memoria de prácticas en valentia biopharma

2008
VALENTIA BIOPHARMA S.L.
EDUARDO L. CALPENA CORPAS
PRÁCTICA Nº 08P220E001
[MEMORIA DE PRÁCTICAS
EN VALENTIA BIOPHARMA]
DROSOPHILA COMO MODELO PARA PATOLOGÍAS GENÉTICAS. LABORATORIO I+D
(PCR, TÉCNICAS GENÉTICAS, VECTORES CLONACIÓN,…)
Eduardo L. Calpena Corpas
PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
MEMORIA DE PRÁCTICAS EN EMPRESA
VALENTIA BIOPHARMA
EDUARDO LUIS CALPENA CORPAS
Nº PRÁCTICA: 08P220E001/08P220E001B
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Eduardo L. Calpena Corpas
PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
Índice
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................... 4
Información general ................................................................................................................... 4
La empresa: VALENTIA BIOPHARMA ..................................................................................... 4
Mis actividades .......................................................................................................................... 4
DROSOPHILA MELANOGASTER ................................................................................................ 5
Ciclo biológico ........................................................................................................................... 5
1. Huevo ............................................................................................................................ 6
2. Larva .............................................................................................................................. 6
3. Pupa .............................................................................................................................. 6
4. Imago ............................................................................................................................. 6
5. Adulto ............................................................................................................................ 7
Morfología externa .................................................................................................................... 7
Identificación del sexo en la mosca adulta ................................................................................ 7
Manejo de Drosophila ............................................................................................................... 8
Recolección de hembras vírgenes ............................................................................................ 9
Cruces ....................................................................................................................................... 9
Recomendaciones para el cuidado de cultivos ....................................................................... 10
Moscas transgénicas ............................................................................................................... 10
TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ..................................................... 11
Técnicas de aislamiento de DNA plasmídico .......................................................................... 11
Extracción de RNA .................................................................................................................. 12
Técnicas de análisis de DNA .................................................................................................. 12
Amplificación del DNA mediante PCR .................................................................................... 13
Mutagénesis dirigida ............................................................................................................... 14
Digestiones de DNA con endonucleasas de restricción ......................................................... 15
Ligación de fragmentos de DNA ............................................................................................. 15
TRANSFORMACION GENÉTICA DE MICROORGANISMOS ................................................... 15
Preparación de células competentes (método del cloruro de rubidio) .................................... 15
Transformación mediante choque térmico .............................................................................. 15
Transformación mediante electroporación .............................................................................. 15
CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 16
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Eduardo L. Calpena Corpas
PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
INTRODUCCIÓN
Información general
Empresa: Valentia Biopharma S.L., localizada en el Parc Científic Universitat de
València
Tutora: M.Carmen Álvarez Abril
Duración: 464 Horas, distribuidas entre Julio, Agosto y Septiembre
Contenido de las prácticas: Drosophila como modelo para patologías genéticas.
Laboratorio I+D (PCR, técnicas genéticas, vectores clonación,…)
La empresa: VALENTIA BIOPHARMA
El objetivo de Valentia Biopharma es el desarrollo de nuevas formas de terapia capaces de
aportar soluciones a patologías humanas que actualmente no tienen tratamiento efectivo; para
ello la compañía cuenta con un programa de
Drug Discovery basado en la modelización de
enfermedades humanas en Drosophila y el
rastreo de compuestos a gran escala in vivo.
Con este objetivo la empresa ha desarrollado
una plataforma biotecnológica en el campo de la
Genética del Desarrollo y aborda programas de
investigación
orientados
inicialmente
a
patologías genéticas como la distrofia miotónica. La distrofia miotónica es una enfermedad
genética degenerativa. Los afectados por esta enfermedad, se caracterizan, principalmente,
por miotonía (incapacidad para relajar los músculos) y miopatía (degeneración muscular). Esta
enfermedad está catalogada como enfermedad rara puesto que tiene una prevalencia de 1 por
cada 8.000 nacimientos vivos. Actualmente no se dispone de ningún tratamiento efectivo para
esta patología.
