Módulo 5 Conservación y Control Las fermentaciones producidas

Módulo 5
Conservación y Control
Las fermentaciones producidas por las bacterias ácido lácticas se han
reconocido desde la antigüedad. Se han utilizado diferentes cultivos en muchas
partes del mundo con la finalidad de mejorar características en el
almacenamiento, palatabilidad y valores nutrimentales de los alimentos
perecederos tales como leche, verduras, carne, pescado, legumbres y
cereales. Los microorganismos que producen este tipo de fermentación, las
bacterias ácido lácticas, han tenido un importante papel en la conservación de
los alimentos, en la prevención de enfermedades a través del consumo de
alimentos, e indirectamente, en la alimentación de personas desnutridas en
todos los continentes.
En los países desarrollados, las bacterias ácido lácticas principalmente se han
asociado con los productos lácteos fermentados, tales como queso,
mantequilla, y yogurt. La utilización de cultivos iniciadores se ha vuelto toda
una industria desde el siglo pasado. Debido a esto, los aspectos tecnológicos
de la fermentación ácido láctica se han cubierto tanto en el aspecto de la
investigación, como en el de capacitación, en el campo de la ciencia de los
alimentos.
Desde épocas ancestrales, las bacterias ácido lácticas se han asociado con
efectos benéficos para la salud. En la actualidad, un número creciente de
alimentos benéficos y los llamados alimentos funcionales, así como
preparaciones farmacéuticas promotoras de la salud utilizan las características
de ciertas especies de bacterias ácido lácticas. Algunas bacterias lácticas,
sobre todo especies de lactobacilos se han identificado como bacterias
probióticas, las cuales tienen la capacidad de colonizar el intestino humano,
confiriendo protección ante algunos microorganismos patógenos, interactuando
con el sistema inmunológico mediante las células dendríticas, provocando la
inactivación de actividades de otras especies sobre éstas y favoreciendo la
buena digestión de los alimentos, entre otras características.
Para que una bacteria sea considerada como probiótica, debe cubrir ciertos
requisitos como son: resistir el paso a través del tracto gastrointestinal, y la
presencia de fenol, producir sustancias antimicrobianas, ser capaz de crecer en
un medio con sales biliares, y no presentar resistencia a antibióticos; entre
otras características. Los microorganismos probióticos se pueden encontrar
comúnmente en productos fermentados, por ejemplo leche, productos lácteos,
yogurt de soya, carne, vino, yuca; con toda seguridad también en el pulque y
ciertos quesos. Además, se han aislado a partir de heces de puerco, humanas,
de niños y leche bronca de vaca.
Existe una amplia evidencia de experimentos realizados en los laboratorios,
que comprueban que la ingesta de microorganismos probióticos, especialmente
bacterias ácido lácticas y bifidobacterias, alivian o previenen varios desórdenes
como la intolerancia a la lactosa y la diarrea por rotavirus, reducen la
incidencia de enterocolitis necrosante neonatal, disminuyen la duración de la
diarrea gastroentérica, reducen el nivel de colesterol en sangre, tienen un
efecto positivo en el sistema inmunológico de niños con VIH y reducen la
111
recurrencia de diarrea provocada por Clostridium difficile, entre otros beneficios
reportados.
La secuenciación genómica de Bifidobacterium longum, Lactobacillus
plantarum WCFS1, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri,
Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus johnsonnii,
Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus rhamnosus proveen de información
acerca de la actividad potencial como bacterias benéficas para el hospedero.
Se define como alimento funcional “aquellos que pueden satisfactoriamente
demostrar que afectan benéficamente una o más funciones del organismo
humano, mas allá de los efectos nutricionales adecuados, en una forma
relevante para mejorar el estado de salud y la reducción de enfermedades”. De
esta manera, los alimentos fermentados que contienen probióticos, prebióticos
(ingredientes del alimento que no son digeribles y que tienen un efecto benéfico
en la salud del hospedero mediante la estimulación selectiva de crecimiento o
actividad de una o algunas bacterias en el colon), o ambos, son considerados
alimentos funcionales.
En la actualidad, el desarrollo de nuevos productos para la industria alimenticia
está enfocado a crear alimentos funcionales que confieran al consumidor una
propiedad extra que beneficie su salud.
Es necesario realizar correctamente técnicas microbiológicas confiables para
enumerar microorganismos viables en estos productos, en los cuales el
beneficio adicional, depende precisamente del número de microorganismos
viables.
