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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
ANEXO. ELECTROFORESIS/
Versión 3.0/
MÓDULO 3/
CÁTEDRA DE FÍSICA/
FFYB/
UBA/
Cátedra de Física-FFYB-UBA [1]
ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
En este Anexo podrás encontrar material complementario de la Guía de Fundamentos y del Seminario referido a
este tema, junto con la bibliografía recomendaba. Son cuatro grandes apartados: Punto isoeléctrico; el Equipo de
Electroforesis, Otras consideraciones acerca de la condiciones de corrida y por último Equilibrio de ionización.
PUNTO ISOELÉCTRICO (pI) ¿Qué es y cómo se determina?
El punto isoeléctrico, pI, es el pH en el cual la carga neta de la molécula es nula, es decir el pH que corresponde a
movilidad electroforética (µ,) igual a cero.
¿Cómosedeterminaexperimentalmenteel pI?
Se realizan corridas electroforéticas de la sustancia en estudio utilizando soluciones buffer de igual fuerza iónica y
viscosidad, pero diferentes valores de pH. En todos los casos se calcula la movilidad electroforética y se grafica µ en
función del pH. Se obtendrá un gráfico como el que se muestra a continuación:
Figura 1: Gráfico de movilidad electroforética en función del pH de corrida. Por convención, la distancia hacia al
ánodo o polo positivo se considera positiva por lo que la movilidad resulta positiva; mientras que, son negativas la
distancia y la movilidad al cátodo o polo negativo.
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En el gráfico por interpolación se determina el pH correspondiente a una movilidad igual a cero (punto en que
la curva intercepta el eje de las abscisas). Ése valor será el pI.
Dada la relación directa que existe entre la distancia corrida y la movilidad electroforética, puede también realizarse un
gráfico distancia en función del pH del buffer de corrida para la determinación de la movilidad electroforética, tomando
siempre la precaución de mantener constantes el resto de las condiciones cuando se realizan las corridas a distintos pH,
para así mantener la proporcionalidad entre la movilidad electroforética y la distancia recorrida.
donde :
Se deduce de lo anterior que los gráficos de movilidad electroforética en función del pH de corrida y
distancia en función del pH de corrida son proporcionales entre sí.
¿De qué depende la proporcionalidad mencionada en el párrafo anterior?
¿Qué condiciones deben cumplirse para que dos gráficos de: d (distancia al punto de siembra) = f (pH) del
buffer sean comparables?
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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
EL EQUIPO DE ELECTROFORESIS
El equipo de electroforesis consta de una cuba electroforética y una fuente de poder (ver Figura 6).
Figura 2: Equipo para electroforesis, abajo se muestra un esquema simplificado. La fuente de poder se
encuentra conectada a la línea de alimentación de corriente, por un lado, y a los electrodos de la cuba, por
el otro. Al ser encendida la fuente, se establece una diferencia de potencial entre los compartimentos de
la cuba, comenzando la circulación de corriente a través del sistema. En la tira de papel se siembra la
muestra cuyas partículas cargadas se moverán hacia el polo de carga opuesta, de acuerdo a los principios
ya explicados.
La cuba electroforética tiene dos compartimentos o reservorios de buffer: uno anódico y otro catódico. Cada
uno de estos compartimentos contiene un electrodo sumergido en buffer. Cada electrodo está conectado, a
través de un cable, a la fuente de poder. Los tabiques de los compartimentos o reservorios, o algún otro
dispositivo según su diseño, permiten montar un soporte donde se siembran las muestras. Este soporte está
embebido en buffer y “pesca” a cada lado en el buffer de los reservorios, cerrando el circuito eléctrico. Esto
es posible ya que el buffer es una solución iónica, por lo que conduce la corriente cuando se enciende la
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fuente de poder. Para saturar la atmósfera en que se realizará la corrida y minimizar los efectos por difusión
del buffer, el soporte se ubica en la cuba unos minutos antes de sembrar la muestra y se deja estabilizar el
sistema con la cuba tapada y la fuente encendida.
El soporte tiene por función contener al solvente y a las muestras, constituyendo un medio de sostén para
las mismas. Es importante tener en cuenta que los componentes de las muestras no se encuentran
adheridos al soporte, sino que están inmersos en el buffer de corrida y cuando migran lo hacen en el buffer
contenido en los poros del soporte. Además, según los casos, el soporte puede generar algún impedimento
al movimiento libre de los componentes de la muestra, tal que se minimice la difusión al azar.