Mis actividades
-Tareas generales de mantenimiento del
laboratorio (preparación de medios de
cultivo y de tampones específicos,
utilización del autoclave,…)
-Clonaciones (digestiones, ligaciones,…)
-Purificación de ácidos nucleicos
-Análisis de secuencias
-Manejo
de
Drosophila
(cultivo
y
mantenimiento,
cruzamientos,
sexar
poblaciones, identificación y aislamiento de
vírgenes,…)
-Extracción DNA y RNA de Drosophila
-Diseño de oligonucleótidos
-Minis y maxis preparaciones
-Transformación de células competentes
(electroporación, choque térmico,…)
-PCR, PCR de colonias
-Mutagénesis dirigida por PCR mediante
extensión de fragmentos que se solapan
-Generación de células competentes de
Escherichia coli
-Técnicas electroforéticas,…
-Localización de inserciones mediante PCR
inversa y mapeo genético
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PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
DROSOPHILA MELANOGASTER
Drosophila melanogaster es una mosca de tamaño pequeño (3 mm en estado adulto) y que
también es conocida como la “mosca de la fruta o del vinagre”. Se ha utilizado como organismo
experimental en estudios genéticos desde principios del siglo pasado (utilizada a partir de
1905). Ha sido el organismo más utilizado por los genéticos, debido a que presenta grandes
ventajas:
-facilidad de cultivo
-tiempo generacional corto (9 a 11 días a 25ºC)
-progenie prolífica
-pequeño tamaño
-número reducido de cromosomas (2n=8)
-cromosomas politénicos en glándulas salivales
-numerosos mutantes
Drosophila melanogaster tiene tres pares de autosomas (cromosomas 2, 3 y 4) y un par de
cromosomas sexuales (cromosomas X e Y). La determinación del sexo en este organismo es
XX para las hembras y XY para los machos. Los cromosomas 2 y 3 son metacéntricos y el 4 es
puntiforme. Los cromosomas sexuales son telocéntricos.
Ciclo biológico
D. melanogaster tiene un ciclo biológico que incluye varios estados: huevo, larva (L1, L2 y
L3), pupa, imago y adulto. La duración del ciclo de vida varía con la temperatura. A 25ºC, el
ciclo de vida completo dura de 9 a 11 días, mientras que a 20ºC la duración es de 15 días. La
exposición continua a temperaturas superiores a 30ºC puede conducir a la esterilización y
muerte de las moscas. Así mismo, las bajas temperaturas, inferiores a 20ºC hacen decrecer la
viabilidad de las moscas y prolongan su ciclo vital. La temperatura óptima para el cultivo es de
25ºC. Los stocks de moscas pueden almacenarse en cámaras a 19ºC.
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PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
1. Huevo
La fecundación tiene lugar dentro del útero. A partir de la formación del cigoto, comienza el
desarrollo embrionario. El embrión se desarrolla dentro de las membranas del huevo,
permaneciendo durante los estados iniciales del desarrollo en el cuerpo de la madre y siendo
depositado después. Una hembra puede empezar a depositar huevos después del segundo día
de emerger y la puesta puede continuar hasta unos 10 días después.
El huevo es de forma ovoide, cubierto por una fuerte membrana quitinosa, el corion, con la
cara dorsal más aplastada que la ventral que es redondeada. La superficie del corion presenta
unas marcas o relieves hexagonales. El huevo viene a tener un tamaño de 0.5 mm. De su parte
anterior se proyectan dos apéndices en cuyo extremo se encuentran una especie de palas, a
modo de remos, cuya función es la de hacer de flotadores para prevenir el hundimiento del
huevo en la superficie semilíquida en que son depositados. En la parte anterior, entre los dos
apéndices, hay un poro diminuto, el micropilo, que es precisamente por donde penetra el
espermatozoide para fecundar a la célula huevo.
2. Larva
Terminado el desarrollo embrionario emerge del huevo la larva, que es un pequeño gusanillo
de gran movilidad, blanco, segmentado, con unas piezas negras en su región anterior,
mandíbulas. En las regiones anterior y posterior tiene un par de espiráculos de función
traqueal.
La larva sufre dos mudas hasta alcanzar el tamaño adulto, a cada periodo entre muda y muda
se le denomina estadío larvario. El cambio se produce cuando se rasga la piel del estadío
anterior y sale de ella una larva un poco mayor. El primer estadío larvario (L1) es el periodo
comprendido entre el nacimiento y la primera muda, el segundo estadío larvario (L2)
comprende el periodo entre las mudas primera y segunda y el tercer estadío larvario (L3) va
desde la segunda muda hasta la inmovilización de la larva para dar lugar a la pupa. En el
tercer estadío larvario la larva llega a alcanzar un longitud de 4.5 mm. Las larvas constituyen el
material idóneo para el estudio de los cromosomas politénicos presentes en las células de las
glándulas salivales, de ahí la necesidad de conocer sus características y desarrollo.