Como parte fundamental de un buen control de calidad de los procesos en la
industria alimentaria, se requiere de respaldar analíticamente la estimación de
de microorganismos presentes en los alimentos funcionales de aquellos
considerados como probióticos, ya que la legislación mexicana, así como la
internacional, coinciden en que para que dichos microorganismos aporten
beneficios al consumidor, es requisito que se encuentren en el alimento
funcional en cierto número y no menor.
De igual manera, como parte del control de calidad, por ejemplo, en la
industria que elabora
leches fermentadas,
es importante
enumerar
confiablemente las bacterias lácticas que se han añadido a la leche con la
finalidad de obtener productos con características mejoradas en el
almacenamiento, palatabilidad y/o valores nutrimentales. Errores en la
proporción de los microorganismos iniciadores o bien, la utilización de cepas no
adecuadas dará como resultado productos terminados de pobre calidad.
Referencias:
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología
analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.
112
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
113
Objetivos:
•
Determinar
microorganismos
intencionalmente.
viables
en
alimentos
inoculados
•
Aplicar métodos de enumeración para establecer la presencia de
microorganismos viables y/o con características probióticas.
•
En el caso de microorganismos probióticos, correlacionar la estimación de
la cifra de microorganismos presente obtenida con la calidad del producto
para concluir acerca de posibles efectos benéficos para la salud del
consumidor.
•
En el caso de microorganismos viables, correlacionar la estimación de la
cifra de microorganismos presente obtenidos para concluir acerca de la
calidad del producto.
Ejercicio:
1. Con base en bibliografía especializada, qué grupo o grupos de
microorganismos de control, viables o probióticos, se sugiere analizar
para el alimento que se le asignó?
2. Cuáles son los límites o especificaciones microbiológicas recomendadas
en bibliografía especializada para que las bacterias viables o probióticas
presenten efectos benéficos para la salud del consumidor?
3. A qué nicho de consumidores se recomendaría el consumo del alimento
analizado adicionado de microorganismos viables y/o con características
probióticas que analizaste y por qué?
114
Estimación de la cifra de microorganismos presentes en yogurt
OBJETIVOS:
• Aplicar el método de enumeración de microorganismos característicos en
yogurt mediante la técnica de cuenta en placa a 37 ºC.
• Comprobar que en el yogurt los microorganismos característicos están
viables y presentes.
.
GENERALIDADES
La fermentación desde el punto de vista económico, es un método temporal de
conservación de los alimentos. De ahí que, desde hace tiempo se utilizan
cultivos iniciadores lácticos con fines comerciales para realizar los procesos de
fermentación de forma controlada, sobre todo en productos lácteos.
Las bacterias ácido lácticas (LAB) constituyen un grupo de bacterias grampositivas que se han unido debido a sus características morfológicas,
metabólicas y fisiológicas. La descripción general de las bacterias incluye en
este grupo a cocos o bacilos gram-positivo, no esporulados, que produce ácido
láctico como producto terminal debido a la fermentación de los carbohidratos.
La fermentación del alimento por bacterias ácido lácticas principalmente,
aunque también las levaduras y otros microorganismos pueden estar
involucrados, depende además, de la concentración de las sales y otros
factores en el medio. Existen muchas clases de medios selectivos y
diferenciales disponibles para caracterizar las bacterias ácido láctico viable.
El agar MRS y M17 son medios de cultivo ampliamente recomendados para
estimar el número de bacterias lácticas viables en yogurt, Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La mayoría de los biotipos de S.
thermophilus no forma colonias viables en el MRS acidificado en diluciones que
normalmente se utilizan para la estimación de la cifra de microorganismos
presente de bulgaricus, y por otra parte, la mayoría de los L. bulgaricus no
forman colonias visibles en placas de agar M17 en las diluciones que
normalmente se utilizan para efectuar cómputos de S. thermophilus.
El L. bulgaricus es un microorganismo mesofílico de forma lenticular y colonias
generalmente en forma puntiaguda, con diámetro de 1-3 mm, en medio MRS
acidificado. Su apariencia microscópica corresponde a la de bacilos
generalmente largos, no esporulado, gram-positivo, catalasa-negativo.
El S. thermophilus es un microorganismo termofílico que forma colonias
lenticulares de 1-2 mm en el medio M 17. Su apariencia microscópica
corresponde a células ovoides o esférica, 0.7-0.9 µm, en forma de pares o
cadenas largas, gran-positivo, catalasa-negativo.