Existen distintos tipos de soportes (papel, acetato de celulosa, geles – poliacrilamida, agar y sus productos de
purificación: agarosas con distinto grado de pureza), los que se usan en distintas aplicaciones. En el caso de
nuestro trabajo práctico el soporte a utilizar será una tira de papel de filtro.
Desde el punto de vista eléctrico, el soporte actúa como una resistencia. Por lo tanto, el equipo de
electroforesis es un circuito simple como se muestra en la siguiente figura:
i
a
R
b
FEM (ε)
Figura 3: Circuito electroforético. La fuente de poder, que cumple la función de FEM del circuito, está conectada a dos
electrodos, a y b, en contacto a través del buffer con el soporte que actúa como una resistencia. La flecha indica el
sentido convencional de circulación de la corriente eléctrica en el sistema. I: intensidad de corriente eléctrica; R:
resistencia (soporte); FEM: fuerza electromotriz (fuente de poder).
Los puntos a y b de la figura 7 corresponden a los electrodos de la cuba electroforética entre los que se
establece una diferencia de potencial. Entre ellos se encuentra la resistencia, en el sistema electroforético
incluye al soporte embebido en buffer (Vea y compare las figuras 2 y 3). Dado que el buffer es una solución
de alta conductividad eléctrica, puede considerarse que el soporte aporta la mayor parte de la resistencia
del sistema, en nuestro trabajo práctico la tira de papel. Obsérvese que la conductividad de una solución (el
buffer en el caso de la electroforesis) está en relación directa con la concentración de electrolitos en la
misma y estos determinan a su vez la fuerza iónica.
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Es notable la importancia que reviste colocar correctamente la tira en la cuba, tal que sus extremos se hallen
inmersos en el buffer, de otra forma el circuito estaría abierto y no habría circulación de corriente.
Para pensar…
Después de realizar una corrida de rutina con una muestra conocida se observa que la muestra no
corrió. Se sabe que se trabajó en condiciones de corrida controladas, y se conoce el comportamiento de la
muestra. ¿Cómo se podría explicar lo sucedido?
Si ocurriera una pérdida de buffer por debajo de los tabiques de la cuba, y como consecuencia el
buffer de los compartimientos entrara en contacto, ¿qué ocurrirá con el sistema electroforético? ¿Cómo
resultaría una corrida en estas condiciones?
Por tratarse de un circuito eléctrico está regido por las mismas leyes que los circuitos tratados en
Electricidad. El enunciado de la Ley de Ohm postula que la corriente que fluye a través de un conductor es
proporcional a la fuerza electromotriz aplicada entre sus extremos, donde la resistencia es la constante de
proporcionalidad involucrada. Entonces, siempre y cuando la temperatura y demás condiciones se
mantengan constantes, se cumplirá:
ΔV: diferencia de potencial o voltaje; i intensidad de corriente eléctrica; R: resistencia.
Para aplicar algunos conceptos de electricidad les proponemos que piensen las siguientes situaciones…
¿Es posible realizar la corrida de tres tiras del soporte en simultáneo? En caso de que fuera así, ¿cómo sería el
esquema del circuito eléctrico?
¿Qué ocurre con la intensidad total del circuito y con la intensidad que pasa por cada tira de soporte si se las
compara con la intensidad en el caso en que se utiliza una sola tira?
Las fuentes de poder transforman la corriente alterna que reciben de la línea de alimentación (un enchufe
conectado a la línea de corriente) en corriente continua, tal como la daría una pila o batería. Existen en el
mercado distintos modelos de fuentes de poder: las más sencillas trabajan a voltaje constante y único;
luego, las más comunes, también mantienen el voltaje constante pero en ellas es posible asignar distintos
valores de voltaje dentro de un rango establecido; y por último, las más sofisticadas, permiten trabajar a
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voltaje constante o a intensidad constante (incluso a potencia constante), dentro de un amplio rango de
valores.
A continuación se muestra como ejemplo el circuito eléctrico de una fuente de poder en la que se pueden
asignar distintos valores de diferencia de potencial, según las necesidades de la corrida electroforética:
Figura 4: Esquema que ejemplifica el funcionamiento de una fuente de poder de voltaje variable
conectado a una cuba electroforética. El transformador y el rectificador de la fuente transforman la
corriente alterna en continua y el potenciómetro permite variar la diferencia de potencial de salida y por
ende entre los electrodos de la cuba. A: amperímetro; V: voltímetro; C.A.: corriente alterna; C.C.: corriente
continua. Ver Electricidad.
