curso 2008 - 2009 - Asociación Española de Biopatología Médica

CURSO DE FORMACIÓN
CONTINUADA A DISTANCIA
TALLER DEL LABORATORIO
CLÍNICO
ALERGENOS RECOMBINANTES
CURSO 2008 - 2009
Nº 5
I.S.S.N.- 1988-7469
Título: Taller del Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Maquetación: AEBM
Fecha de Distribución: Marzo 2009
Alergenos recombinantes.
Artaza Álvarez, Carlos*; Casas Losada, Mª Luisa**
MIR3*; Tutora de MIR HUFA**; Hospital Universitario Fundación Alcorcón
1.INTRODUCCION
1.1
Bases inmunológicas de las reacciones de hipersensibilidad
Las distintos procesos alérgicos se caracterizan por respuestas anormales frente a
diferentes sustancias desencadenantes a las que se denomina alergenos.
La respuesta alérgica se inicia y mantiene mediante una red de interacciones de
células inmunológicas e inflamatorias (Fig. 1), con la participación de linfoquinas, en
respuesta a la exposición a los alergenos. Cuando un alergeno se pone en contacto
con el organismo se produce una respuesta frente al mismo, que básicamente sigue
los mecanismos de cualquier respuesta inmune. En primer lugar hay un
reconocimiento del antígeno por el sistema inmune. Así, el alergeno es captado por
una célula presentadora de antígeno (APC), quien lo interioriza y procesa en
pequeños fragmentos peptídicos para a continuación presentarlo, unido a moléculas
de clase ll del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), a los linfocitos T. El
reconocimiento de los antígenos por parte de las células T es altamente específico y
está mediado por el receptor del linfocito T (TCR). La interacción entre la célula
presentadora de antígeno (APC) y el linfocito T afín produce una activación parcial de
los linfocitos T que es completada con una segunda señal, aportada bien por
moléculas expresadas en las células presentadoras y células T o bien por factores de
220
crecimiento o por linfoquinas. La activación completa de la célula T conduce a la
producción de linfoquinas, a la proliferación de la propia célula T y a la activación y
proliferación de las células B, cuyo resultado final es la producción de anticuerpos
específicos del antígeno.
Figura 1: Esquema de la respuesta alérgica: interacciones de células inmunológicas e
inflamatorias (ver texto)
En el caso de las reacciones alérgicas, el subtipo de célula T que se activa tras
la interacción con el alergeno es el linfocito denominado Th2, que produce
preferentemente las interleuquinas IL-4,IL-5,IL-6, IL-10 e IL-13. La IL-4 induce, con
la colaboración de otras señales (moléculas CD40L expresadas en linfocitos Th2 y
CD40 en linfocitos B), el cambio de isotipo de la célula B hacia la síntesis de IgE, así
como una inhibición del subtipo Thl. Además, los linfocitos Th2, junto con IL-3 e IL221
10, estimulan a los mastocitos y basófilos; también estimulan a los macrófagos para
producir IL-I. La IL-5 es un potente factor quimiotáctico y de activación de los
eosinófilos. Los basófilos, mastocitos y eosinófilos, productores de IL-4 e IL-13 al
igual que los linfocitos Th2, activan a los linfocitos B, induciendo su diferenciación y
la producción de IgE. Los basófilos activados expresan también la molécula CD40L.
Por su parte, la IgE sintetizada se une a los receptores de alta afinidad presentes en
mastocítos y basófilos. Al contactar de nuevo el alergeno con el organismo, se
produce la unión de aquél con la IgE fijada a los mastocítos y basófilos, que da lugar
a la liberación por estas células de potentes mediadores preformados y a la síntesis
de novo de otros mediadores, cuyo resultado final son las manifestaciones clínicas
inmediatas, características de los procesos alérgicos. Estas sustancias producen
también el reclutamiento y la activación de diversas células inflamatorias, entre otras
los eosinófilos, en el foco de la inflamación alérgica, originando así la denominada
respuesta tardía (1). En definitiva, los mastocítos, basófilos y eosinófilos se
comportan de una parte como células efectoras, induciendo una respuesta
inflamatoria, y de otra como células inmunorreguladoras, activando a los linfocitos
Th2 y a los propios linfocitos B, induciendo la producción de IgE (2,3,4).
2. ALERGENOS
Se define a los alergenos como sustancias de naturaleza heterogénea, que
introducidas o en contacto con un organismo sensible producen la aparición de un
fenómeno alérgico, es decir la respuesta inmunitaria de éste, contra dicha sustancia
(5).
