Descargar PDF

Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
originales
Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso-99mTc
a partir de muestras de sangre entera
G. RABILLER, L. QUESTA, R. GALLI, F. VISCUSI, E. EL TAMER
Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José de San Martín. Universidad de Buenos Aires.
Comisión Nacional de Energía Atómica. Buenos Aires. Argentina.
Resumen.—Se presenta la preparación de un radiocoloide
que permite la marcación de leucocitos utilizando su
capacidad de fagocitosis. Dado que esta función es exclusiva
de los glóbulos blancos, no ejerciéndola otras células
sanguíneas, se probó la utilización de un coloide de fluoruro
estannoso marcado con 99mTc (F2Sn-99mTc) a fin de marcar
dichas células en muestras de sangre entera. Mediante
técnicas de separación celular en gradientes de densidad y
adquisición de imágenes en cámara gamma de la distribución
de radioactividad en tubos con Percol 90 %, se observó que la
marcación lograda es selectiva y de alta eficiencia para
leucocitos (en todos los casos fue mayor del 70 %), óptima
reproducibilidad, bajo costo y baja toxicidad celular.
PALABRAS CLAVE: Marcación de leucocitos.
Fagocitosis. Coloide. Imágenes de infección.
LABELING OF LEUKOCYTES USING STANNOUS
99MTC-COLLOID IN WHOLE BLOOD SAMPLES
Summary.—This paper presents the preparation of a
radiocolloid that still makes it possible to label leukocytes using
its fagocitosis capacity. Given that this function is exclusively of
the white blood cells, not being exercised by other blood cells,
the use of a stannous fluoride radiocolloid labeled with 99mTc
(F2Sn-99mTc) was tested in order to label leukocytes in whole
blood samples. Using cellular separation techniques in density
gradients and acquisition of images in gamma camera of
radioactivity distribution in Percol, it was observed that the
white cells labeling achieved was selective and with high
efficiency for leukocytes (in all cases, it was superior to 70 %),
optimal reproducibility, low cost and low cellular toxicity.
KEY WORDS: Leucocyte labelling. Phagocytosis.
Colloid. Infection imaging.
Recibido: 22-10-02.
Aceptado: 30-06-03.
Correspondencia:
Bioq. G. RABILLER DE LIS
Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas
José de San Martín. Universidad de Buenos Aires
Comisión Nacional de Energía Atómica
Avda. Córdoba 2351 Ciudad de Buenos Aires
1120 Argentina
E-mail: [email protected]
22
INTRODUCCIÓN
Los primeros métodos de marcación de leucocitos
se basaron en la captación de un radiofármaco
mediante la capacidad propia de este tipo de células
de fagocitar partículas1,2. Para este fin se prepararon
compuestos coloidales o partículas para marcar con
99m
Tc. Estos fueron dejados de lado cuando surgen en
el mercado radiofármacos lipofílicos capaces de
ingresar en el leucocito atravesando la membrana
celular (Ej. 99mTc-Exametazina –HMPAO e 111In–
oxima)3,9-12.
Evidentemente, dado que todas las membranas
celulares son lipofílicas, esta última metodología
requiere la separación de leucocitos previa a la
marcación, siendo una ventaja para los métodos que
utilizan la capacidad fagocítica, la posibilidad de
realizarlos en una muestra de sangre entera, tal como
lo demostraron Hanna R et al4,5,14 (fig. 1).
En experimentos de separación celular en
gradiente de densidad, Hanna et al demostraron que
un 80 % de la actividad se une a leucocitos, mientras
que Mock y English discuten el método asegurando
que un importante porcentaje se une a eritrocitos6.
En el presente trabajo se muestra por centelleografía
de columnas de Percol 90 % (gradiente de densidad)
que la actividad se concentra en proporciones
mayores al 70 % en la capa leucocitaria
coincidentemente con lo que demuestran otros
autores usando métodos autorradiográficos7.
El coloide de F2Sn-99mTc es de fácil preparación, es
económico y reduce la manipulación de muestras de
sangre, dado que no requiere la separación de
leucocitos.
Frente a estas considerables ventajas, este
radiofármaco, deberá probarse en estudios “in vitro”
de quimiotaxis e “in vivo” en convalidación clínica y
comparación con otros productos8,13.
Rev Esp Med Nucl, 2004;23(1):22-6
38
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Rabiller G, et al. Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso-99mTc a partir de muestras de sangre entera
FIG. 2.—A) Marcación de leucocitos en muestras de sangre entera,
separación en Percol y centelleograma. B) Separación con Hespan
6 % post-marcación de leucocitos, localización de la capa
leucocitaria en columna de Percol y centelleografía en cámara
gamma.
