PEPTIDOS ANTINEOPLASICOS.(ES2229287)

19
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 229 287
51 Int. Cl. : C07K 7/06
7
A61K 38/08
C07K 1/00
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 96943076 .8
86 Fecha de presentación: 11.12.1996
87 Número de publicación de la solicitud: 0866800
87 Fecha de publicación de la solicitud: 30.09.1998
54 Título: Péptidos antineoplásicos.
30 Prioridad: 15.12.1995 US 573422
73 Titular/es: Abbott GmbH & Co. KG.
Max-Planck-Ring 2
65205 Wiesbaden, DE
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.04.2005
72 Inventor/es: Amberg, Wilhelm;
Barlozzari, Teresa;
Bernard, Harald;
Buschmann, Ernst;
Haupt, Andreas;
Hege, Hans-Guenther;
Janssen, Bernd;
Kling, Andreas;
Lietz, Helmut;
Ritter, Kurt;
Ullrich, Martina;
Weymann, Jürgen y
Zierke, Thomas
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ungría López, Javier
ES 2 229 287 T3
16.04.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 229 287 T3
DESCRIPCIÓN
Péptidos antineoplásicos.
5
10
Nuevos péptidos, preparación y uso de ellos.
La invención descrita en la presente memoria proporciona nuevos péptidos y derivados de ellos que ofrecen utilidades terapéuticas potencialmente mejoradas para el tratamiento de enfermedades neoplásicas comparados con la
dolastatina -10 y -15 (patentes de EE.UU. números 4.897.276 y 4.816.444) y los compuestos descritos en el documento WO 93/23.424. El documento DE 4.415.997 A1 concierne al derivado de la dolastina
Me2 Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NH(CH2 Ph)
15
que se dice exhibe una actividad antineoplásica particularmente buena
Los compuestos de esta invención son péptidos de la fórmula I:
R1 R2 N-CHX-CO-A-B-D-E-K
I
20
en el que:
R1
es metilo;
R2
es metilo;
A
es un resto de valina;
B
es un resto de N-metil-valina;
D
es un resto de prolilo;
E
es un resto de prolilo;
X
es isopropilo;
25
30
35
en el que
40
45
K es -NHC(CH3 )3 , -NHCH(CH2 CH3 )CH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )C(CH3 )3 , -N(CH3 )OCH2 CH3 , -N(CH3 )OCH2 CH2
CH3 , -N(CH3 )OCH(CH3 )2 , -N(CH3 )O(CH2 )3 CH3 , -N(CH3 )OCH2 C6 H5 , -NHC(CH3 )2 C6 H5 , -NHC(CH3 )2 CH2 CH3 ,
-NHC(CH3 )(CH2 CH3 )2 , -NHCH[CH(CH3 )2 ]2 , -NHC(CH3 )2 CN, -NHCH(CH3 )CH(OH)C6 H5 , -NH-C(CH3 )2 CH=CH2 ,
-NHC(CH3 )2 C≡CH, -NHC(CH2 CH3 )2 C≡CH, -NHC(CH3 )2 CH2 CH2 OH, -NHC(CH3 )2 CH(CH3 )2 , -NHC(CH3 )2 CH2
CH2 CH3 , -NHC(CH3 )2 CH2 C6 H5 , -N(OCH3 )CH(CH3 )2 , -N(OCH3 )CH2 CH3 , -N(OCH3 )CH2 CH2 CH3 , -N(OCH3 )CH2
C6 H5 , -N(OCH3 )C6 H5 , -N(CH3 )OC6 H5 , -N(OCH3 )CH2 CH2 CH2 CH3 ,
o K es: -NHCH(C2 H5 )2 , -NHCH(C2 H5 )CH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )CH(CH3 )2 , -NHC(CH3 )2 C2 H5 , -NHC(CH3 )2 CH
(CH3 )2 , -NHCH(C3 H7 )2 , -NHCH(C2 H5 )C3 H7 , -NHCH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )C2 H5 , -NH-ciclohexil, NH-cicloheptil,
50
o K es:
55
60
65
2
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o K es:
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y sus sales con ácidos fisiológicamente tolerados.