115
FUNDAMENTO
El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimales
de la muestra en:
1. agar MRS acidificado, seguido de incubación aneróbica a 37ºC/72 hr, para la
estimación de la cifra de microorganismos presente de L. bulgaricus.
2. agar M17, seguido por incubación aeróbica a 37 ºC/48hr para la estimación
de la cifra de microorganismos presente de S. thermophilus.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
• 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL de
solución amortiguadora de peptonas a.
• 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solución
amortiguador de peptonas a.
• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS acidificadoa.
• 1 matraz de 500, mL con 250,0 mL de medio M17 completoa.
SOLUCIONES Y REACTIVOS
• Colorantes para Tinción de Gramd.
MATERIALES Y EQUIPO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Incubadora 37 ± 1ºCa.
Motor para licuadora estéril o Stomachera.
Agitador de tubos tipo vortexa.
Contador de coloniasc,d.
Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºCa.
6 pipetas graduadas de 1,0 mLa.
1 pipetas graduada de 10,0 mLa.
16 cajas de Petria.
Espátula de metala
Microscopio ópticod.
Asa bacteriológica d.
Portaobjetosd.
NOTAS
a
b
c
d
Material necesario al inicio de la práctica.
Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.
Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.
Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.
116
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de la muestra y porción de prueba.
NOTAS
Antes de abrir el envase del yogurt, limpiar la superficie externa que rodea la
parte por la cual la muestra será tomada, con el objeto de retirar cualquier
material que pueda contaminar la muestra. Desinfectar el área de trabajo con
etanol al 70% (v/v) para prevenir futura contaminación, Abrir el envase
asépticamente.
En esta etapa es importante obtener no solamente una dilución homogénea,
sino poder fragmentar las cadenas de estreptococos y lactobacilos en células
individuales o cadenas cortas para que en el resultado sea posible expresar la
estimación de la cifra de microorganismos presente de viables por gramo de
muestra.
1.1. Yogurt natural.
Mezclar el contenido del envase con espátula estéril. Pesar 10,0 a 10,1 g de la
muestra en un recipiente adecuado.
1.2. Yogurt con fruta ó cereales
Licuar el contenido del yogurt durante un minuto utilizando stomacher.
Pesar 10,0 a 10,1 g de la muestra.
2. Preparación de la primera dilución.
NOTA
• Añadir la solución amortiguadora de peptonas a la porción de prueba hasta
que la masa de la porción de ensayo y diluyente sea de 50 g, homogeneizar
durante un minuto.
• Llevar a 100,0 g con el mismo diluyente para obtener la dilución 1:10.
3. Preparación de diluciones decimales.
• Realizar diluciones seriadas en tubos con 9,0 mL de solución amortiguadora
de peptonas añadiendo 1,0 mL de la primera dilución al primer tubo.
• Repetir esta operación hasta obtener la dilución requerida (10-7) utilizando
una pipeta diferente para cada dilución.
117
4. Inoculación e incubación.
• El tiempo máximo entre la inoculación de las diluciones y el vertido en cajas
petri, no debe exceder de 15 min.
• Colocar un mL de las cuatro últimas diluciones duplicado en cajas Petri.
• Para S. thermophilus, verter 12-15 mL de M17 mantenido a 45 ± 1ºC en un
baño de agua.
• Para L. bulgaricus, verter 12-15 mL de MRS acidificado mantenido a 45 ±
1ºC en un baño de agua.
• Mezclar cuidadosamente, y dejar solidificar en una superficie horizontal las
cajas Petri en posición invertida.
• Incubar las placas destinadas para la numeración de L.bulgaricus a 37 ± 1ºC
durante 72 h. en jarra de aneorobiosis (atmósfera de 90 % nitrógeno y 10 %
CO2). No apilar más de 6 cajas Petri.
• Incubar las placas destinadas para la enumeración de S. thermophilus 37 ±
1ºC durante 48 h.
5. Cómputo de colonias.
Después del periodo de incubación especificado, contar las colonias que
muestren las características para cada microorganismo en las placas que
tengan de 10-300 colonias. Evitar contabilizar la materia extraña utilizando un
lente de ampliación.
6. Confirmación.
Teñir estas colonias utilizando el método de Gram, y confirmar que no son
formadoras de esporas. Bacilos Gram-positivo, catalasa-negativo para aquellos
que crecen en el medio MRS, y cadenas de cocos o diplococos Gram-positivo,
catalasa-negativo en el caso de que crezcan en el medio M17.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
Utilizar las cuentas de las placas que contengan 10-300 colonias.
