cumplirá esta condición si [A0] >> KMA o si durante el período
de análisis sólo se consume una pequeña cantidad de A. Puede aceptarse que la reacción será
irreversible, puesto que B es retirado del sistema por la actividad de la enzima acoplada.
Podemos estar seguros que la velocidad de aparición de C es de primer orden con
respecto a B si [B] en estado estacionario << KMB. Esto puede lograrse efectuando el análisis
con un exceso de E2. Podremos asegurar que esta segunda etapa será esencialmente
irreversible si el análisis se efectúa en un corto período de tiempo, para evitar la acumulación
de C.
Si se cumplen todas éstas condiciones básicas, tras un corto período de latencia, la
velocidad de aparición de C será constante y proporcional a [E1]; dado que las reacciones
ocurren en estado estacionario.
6. Determinación de sustrato
Por su gran especificidad las enzimas pueden ser utilizadas para el análisis de
componentes de los alimentos sin necesidad de purificarlos previamente. Además muchas de
las reacciones enzimáticas son muy sensibles y permiten determinar incluso 10 -10 g de
material.
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Cuando se utilizan enzimas para la determinación de sustratos, es importante controlar
estrictamente las condiciones en que tiene lugar la reacción. Dado que lo que se desea
analizar es el sustrato, éste debe ser el componente limitante del sistema. Por lo tanto, los
activadores y cofactores, por ejemplo deben encontrarse en cantidad suficiente para saturar a
la enzima.
La concentración de sustrato puede ser determinada de dos modos:
•
•
Método de equilibrio o de conversión total. Se permite que la reacción se complete y
se mide la cantidad de producto formado por métodos físicos o químicos específicos.
Método cinético. Se basa en operar a concentración fija de enzima en condiciones
tales que la velocidad de reacción sea proporcional a la concentración de sustrato (o
de un activador o inhibidor, si es éste el que se desea determinar).
Cuando [S] es muy baja ( [S0] < 0.2 Km) las curvas de progreso deben ser lineales. De
la ecuación (6):
v=
K 3[E o ]
.[S ]
KM
(10)
Para obtener una gráfica patrón que relacione la velocidad de formación de producto
con la concentración de sustrato, se construyen curvas de progreso a diferentes valores de
[S0] y sus pendientes se representan en función de la concentración de sustrato
correspondiente.
6.1. Seguimiento de las reacciones
6.1.a. Si el producto de la reacción es coloreado, su concentración puede determinarse por
métodos colorimétricos, es decir, midiendo la absorbancia en el espectro visible. Ejemplos
de éstos son:
•
Las mediciones con oxidasas: se transfiere H desde el sustrato al 0 y se forma H202
como intermediario. Luego éste reacciona con una leucobase en presencia de
peroxidasa y se forma un colorante que se mide en el visible. Alternativamente el
H202 puede reaccionar con NADH en presencia de NADH:POD (por ejemplo en la
determinación de sulfito). POD:peroxidasa. De esta manera, las reacciones
indicadoras con la enzima peroxidasa puieden emplearse para el seguimiento de
cualquier reacción que produzca peróxido de H.
Ejemplos
Determinación de glucosa:
Medición de Sacarosa
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La medición de sacarosa requiere tres enzimas: invertasa, mutarotasa y glucosa oxidasa. La
invertasa convierte sacarosa a glucosa y fructosa. Mutarotasa permite la rápida conversion de
alfa-D-glucosa a beta-D-glucosa hasta que se establece el equilibrio. Luego beta-D-glucosa se
oxida en presencia de glucosaoxidasa, produciendo peróxido de hidrógeno, que en presencia
de peroxidasa oxida a un reactivo cuyo producto absorbe en el visible.
6.1.b. Si en la reacción intervienen coenzimas puede determinarse la formación (o el
consumo) de la especie reducida por espectrometría en el UV.
La medición de analitos con deshidrogenasa o reductasas vía la formación o consumo
de NAD(P)H es ventajosa, ya que los coeficientes de extinción que se usan para los cálculos
son perfectamente conocidos y las reacciones están libres de interferencias. Las formas
reducidas de las coenzimas NAD y NADP absorben a 334, 340 y 365 nm, por lo tanto se
puede medir su formación o consumo. En la Fig.6 se muestra el espectro de absorción del
NAD(P) y NAD(P)H.
Por ejemplo, además de emplear una oxidasa para la determinación de glucosa, como se
discutió previamente, alternativamente, se puede emplear una hexoquinasa como primera
enzima, y glucosa 6P deshidrogenasa como 2da. enzima:
Glucosa + ATP --Æ Glucosa 6P + ADP
Glucosa 6P + NADP+ -Æ 6 P glicérico + NADPH + H+
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En base a la absortividad molar de los productos, el ensayo de glucosaoxidasa/peroxidasa se
espera que tenga mayor sensibilidad y menor límite de detección.