FIG. 1.—A) Marcación de leucocitos en una muestra de sangre entera.
B) Marcación de leucocitos separados con Hespan 6 %. Separación
en columnas de Percol 90 %.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de coloide estannoso
Se preparó un coloide estannoso a partir de una
solución acuosa de FNa y otra de F2Sn marcándola
posteriormente con 99mTc mediante rotación por una
hora. Para este fin se procedió de la siguiente manera:
Se disolvieron 5 mg de FNa en 5 ml de solución
fisiológica nitrogenada. Este vial se identificó con la
letra A.
En otro frasco se pesaron 64 mg de F2Sn que se
disolvieron en 10 ml de solución fisiológica también
nitrogenada. Se identifico como vial B.
En un frasco identificado como vial C, se
colocaron 4 ml de la solución A y se adicionó 1 ml de
la solución B.
A 2,5 ml de elución de 99mTcO4– con una actividad
aproximada de 50 mCi (1850 MBq) se agregó la
solución preparada en el vial C, filtrándolo a través de
una membrana tipo millipore de poro 0,22 um.
El coloide se marcó incubando esta solución
durante una hora a temperatura ambiente con rotación
39
continua. Los controles de calidad se realizaron por
cromatografía utilizando como fase fija ITLC, y con
metil-etil-cetona o solución fisiológica como fase
móvil. Concluido el proceso de marcación y
control de calidad se adicionó 1,5 ml del radiocoloide
(99mTc-SnF2) a 20 ml de sangre entera fresca,
heparinizada (100 UI/ml) y se mezcló con agitación
suave a 37 °C en baño de agua durante 1 hora (fig. 2).
Validación de la marcación de leucocitos
A fin de validar la marcación de leucocitos en una
muestra de sangre entera se siguieron los pasos que se
describen a continuación:
1. Marcación de leucocitos separados de muestras
de sangre extraída con ACD, sedimentando glóbulos
rojos mediante el agregado de HESPAN 6 %
(fig. 1B).
2. Marcación de muestras de sangre entera
extraídas con Heparina 100 Ul/ml mediante el
agregado directo del radiocoloide (fig. 1A). Todas las
muestras se incubaron con radiocoloide durante una
hora a 37 °C con agitación constante.
3. Centrifugación en Percol 90 % (partículas de
sílica de 15-30 nm de diámetro revestidas de PVP
Rev Esp Med Nucl, 2004;23(1):22-6
23
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Rabiller G, et al. Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso-99mTc a partir de muestras de sangre entera
Percol es capaz, por si mismo, de generar
espontáneamente gradientes, mediante centrifugación
a moderada velocidad. El rango de densidades
formado está dentro de 1,0 y 1,3 g/ml y son
isoosmóticos19. Las células se ubican en la fracción
superior mientras que en la fracción inferior lo hace
el coloide libre. Ambas columnas fueron
centelleografiadas en cámara gamma (figs. 2A y B)
obteniéndose imágenes de la distribución de actividad
y de los correspondientes perfiles a partir de los cuales
se realizó la integración de las distintas áreas.
4. En todas las marcaciones se determinó el
porcentaje de células viables mediante el uso de la
técnica de coloración de azul tripán y posterior
observación en microscopio. Para la realización del
conteo se uso una cámara de Newbauer procediendo
del mismo modo que para un recuento leucocitario. Se
contó el número de células coloreadas (azules) que
por alteración de la permeabilidad de la membrana,
permitieron el ingreso del colorante al citoplasma, lo
cual indica una alteración de su viabilidad. Se usó
como criterio estadístico el conteo de no menos de
200 células y se determinó sobre ellas el porcentaje de
alteraciones.
5. Posteriormente se analizó al microscopio la
composición celular de las capas, localizadas por
centelleografía en cámara gamma respetando la
distribución de radioactividad, habiendo en la capa
superior más del 80 % de leucocitos. La distribución
de la radioactividad guarda la misma proporción.
A
100
80
60
40
20
0
Cromatografía ITLC en MEK
Radiocoloide
99mTc
B
100
80
60
40
20
0
Cromatografía ITLC en Sol. Fis.
Radiocoloide
RESULTADOS
Productos intermedios
Eficiencia de marcación del radiofármaco
FIG. 3.—A y B) Control de calidad cromatográfico del radiocoloide.
–polivinil pinolidona– no dializable)19 y
centelleografía en cámara gamma a fin de observar la
distribución de radioactividad en las capas celulares.