Todo el periodo larvario es de gran movilidad; la larva no cesa de moverse y alimentarse
formando unos canalillos característicos por todo el medio de cultivo. La distinción entre los
estadíos larvarios se puede hacer fijándose tanto en el tamaño de la larva como en el número
de piezas mandibulares. El estado larval se extiende aproximadamente 4 días a 25ºC.
3. Pupa
La larva en el tercer estadío cambia sus espiráculos por las antenas pupales y un poco
después se va inmovilizando y acortando su longitud, la cutícula se oscurece y fortalece
formando el puparium. A esta prepupa se le puede considerar también como el cuarto estadío
larvario que termina con una muda. A partir de entonces comienza el periodo de pupa o
crisálida en el que se producen grandes cambios histolíticos e histológicos para dar lugar a los
tejidos adultos. Las estructuras del adulto que se van adquiriendo van tomando más forma y
color conforme avanza el estado de pupa. Los tejidos localizados en el preadulto se llaman
discos imaginales y, debido a la facilidad de su aislamiento se han utilizado mucho en
Genética del Desarrollo o Epigenética. El metabolismo pupal se centra en la sustitución de los
tejidos larvarios por los del adulto.
4. Imago
Las transformaciones histológicas dan lugar a un individuo adulto, pero sexualmente inmaduro,
llamado imago. Si el medio en el que se desarrolla el animal está a 25ºC, entre el cuarto y
quinto día de la vida pupal se rasga el puparium y surge el imago. La Drosophila recién
emergida es muy clara y tiene las alas sin desplegar. Una hora más tarde despliega las alas y a
las 12 horas ya tiene su pigmentación normal de adulto.
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5. Adulto
El adulto es el estadío reproductivo del ciclo. Los adultos serán sexualmente maduros después
de seis horas de emerger del pupario. En los machos, la formación tiene lugar en los testículos.
Las cuatro células derivadas de la meiosis de una célula madre son gametos viables y se
acumulan en el saco eyaculador. En las hembras la célula madre de los gametos femeninos se
divide en 16 células, de las cuales sólo una experimenta meiosis, las otras se convierten en
células nutritivas.
La meiosis se detiene en metafase I. El esperma se almacena en las espermatecas y el
receptáculo seminal de la hembra será descargado gradualmente en el oviducto, a medida que
los huevos pasan a través del mismo a la vagina. Cuando el espermatozoide penetra en el
óvulo inmaduro (fecundación) continúa la meiosis con la formación de los corpúsculos polares y
la cariogamia. A continuación el núcleo del huevo comienza a dividirse activamente.
La hembra comienza a depositar huevos maduros al 2º día de haber emergido de la pupa;
aproximadamente entre 50 y 70 huevos por día, durante los primeros días. La producción de
huevos decrece con el tiempo.
El promedio de vida de la mosca adulta es de 37 días a 25ºC.
Morfología externa
El cuerpo de la mosca adulta se divide en: cabeza, tórax y abdomen.
a. La cabeza está compuesta por 6 segmentos fusionados. En ella se distinguen:
-Antenas, un par, cada una formada por 3 segmentos
-Probóscide, lengua
-Ojos compuestos, constituidos por numerosas facetas u omatidios (780 en las
hembras, 740 en los machos)
-Ocelo, tres, localizados entre los ojos compuestos, sobre la superficie dorsal de la
cabeza.
-Quetas o cerdas, órganos de los sentidos, de distinto tamaño.
b. El tórax está compuesto por tres segmentos fusionados. Se distinguen:
-Protórax, que lleva el primer par de patas. Cada pata consta de: Coxa, trocánter,
fémur, tibia y 5 segmentos tarsales.
-Mesotórax, que porta las alas y el 2º par de patas. Las alas tienen una estructura
membranosa con 5 venas longitudinales y dos transversales cada una.
-Metatórax, que lleva los halterios o balancines y el 3er par de patas.
c. El abdomen consta de 7 segmentos visibles en la hembra y 5 en el macho.
Identificación del sexo en la mosca adulta
Las diferencias en los adultos son las siguientes:
a. Tamaño. La hembra es ligeramente mayor que el macho.
b. Abdomen. La hembra tiene 7 segmentos visibles y el extremo posterior
alargado, cada segmento abdominal tiene en la superficie dorsal una banda de
color más oscuro. El macho tiene 5 segmentos visibles y el extremo posterior
redondeado; los dos últimos segmentos están fusionados.
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c. Región genital. La hembra tiene en la cara ventral del abdomen una placa anal
y la placa vaginal. El macho tiene una placa anal y un arco genital de color
pardo.
d. Peine sexual. Se encuentra sólo en los machos. Es un conjunto de cerdas
sobre cada segmento tarsal proximal del 1er par de patas.