OTRAS CONSIDERACIONES ACERCA DE LAS VARIABLES DE CORRIDA
Incidencia del soporte en la corrida electroforética: Efecto electroendosmótico
Como se mencionó anteriormente el soporte presenta entre sus funciones principales, oponer algún tipo de
resistencia a la libre difusión de la muestra, lo cual favorece la separación de los distintos componentes de la
muestra de acuerdo a los principios que rigen esta técnica.
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¿Qué es el efecto electroendosmótico? En algunos soportes (por ejemplo: el papel), de acuerdo a cuáles sean
las condiciones de corrida, se presenta lo que se denomina electroendósmosis o efecto electroendosmótico.
Estos soportes poseen en su composición grupos químicos que pueden presentar propiedades ácidas o
básicas. Los mismos pueden hallarse ionizados en determinadas condiciones de pH adquiriendo carga. Se
produce, entonces, un efecto de polarización de las cargas del buffer que está en contacto con el soporte.
Por ejemplo, en el caso del papel los grupos carboxilos a pH cercanos o mayores a su pKa estarán ionizados
(en forma de carboxilatos) por lo que presentan una carga neta negativa. Los contra-iones positivos que
neutralizan dichas cargas estarán libres de moverse junto con el buffer por lo que el buffer en contacto
directo con el soporte presentará una carga neta positiva debido a la polarización de la solución.
B
Figura 5: Efecto electroendosmótico. En A) se ejemplifica la polarización de la solución al encontrarse
ionizado el soporte. Los iones con carga positiva, cationes, se disponen en el entorno de los aniones que se
encuentran sujetos al papel. B) Al aplicarse una diferencia de potencial, se producirá la migración de los
cationes hacia el cátodo, arrastrando consigo su esfera de hidratación. Los aniones están fijos al papel por
lo que no migrarán.
Cuando se aplica una diferencia de potencial al sistema, los iones positivos se mueven hacia el cátodo
arrastrando consigo su esfera de solvatación. Por ende existe un flujo neto de la solución que se transmite a
todas las moléculas arrastrándolas hacia el cátodo. En consecuencia la migración de cualquier sustancia
presente en el soporte se verá arrastrada hacia el cátodo independientemente de cuál sea su carga.
(Ver en esta guía “corrección del flujo electroendosmótico”)
El efecto electroendosmótico depende del pH, debido a que, como se mencionó anteriormente, se produce como
consecuencia de la ionización de los grupos funcionales del soporte. En el papel este efecto es significativo bajo
condiciones de pH superiores a 4.
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Figura 6: Gráfico que muestra la variación del flujo electroendosmótico en función del pH de corrida
utilizando tiras de papel como soporte. Se graficó el porcentaje del efecto electroendosmótico respecto
del máximo evaluando la distancia corrida por un testigo neutro, y relativizando la distancia a la máxima
que corrió.
Corrección del flujo electroendosmótico
Dado que el flujo electroendosmótico modifica la verdadera distancia corrida por las moléculas, para la
determinación apropiada de la movilidad electroforética de una sustancia es necesario realizarle una
corrección a la distancia experimental corrida por la sustancia en estudio, a fin de “descontar” los efectos
que produce dicho flujo.
El flujo electroendosmótico se determina empleando un testigo
electroforéticamente neutro, es decir una sustancia tal que su carga eléctrica sea nula a cualquier pH, o al
menos, al pH de la corrida (Ver “Punto isoeléctrico”). Este testigo debe además cumplir con otras
condiciones:
 tener forma y tamaño molecular semejante a la sustancia cuya movilidad se desea determinar

no ser absorbido por el soporte utilizado
 no formar complejos con los iones de la solución
Por ejemplo: la glucosa y el dextrano pueden utilizarse como testigos neutros para corregir movilidades
electroforéticas de sustancias de bajo y alto peso molecular respectivamente.
Veamos cómo corregir la distancia recorrida por una sustancia cargada en un soporte que posee flujo
electroendosmótico, si:
1. La muestra y el flujo electroendosmótico se mueven en el mismo sentido.
2. La muestra y el flujo electroendosmótico se mueven en sentidos opuestos
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El testigo neutro siempre será arrastrado en el sentido en que se mueve el flujo electroendosmótico (hacia el
cátodo). El análisis de los casos propuestos lo haremos por comparación de las distancias corridas por la
muestra y el testigo neutro. Nos interesa saber cuál es la distancia corrida por la muestra en ausencia de
efecto electroendosmótico, o sea, la debida sólo como consecuencia de la carga de sus moléculas. Por lo
tanto, debemos “descontar” la distancia corrida por el testigo neutro, tal como si fuera un error de cero.