El Percol al 90 % se preparó agregando 1 ml de ClNa
1,5 molar a 9 ml de Percol al 100 %. De esta solución
se tomaron 6 ml y se colocaron en tubos de centrífuga
de aproximadamente 10 ml. Esta operación se realizó
siempre por duplicado. Sobre la superficie de uno de
ellos se agregó 1 ml de sangre entera marcada con
coloide y en el otro, 1 ml de leucocitos separados post
marcación de sangre entera con HESPAN al 6 %. Se
centrífugo a 150 g (1150 rpm) por 30 minutos. El
24
El control cromatográfico en ITLC mostró que la
preparación del coloide permitía la obtención de un
radiofármaco con 90 % + /– 0,4 % de eficiencia de
marcación (n = 10) (figs. 3A y B).
Eficiencia de marcación de leucocitos
Las muestras de sangre entera heparinizadas
(100 U.I./ml) se marcaron con radiocoloide.
a) La eficiencia de marcación de leucocitos fue
determinada en Percol según el método ya descripto.
El porcentaje de actividad en la fracción leucocitaria
fue del 74 % + /– 4 % (siendo n = 5). Mediante un
Rev Esp Med Nucl, 2004;23(1):22-6
40
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Rabiller G, et al. Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso-99mTc a partir de muestras de sangre entera
microscopio óptico se corroboró que el 80 % de las
células que componían esta capa eran leucocitos.
b) Se separaron leucocitos a partir de alícuotas de
sangre entera marcada, según procedimientos
convencionales. Luego las fracciones leucocitarias se
sembraron en columnas de Percol al 90 %.
Se comparó la ubicación de la capa leucocitaria
identificada mediante la observación en el
microscopio y centelleografía en cámara gamma, con
la capa de mayor concentración de actividad de la
muestra de sangre entera marcada. Se observó que
ambas capas resultaron coincidentes (fig. 1 y figs. 2A
y 2B).
Control de calidad directo
Otra fracción de estas muestras de sangre entera
marcada se centrifugó a 200 g, según lo indicado en el
método de Hanna et al4,5, y se determinó la actividad en
plasma y en la fracción celular. Considerando que en
esta última, los leucocitos, exclusivamente tienen
capacidad
de
fagocitosis,
se
determinó
cuantitativamente la eficiencia de marcación siendo de
75 % + /– 4 % (para n = 5).
Viabilidad celular
El porcentaje de células viables fue del 95 % + /–
2 %, es decir, no más del 7 % alteró su viabilidad
durante la marcación (fig. 4).
DISCUSIÓN
Si bien existen antecedentes en la bibliografía
acerca de la marcación de leucocitos, aprovechando
su capacidad fagocítica mediante un radiocoloide en
muestras de sangre entera, esta técnica ha sido
discutida por algunos autores quienes argumentan
uniones inespecíficas a eritrocitos.
Por este motivo se han utilizado otros
radiofármacos, tales como el HMPAO-99mTc y
Oxima-In11115. El costo de estos productos es
generalmente elevado; además la ventaja de no
separar leucocitos previos a la marcación, evitando
manipuleos riesgosos para el paciente y el operador,
motivaron la realización del presente trabajo.
Los resultados evidencian la posibilidad de marcar
leucocitos en las condiciones descriptas, aclarando la
41
FIG. 4.—Foto de campo microscópico, donde se observa una célula
coloreada que indica alteración de su viabilidad.
controversia planteada por algunos autores. La
actividad no asociada a células puede eliminarse
centrifugando la muestra de sangre marcada durante
5 minutos a 150 g (1.500 rpm), separando el plasma y
agregando el mismo volumen de solución fisiológica
previamente a la reinyección.
Un radiofármaco similar se encuentra disponible
comercialmente, no obstante, el utilizado en esta
experiencia fue preparado en nuestro laboratorio. Si
bien contamos con campana de flujo laminar y el
equipamiento necesario para obtener un producto
estéril, el mismo se preparó sólo con la finalidad de
ensayarlo “in vitro”.
En una etapa futura, se propondrá para su
fraccionamiento y liofilización, en áreas
recomendadas a tal efecto16,17.
A fin de completar los estudios radiofarmacéuticos
de este producto próximamente se realizarán ensayos
de estabilidad del radiocoloide y se completarán las
pruebas de viabilidad celular analizando la quimiotáxis
de los leucocitos marcados18. La estabilidad de las
células marcadas ya fue estudiada por Hanna et al en
19844.
CONCLUSIÓN
La preparación de este radiocoloide permite la
marcación de leucocitos utilizando su capacidad de
fagocitosis aún en presencia de otras células
sanguíneas. Mediante esta técnica la marcación de
leucocitos es selectiva, de alta reproducibilidad, bajo
costo, baja toxicidad celular y fundamentalmente alta
eficiencia de marcación celular (superior al 70 %).