Manejo de Drosophila
En el laboratorio Drosophila puede cultivarse en botellas estériles con una comida preparada a
base de harina de maíz, azúcar, levadura y agar como espesante. Para evitar contaminaciones
se añade un fungicida, normalmente nipagín (metil p-oxibenzoato), y un bactericida (ácido
propiónico). Una vez solidificada se le añade levadura picada (para proporcionar una fuente de
proteínas a las larvas) y opcionalmente un papel en zigzag (para que absorba la humedad).
Estos frascos se tapan con un algodón esterilizado y se indica la fecha y el tipo de cepa o cruce
cultivado en la botella.
Anestesia
Para facilitar su estudio, conviene anestesiar las moscas, para ello hay dos métodos, éter y
CO2.
I.
Eter
Se toma el frasco donde se encuentran los adultos y se golpea suavemente en un corcho para
que caigan hacia el fondo. Se retira el algodón y se vuelca el frasco sobre el eterificador. El
eterificador (una botella o tubo de vidrio) se tapa con un algodón impregnado de éter. Cuando
las moscas están dormidas se vuelcan sobre un papel y se observan con la lupa. El tiempo que
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tardan las moscas en dormirse es muy variable, y depende bastante de la edad (cuanto más
viejas son, antes se duermen).
1.- Hay que tener cuidado, pues una exposición prolongada al éter les puede producir
la muerte (se reconoce porque las alas se disponen perpendicularmente al cuerpo).
2.- Hay que cuidar no mantener abierta la botella del cultivo, para evitar que las moscas
se escapen o que entren otras y el cultivo se contamine.
3.- No dejar abierto el eterificador ni la botella de éter, ya que además de evaporarse,
por su bajo punto de ebullición y cargar el ambiente, hay peligro de explosión, ya que
es altamente inflamable.
4.- Antes de eterificar de nuevo, nos hemos de asegurar de que no quedan moscas en
el fondo del eterificador.
5.- Si durante una observación o recuento las moscas empiezan a despertarse, se
pueden reeterificar, con cuidado de no matarlas.
6.- Para facilitar la observación de los individuos es recomendable alinear todas las
moscas sobre la cartulina, pasando la hilera bajo el foco de la lupa. Así se pueden ir
separando según nuestro interés.
7.- Cuando se devuelven las moscas dormidas a un frasco con comida, se ha de
procurar que éste esté horizontal, para que no se peguen y mueran. La botella no se
colocará en posición vertical hasta que estén despiertas. Otro método consiste en
meter las moscas en un pequeño cucurucho de papel, que a su vez se mete en el
frasco.
II.
CO2
El proceso en su inicio es similar, salvo que el algodón con el que se tapa el frasco debe estar
seco. A continuación se introduce una aguja perforada por la cual pasará el CO2 y de esta
manera, debido a la escasez de oxigeno, las moscas quedan anestesiadas. Se vacía el
contenido del frasco eterificador sobre la placa difusora del CO2 sobre la que se realizará la
observación. En este caso las moscas no mueren por exceso de anestesia, pero hay que tener
cuidado porque se despertarán en el momento que cese el suministro de CO2.
Una vez finalizada la observación, los individuos que no nos interesen se introducen en un
frasco (“morgue”) que contiene aceite o una mezcla H2O:EtOH:Eter, para evitar la
descomposición de las moscas.
Recolección de hembras vírgenes
Las hembras de D. melanogaster almacenan el esperma de una sola inseminación durante
gran parte de su vida reproductiva. Esto supone un inconveniente cuando se trata de realizar
estudios genéticos en los cuales es preciso realizar cruces entre genotipos determinados, y por
tanto es necesaria la utilización de hembras vírgenes.
Hay distintos métodos para seleccionar hembras vírgenes. Uno de ellos es la recolección de
hembras imagos (aún sexualmente inmaduras). Son fácilmente identificables: hembras con las
alas plegadas y con el cuerpo sin pigmentar. La pigmentación normal no se adquiere hasta
horas después de la emergencia.
Cruces
La selección de las moscas se hace bajo lupa, con un pincel fino y sobre una placa difusora de
CO2. Se cruzan moscas con fenotipos concretos y normalmente con una proporción de 5♀
(vírgenes) x 3♂. Podemos eliminar los padres a los 5-6 días para no confundirlos con la F1
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Recomendaciones para el cuidado de cultivos
1.- Es importante impedir la contaminación de un cultivo por otras cepas. No se debe
dejar nunca la botella destapada para que no entren individuos indeterminados.