Existen distintas maneras de razonar la corrección de la distancia corrida por una muestra cuando dicha
distancia está afectada por efecto electroendosmótico. Si bien con todas se arriba a los mismos resultados,
tal vez la más simple sea considerar como línea de siembra a la distancia corrida por el testigo neutro y
determinar entonces la distancia corregida como la distancia corrida por la muestra respecto a esta nueva
línea.
Tabla A : Referencias
Especie química electroforéticamente activa
Testigo electroforéticamente neutro
deeo
Distancia corrida por el testigo neutro, con su respectivo signo.
dM
Distancia corrida experimentalmente por la especie química electroforéticamente
activa en presencia de efecto electroendosmótico, con su respectivo signo.
dMC
Distancia corrida por la especie química electroforéticamente activa corregida, o
sea en ausencia de efecto electroendosmótico. El signo resultante indica hacia que
polo migra
Caso 1: la muestra se mueve hacia el cátodo una distancia mayor que la que debería, porque es ayudada por
el flujo electroendosmótico. La distancia recorrida en ausencia de efecto electroendosmótico hubiera sido
menor.
Figura 7. La muestra y el flujo electroendosmótico se mueven en el mismo sentido. En este caso la distancia recorrida
por la muestra una vez corregida es menor que la que se mide experimentalmente. Cátodo y ánodo se representan
con sus correspondientes signos, - y + respectivamente. La línea de puntos indica la línea de siembra. La flecha
correspondiente a dMC representa el sentido en que se hubiera desplazado la muestra y la longitud de la flecha la
distancia que hubiese corrido desde el punto de siembra si no hubiera efecto electroendosmótico.
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Caso 2: El flujo al moverse en sentido opuesto a la muestra retrasa su movimiento y por ende la muestra
corre una menor distancia. En este caso se pueden dar dos situaciones: (A) que al finalizar la corrida se
observe que la sustancia corrió hacia el polo opuesto al que corrió el testigo neutro, o (B) que al finalizar la
corrida se observe que la sustancia corrió hacia el mismo lado que el testigo neutro pero menor distancia
que él, o sea que fue tan grande el efecto del flujo que la distancia corrida por la muestra fue en sentido
opuesto al esperado
(A) al finalizar la corrida se observa que la sustancia corrió hacia el polo opuesto al que corrió el
testigo neutro, Sin embargo, la distancia que corre la muestra es menor que la que correría en
ausencia de efecto electroendosmótico.
Figura 8. La muestra corre en sentido opuesto al testigo neutro. En este caso la muestra hubiera migrado una mayor
distancia en ausencia de efesto electroendosmótico, por ello d MC es mayor que dM. Cátodo y ánodo se representan
con sus correspondientes signos, - y +, respectivamente. La línea de puntos indica la línea de siembra. La flecha
correspondiente a dMC representa el sentido en que se hubiera desplazado la muestra y la longitud indica la distancia
que hubiese corrido desde el punto de siembra si no hubiera efecto electroendosmótico.
(B) al finalizar la corrida se observa que la sustancia corrió hacia el mismo lado que el testigo
neutro. La muestra termina corriendo hacia el cátodo porque la magnitud del efecto
electroendosmótico supera la distancia que correría la muestra hacia el ánodo si no existiera
efecto del flujo.
Figura 9: La muestra y el flujo electroendosmótico se mueven en el mismo sentido pero, a diferencia de la figura 13.a,
la migración por efecto electroendosmótico es superior a la migración de la muestra. En este caso d M presenta un
sentido opuesto al que presentaría la muestra si no existiera efecto electroendosmótico. Por ello, d MC tiene sentido
opuesto y sería inferior a deeo, es así que es posible que el flujo electroendosmótico invierta el sentido de la
migración. Cátodo y ánodo se representan con sus signos correspondientes, - y + respectivamente. La línea de puntos
indica la línea de siembra. La flecha correspondiente a d MC presenta el sentido en que se hubiera desplazado la
muestra y la longitud indica la distancia que hubiese corrido desde el punto de siembra si no hubiera efecto
electroendosmótico.
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Otra manera de razonar la corrección de la distancia corrida por una muestra, es: restarle la distancia corrida
por el testigo neutro a la distancia experimental corrida por la muestra, utilizando la convención de signos.