Los compuestos anteriores de la fórmula (I) corresponden a péptidos de fórmula (Ia)
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(CH3 )2 N-CH(CH(CH3 )2 )-CO-(valil)-(N-metil-valil)-(prolil)-(prolil)-K
(Ia)
en la que K es como se definió anteriormente.
25
Los compuestos preferidos de fórmula I o Ia son aquellos en los que K es: -NH-alquilo, -NH-cicloalquilo, alquiloN-alquilo, en cuyos restos un grupo CH2 se puede reemplazar por O, un H por fenilo o 1 ó 2 H por F, excepto el resto
de N-metoxi-N-metilamino, N-bencilamino, o N-metil-n-bencilamino, o K es:
30
35
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60
Más preferiblemente K es:
65
-NHCH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )CH2 CH3 , -NHCH(CH2 CH3 )2 , -NHCH(CH2 CH2 CH3 )2 , -NHC(CH3 )3 , -NHCH(CH2
CH3 )CH2 CH2 CH3 , -NHCH(CH3 )CH(CH3 )2 , -NHCH(CH2 CH3 )CH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )C(CH3 )3 , -NH-ciclohexilo,
-NH-cicloheptilo, -N(CH3 )OCH2 CH3 , -N(CH3 )OCH2 CH2 CH3 , -N(CH3 )OCH(CH3 )2 , -N(OCH3 )CH(CH3 )2 , -N(CH3 )
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OCH2 C6 H5 , -NHC(CH3 )2 C6 H5 , -NHC(CH3 )2 CH2 CH3 , -NHC(CH3 )(CH2 CH3 )2 , -NHCH(CH3 )CH(OH)C6 H5 , -NHC
(CH3 )2 CH2 CH2 OH, -NHC(CH3 )2 CH(CH3 )2 , -NHC(CH3 )CH=CH2 , -NHC(CH3 )2 CN, -NHC(CH3 )2 C≡CH, -N(OCH3 )
C6 H5 , -NHCH[CH(CH3 )2 ]2 , -N(OCH3 )CH2 C6 H5 , -N(OCH3 )CH2 CH3 , -N(OCH3 )CH2 CH2 CH3 , -N(OCH3 )CH2 CH2 CH2
CH3 ,
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30
Esta invención también proporciona métodos para preparar los compuestos de la fórmula I o Ia, composiciones
farmacéuticas que contienen tales compuestos junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y métodos para
usar los mismos para tratar el cáncer en mamíferos.
Los nuevos compuestos pueden estar presentes como sales con ácidos fisiológicamente tolerados tales como: ácido
clorhídrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido
fórmico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido succínico, ácido malónico, ácido sulfúrico, ácido Lglutámico, ácido L-aspártico, ácido pirúvico, ácido múcico, ácido benzoico, ácido glucurónico, ácido oxálico, ácido
ascórbico y acetilglicina.
35
Los nuevos compuestos se pueden preparar por métodos conocidos de la química de péptidos. Así, los péptidos se
pueden ensamblar secuencialmente a partir de aminoácidos o uniendo pequeños fragmentos de péptidos adecuados.
En el ensamblaje secuencial, comenzando en el carbono terminal la cadena del péptido se alarga por pasos con un
aminoácido cada vez. En la copulación de fragmentos es posible unir juntos fragmentos de diferentes longitudes, y los
fragmentos en cambio se pueden obtener por ensamblaje secuencial de aminoácidos o de ellos mismos por copulación
de fragmentos.
40
Tanto en el ensamblaje secuencial como en la copulación de fragmentos es necesario unir las unidades formando
un enlace amida. Son adecuados para esto los métodos enzimáticos y químicos.
45
50
55
Los métodos químicos para formar el enlace amida se describen en detalle por Mueller, Methoden der organischen
Chemie Vol. XV/2, páginas 1 a 364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis,
páginas 31 a 34, 71 a 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, páginas 85 a 128, John Wiley & Sons, New York, 1976; The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodanszky, A.