2.- Antes de empezar un cultivo, conviene mirar que el frasco no contenga ninguna
mosca.
3.- Los cultivos descartados son un nido de infecciones de hongos y ácaros en el
laboratorio, por ello cuando un cultivo ya no se necesita, se pone en una estufa de
desecación para esterilizarlo y matar todos los individuos. Después se limpia y
esteriliza la botella.
4.- Si no se necesitan algunas moscas determinadas se echan a la morgue.
5.-A veces el medio se llena de hongos del género Penicillium, que impiden la marcha
normal del cultivo, ya que acaban cubriendo toda la superficie de la comida, haciéndola
inaccesible a los adultos. Cuando se prepara la comida suelen usarse trazas de
fungicida, pero éste puede accidentalmente no tener efecto, y se produce la infección.
Se puede aumentar la dosis de fungicida, pero poco, porque se retrasa el desarrollo del
cultivo, o incluso se interrumpe. Conviene esterilizar todo el material utilizado, y
subcultivar las cepas contaminadas.
6.- Otra plaga peligrosa para los cultivos la constituyen los ácaros. Se alimentan de
larvas y adultos, adhiriéndose a patas, órganos genitales y trompa (las partes que la
mosca tiene en contacto con el medio). Todos los ácaros tienen un mayor poder
reproductor que Drosophila, por lo que pueden infectar en poco tiempo todo el
laboratorio. Sus efectos siempre son nocivos, y por eso conviene detectarlos pronto y
combatirlos a tiempo. El cultivo afectado se ha de pasar cada dos o tres días a medio
fresco con un papel impregnado en benzil-benzoato, compuesto que ataca
selectivamente los ácaros sin afectar a las moscas. Para prevenir, lo mejor es la
limpieza y la revisión periódica de los cultivos.
Moscas transgénicas
El sistema UAS-GAL4 es un sistema de regulación transcripcional de levaduras por el que la
proteína activadora GAL4 (un factor de transcripción) se une a la secuencia UAS (upstream
activator sequence, que es el nombre que reciben los enhancers de levaduras), activando la
transcripción del gen ubicado hacia la dirección 3’ de dicha secuencia.
Se ha demostrado que la expresión de Gal4 es capaz de activar la expresión de un gen
reporter ubicado en sentido 3’ de la secuencia UAS en Drosophila y su desarrollo fue posible
debido a que es posible, y relativamente sencillo, lograr líneas de moscas transgénicas.
Al establecerse este sistema, los distintos laboratorios del mundo han ido generando distintas
líneas “promotoras” y distintas líneas “UAS”, de modo tal que actualmente existen miles de
ellas y son compartidas por los distintos laboratorios. La gran potencialidad de este sistema
para lograr expresión espacio-temporal controlada de genes y el gran número de líneas
existentes lo han vuelto una herramienta fundamental en los estudios funcionales en
Drosophila.
Esquema del funcionamiento del sistema GAL4-UAS.
Cruzando moscas en las que la expresión de Gal4
está dirigida por un promotor específico por una línea
que posee un gen de interés downstream de la
secuencia UAS, se puede lograr en la progenie la
expresión de dicho gen bajo el patrón de expresión
dirigido por el promotor de Gal4.
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Una característica importante de este sistema de expresión es su dependencia de la
temperatura. Debido a que el sistema ha sido “exportado” de levaduras, su temperatura de
funcionamiento óptimo es 28ºC, una temperatura en la que se pueden cultivar a Drosophila,
pero que es un poco más elevada que la temperatura óptima (25ºC). Un modo de regular el
funcionamiento del sistema es variar la temperatura de cría, pudiéndose optimizar la expresión
si se sube la temperatura a 28ºC o disminuirla al bajarla, por ejemplo a 18-21ºC.
TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Técnicas de aislamiento de DNA plasmídico
Minipreparaciones de Escherichia coli (método de la lisis alcalina)
Recolección de las bacterias
1. Se cogen 1.5-3 mL de un cultivo de E. coli que se ha dejado creciendo durante toda la
noche en agitación a 37°C en LB con ampicilina.
2. Se dispensan en un tubo eppendorf y se centrifuga durante 3 min a 12.000 g.
3. Se retira el sobrenadante.
4. Se da un pulso de centrífuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante que aún quede.
Nos quedamos con el precipitado de las bacterias.
Lisis alcalina
5. Se resuspende (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 μl de una
solución isotónica (GTE: Glucosa, Tris y EDTA) a 4°C. Se deja a temperatura ambiente
durante 5 min.