El número de microorganismos característicos por gramo es igual a:
Σ C / (n1 + 0,1n2) d
Donde:
C:
Es la suma de colonias contadas en las placas n1 y n2.
n1:
Es el número de placas contadas en la menor dilución.
n2:
Es el número de placas contadas en la mayor dilución.
d:
Es la dilución en la cual la primer cuenta se obtuvo.
NOTA
Si hay más de dos diluciones contables, la fórmula se modifica:
Así para tres diluciones:
118
Σ EC / (n1 + 0,1n2 + 0,1n3) d
• Redondear el resultado obtenido en a dos cifras significativas. Para un
número de tres dígitos, redondear el tercer dígito al cero más cercano. Si el
tercer dígito es cinco redondear el dígito hacia abajo en caso de que los dos
primeros dígitos sean número par, y al dígito superior en caso de que los dos
primeros dígitos sean número impar, por ejemplo:
Para
234
235
225
245
redondear a
230
240
220
240
• Si existen solamente cuentas menores de 10, reportar el número de
microorganismos por gramo como “menor que”,
siendo el valor
correspondiente a la menor dilución.
• El número total de microorganismos característicos por gramo de yogurt.
Nl + Ns
Donde:
Nl
Ns
Es el número de L. bulgaricus por gramo.
Es el número de S. thermphilus por gramo.
Ejemplo:
Asumir que la estimación de la cifra de microorganismos presente L. bulgaricus
dio los siguientes resultados en dos cajas de Petri por dilución:
10- 5, 295 y 245 colonias,
10- 6, 33 y 40 colonias,
Σ C/(n1 + 0,1n2) d = 295 + 245 + 33 + 40 /(2 + 0,1 x 2) 10-5
= 613 / 2.2 x 10-5 = 278,6 x 105
Con el redondeo el número estimado de L. bulgaricus es 2,8 x 107 UFC/ g de
yogurt.
BIBLIOGRAFÍA
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología
analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
De Man. J.C. Rogosa, M & Sharpe, M. E. (1960). J. Applied Bacteriology.
23,130-134.
119
International IDF Standard 117 A. Yogurt, enumeration of characteristic
microorganisms colony count technique at 37ºC.
120
Medios de Cultivo
Solución amortiguadora de peptonas (cuentas viables en yogurt)
Peptona 1 (digerido tríptico de caseína)
Peptona 2 (digerido tríptico de carne)
Agua
pH final25°C
0,5 g
0,5 g
1,0 L
7,0 ± 0,2
Disolver las peptonas en agua. Distribuir la solución en porciones de 90,0 o 9,0
mL en recipientes según se requiera. Esterilizar a 121 ºC / 15 min.
NOTA
La mezcla de peptonas de este tipo (peptona 1 y 2), se consigue en forma
comercial con el nombre de polipeptonas.
Reactivos para ajustar el pH
Hidróxido de sodio (Na OH), aproximadamente 0,1 mol/L de solución.
Acido clorhídrico (HCl) aproximadamente 0.1 mol/L de solución.
Agar MRS acidificado
Peptona de caseína
Extracto de malta
Extracto de levadura
Dextrosa
Tween 80 (sorbitán mono-oleato)
Fosfato dipótasico (K2HPO4)
Acetato de sodio trihidratado (CH3CO2Na)3. 3 H2O
Citrato de amonio [C6H6O7( NH4) 2]
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
Sulfato de manganeso heptahidratado (MnSO4.7H2O)
Agar bacteriológico
10,0 g
10,0 g
5,0 g
20,0 g
1,0 mL
2,0 g
2,0 g
2,0 g
0,2 g
0,05 g
15,0 g
Reactivos para ajustar el pH
Acido acético (CH3COOH), 100% glacial.
Disolver los componentes en un baño de agua. Enfriar a 50 ºC y añadir ácido
acético para ajustar el pH, comprobar por medio de potenciómetro, de tal forma
que después de esterilizado llegue a 5,4 a temperatura ambiente. Distribuir en
porciones de 500,0 mL. Esterilizar a 121º C durante 15 min.