Así, es posible calcular la distancia corrida por la muestra si no existiera efecto electroendosmótico
(corregida), mediante la siguiente ecuación:
d
d -deeo
(Ec. 1)
donde dM y deeo deben ir con su signo.
Desde la línea de siembra,
-
las distancias al ánodo o polo positivo se consideran positivas
-
las distancias al cátodo o polo negativo se consideran negativas
Nótese que dMC presentará un signo compatible con el polo al que migrará la muestra. En consecuencia la
movilidad calculada basado en este criterio siempre presenta el signo del polo al que migra la muestra.
Error que se introduce en la determinación del punto isoeléctrico debido al flujo electroendosmótico
Hemos definido el punto isoeléctrico de una sustancia como aquel pH en que la movilidad electroforética es igual a cero.
En términos de lo explicado recientemente, se puede establecer una relación de proporcionalidad directa entre la
movilidad electroforética y la distancia recorrida por una sustancia, podríamos entonces concebir la idea de determinar el
pI como el pH en que la sustancia electroforéticamente activa corre una distancia nula.
En términos de lo que se ha explicado del efecto electroendosmótico sabemos que la distancia corrida está alterada
como consecuencia del flujo hacia el cátodo. Por ello, para la determinación del pI debe contemplarse la corrección de la
distancia por el efecto electroendosmótico (Ver “Flujo electroendosmótico: corrección”). En términos experimentales, el pI
corresponderá al pH en que la sustancia en estudio migre igual que el testigo neutro ya que este se mueve sólo por acción
del efecto electroendosmótico. Es posible, también, construir la curva de distancia recorrida -corregida punto a punto- en
función del pH de la corrida y determinar el pI de la misma forma en que se indicó anteriormente.
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Figura 10: Efecto del flujo electroendosmótico en la determinación del pI. Nótese que la curva corregida resulta de la
diferencia punto a punto entre las curvas de la muestra y del testigo. Se manifiesta que el efecto electroendosmótico
en este soporte incide recién a pH mayor a 4, y es constante después de pH =10 (Ver Figura 6). Por convención se
considera positiva la distancia al ánodo, polo positivo, y negativa la distancia al cátodo, polo negativo, respecto del
punto de siembra.
Efecto Joule
En todo circuito eléctrico, el movimiento de cargas a través de la resistencia supone la realización de un
trabajo que involucra una pérdida de energía. Esta pérdida de energía por unidad de tiempo, es la potencia
disipada en la resistencia y en el caso de la electroforesis es el calor disipado en el soporte. (Efecto Joule)
En la última ecuación se puede observar que la disipación de energía es proporcional al cuadrado de la
intensidad de corriente eléctrica circulante. Cuando se trabaja a voltajes elevados la disipación de energía es
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muy alta, elevando la temperatura del sistema. La temperatura es una de las variables que afectan la
velocidad con la que se mueve una partícula (Ver Fundamento: Variables que determinan la velocidad de
movimiento). Por ello, para controlarla, los equipos que trabajan con altos voltajes poseen algún sistema de
refrigeración del soporte.
Como se mencionó antes (Ver “El equipo de electroforesis”), las corridas electroforéticas pueden realizarse a
voltaje o a intensidad constante, si se dispone de una fuente de poder que lo permita. Si durante la corrida la
resistencia R del soporte se mantuviera constante, cualquiera de las dos variables experimentales que
fijemos (voltaje o intensidad), la otra también se mantendrá constante (ecuación 10) y daría lo mismo fijar
una u otra. Ahora bien, en la práctica esto no sucede. A medida que transcurre la corrida electroforética, la
resistencia del soporte (papel o acetato de celulosa) va disminuyendo debido a que los poros del mismo se
impregnan con buffer y aumenta la conductividad (recordar que conductividad y resistividad están en
relación inversa). Si graficamos resistencia en función del tiempo de corrida se obtiene:
Figura 11: Gráfico de resistencia del soporte en función del tiempo de corrida.
En este gráfico podemos distinguir dos regiones según cómo sea el tiempo de corrida: corto o largo. A
tiempos cortos se produce una modificación rápida de la resistencia del sistema. A tiempos largos, no habría
mayores inconvenientes, ya que la resistencia del soporte se mantiene casi constante, pero pasar por la
primera etapa es inevitable y además, en muchos casos, los tiempos de corrida empleados comúnmente
caen en la primer zona.