222
Los alergenos se pueden clasificar en exógenos y endógenos. Los alergenos
exógenos pueden subdividirse a su vez, según la vía de penetración en el organismo,
en: alergenos introducidos a través del aparato digestivo (cereales, mariscos,
fármacos); alergenos absorbidos a través de las mucosas (aeroalergenos: polen,
polvos insecticidas o pelos de animales); alergenos activos por contacto (disolventes
industriales, colorantes o cosméticos), y alergenos introducidos directamente en la
circulación sanguínea (antibióticos inyectables, sueros o venenos). Los alergenos
endógenos se forman durante el metabolismo o como consecuencia de la
descomposición intraorgánica de distintos elementos .
La mayor parte de los alergenos son proteínas, glicoproteinas y polipéptidos.
Su peso molecular oscila entre 5 y 70 Kd, su estructura corresponde a una cadena
de aminoácidos con cadenas laterales que se pliegan presentando una conformación
espacial (estructura terciaria) que permite que ciertas partes de la proteína queden
expuestas para ser reconocidas como antígenos. Algunas características, como la
capacidad de acceder al sistema inmune, la concentración y lacomplejidad molecular,
la solubilidad y estabilidad de la molécula y las características bioquímicas de una
proteína, favorecen que esta llegue a ser un alergeno en un paciente susceptible
(5,6).
2.1
Obtención de alergenos
2.1.1 Fuente o materia prima alergénica:
Son los materiales originales
a partir de los cuales obtenemos las sustancias
alergénicas. Las fuentes alergénicas pueden ser tan variadas como causas de alergia
223
existen, siendo las principales causas de alergia los ácaros, pólenes de plantas,
hongos, epitelios de animales y alimentos (7). Al ser por lo general materia viva, la
fuente puede tener variabilidad en su composición proteica tanto cuantitativa como
cualitativa, dependiendo de las condiciones de crecimiento de la misma en el caso
por ejemplo de ácaros, o de las condiciones climatológicas en el caso de pólenes.
2.1.2 Extracto alergénico:
Son preparados que derivan de la fuente o materia prima alergénica; son mezclas
complejas de biomoléculas, principalmente proteínas y glicoproteínas hidrosolubles,
así como carbohidratos, que constituyen todos los alergenos potenciales presentes
en la fuente, habiéndose retirado todo el material antigénicamente irrelevante. Es a
partir de este extracto que se obtienen los alergenos.
Obtención del extracto alergénico:
La elaboración de un extracto alergénico presenta una serie de procesos que
permiten garantizar que todas las proteínas alergénicas estén presentes en el
extracto final (Fig. 2). El proceso general de elaboración incluye la selección de la
materia prima, la extracción de proteinas hidrosolubles, la clarificación, la dialisis y la
esterilización. El número de alergenos presentes en un material biológico puede ser
grande pero no es ilimitado, y desde luego no todos tienen la misma relevancia en la
sintomatología clínica. En una fuente biológica dada podemos encontrar dos tipos de
alergenos:
224
•
Alergenos principales o mayores; se denominan así a aquellos alergenos frente a
los cuales son sensibles (presentan IgE específica) un elevado porcentaje de
pacientes (más del 50% de alérgicos al extracto alergénico completo)
•
Alergenos secundarios o menores; son aquéllos que son reconocidos por menos
del 50% de los pacientes alérgicos.
Figura 2: Fases para la obtención de extractos alergénicos
En la elaboración de extractos alergénicos
es importante disponer de un
extracto de referencia con adecuada caracterización tanto de su composición como
de su actividad alergénica (7,8). La caracterización del extracto incluye el análisis de
su contenido en proteínas y carbohidratos, el análisis proteico mediante técnicas de
electroforesis, el contenido de alergenos mediante inmunodetección y la valoración
de
su actividad biológica
o potencia in vivo, probando el extracto en pacientes
225
alérgicos y calculando la cantidad de alergenos mayores en el extracto utilizando
anticuerpos monoclonales.
La valoración biológica de los extractos alergénicos presenta importantes ventajas
como:
1) Permite establecer la potencia del extracto en base al contenido
de
alergenos o componentes activos.
2) Asegura la homogeneidad de los diferentes lotes de extracto mediante la
comparación con un extracto de referencia de actividad biológica conocida.
3) Asegura que extractos alergénicos procedentes de distintas materias primas
pero con igual actividad in vitro provoquen el mismo tipo de respuesta
cutánea en la población alérgica correspondiente.