6. Se añaden al mismo tubo, 200 μl de la solución de lisis (NaOH, SDS) que está a
temperatura ambiente. Se agita suavemente con la mano por inversión del tubo (unas
10 veces). Se incuba no más de 5 min.
Neutralización
7. Se añaden 150 μl de la solución de neutralización (acetato potásico 3M, pH 4,8). Se
agita con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces).
Aislamiento de los plásmidos
8. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugación (15 min a 12.000 g y
4°C), formándose un sedimento blanco de aspecto lechoso.
9. El sobrenadante, que contiene mayoritariamente ADN plasmídico, se transfiere a un
nuevo tubo al que previamente se ha añadido 1 mL de etanol absoluto. Se mezcla con
la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba 15 min.
10. Se precipitan los plásmidos por centrifugación (15 min a 12.000 g), se retira
cuidadosamente el sobrenadante.
11. Lavado opcional: se añaden al mismo tubo, 900 μl de etanol al 70%. Se mezcla
suavemente con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se vuelven a precipitar
los plásmidos por centrifugación (10 min a 12.000 g), se retira cuidadosamente el
sobrenadante.
12. Se da un spin (pulso de centrifugación) y se retira cuidadosamente el sobrenadante que
aún quede.
13. Se resuspende el precipitado de plásmidos en 30-50 μl de agua. Se incuba a
temperatura ambiente 5 min.
14. Mantener la muestra a 4°C o congelar para su uso posterior.
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PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
Extracción mediante preparado comercial
Cuando es necesario disponer de ADN plasmídico de gran pureza, se utiliza el sistema
QIAprep Spin Miniprep Kit de QIAGEN, siguiendo las indicaciones del fabricante.
Lo mismo ocurre con las maxipreps (el kit empleado en este caso es específico para obtener
grandes cantidades).
Extracción de RNA
El RNA total de mosca se extrae en 1 mL de Tri-Reagent (Sigma) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Se diluye 1 μL de RNA en 499 μL de agua y se cuantifica su concentración a
partir de las medidas de absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro.
Técnicas de análisis de DNA
Electroforesis en gel de agarosa
La separación y visualización de plásmidos, fragmentos de restricción o productos de PCR, se
realiza mediante electroforesis sumergida horizontal en gel de agarosa de baja
electroendósmosis (tipo 1A, Sigma) a la concentración apropiada (0.8-1.5 %), según el tamaño
de los ADNs a resolver. El tampón de la electroforesis empleado es TBE (1x).
Las muestras se mezclan con tampón de carga (1/10 de su volumen) y se depositan en los
pocillos del gel, aplicando a continuación un voltaje constante, hasta que el frente llegue al
borde del gel o hasta donde sea suficiente para conseguir una separación de bandas
adecuadas a las necesidades (en función de si solo se quiere hacer una comprobación o si se
quiere purificar a partir de una banda).
Una vez terminada la electroforesis, el gel hay que teñirlo, y para ello se sumerge en una
solución de TBE con Sybr Green o con GelRed durante 20 min (se intenta no usar bromuro de
etidio debido a su toxicidad). El ADN se visualiza por exposición a luz UV en un
transiluminador. Los geles son también fotografiados en una cámara especialmente
acondicionada para este cometido.
Para conocer el tamaño aproximado de los ADNs presentes en las muestras sometidas a
electroforesis, se utilizan como patrones los marcadores de peso molecular VI, VII,… (en
función del tamaño de la banda que se espera) o los del marcador 100 pb DNA ladder. Además
de servir para conocer el tamaño aproximado,los marcadores nos sirven también para
cuantificar, comparando la intensidad de la banda obtenida con la de los marcadores
(conocemos la cantidad adicionada y la concentración de cada banda del marcador).
Normalmente se prepara 1 µL de marcador, con 1 µL de tampón de carga y 8 µL de agua,
cargando los 10 µL obtenidos.
Purificación de fragmentos de ADN de los geles de agarosa
Una vez realizada la electroforesis en gel de agarosa y visualizadas las bandas de ADN, se
corta con un bisturí el trozo de agarosa correspondiente al fragmento de ADN que se quería
recuperar y se sigue instrucciones del kit específico según el fabricante.