¿Qué pasa entonces durante la corrida cuando trabajamos a voltaje constante? ¿Y cuando lo hacemos a
intensidad constante? ¿Cuál es la incidencia de la elección de una u otra condición en el resultado de la
corrida electroforética?
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Si se trabaja en condiciones de voltaje constante, la disminución en la resistencia trae como consecuencia un
aumento en la intensidad de corriente.
A voltaje constante, el aumento de la intensidad de corriente produce un aumento del calor disipado por
unidad de tiempo (efecto Joule) y por lo tanto habrá mayor evaporación de solvente; en consecuencia
aumentará la fuerza iónica y a causa de esto disminuirá la movilidad. Lo visualizaremos porque la distancia
corrida será menor.
Como se mencionó anteriormente, una forma de solucionarlo es utilizar un sistema refrigerante, cosa
particularmente útil cuando se trabaja a voltajes constantes muy altos.
Si trabajamos en condiciones de intensidad constante, la disminución de la resistencia, traerá como
consecuencia una disminución del voltaje.
En estas condiciones, en consecuencia, el calor disipado por efecto Joule es menor
Ahora bien, en esta situación el menor voltaje resultante conduce a una menor distancia corrida por la
partícula.
Por lo tanto, para obtener una mayor distancia recorrida por la sustancia (probablemente ello sea necesario
en ciertas condiciones) deberíamos incrementar el tiempo de la corrida. Sin embargo, esto no es beneficioso
porque trae aparejado un incremento de la difusión natural de las sustancias y por ende, una pérdida de
resolución.
EQUILIBRIO DE IONIZACIÓN
Los grupos ácidos y básicos presentes en las moléculas biológicas se caracterizan por disociarse
parcialmente en solución ya que se comportan como ácidos y bases débiles. Cada equilibrio de
ionización asociado a un grupo funcional está regido por una constante, K, que es el parámetro
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termodinámico que permite evaluar las concentraciones correspondientes a las especies en el
equilibrio, a una determinada temperatura (Ver Figura 12).
Figura 12: Equilibrio de ionización de ácidos (i) y bases (ii) débiles en solución acuosa. Se ejemplifican la ecuación de
equilibrio químico y la expresión matemática correspondiente a la constante de ionización K que rige dicho
equilibrio.
De la observación de la figura 1 se evidencia que el grado de ionización depende del pH del medio.
Dado que -para un determinado grupo químico, temperatura y presión- K es constante, habrá
diferente proporción de las distintas especies iónicas en equilibrio dependiendo del pH en que se
encuentra la sustancia.
La ecuación de Henderson- Hasselbach, que se deduce a partir de la expresión matemática de la
constante de equilibrio, relaciona la concentración de las especies en equilibrio y el pH del medio:
Donde:
,y
es la constante de ionización del ácido en solución acuosa.
Esta misma expresión puede escribirse para una base débil,
Una explicación más detallada se encuentra en Chang, ‘Química General’, McGrawHill Skoog-West,
‘Fundamentos de química analítica’, España, McGrawHill.
¿Qué significado tiene el cociente entre las concentraciones de las especies en el equilibrio?
El equilibrio químico es un fenómeno dinámico, donde productos y reactivos alternan
constantemente entre ambos estados, en nuestro caso de ácido o de base. Por ello, la relación de
concentraciones entre las especies a un dado pH da idea de la probabilidad de hallar cada una de
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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
las especies en el equilibrio. Observando las ecuaciones anteriores, se deduce que la relación entre
los valores de las concentraciones de las especies en equilibrio
para una dada reacción
está determinada por la constante de equilibrio, la concentración de protones (pH) y la
temperatura.
En el caso de los ácidos y bases fuertes, donde la correspondiente constante de equilibrio
determina que la reacción de disociación es prácticamente total, la sustancia estará todo el tiempo
en la forma ionizada. En cambio, para ácidos y bases débiles, el valor del cociente entre
está relacionado con el grado de ionización y da idea de la probabilidad de hallar cada
una de las especies en equilibrio en esa situación. Por ejemplo, si el valor de cociente entre
es más grande en determinadas condiciones -aumentando el pH por ejemplo- implica
una mayor probabilidad de encontrar a la sustancia en el estado ionizado:
.