Bodanszky, Springer-Verlag, 1994, y otros trabajos estándar en la química de péptidos. Se da preferencia particular al
método de la azida, al método del anhídrido simétrico y mezclado, ésteres activos generados in situ o preformados,
al uso de anhídridos de amino ácidos N-carboxi protegidos con uretano y a la formación del enlace amida usando
reactivos de copulación, especialmente diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), 1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), cloruro de pivaloilo, hidrocloruro de 1-ethyl-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDCI), anhídrido n-propanofosfónico (PPA), cloruro de N,N-bis(2-oxo-3-oxazolodinil) -amido-fosforilo (BOP-Cl), hexafluorfosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfonio (PyBrop), difenilfosforil azida (DPPA), reactivo
de Castro (BOP, PyBop) , sales de O-benzotriazolil-N,N,N’,N’-tetrametiluronio (HBTU), sales de O-azabenzotriazolil-N,N,N’,N’-tetrametiluronio (HATU), dietilfosforil cianuro (DEPCN), dióxido de 2, 5-difenil-2, 3-dihidro-3-oxo4-hidroxitiofeno (reactivo de Steglich; HOTDO) and 1,1’-carbonildiimidazol (CDI). Los reactivos de copulación se
pueden emplear solos o en combinación con aditivos tales como N,N-dimetil-4-aminopiridina (DMAP), N-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-hidroxibenzotriazina (HOOBt), azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida (HOSu) o 2-hidroxipiridina.
60
Mientras que normalmente es posible prescindir de grupos protectores en la síntesis enzimática de péptidos, en la
síntesis química es necesaria la protección reversible de los grupos reactivos no implicados en la formación del enlace
amida para ambos reactivos. Se prefieren tres técnicas convencionales de grupo protector para la síntesis química de
péptidos: las técnicas del benziloxicarbonilo (Z), del t-butoxicarbonilo (Boc) y del 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).
65
El grupo protector se identifica en cada caso en el grupo alfa-amino de la unidad de extensión de cadena. Una
recopilación detallada de los grupos protectores de aminoácidos viene dada por Mueller, Methoden der organischen
Chemie Vol. XV/1, páginas 20 a 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Las unidades empleadas para ensamblar la
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cadena de péptidos se pueden hacer reaccionar en disolución, en suspensión o por un método parecido al descrito por
Merrifield en J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149.
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Son adecuados para la síntesis de péptidos en disolución todos los disolventes que son inertes en las condiciones de
reacción, especialmente agua, N,N-dimetilformamida (DMF), dimetil sulfóxido (DMSO), acetonitrilo, diclorometano
(DCM), acetato de etilo, 1,4-dioxano, tetrahidrofurano (THF), N-metil-2-pirrolidona (NMP) y mezclas de dichos
disolventes.
La síntesis de péptidos sobre el soporte polímero se puede llevar a cabo en todos los disolventes orgánicos inertes
en los que son solubles los derivados usados de los aminoácidos. Sin embargo, los disolventes preferidos tienen
adicionalmente propiedades de hinchamiento de la resina, tales como DMF, DCM, NMP, acetonitrilo y DMSO, y
mezclas de estos disolventes. Después de que la síntesis se ha completado, el péptido se corta del soporte polímero.
Las condiciones en las que es posible la escisión de los distintos tipos de resinas se describen en la bibliografía. Las
reacciones de escisión más comúnmente usadas son catalizadas por ácido y por paladio, especialmente escisión en
fluoruro de hidrógeno líquido anhidro, en ácido trifluormetanosulfónico anhidro, en ácido trifluoracético diluido o
concentrado, escisión catalizada por paladio en THF o mezclas THF-DCM en presencia de una base débil tal como
morfolina o escisión en mezclas de ácido acético/diclorometano/trifluoretanol. Dependiendo de los grupos protectores
elegidos, éstos pueden ser retenidos o igualmente liberados con las condiciones de escisión.
También puede merecer la pena la desprotección parcial del péptido cuando se llevan a cabo ciertas reacciones de
derivatización.
Se pueden preparar los péptidos dialquilados en el N terminal por copulación de los N,N-di-alquilaminoácidos apropiados en disolución o en el soporte polímero, por alquilación reductora del péptido ligado a la resina en
DMF/ácido acético al 1% con NaCNBH3 y los aldehídos apropiados, por hidrogenación del péptido en disolución en
presencia de aldehído o cetona y Pd/C.