Purificación de ácidos nucleicos
La purificación del producto de digestiones o de PCR se lleva a cabo mediante kit específico
(high pure PCR product purification kit de Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Determinación de la concentración de ADN
La determinación de la concentración de ADN de una solución se lleva a cabo mediante
método espectrofotométrico. Se determina la absorbancia de la solución de ADN a 260 y 280
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PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
nm utilizando como blanco agua destilada (disolvente utilizado en la disolución del ácido
nucleico). La relación A260/A280 sirve para comprobar la pureza de la preparación,
considerándose que valores por debajo de 1.8 son indicadores de contaminación por proteínas
y/o fenol.
Si la concentración es muy baja, es posible concentrar la muestra mediante un concentrador de
vacío.
Amplificación del DNA mediante PCR
PCR
Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de DNA de interés. Además
esta técnica es empleada tanto para verificar la presencia de un inserto determinado en los
transformantes obtenidos, como para llevar a cabo mutagénesis dirigida por PCR.
El método se basa en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas
temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces.
Se lleva a cabo en un termociclador: permite controlar el tiempo y la temperatura de cada paso,
así como repetir los ciclos. Lo primero que se debe hacer es calentar la tapa del termociclador
para minimizar la evaporación al situar las muestras en el termociclador.
La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que
constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la
temperatura se reduce para permitir el "anillamiento" de cada una de dos cadenas cortas de
nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata
de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera
tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para
que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se
denomina primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas
separadas del ADN molde. En tercer lugar se produce la “extensión”, en la que una enzima
ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las
secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa
dNTPs agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso
está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa.
Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, anillamiento y extensión) el
tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra
disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de
numerosos ciclos da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por
los primers.
Los productos resultantes de la amplificación mediante PCR son purificados posteriormente
mediante un kit específico.
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PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
PCR inversa
La técnica de la PCR inversa (inverse PCR) permite amplificar fragmentos de DNA
desconocidos y que son adyacentes a una secuencia conocida en el genoma.
A partir de DNA genómico digerido y ligado entre sí se
amplifica por i-PCR fragmentos de DNA adyacentes a la
secuencia conocida, utilizando para la reacción cebadores
internos encarados hacia fuera y complementarios a las
zonas más externas de la secuencia conocida. El producto
de amplificación es purificado y mandado a secuenciar.
Cada nueva secuencia obtenida se enfrentaba contra las
bases de datos mediante Blast
La reacción de ligación se lleva a cabo en grandes
volúmenes para minimizar las posibles uniones entre
distintos fragmentos, favoreciendo así a la circularización de
los fragmentos obtenidos en la digestión.
En este caso se utilizó para localizar la posición del inserto
en el genoma de Drosophila transgénicas. Tras amplificar
las secuencias flanqueantes al inserto, se mandaron a
secuenciar y con la secuencia obtenida podemos identificar
la posición que ocupa enfrentándola contra el genoma de
Drosophila mediante BLAST.
PCR de colonia
Para identificar los clones que contienen nuestro fragmento, una vez realizada la
transformación, podemos usar la PCR de colonia. Este tipo de PCR permite amplificar un
fragmento de DNA clonado a partir de una colonia bacteriana sin necesidad de crecer en medio
líquido y purificar plásmidos recombinantes. Este tipo de PCR ahorra tiempo de trabajo. De no
hacerlo así, tras la transformación se tendrían que picar las colonias positivas y ponerlas a
crecer en LB durante toda la noche, y al día siguiente realizar la minipreps o purificación del
plásmido recombinante.
Mutagénesis dirigida
Para la introducción de una mutación dentro de un gen estructural, se puede emplear el
método de mutagénesis dirigida por PCR mediante extensión de fragmentos que se solapan.
Este método se basa en la utilización de cuatro
cebadores (primers), dos de los cuales contienen la
mutación
que
se
desea
introducir
y
son
complementarios al menos en una parte de sus
secuencias. Los primers externos, además pueden
contener secuencias específicas que servirán de diana
para la digestión con enzimas. También se puede
incluir en el oligonucleótido externo A (del dibujo) la
secuencia Kozak.
Esquema del método de mutagénesis dirigida por PCR
mediante extensión de fragmentos que se solapan. Se
indican los nombres de los oligonucleótidos A, B, M
(mutante) y MC (mutante complementario). Cada
reacción de PCR se nombra como PCR1, PCR2 y
PCR3, para indicar que son reacciones separadas.
En primer lugar se realizan dos reacciones de PCR
paralelas, una utilizando los cebadores A y M (este último porta la mutación), y otra utilizando
los cebadores MC y B (donde MC porta la mutación y es parcialmente complementario a M).