Rev Esp Med Nucl, 2004;23(1):22-6
25
Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
Rabiller G, et al. Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso-99mTc a partir de muestras de sangre entera
BIBLIOGRAFÍA
1. Fisher CH, Scheffel U, Tsam MF, Rhodes BA, Wagner HN.
Leukocyte tagging by phagocitosis of Tc-99m HAS
microspheres. Use in localization of experimental abscesses by
external scanning. J Nucl Med 1975;16:527.
2. McAfee JG, Thakur ML. Survey of radioactive agents for in
vitro labeling phagocytic leukocytes. II. Particles. J Nucl Med
1976;17:488-92.
3. P.A. Delima Ramos, J. Martín Comin, M.T. Bajen, M Roca Y.
Ricart, M. Castell, J. Mora, R. Puchal and M. Ramos.
Simultaneous administration of 99mTc - HMPAO – labeled
autologous leukocytes and 111 In – labeled non-specific
polyclonal human inmunoglobulin G in bone and point
injections. Nucl Med Commun 1996;17:749-57.
4. Hanna R, Braun T, Levendel A, Lomas F. Radiochemistry and
biostability of autologous leucocytes labeled with Tc-99m
stannous colloid in whole blood. Eur J Nucl Med 1984;9:216-9.
5. Hanna R, Lomas F. Identification of factors affecting technetium
99m leucocyte labelling by phagocytic engulfment and
development of an optimal technique. Eur J Nucl Med
1986;12:159-62.
6. Mock BH, English D. Leukocyte labelling with technetium-99m
tin colloids. J Nucl Med 1987;28:1471-7.
7. Mathew R. B. Puncher, Philip J. Blower Labelling of leucocytes
with colloidal 99mTc - SnF2: an investigation of the labeling
process by autoradiography. Eur J Nuc Med 1995;22:101-7.
8. J. Martin-Comin, E. Prats. Clinical applications of radiolabeled
blood elements in inflammatory bowel disease the Q J Nucl Med
1999;43:74-82.
9. Segal AW, Ensell J, Munro M. 111In tagged leukocytes in the
diagnosis of inflammatory bowel disease. Lancet 1981;2:230-7.
26
10. Saverymuttu SH, Peters AM, Lavander JP, Hodgson HJ,
Chadwich WS. 111In-labelled autologous leukocytes in
inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1981;80:1273.
11. Peters AM, Osman S, Henderson BL, Kelly JD, Danpure HD,
Hawker
RJ,
et
al.
Clinical
experience
with
99m
Tc-hexamethylpropylene amine oxime for labeling leucocytes
and imaging inflammation. Lancet 1986;25:946-9.
12. Peters AM, Lavender JP, Danpure HD, Osman S, Saveryuttu
SH. Technetium 99m analogous phagocyte scanning: a new
imaging technique for inflammatory bowel disease. Br Med J
1986(a); 293:450-1.
13. Segarra I, Roca M, Baliellas C, Vilar L, Ricart Y, Mora M, et al.
Granulocyte-specific monoclonal antibody technetium-99mBW 250/183 and Indium-111 oxine-labelled leucocyte
scintigraphy in inflammatory bowel disease. Eur J Nucl Med
1991; 18:715-9.
14. Radpharm Scientific leucocyte labeling bit, package insert,
1994 Radpharm Scientific, PO Box 223, Kippax ACT, Australia
2615.
15. M Roca, J Martin-Comin, et al. A consensus protocol for white
blood cells labeling with technetium-99m hexamethylpropylene
amine oxime. Eur J Nucl Med 1998;25:797-9.
16. Hirch JI, Tatum JL, Fratkin MJ, et al. Preparation and evaluation
of a 99mTc-SnF2 colloid kit for leucocyte labeling. J Nuc Med
1986;15(2):159-62.
17. Martinadale AA, Peris MJ, Turner JH, et al. Technetium-99m
leucocyte labeling using a lyophilized stannous fluoride colloid
kit. Prog Clin Biol Res 1990;21(9105):257-60.
18. Roca M, Iglesias F, García V, Armero F, Díaz MC. Chemotaxis,
viability and labeling stability of leucocytes labeled with
99mTc-Exometazime stabilized and metylene blue. J Nucl Med
2001;42:505-8.
19. Percoll methodology. Separation News 1 (1979) Pharmacia
Biotech.
Rev Esp Med Nucl, 2004;23(1):22-6
42