30
Los distintos aminoácidos no naturales así como los distintos restos de no-aminoácidos descritos en la presente
memoria se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o sintetizar a partir de materiales comercialmente disponibles usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los bloques de construcción de aminoácidos con restos R1
y R2 se pueden preparar según E. Wuensch, Houben Weyl, Meth. d. Org. Chemie, Bd. XV, 1, página 306 y siguientes,
Thieme Verlag Stuttgart 1974 y la bibliografía citada en él.
35
Los compuestos de esta invención se pueden usar para inhibir o tratar de otra manera los tumores sólidos (por ejemplo, tumores de pulmón, mama, colon, próstata, vejiga, recto, o tumores endometriales) o malignidades hematológicas
(por ejemplo, leucemias, linfomas) por administración del compuesto al mamífero.
Es una ventaja especial de los nuevos compuestos que son muy resistentes a la degradación enzimática y que
también se pueden administrar oralmente.
40
La administración puede ser por cualquiera de los medios que son convencionales para agentes farmacéuticos, preferiblemente oncológicos, incluyendo medios orales y parenterales tales como subcutáneo, intravenoso, intramuscular
e intraperitoneal.
45
Los compuestos se pueden administrar solos o en forma de composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la fórmula I junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado para la ruta de administración
deseada. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser productos de combinación, es decir, también pueden contener
otros ingredientes terapéuticamente activos.
50
La dosis que se ha de administrar al mamífero contendrá una cantidad inhibidora tumoral efectiva del ingrediente
activo que dependerá de factores convencionales que incluyen la actividad biológica del compuesto particular empleado; el medio de administración; la edad; salud y peso corporal del receptor; la naturaleza y extensión de los síntomas;
la frecuencia del tratamiento; la administración de otras terapias; y el efecto deseado. Una dosis típica diaria será
aproximadamente 0,05 a 50 miligramos por kilogramo de peso corporal en la administración oral y aproximadamente
0,01 a 20 miligramos por kilogramo de peso corporal en administración parenteral.
55
60
65
Los nuevos compuestos se pueden administrar en formas de administración farmacéutica sólida o líquida, por
ejemplo, comprimidos sin revestir o revestidos (de película), cápsulas, polvos, gránulos, supositorios o disoluciones.
Éstos se producen de una manera convencional. Las sustancias activas se pueden procesar para este propósito con
agentes coadyuvantes farmacéuticos convencionales tales como agentes ligantes de comprimidos, agentes de carga,
agentes conservantes, agentes desintegrantes de comprimidos, agentes reguladores de flujo, agentes plastificantes,
agentes humectantes, agentes dispersantes, agentes emulsionantes, disolventes, composiciones de liberación sostenida,
agentes antioxidantes y/o gases propelentes (confróntese H. Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, ThiemeVerlag, Stuttgart, 1978). Las formas de administración obtenidas de esta forma normalmente contienen 1-90% en peso
de la sustancia activa.
Los siguientes ejemplos se destinan a ilustrar la invención. Los aminoácidos proteinógenos se abrevian en los
ejemplos usando el conocido código de tres letras. Otras abreviaturas usadas:
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Me2 Val = N,N-dimetilvalina, MeVal = N-metilvalina.
A. Procedimientos generales
5
I. Los péptidos reivindicados en la reivindicación 1 se sintetizan por síntesis clásica en disolución usando
metodología Z y Boc estándar como se describió anteriormente o por métodos estándar de síntesis en fase
sólida usando técnicas de grupos protectores Boc y Fmoc.
En el caso de síntesis en fase sólida, los ácidos N,N-dialquilpenta- o hexa-péptidos se liberan del soporte
sólido y se copulan adicionalmente con las correspondientes aminas de C terminal en disolución. BOPCl y PyBrop se usaron como reactivos para la copulación del aminoácido resultante de los ácidos Nmetilamino. Los tiempos de reacción se incrementaron correspondientemente. Para la alquilación reductora
del N terminal, el péptido-resina se desprotegió en el N terminal y después de hizo reaccionar con un
exceso 3 veces molar de aldehído o cetona en DMF/ácido acético al 1% con adición de 3 equivalentes de
NaCNBH3 . Después de que se completó la reacción (ensayo de Kaiser negativo) la resina se lavó varias
veces con agua, isopropanol, DMF y diclorometano.