La obtención de alergenos individualizados y la identificación de la naturaleza
de los mismos posibilita la realización de un mapa alergénico universal muy preciso,
así como un mapa epidemiológico de las enfermedades alérgicas en relación con los
agentes etiológicos reales (antígenos, epítopos) y no en base a las especies
animales, vegetales, fúngicas, protistas o mónera que los contienen (9, 10, 11).
3. BIOLOGIA MOLECULAR Y OBTENCIÓN DE ALERGENOS
La utilización de técnicas de biología molecular aplicadas a la obtención de
alergenos ha hecho posible disponer de grandes cantidades de material alergénico
estable y reproducible. El uso de la tecnología recombinante ha permitido la
226
obtención de material alergénico de alta pureza mejorando significativamente el
diagnostico y el tratamiento de los pacientes alérgicos (12).
3.1
Tecnología recombinante:
Se denomina así al conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un
organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta
manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un
virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.
Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran
escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y
lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana. Como las
bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de
proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. El
desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas
de investigación:
1) El conocimiento de las enzimas de restricción,
2) La replicación y reparación del ADN,
3) La replicación de virus y plásmidos, y
4) La síntesis química de secuencias de nucleótidos.
El desarrollo de la tecnología recombinante se remonta a 1869, cuando Miescher
aisló por primera vez el ADN. En 1944 Avery demostró que el ADN y no la proteína
contenía la información genetica. Watson y Crick en 1953 propusieron el modelo de
la doble helice
para la estructura del ADN. En 1957 Kornberg descubrió la DNA
polimerasa I, la enzima que ahora se utiliza para producir sondas de DNA marcadas.
227
En 1961 Marmur y Doty descubrieron la renaturalización del DNA, estableciendo la
especificidad y la posibilidad de las reacciones de hibridación de los acidos nucleicos.
En 1962 Alber proporcionó la primera evidencia de la existencia de las nucleasas de
restricción del DNA, lo que condujo a su posterior purificación y utilización en la
caracterización de las secuencias del DNA por parte de Nathans y H. Smith. En 1967
Geller descubrió la DNA ligasa,
la enzima que permite unir fragmentos de DNA.
Entre 1972 y 1973 Boyer, Cohen, Berg y colaboradores desarrollaron las técnicas de
clonaje del DNA. Entre 1975 y 1977 Sanger, Barrell, Maxam y Gilbert desarrollaron
metodos rapidos de secuenciación del DNA. Por último, en 1985 Mullis y
colaboradores idearon y desarrollaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
para amplificación del DNA (12, 13).
La tecnología del DNA recombinante in vitro es un término general que
engloba todas aquellas técnicas que conducen a la transferencia de información
genética (DNA) desde un organismo a otro, que generalmente sigue las siguientes
etapas (Fig. 3):
• El DNA de un organismo “donador” se extrae, se rompe enzimáticamente y se
junta (liga, une) a otro DNA (vector de clonación) para formar una nueva molécula
de DNA recombinado: construcción del vector de clonación-DNA insertado.
• Esta construcción vector de clonación-DNA insertado se transfiere y mantiene
dentro de una célula hospedadora (huésped); La introducción del DNA en la célula
huésped se denomina transformación.
228
Figura 3: Etapas en la tecnología del DNA recombinante
229
• Las células transformadas se identifican y se seleccionan
de aquéllas que no
contienen la construcción vector de clonación-DNA insertado.
• Si es necesario, la construcción de DNA puede manipularse para asegurarnos que
la proteína que es codificada por la secuencia del DNA clonado es producida por la
célula huésped (14).
3.1.1 Técnicas utilizadas para la tecnología del DNA recombinante.
1. Extracción y purificación del DNA
Para obtener el DNA libre de otros compuestos celulares se parte de una suspensión
celular, las células se lisan para liberar el DNA, se añade alcohol y el DNA precipita
en la interfase. Se retira el DNA y se transfiere a otro tubo, esta solución acuosa se
trata con RNAasas para eliminar el RNA y las proteínas se eliminan usando fenol (las
proteínas pasan a la fase orgánica y el DNA a la fase acuosa). Repitiendo estos
procedimientos varias veces puede conseguirse DNA puro. La solución de DNA así
obtenida nunca tiene la longitud de las moléculas nativas en la célula, ya que la
manipulación provoca roturas aleatorias del DNA. Si el DNA se ha manipulado con
cuidado, la longitud de los fragmentos será aproximadamente la centésima parte de
la longitud total del cromosoma.