121
Principio de acción
La peptona es fuente de carbono y nitrógeno. El extracto de levadura es fuente
de elementos traza, vitaminas y amino ácidos. La dextrosa es fuente de
carbohidratos que proporciona carbono. El acetato de sodio y citrato de
amonio, inhiben los estreptococos, hongos y otros microorganismos. El sulfato
de magnesio y sulfato de manganeso son fuente de iones inorgánicos. El tween
80 actúa como surfactante.
Medio M17
Medio básico:
Peptona 1 (digerido tríptico de caseína)
Peptona 2 (digerido péptico de carne)
Peptona 3 (digerido papaínico de soya)
Extracto de levadura
Extracto de carne
Sal disódica del β- glicerofosfato (C3H7O6PNa2)
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
Acido ascórbico
Agar bacteriológico
Agua
2,50 g
2,50 g
5,00 g
2,50 g
5,00 g
9,00 g
0,25 g
0,50 g
15,0 g
950,0 mL
Disolver los componentes en agua hirviendo enfriar a 50ºC y ajustar el pH,
utilizando los reactivos para ajustar el pH de tal forma que después de
esterilizado llegue a 7,1-7,2 a temperatura ambiente. Transferir el medio en
porciones de 95,0 mL en frascos de 150,0 mL de capacidad. Esterilizar a
121ºC/15 min.
Solución de lactosa:
Lactosa
Agua
10,0 g
100,0 mL
Disolver la lactosa en agua. Esterilizar a 121ºC/ 15 min.
Medio completo:
Medio básico
Solución de lactosa
950,0 mL
5,0 mL
Inmediatamente antes de utilizar, fundir el medio básico en un baño de agua
hirviente y enfriar a 48-50ºC. Calentar la solución de lactosa a 48-50ºC. Añadir
la solución de lactosa al medio básico y mezclar. Mantener el medio en un
baño de agua (48-50ºC) hasta su utilización.
Principio de acción.
122
El agar M17 contiene peptonas y carne que son fuente de carbono, nitrógeno,
vitaminas y minerales. El extracto de levadura proporciona vitaminas del
complejo B que estimula al crecimiento bacteriano. La sal disódica del βglicerofosfato amortigua el ácido que se produce por la fermentación de la
lactosa. El ácido ascórbico estimula el crecimiento de estreptococos lácticos. El
sulfato de magnesio provee de iones esenciales para el crecimiento. El agar es
el agente solidificante.
123
Estimación de la cifra presente de Lactobacillus casei o de
Lactobacillus acidophilus
OBJETIVO
Estimar la cifra presente de Lactobacillus casei o de Lactobacillus acidophillus,
en asociación o no, con Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, y
Bifidobacterium, en productos lácteos.
FUNDAMENTO
El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimales
de la muestra en
1. agar MRS acidificado adicionado con clindamicina, seguido de
incubación aneróbica a 37ºC/72 h., para la estimación de la cifra de
microorganismos presente de L. acidophillus.
2. agar MRS acidificado adicionado con sales biliares, seguido de
incubación aneróbica a 37ºC/72 h., para la estimación de la cifra de
microorganismos presente de L. casei.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
• 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL de
solución de triptona sala.
• 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solución de
triptona sala.
• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS + clindamicina
acidificadoa (para enumeración de L. acidophilus).
• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS + oxgall acidificadoa
(para enumeración de L. casei).
SOLUCIONES Y REACTIVOS
• Colorantes para Tinción de Gramd.
MATERIALES Y EQUIPO
•
•
•
•
•
•
Incubadora 37 ± 1ºCa.
Motor para licuadora estéril o Stomachera.
Agitador de tubos tipo vortexa.
Contador de coloniasc,d.
Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºCa.
5 pipetas graduadas de 1,0 mLa.
124
•
•
•
•
•
•
1 pipetas graduada de 10,0 mLa.
6 cajas de Petria.
Espátula de metala
Microscopio ópticod.
Asa bacteriológica d.
Portaobjetosd.
NOTAS
a
b
c
d
Material necesario al inicio de la práctica.
Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.
Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.
Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra y porción de prueba.
NOTAS
• Para productos con frutas, únicamente tomar la masa sin la fruta, porque la
masa sola contiene las bacterias lácticas viables.
• En el caso de producto sólidos, homogeneizar el producto que se va analizar
haciendo “8” (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estéril.
Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar las
demás diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente.
• En el caso de productos líquidos, homogeneizar agitando en forma de arco
durante 1 min.