Si se desea separar por electroforesis sustancias con características de electrolitos débiles, existen
dos aspectos a considerar:
a) la carga neta sobre cada especie iónica presente a ese pH. Esta depende exclusivamente de las
propiedades químicas de la sustancia. Por ejemplo, la glucosa no presenta carga sobre su estructura
a ningún pH, el sodio en solución se halla en forma catiónica, el grupo carboxilo al ionizarse
adquiere carga negativa, el grupo amino presenta carga positiva a valores de pH muy ácidos, etc.
b) la carga neta “efectiva” resultante de la contribución (sumatoria) de cada una de las cargas
aportadas por las distintas especies iónicas de esa sustancia presentes en el equilibrio, al pH y
temperatura de trabajo; ya que de acuerdo al grado de ionización que presente la sustancia, habrá
cierta probabilidad de encontrarla en un estado cargado o no cargado. Esta probabilidad se traduce
en la práctica en proporción o concentración relativa de un tipo de estructura respecto al otra
(cargada-no cargada).
¿Cómo podemos evaluar la carga efectiva presente en la muestra?
A partir de la ecuación de Henderson-Hasselbach podemos conocer cuál es la relación entre la
concentración de las especies –ionizada y no ionizada- en el equilibrio a un determinado pH (Ver
Cátedra de Física-FFYB-UBA [17]
ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
recuadro gris). En estos casos, de acuerdo a los distintos valores que puede tomar el pH, podrían
describirse numerosas situaciones diferentes para un grupo funcional, donde coexistan distintas
proporciones de cada una de las especies en cuestión. Sin embargo, estas tantas posibilidades podemos
resumirlas en las siguientes situaciones (Ver Figura 12):
I.
SI el pH de la solución en que se halla una sustancia es mayor que el pKa del grupo funcional, el
equilibrio estará favorecido hacia los productos, resultando la proporción de las especies en el
equilibrio mayor a 1. En otras palabras, existirá una mayor probabilidad de encontrar a la
sustancia en la forma ionizada (cargada).
II.
Ahora bien, si el pH es mucho mayor que el pKa:
En este caso su carga neta “efectiva” será cercana a la máxima posible.
III.
Si en cambio, el pH es menor que el pKa, la relación entre las concentraciones de las especies en
el equilibrio será menor que 1. Siguiendo con el razonamiento anterior, existe mayor
probabilidad de hallar al ácido débil en forma no ionizada que en forma ionizada porque el
equilibrio está favorecido hacia los reactivos.
Cátedra de Física-FFYB-UBA [18]
ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
IV.
Y, cuando el pH del medio sea mucho menor que el pKa:
En estas condiciones, en una corrida electroforética la sustancia se comportará como si no
tuviera carga o una carga mínima, porque resultará despreciable la proporción que se
encuentra cargada.
V.
Finalmente, sI el pH del medio es igual al pKa del grupo ácido, la relación entre las concentraciones de las
especies en el equilibrio es igual a 1. Esto significa, por ejemplo en el caso de un ácido débil, que existe la
misma probabilidad de encontrar a la sustancia en forma ionizada como en forma no ionizada.
En este caso su carga neta “efectiva” será la mitad de la máxima posible.
Cátedra de Física-FFYB-UBA [19]
ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
Por lo tanto, es importante considerar las condiciones de pH que se eligen para trabajar en una
corrida electroforética, porque esto afectará el grado de ionización de la sustancia y en
consecuencia la carga neta efectiva.
Cuando se trabaja con moléculas que presentan más de un grupo funcional, como son los aminoácidos, el
número de especies en solución es mayor y el tratamiento matemático es, en consecuencia, más complejo.
ACERCA DE LOS AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos, unidades estructurales de las proteínas, son ácidos α-aminocarboxílicos. La
estructura de los mismos como puede verse en la
Figura 13, consiste en un carbono central sustituido por un grupo amino (básico), un grupo
carboxílico (ácido) y un grupo R, o sustituyente.
Figura 13: Esquema de la estructura genérica de los α-aminoácidos
Los grupos amino y carboxílico por sus propiedades ácido – base pueden presentar distinto grado
de ionización según el pH del medio en que se encuentre el aminoácido, tal como se vio
anteriormente. Es así que para cualquier aminoácido sencillo pueden describirse tres estructuras
con distinta carga:
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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
Figura 14: Ionización de un aminoácido sencillo, monoamínico y monocarboxílico. Los equilibrios de ionización están
regidos por la constante de disociación de los grupos funcionales (K1, K2). La forma catiónica predomina a pH
inferiores a pK1, la forma aniónica predomina a pH superiores a pK 2. Zwitterión: ión dipolar. Ver Equilibrio de
ionización.