2. Detección del DNA
El método más utilizado es la absorción de la radiación ultravioleta a una longitud de
onda de 260 nm. Esta absorción es debida a las bases púricas y pirimidínicas. El DNA
bicatenario absorbe menos que el monocatenario debido a que la interacción de las
230
bases complementarias en el DNA bicatenario reduce la absorbancia en el
ultravioleta.
3. Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es el procedimiento por el cual moléculas cargadas migran en
un campo eléctrico. El grado de movilidad viene determinado por su tamaño y su
carga eléctrica. En la electroforesis en gel el ácido nucleico se incluye en el gel,
normalmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos migran a través de
los poros del gel dependiendo de su tamaño y de su forma. Las moléculas pequeñas
y compactas migran más rapidamente que las grandes. Después de un tiempo
definido de migración (normalmente unas pocas horas), la ubicación de las moléculas
de DNA en el gel puede observarse por iluminación con luz ultravioleta (Bromuro de
etidio), por tinción con nitrato de plata (AgNO3), o por radioactividad.
Las moléculas grandes de DNA (mayores de 400 000 pares de bases) no se separan
unas de otras mediante esta técnica, por lo que es necesario el uso de otras técnicas
electroforéticas como la electroforesis en campo pulsante (PFGE, por Pulsed Field Gel
Electrophoresis) que consiste en cortos pulsos eléctricos a una serie de electrodos
que rodean el gel. El PFGE y las técnicas relacionadas son muy útiles para separar
fragmentos grandes de DNA, incluso cromosomas (15).
4. Marcaje de los ácidos nucleicos (DNA radioactivo)
La radioactividad se usa en la investigación de ácidos nucleicos porque puede ser
detectada en cantidades muy pequeñas. Los ácidos nucleicos radioactivos pueden
detectarse directamente en un contador de radioactividad o bien indirectamente
sobre una placa fotográfica (autorradiografía).
231
Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adición de fosfato
radioactivo (fósforo 32) durante su síntesis. Así, si se añade fosfato radioactivo al
medio de cultivo cuando está teniendo lugar la síntesis de DNA, el nuevo DNA será
radioactivo.
Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de
DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato. La enzima polinucleótido
quinasa quita específicamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5'
del DNA. Esta técnica es extremadamente útil y rápida, ya que permite el marcaje de
moléculas de DNA ya preformadas.
Se han desarrollado también métodos de marcaje de ácidos nucleicos que usan
compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien
porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden
detectarse por autorradiografía). Algunos de estos métodos casi igualan al
radioactivo en cuanto a sensibilidad teniendo la ventaja añadida de que no generan
desechos radioactivos.
5. Desnaturalización de los ácidos nucleicos
Las dos cadenas del DNA están unidas por puentes de hidrógeno (H2) que pueden
romperse por acción del calor sin afectar a los enlaces covalentes que unen a los
nucleótidos. Por lo tanto, las cadenas de un DNA bicatenario pueden separarse por
calentamiento, proceso conocido como fusión. Como ya se ha indicado, las moléculas
bicatenarias absorben menos que las monocatenarias en el ultravioleta. Por tanto, si
se va observando la absorción a medida que se calienta un DNA bicatenario, el
incremento en absorbancia cuando el DNA bicatenario se convierte en
232
monocatenario nos indicará la temperatura de fusión (Tm). El Tm está en función
del contenido en guanina-citosina (GC) del DNA en cuestión, ya que los pares de
bases GC se unen por 3 puentes de H2, mientras que los pares adenina-timina (AT)
sólo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor será la temperatura de
fusión. Si el DNA calentado se enfría lentamente, la doble cadena vuelve a formarse
(el DNA se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA
procedentes de fuentes distintas.
Las cadenas del DNA también pueden separarse a temperatura ambiente cambiando
las condiciones iónicas del medio. Al no estar implicada la temperatura, el proceso se
conoce como desnaturalización. Sin embargo, el resultado final es el mismo; si las
condiciones iónicas vuelven a lo normal se restablece de nuevo la doble hélice.
6. Hibridación de ácidos nucleicos
La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de
dos monocatenarios y por complementariedad de bases. Cuando una solución de
DNA que ha sido calentada se enfría lentamente se produce la rehibridación dando
lugar a la estructura inicial. Tal reasociación ocurre sólo si las secuencias de bases
son complementarias. Por lo tanto, la hibridación permite la formación de complejos
bicatenarios no naturales de DNA:DNA y de DNA:RNA. Este es un método muy
versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos
nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son
complementarios de fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas).