• Para la preparación de la muestra, realizar la primera dilución tomando
aproximadamente 10,0 mL de producto y trasvasarlo asépticamente en 90,0
mL de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completa
disolución. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de la
muestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredes
externas de la pipeta.
• Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, se
recomienda una rotación manual y no en vortex debido a que se pueden
dañar las bacterias viables.
1. Una vez realizada la primera dilución al 10-1, desechar la pipeta después de
su uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilución.
2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estéril, tomar
1,0 mL de la dilución al 10-1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con
9,0 mL de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene una
dilución al 10-2, desechar la pipeta después de utilizarla. Continuar así las
diluciones sucesivas hasta 10-8.
3. Simultáneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimas
diluciones a razón de 1,0 mL por caja de Petri
125
4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizar
por rotación las cajas. Después de solidificar (aprox. 30 min) sobre una
superficie horizontal).
5. Después de la solidificación poner las cajas en jarra de anaerobiosis
(invertidas).
6. Incubar a 37ºC (+2ºC) durante 72 h. (+ 3 h) bajo atmósfera de CO2.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
Utilizar las cuentas de las placas que contengan 20-200 colonias.
Para efectuar los cálculos y expresión de resultados, consultar el protocolo de
enumeración de microorganismos viables en yogurt.
BIBLIOGRAFÍA
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología
analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
126
Medios de Cultivo
Triptona sal, solución de
Triptona (peptona de caseína)
Cloruro de sodio (NaCl)
Agua destilada
1g
8,5 g
1,0 L
Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antes
de la esterilización el pH para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25º C (+ 2ºC). Repartir para
tener 9,0 mL por tubo y después de la esterilización. Esterilizar durante 20 min
a 121ºC (+ 2ºC).
Utilizar solución de triptona sal, solo si el producto a analizar no contiene
Bifidobacterium.
MRS + oxgall, medio
MRS, agar + 1,5 g/L de Bacto oxgall (sales biliares)
Poner en suspensión 70,3 g del polvo MRS en agua destilada, añadir las sales
biliares. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta la obtención de
un líquido claro.
Ajustar el pH antes de la esterilización a 5.65 (+0,1) con ácido acético glacial
concentrado (alrededor de 5,0 mL) para que el pH después del autoclave sea
5,4 (+ 0,1) a 25ºC (+ 2ºC). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121ºC (+
2ºC). Almacenar hasta por un máximo de un mes a 4°C
Principio de acción
El principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a las sales biliares
de L. casei
MRS + clindamicina, medio ácido.
MRS (polvo comercial listo para su uso)
70,3 g
Agua destilada
1,0 L
Solución de clindamicina al 0,005% (clindamicina 5,0 mg, agua destilada 100,0
mL), esterilizada por filtración (0,45 µm). Almacenar máximo por un mes a
4°C.
Poner en suspensión 70,3 g del polvo MRS en agua destilada. Disolver la
suspensión en baño María hirviente hasta la obtención de un líquido claro.
Ajustar el pH antes de la esterilización a 5.65 (+ 0,1) con ácido acético glacial
concentrado (alrededor de 5,0 mL) para que el pH después del autoclave sea
5,4 (+ 0,1) a 25ºC (+ 2ºC). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121ºC (+
127
2 ºC). Añadir 0,2% de solución de clindamicina en 100, 0 mL de medio MRS,
en condiciones de asepsia. Conservar máximo un mes en oscuridad a una
temperatura entre 0 y 5º C.
Principio de acción
El principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a la clindamicina
del L. acidophilus.
128
Estimación de la cuenta de Bifidobacterium
OBJETIVO
Estimar el número presente de Bifidobacterium en las leches fermentadas en
asociación o no, con Streptococcus thermophilus y Lactococcus lactis,, en
productos lácteos.
FUNDAMENTO
El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimales
de la muestra, en agar MRS neutro adicionado con dicloxacilina, seguido de
incubación anaeróbica a 37ºC/120 h., para la estimación de la cifra de
Bifidobacterias presente.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
• 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL de
solución de triptona sal cisteínaa.
• 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solución de
triptona sal cisteínaa.
• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS neutro + dicloxacilinaa
(para enumeración de Bifidobacterias).
SOLUCIONES Y REACTIVOS
• Colorantes para Tinción de Gramc.
MATERIALES Y EQUIPO
•
•
•
•
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•
•
•
•
•
•
•
Incubadora 37 ± 1ºCa.
Motor para licuadora estéril o Stomachera.
Agitador de tubos tipo vortexa.