Tal como se describió en el apartado anterior, cada grupo funcional presenta una constante que
rige su equilibrio de ionización y es posible evaluar qué especies y en qué proporción conforman
cada equilibrio a partir de la ecuación de Henderson Hasselbach. Así, el pH del medio en que se
halla la sustancia determina cuál/es es/son la/s especie/s predominante/s y esto afectará su
migración en una corrida electroforética.
Por ejemplo, el aminoácido glicina presenta dos grupos funcionales (amino y carboxilo) donde cada
uno tiene un pKa asociado (pKa1= 2.34, pKa2= 9.62) y existen tres especies en equilibrio cuando se
halla en solución. Ver Figura 15.
Figura 15: Equilibrio de ionización del aminoácido glicina. pKa1=2.39 corresponde al grupo carboxilo; pKa2=9.62
correspondiente al grupo amino
Como explicamos en el apartado anterior, podemos analizar para cada grupo funcional cuál es la
especie predominante de acuerdo con el pH y el pKa correspondiente. En forma general, en
condiciones donde el pH es mucho menor a pKa1 predomina la especie catiónica (carga eléctrica
positiva), mientras que a valores de pH por encima de pKa2 predominará la especie aniónica (carga
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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
eléctrica negativa). El ión dipolar, o zwitterión (carga eléctrica = 0), predomina bajo condiciones de
pH que corresponden al punto isoléctrico –pI- (Ver en apartado anterior “Punto isoeléctrico”). En
consecuencia, en forma teórica puede estimarse el punto isoeléctrico mediante el promedio de los
pKa de los grupos funcionales que afectan la estabilidad del zwitterión: pI= (pKa1+pKa2)/2 en el
ejemplo.
Bajo condiciones de pH intermedios, es necesario conocer, mediante la ecuación de Henderson
Hasselbach, cuál es la relación de concentraciones de las especies en equilibrio para cada grupo
funcional, y luego estimar la carga neta “efectiva” de la sustancia considerando los aportes de cada
uno de los grupos cargados (Ver Equilibrio de ionización).
Nótese que por tratarse de un equilibrio siempre están presentes todas las especies. El
desplazamiento del equilibrio en un sentido u otro, determina la probabilidad de encontrar en
mayor concentración algunas especies que otras.
Sin embargo, bajo ciertas condiciones extremas, la concentración de una de las especies resultará:

muy baja y por lo tanto, podrá considerarse su carga despreciable o ausente al momento de estimar
la carga neta “efectiva”, ó,

muy alta y por lo tanto, prácticamente podrá considerarse como la única especie presente, o sea , la
carga neta “efectiva” será prácticamente la carga máxima.
De lo dicho hasta ahora se desprende que para estudiar el equilibrio de ionización de una sustancia
y por ende determinar su carga efectiva a determinado pH, es necesario conocer el valor de sus pKa
y/o su curva de titulación.
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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
Figura 16: Curva de titulación del aminoácido glicina. Se indican en las distintas regiones de la curva las especies
predominantes (ver Figura 15). Nótese que: i) cuando el valor de pH es igual al valor de alguno de los pKa, las
especies involucradas en el equilibrio correspondiente tienen la misma probabilidad de existir como describe la
ecuación de Henderson-Hasselbach; ii) la concentración de las especies no indicadas en cada situación es
despreciable. pI: punto isoeléctrico, pKa1: pka asociado al grupo carboxilo; pka2: pKa asociado al grupo amino, pKa=
-logKa.
Cuando se trata de aminoácidos cuyo grupo sustituyente también presenta propiedades ácidobase, este también se verá afectado por las condiciones del medio, de la misma forma que el amino
y el carboxilo del C α. En consecuencia, en estos casos pueden describirse más de tres estructuras.
A continuación se representan los equilibrios de ionización de los aminoácidos que se utilizarán en
el trabajo práctico.
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ANEXO ELECTROFORESIS 3.0/M3/FISICA
Figura 17: Equilibrio de ionización de la histidina - pK1:1.82, pK2: 6.00, pK3:9.17-.
Figura 18: Equilibrio de ionización del ácido aspártico – pK1: 1.88, pK2: 3.65, pK3: 9.60-.
Figura 19: Equilibrio de ionización de la lisina – pK1: 2.18, pK2: 8.95, pK3: 10.53-.
Para más información respecto del equilibrio ácido base recurrir a la bibliografía recomendada:
Lehninger, Principios de Bioquímica; Morrison -Boyd, Química Orgánica.
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