La hibridación puede incluso realizarse después de la electroforesis. Las moléculas de
ácido nucleico se transfieren del gel a las membranas bien por capilaridad o bien
233
aplicando corriente eléctrica, y es entonces cuando se añade la sonda. La sonda, que
es radioactiva, se unirá al fragmento con el que tenga complementariedad y se
detectará por autorradiografía.
7. Secuenciación de DNA
Se puede determinar la secuencia de bases tanto en el DNA como en el RNA, aunque
es más fácil hacerlo en el primero. Actualmente existen máquinas automáticas para
hacerlo.
Para llevar a cabo la secuenciación lo primero que se hace es generar distintos
fragmentos de DNA que terminen en cada una de las cuatro bases y que queden
marcados radioactivamente. Los fragmentos se separan por electroforesis de modo
que las moléculas con diferencia de un nucleótido sean separables en el gel. Esta
electroforesis requiere por tanto cuatro carriles, uno para cada fragmento que
termina en cada una de las cuatro bases del DNA (adenina, guanina, citosina y
timina). La posición de los fragmentos se localiza por autorradiografía y, sabiendo
qué base representa a cada carril, es fácil leer la secuencia nucleotídica en un
fragmento de DNA.
8. Endonucleasas de restricción
El descubrimiento de las endonucleasas de restricción hizo posible trabajar en
clonación. Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas que cortan
internamente las moléculas de DNA de una forma específica que viene determinada
por la secuencia de los pares de bases. Una de las primeras endonucleasas de
restricción que se caracterizó fue de la bacteria Escherichia coli y se designó EcoRI.
234
Estas enzimas se denominan con el nombre del género en letras mayúsculas seguido
de las dos primeras letras del nombre de la especie en minúscula, utilizándose
números romanos para designar el orden de caracterización de diferentes
endonucleasas de restricción del mismo organismo (HpaI, HpaII de Haemophilus
parainfluenzae).
La EcoRI se une a una región del DNA con una secuencia palindrómica específica (las
dos cadenas son idénticas cuando se leen en la misma polaridad, por ejemplo 5'->3'; un palíndromo es un conjunto de caracteres que se lee lo mismo de derecha a
izquierda que de izquierda a derecha) de seis pares de bases, y la corta entre los
residuos de guanina y de adenina de cada cadena cortando específicamente el
enlace internucleotídico entre el oxígeno del carbono 3' del azúcar de un nucleótido y
el grupo fosfato unido al carbono 5' del azúcar del nucleótido adyacente. Este corte
simétrico del DNA por EcoRI produce dos cadenas sencillas con los extremos
complementarios y cada una con una extensión de cuatro nucleótidos. En este caso,
cada extensión de la cadena sencilla finaliza en un grupo fosfato 5' mientras que el
grupo 3' hidroxilo está retirado. Las secuencias palindrómicas donde se unen y que
posteriormente cortan las endonucleasas de restricción se llaman secuencias de
reconocimiento.
Las enzimas de restricción solas no son suficientes en la clonación, ya que cuando se
alinean los extremos de las cadenas de DNA los puentes de H2 de las bases que se
aparean no son lo suficientemente fuertes como para mantener dos moléculas de
DNA unidas. Es necesaria la unión internucleotídica entre el grupo hidroxilo 3' y el
grupo fosfato 5' de los dos sitios de corte. Este problema puede resolverse usando la
235
enzima DNA ligasa, normalmente del bacteriófago T4. Esta enzima cataliza la
formación de enlaces fosfodiester entre los extremos de las cadenas de DNA que ya
están unidas por el apareamiento de bases de dos extensiones.
9. Vectores de clonación
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN que tienen capacidad
para autorreplicarse dentro de las células huésped. Las características que requiere
un vector de clonación de alta calidad son:
I. Pequeño tamaño. Es necesario, ya que la eficiencia en la transferencia de DNA
exógeno decrece significativamente cuando se utilizan moléculas mayores de 15 Kb.
II. Un único sitio de reconocimiento para las endonucleasas de restricción dentro del
cual se pueda clonar el DNA insertado.
III. Uno o más marcadores genéticos fácilmente seleccionables que permitan
identificar las células huésped que contienen la construcción DNA insertado - Vector
de clonación.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus
(13,16).
A)
Plásmidos.
Son moléculas de DNA circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se
replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen
de replicación. Virtualmente todos los géneros bacterianos tienen plásmidos. Algunos
plásmidos llevan información sobre su propia transferencia de una célula a otra
(plásmidos F), otros codifican resistencia a antibióticos (plásmidos R), otros llevan un
conjunto de genes específicos para la utilización de metabolitos inusuales (plásmidos
236
degradativos) y algunos contienen genes sin función conocida (plásmidos crípticos).