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Eduardo L. Calpena Corpas
PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
De esta forma se generan dos fragmentos de ADN que tienen una secuencia común en
extremo y contienen la mutación deseada. Estos dos fragmentos sirven simultáneamente
molde y de cebador en los ciclos iniciales de una tercera reacción de PCR, de modo que
obtuvo un fragmento suma de los dos productos que contenía la mutación deseada y que
amplifica con los cebadores A y B.
un
de
se
se
Digestiones de DNA con endonucleasas de restricción
La digestión del ADN con enzimas de restricción se realiza con los tampones y las condiciones
óptimas de incubación indicadas por los proveedores para cada enzima. Las reacciones
contienen por lo general 0.1-5 μg de ADN, 0.1 volúmenes del tampón de restricción
correspondiente (10 veces concentrado), y 0.5-10 unidades del enzima, en volúmenes finales
de 10-30 μl, completados con agua destilada estéril.
Ligación de fragmentos de DNA
Para la ligación de moléculas de ADN se generan fragmentos de ADN mediante digestión con
los enzimas de restricción apropiados, que originan extremos compatibles con los sitios de
clonación del vector empleado. Se mezclan el vector linearizado y el fragmento de ADN
purificado procedente de la digestión con una o varias enzimas de restricción, en proporción
1:2 ó 1:3. Se añaden 0.1 volúmenes de tampón de ligación (suministrado por el fabricante) y
una unidad de ADN ligasa del fago T4, en un volumen final de 10-20 μl, y se incuba en las
condiciones adecuadas (normalmente 4°C en el caso de extremos cohesivos y a 19ºC en el
caso de extremos romos). El tiempo y la temperatura de la reacción de ligación suelen ser
factores críticos.
También se prepara una reacción sin inserto en las mismas condiciones y se usa como control
negativo de la digestión.
TRANSFORMACION GENÉTICA DE MICROORGANISMOS
Preparación de células competentes (método del cloruro de rubidio)
Se hace un cultivo de células de E.coli en medio LB y se deja incubando a 37°C hasta obtener
una OD adecuada (se va midiendo la absorbancia a 590 nm) y se pone el cultivo en hielo. Las
células se recuperan por centrifugación a 4°C y se lavan con buffer 1. Las células se incuban
nuevamente en hielo, se centrifugan y se recuperan en buffer 2. Las células se alicuotan (100
μL por eppendorf) para su almacenaje a -80°C o para su utilización inmediata.
Transformación mediante choque térmico
Se descongela cada alícuota de células competentes (100 μL) 10-15 minutos en hielo. Se
agrega de 1 a 10 μL de ADN. Se mezcla con cuidado. El choque térmico se realiza incubando
20 min en hielo, 100 s a 42ºC y 1-2 min en hielo. Se añaden 400 μL de LB (se añade 4 veces
el volumen de células de partida) y se incuba 1 hora a 37ºC. Se centrifuga 1-2 min a 6000g. Se
elimina la mayor parte del sobrenadante (aprox. 400 μL ) y se resuspenden las células en los
100 μL restantes, con lo que se plaquea en placa de agar que lleva ampicilina y se dejan
incubando a 37ºC toda la noche.
Transformación mediante electroporación
Se requiere la preparación de células de E. coli electrocompetentes. La electroporación se
realiza según las condiciones descritas en el protocolo del electroporador para E. coli
electrocompetentes, utilizando cubetas específicas para el proceso. En la cubeta se mezclan 15 μl de ADN (10-20 ng) y 45 μl de células electrocompetentes, previamente descongeladas en
hielo. La mezcla se dispone inmediatamente en el electroporador y se aplica un voltaje de 2.5
KV a una resistencia de 129 Ω y una capacitancia de 25 μF. A continuación, las células se
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PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA
diluyen rápidamente en 950 μl de medio LB frío y se incuban a 37 ºC durante 1 h en agitación
para permitir la expresión fenotípica del ADN incorporado. Tras ese período, se siembran 100
μl de la suspensión bacteriana en placas de LB con ampicilina, incubando a 37 ºC hasta que se
observa la aparición de colonias.
CONCLUSIONES
Estas prácticas me han servido para poner en práctica las técnicas y conceptos aprendidos
durante la licenciatura y para aprender nuevas técnicas hasta ahora desconocidas para mí, así
como aprender a trabajar con otros organismos modelos como es Drosophila.
He de agradecer la atención recibida en todo momento en Valentia Biopharma, ya que he
tenido a mi disposición apoyo y ayuda, así como a alguien que me guiase en mis cometidos o
que supervisara los experimentos.
El ambiente que hay en el laboratorio es muy bueno, lo que ayuda a la rápida adaptación y a la
realización de las prácticas.
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