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Otros ejemplos:
a) Ensayo para la determinación de ácido cítrico (y/o su sal citrato).
El ácido cíítrico (o su sal, citrato) es convertido en oxaloacetato y en acetato en una reacción
catalizada por la enzima citrato liasa (CL).
(1) Citrato
CL
Oxaloacetato + acetato
En la presencia de la enzimas L-malato deshidrogenasa (L-MDH) y lactato deshidrogenasa
(L-LDH), el oxaloacetato y su producto descarboxilado: el piruvato, son reducidos a Lmalato y L-lactato respectivamente por la nicotinamida dinucleótido adenina (NADH). (2,3).
(2) Oxaloacetato + NADH + H+
(3) Piruvato + NADH + H+
L-MDH
L-LDH
L-malato + NAD+
L-lactato + NAD+
La cantidad de NADH oxidada en las reacciones (2) y (3) es estequiométricamente igual a la
cantidad de citrato presente en la muestra. NADH se determina espectrofotométricamente
por su absorbancia en las longitudes de onda 334, 340, 365 nm.
b) Determinación de lactosa
La lactosa se hidroliza a D-glucosa y D-galactosa a pH 6,6 en presencia de la enzima βgalactosidasa y aguar (1).
(1) Lactosa + H2O Æ D-glucosa + D-galactosa
D-galactosa se oxida a pH 8,6 por (NAD) a ácido D-galactónico en presencia de la enzima βgalactosa deshidrogenasa (Gal -DH) (2).
(2) D-galactosa + NAD+ Æ ácido D-galactónico + NADH + H+
La cantidad de NADH formado en la reacción (2) está estequiométricamente relacionado con
la cantidad de lactosa y D-galactosa respectivamente. El aumento de NADH se determina por
la medida de absorbancia a 340 nm.
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6.1.c Acoplamiento NADH-diaforasa: las reacciones de formación se acoplan a la reacción
catalizada por diaforasa que transfiere H al iodonitrotetrazolio (INT). Se forma un
colorante formazán que se mide en el visible.
Sales de tetrazolio: amarillentas
Formazán: rojizos
Diformazanes: azules
7. Kits enzimátícos
El primer paso en el desarrollo de los kits enzimáticos en alimentos fue adaptar los
métodos enzimáticos de análisis clínicos al análisis de alimentos, y luego se desarrollaron
métodos especiales.
Estos kits contienen reactivos seleccionados y probados, y se encuentran en las
calidades adecuadas. Las ventajas que proporcionan dichos métodos son:
•
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Considerable ahorro de tiempo.
Seguridad analítica.
Fácil chequeo.
Por otro lado muchos de ellos han sido publicados como métodos de referencia o como
parte de leyes nacionales, y fueron estandarizados por comités internacionales.
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Licenciatura en Ciencia y Tecnología de Alimentos
AAA - 2012
UBA
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
En el AOAC (Association of Analytical Communities, que publica los métodos oficiales
de análisis) se introdujeron los métodos enzimáticos como métodos oficiales a partir de
1995, por ejemplo:
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L málico en jugo de manzana.
glucosa / fructosa en vino.
ácido cítrico en vino.
CO2 en vino.
Almidón en cereales.
1-4 βD glucanos en cebada y avena, cereales listos para comer.
Fibra
Lactosa en leche
Etanol en vinos
En la actualidad hay otros más.
8. Consideraciones prácticas para los ensayos enzimáticos.
Con cualquier ensayo que involucre enzimas, debe tenerse cuidado de que éstas no se
desnaturalicen: evitar temperaturas por encima de 40°C, valores de pH por encima de 9 o por
debajo de 5, presencia de solventes orgánicos, agentes surfactantes, metales. Siempre
conservar en frío, aún las preparaciones liofilizadas (las suspensiones en heladera, las
liofilizadas pueden almacenarse en freezer). Algunas enzimas se adsorben fuertemente al
vidrio, por eso muchas veces las preparaciones enzimáticas tienen un exceso de proteína
inerte, como albúmina, para evotar prérdida de actividad.
Las formas reducidas de las coenzimas piridínicas NADH y NADPH son sensibles a la luz,
humedad y altas temperaturas. Las formas oxidadas son más estables, pero igual requieren
cuidado en su manipuleo.
Debe cuidarse también la solución buffer, en lo posible prepararla en esterilidad.