El tamaño de los plásmidos varía desde menos de 1 Kb a más de 500 Kb. Algunos
plásmidos están representados por 10 a 100 copias dentro de cada célula (plásmidos
de alto número de copias). Otros mantienen de 1 a 4 copias por célula (plásmidos de
bajo número de copias). Algunos plásmidos sólo pueden replicarse en determinadas
especies de células hospedadoras (plásmidos de rango estrecho). Otros pueden
replicarse en un gran número de especies bacterianas (plásmidos de amplio rango).
Uno de los plásmidos usados como vector de clonación y mejor estudiado y más a
menudo utilizado para "propósitos generales" es el pBR322. Estos vectores de
clonación, en general, se denominan con la letra minúscula p (de plásmido) y alguna
abreviatura que puede ser descriptiva o, en el caso del pBR322, anecdótica. La BR
son las iniciales de los investigadores que crearon el plásmido (F. Bolivar y R.
Rodríguez) y el 322 es una designación numérica que tiene relevancia para estos
investigadores.
El plásmido pBR322 tiene 4361 pb. Contiene dos genes de resistencia a antibióticos:
uno confiere resistencia a ampicilina (Ampr) y el otro a tetraciclina (Tetr).
B)
Bacteriófagos.
Son elementos extra-cromosomales autónomos que pueden replicarse por si solos,
portan información genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades.
Los fagos pueden clasificarse de acuerdo a su desarrollo en dos grupos: los fagos
virulentos y los fagos temperados. El desarrollo de los fagos virulentos se inicia
237
infectando a la bacteria, posteriormente sus genes son transcritos y traducidos para
producir sus propias proteínas, las cuales son necesarias para la replicación de su
genoma, para la formación de su cápside y tallo, para el empaquetamiento del nuevo
material genético sintetizado y para la lisis bacteriana, teniendo como objetivo final
la producción de las partículas o viriones maduros. Los fagos temperados pueden
seguir al igual que los fagos virulentos la vía lítica, pero a diferencia de éstos, pueden
convivir como profagos dentro de la bacteria. A la bacteria que posee un fago
integrado se le denomina bacteria lisógena, y al fago integrado se le denomina
profago. En la vía lisogénica, como en el caso del bacteriófago λ (lambda) que
infecta a su huésped Escherichia coli, su ADN inyectado en forma lineal es
primeramente circularizado para ser posteriormente integrado al cromosoma
bacteriano. El ADN de λ integrado estará formando parte del cromosoma bacteriano.
La replicación del ADN se lleva en forma pasiva, o sea que solo se replicará si se
replica el cromosoma del huésped. Las funciones necesarias para que se desarrolle la
vía lítica estarán reprimidas y por consiguiente permanecerá en un estado de
latencia. Este estado puede continuar a través de un número indefinido de
generaciones, hasta que algún disturbio ambiental induzca la señal para que el ADN
se escinda. Las funciones líticas se verán reactivadas y se producirán nuevos
viriones.
El bacteriófago λ se caracteriza por estar constituido por aproximadamente la mitad
de proteína y la otra mitad de ADN. Su cromosoma lo forma una molécula de ADN de
doble cadena y consta de 48,502 pb, conteniendo aproximadamente 50 genes, que
codifican para 5 proteínas relacionadas con la regulación, 7 con la recombinación, 21
con la morfogénesis de la cápside y tallo, 2 con la replicación y 2 con la lisis
238
bacteriana. La cápside tiene una estructura icosaédrica, con un diámetro aproximado
de 0.05 m, y unido a ésta, una proyección tubular de 0.15 m de longitud.
Los Bacteriófagos permiten clonar segmentos de DNA más largos (hasta 23000 pares
de bases). Alrededor de un tercio de su genoma no es esencial, por lo que se puede
reemplazar por DNA foráneo.
C)
Cósmidos.
Representan plásmidos recombinantes que combinan caracteristicas útiles de los
plásmidos y del bacteriofago. Permiten la clonación de fragmentos largos de DNA
(hasta 45 000 pares de bases).
10.
Transformación y selección
El DNA clonado debe ser introducido en la célula huésped. En bacterias, el proceso
de introducir DNA purificado dentro de una célula se llama transformación. Para
Escherichia coli, uno de los métodos de transformación requiere que las células sean
tratadas con CaCl2 en frío, seguido de una breve exposición a alta temperatura
(42°C).