Contador de coloniasc.
Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºCa.
5 pipetas graduadas de 1,0 mLa.
1 pipetas graduada de 10,0 mLa.
6 cajas de Petria.
Espátula de metala
Microscopio ópticod.
Asa bacteriológica c.
Portaobjetosc.
NOTAS
129
a
b
c
Material necesario al inicio de la práctica.
Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.
Material necesario a las 120 horas de iniciada la práctica.
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra y porción de prueba.
NOTAS
• Para productos con frutas, únicamente tomar la masa sin la fruta, porque la
masa sola contiene las bacterias lácticas viables.
• En el caso de producto sólidos, homogeneizar el producto que se va analizar
haciendo “8” (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estéril.
Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar las
demás diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente.
En el caso de productos líquidos, homogeneizar agitando en forma de arco
durante 1 min.
• Para la preparación de la muestra, realizar la primera dilución tomando
aproximadamente 10,0 mL de producto y trasvasarlo asépticamente en 90,0
mL de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completa
disolución. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de la
muestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredes
externas de la pipeta.
• Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, se
recomienda una rotación manual y no en vortex debido a que se pueden
dañar las bacterias viables.
1. Una vez realizada la primera dilución al 10-1, desechar la pipeta después de
su uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilución.
2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estéril, tomar
1,0 mL de la dilución al 10-1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con
9,0 mL de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene una
dilución al 10-2, desechar la pipeta después de utilizarla. Continuar así las
diluciones sucesivas hasta 10-8.
3. Simultáneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimas
diluciones a razón de 1,0 mL por caja de Petri
4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizar
por rotación las cajas. Después de solidificar (aprox. 30 min) sobre una
superficie horizontal).
5. Después de la solidificación poner las cajas en jarra de anaerobiosis
(invertidas).
6. Incubar a 37ºC (+ 2ºC) durante 120 h. (+ 3 h) bajo atmósfera de CO2.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
Utilizar las cuentas de las placas que contengan 20-200 colonias.
130
Para efectuar los cálculos y expresión de resultados, consultar el protocolo de
enumeración de microorganismos viables en yogurt.
BIBLIOGRAFÍA
(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects. 3th
ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.
Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología
analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
131
Medios de Cultivo
Triptona sal, solución de, (TSC)
Triptona (peptona de caseína)
Cloruro de sodio (NaCl)
Clorhidrato de L-cisteina
1g
8,5 g
0,30 g
Agua destilada
1,0 L
Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antes
de la esterilización el pH para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25º C (+ 2ºC). Repartir para
tener 9,0 mL por tubo después de la evaporación que se presenta durante la
esterilización. Esterilizar durante 20 min a 121ºC (+ 2ºC).
Es recomendable regenerar los tubos de TSC durante 20+/- 5 min a 100 +/2°C en un baño María antes de su uso.
MRS neutro + dicloxacilina, medio
MRS neutro pH 6,5 + 0,1 después autoclave + 1,0 mL de solución antioxígeno
+ 1,0 mL de una solución al 1/10 de antibiótico dicloxacilina por cada 100,0 mL
de medio de cultivo.
Poner en suspensión 15 g de agar bacteriológico en un recipiente con 500,0
mL de agua destilada. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta la
obtención de un líquido claro.
Poner en suspensión 55g de polvo MRS neutro en otro recipiente con
igualmente 500,0 mL de agua destilada (alrededor de 50ºC).
Mezclar las dos soluciones agitando bien.
Ajustar el pH antes de la esterilización a 6,5 (+ 0,1).
Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121ºC (+ 2ºC).
Conservar un mes máximo a la oscuridad a una temperatura entre 0 y 5º C.
Solución anti—oxigeno
Hidrocloruro de L-cisteína
3,0 g
Agua destilada
100,0 mL
132
•
Después de la disolución, esterilizar por filtración en membrana estéril de
0.45 µm. Conservación 15 días a 4ºC. (Después de este tiempo la solución
pierde su efectividad).
Solución de antibiótico
Dicloxacilina
25,0 mg
Agua
50,0 mL
Después de la disolución, esterilizar por filtración sobre membrana estéril de
0,45 µm. Conservación 15 días a 4ºC. Repartir a razón de 10,0 mL en tubos
estériles. Conservación 15 días a 4ºC. En el momento del empleo, efectuar una
dilución al 1/10 de esta solución madre con solución de triptona sal cisteína
regenerada.
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