Después de la transformación es necesario identificar y seleccionar, de la manera
más fácil posible, aquellas células que contienen la construcción plásmido-DNA
clonado.
11.
Identificación del DNA clonado
Una vez que se ha creado un banco de genes es necesario identificar aquellos clones
que contengan la secuencia diana. Normalmente se utilizan tres métodos de
identificación:
239
•
Hibridación del DNA con una sonda de DNA radioactivo:
el DNA se
desnaturaliza y las cadenas sencillas se unen de manera irreversible a una
matriz (nitrocelulosa, nylon). Posteriormente se añade la sonda marcada
radioactivamente, y si esta sonda es complementaria de una secuencia de la
muestra se aparean las bases, ocurriendo la hibridación. Esta hibridación
puede detectarse por autorradiografía.
•
Ensayo inmunológico: si no se dispone de sondas, se pueden utilizar
métodos alternativos de screening en un banco de genes. Por ejemplo, si la
secuencia de DNA clonado se transcribe y traduce, la presencia de la
proteína, o incluso parte de ella, puede determinarse por ensayos
inmunológicos.
•
Ensayo de actividad : si el gen que se busca produce una enzima que
normalmente no es sintetizado por la célula huésped, se puede llevar a cabo
el screening al identificar los miembros de un banco de genes que llevan el
gen funcional que codifica para esa enzima. Por ejemplo, han sido aislados
los genes de α-amilasas, endoglucanasas y ß-glucosidasas de varios
organismos al utilizar un banco de genes de Escherichia coli (que no produce
esos enzimas), e incubar la bacteria en un medio suplementado con un
sustrato específico para posteriormente,
utilizando un colorante selectivo,
identificar aquellas colonias que son capaces de utilizar el sustrato. Este
mismo principio se puede utilizar también en complementación de mutantes
auxotrofos, para producción de antibióticos, etc.
240
4. ALÉRGENOS RECOMBINANTES
La aplicación de las técnicas de ingeniería genética al campo de la
caracterización alergénica ha permitido la generación de alergenos recombinantes.
Un alergeno recombinante es una molécula alergénica producida mediante
biotecnología e identificada originalmente a partir de un extracto alergénico. Los
alérgenos más importantes de ácaros, pólenes, insectos y alimentos han sido
clonados, secuenciados y expresados. Se han desarrollado sistemas de expresión en
bacterias, levaduras o células de insectos para producir grandes cantidades
de
alérgenos (Fig. 4) y se ha comprobado que estos muestran una fijación a Ig E
comparable con la del alergeno natural, así como excelentes resultados
en los
análisis de reacción cutánea y análisis de diagnostico in vitro . En un principio fueron
utilizados con esta finalidad organismos procarióticos como la bacteria E. coli, pero
en los últimos años se ha extendido el uso de organismos eucarióticos, siendo la
levadura metilotrófica Pichia pastoris el más utilizado. Este organismo está
permitiendo la obtención de alergenos cuya producción en E. coli había sido
incorrecta o escasa. Una vez producida la proteína recombinante en la levadura, la
purificación suele comprender un menor número de etapas y menor dificultad
técnica. Ello se debe al hecho de que frecuentemente se puede introducir, junto con
el gen a expresar, un segmento nucleotídico que codifica un péptido en la región Nterminal de la proteína recombinante que permite a la célula de Pichia la secreción
del producto expresado al medio extracelular (a veces este péptido de secreción está
ya codificado por el propio gen de la proteína a expresar). Este medio se encontrará
241
muy enriquecido en el alérgeno recombinante y su purificación se verá notablemente
simplificada (12, 16).
Figura 4: Etapas de la producción de alergenos recombinantes.
4.1
Ventajas de la producción de alérgenos recombinantes frente a la
alternativa natural.
•
Están perfectamente caracterizados a nivel molecular e inmunoquímico,
permitiendo la disponibilidad de productos muy bien definidos, de estructura y
propiedades conocidas y fácilmente cuantificables
•
Están altamente purificados y son fáciles de estandarizar
•
Hace posible una producción ilimitada de la proteína, ya que disponiendo del
vector de expresión con el cDNA del alérgeno insertado se puede repetir el
242
proceso tantas veces como sea necesario, utilizando además grandes volúmenes
de cultivo.
•
La estabilidad del producto es superior a la de las preparaciones naturales, entre
otros motivos por la ausencia de proteasas, agentes oxidantes, otras proteínas
que interaccionen con el alérgeno, etc.
•
Posibilita la expresión de alérgenos modificados, ya que por mutagénesis dirigida
se pueden introducir cambios en la estructura proteica para alterar alguna
propiedad del alérgeno como su estabilidad o su capacidad de unir anticuerpos
IgE o IgG, etc, de forma que posea sus propiedades alergénicas atenuadas o
suprimidas, o incluso una actividad antigénica superior a la del producto natural;
también pueden prepararse fragmentos del alérgeno que conserven alguna
propiedad (por ejemplo unión a IgG) y que carezcan de otras indeseables (como
unión a IgE).
Estas alternativas abren las puertas a la preparación de formas hipoalergénicas de
los alérgenos, para las que se augura un prometedor futuro.
4.2
Utilidad de los alergenos recombinantes
Los alérgenos recombinantes son instrumentos muy útiles para el estudio de los
extractos alergénicos y
para el diagnóstico y
el tratamiento de la enfermedad
alérgica, gracias a sus características, y en particular a su pureza (Fig. 5).
El uso de estos alérgenos permite
comprender mejor la epidemiología de las
alergias; las pruebas in vitro con alérgenos recombinantes permiten estudiar
fenómenos complejos, como por ejemplo diferencias de reactividad clínica en
243
Figura 5: Alérgenos recombinantes e inmunoterapia de enfermedades alérgicas.
función de la ubicación geográfica, así como reacciones cruzadas entre fuentes de
alérgenos aparentemente alejadas. En concreto, la cuantificación de IgE específica
de alérgenos recombinantes ha permitido explicar por qué en el norte de Europa los
síntomas característicos de la alergia a la fruta y a la verdura suelen ser de tipo oral,
mientras que en el sur de Europa los pacientes suelen presentar síntomas sistémicos.
El estudio de estos perfiles muestra que en el norte de Europa domina la
sensibilización al Bet v 1 (alérgeno mayoritario del abedul), orientando las
sensibilizaciones hacia reacciones homólogas de esta proteína presente en otras
especies. Por el contrario, en la zona mediterránea domina la sensibilización a las
proteínas de transferencia de lípidos (LTP), lo que induce la predominancia
244
de una verdadera alergia alimentaria (17, 18, 19).
Tambien permiten determinar perfiles de reactividad y analizar las reacciones
cruzadas entre alérgenos, aportando información antes inaccesible. Por ejemplo, en
una fuente de alérgeno como el polen del abedul permiten precisar las moléculas
responsables de los síntomas.
Cuando las plantas son taxonómicamente próximas y polinizan durante el mismo
periodo, el uso de alérgenos recombinantes permite identificar qué fuente de
alergeno es realmente responsable de los síntomas (Fig. 6).
Utilizando un análisis con alérgenos recombinantes, también será posible comprender
qué proteínas pueden inducir la reacción clínica y cuáles provocar las reacciones
cruzadas, y así deducir los pasos a seguir para ofrecer el mejor tratamiento posible al
paciente.
Es posible obtener perfiles de reactividad con dosis de IgE específicas de alérgenos
recombinantes complementadas con dosis tradicionales, lo que permite comprender
el origen de las reacciones y analizar las interacciones potenciales heteroespecíficas.
Se puede determinar también un perfil de sensibilización antes de un tratamiento
con inmunoterapia específica para evaluar si las reacciones alérgicas del paciente
245
Figura 6: Antigenos recombinantes y diagnóstico con separación de componentes
están provocadas por la sensibilización al alérgeno mayoritario de una materia prima
alergénica (por ejemplo, el Bet v 1 en el polen de abedul). En este caso, el paciente
responderá probablemente mejor a la inmunoterapia porque los extractos contienen
cantidades elevadas y controladas del alérgeno mayoritario.
Actualmente, los alérgenos recombinantes también se utilizan para mejorar las
pruebas in vitro. En algunos casos, cuando la extracción no permite representar de
forma suficiente un compuesto alergénico específico, el hecho de añadir al extracto
esta proteína obtenida por ingeniería genética mejora la sensibilidad clínica. Dos
ejemplos concretos de ello son la mejora del látex mediante el alérgeno
246
recombinante rHev b 5 y, más recientemente, la mejora de la avellana enriquecida
con rCor a 1.
Por tanto, la producción de alérgenos mediante el uso de tecnología recombinante
abre las puertas al desarrollo de mejores pruebas diagnósticas y nuevos tratamientos
que marcarán un hito durante los próximos años en el manejo de las patologías
alérgicas.
247
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