10
15
En la síntesis en disolución, el uso de NCAs de aminoácidos protegidos con Boc (N-tert-butiloxicarbonilaminoácido-N-carboxo-anhidridos), NCAs de aminoácidos protegidos con Z (N-benciloxicarbonil-aminoácidos-N-carboxi-anhidridos), o el uso de cloruro de pivaloilo como agente condensante respectivamente es
más ventajoso para la copulación del aminoácido resultante de los ácidos N-metilamino. La alquilación
reductora del N terminal se puede realizar, por ejemplo, por reacción de los péptidos o aminoácidos desprotegidos en el N terminal con los correspondientes aldehídos o cetonas usando NaCNBH3 o hidrógeno,
Pd/C.
20
25
II. Purificación y caracterización de los péptidos
La purificación se llevó a cabo por cromatografía de gel (SEPHADEX G-10, G-15/10% HOAc, SEPHADEX LH20/MeOH), cromatografía de presión media (fase estacionaria: HD-SIL C-18, 20-45 micrómetros,
100 Ángstrom; fase móvil: gradiente con A = 0,1% TFA/MeOH, B = 0,1% TFA/agua), o HPLC preparativa
(fase estacionaria: Waters Delta pack C-18, 15 micrómetros, 100 Angstrom; fase móvil: gradiente con A =
0,1% TFA/MeOH, B = 0,1% TFA/agua).
30
La pureza de los productos resultantes se determinaron por HPLC analítico (fase estacionaria: 100 2,1 mm
VYDAC C-18, 5 1, 300 A; fase móvil: gradiente de acetonitrilo-agua, tamponado con TFA al 0,1%, 40ºC).
35
La caracterización fue por análisis de aminoácidos y espectrometría de masas por bombardeo con átomos
rápidos.
40
B. Procedimientos específicos
Ejemplo 1
(SEQ ID NO: 1)
45
Me2 Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH3 )2
a) Z-MeVal-Pro-OMe
50
55
Se disolvieron 66,25 g (250 mmol) de Z-MeVal-OH en 250 ml de diclorometano seco. Después de la
adición de 36,41 ml (262,5 mmol) de trietilamina, la mezcla de reacción se enfrió a -25ºC y se añadieron
32,27 ml (262,5 mmol) de cloruro de pivaloilo. Después de agitar durante 2,5 h, se añadieron a la mezcla
de reacción 41,89 g (250 mmol) de H-Pro-OMe.HCl en 250 ml de diclorometano neutralizado con 36,41
ml (262,5 mmol) de trietilamina a 0ºC. Se continuó la agitación durante 2 h a -25ºC y durante la noche
a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó minuciosamente
con disolución acuosa saturada de NaHCO3 (tres veces), agua (una vez), ácido cítrico al 5% (tres veces)
y disolución saturada de NaCl. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. El
residuo (91,24 g) se agitó con éter de petróleo durante toda la noche y se filtró. Se obtuvieron 62,3 g del
producto.
60
b) H-MeVal-Pro-OMe
65
Se disolvieron 48,9 g (130 mmol) de Z-MeVal-Pro-OMe en 490 ml de metanol. Después de la adición de
10,9 ml (130 mmol) de ácido clorhídrico concentrado y 2,43 g de paladio al 10%/carbón vegetal, la mezcla
de reacción se hidrogenó. La filtración y evaporación a sequedad produjo 36,43 g del producto.
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c) Z-Val-MeVal-Pro-OMe
5
10
Se agitaron 18,1 g (65 mmol) de H-MeVal-Pro-OMe, 21,6 g (78 mmol) de Z-Val-N-carboxianhídrido y
22,8 ml (130 mmol) de diisopropiletilamina en 110 ml de DMF a 40ºC durante 2 días. Después de la
evaporación de la DMF, se añadió diclorometano y la fase orgánica se lavó con disolución acuosa saturada
de NaHCO3 (tres veces), agua (una vez), ácido cítrico al 5% (tres veces) y disolución saturada de NaCl. La
fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. El producto (29,3 g) se obtuvo como
un aceite viscoso.
d) H-Val-MeVal-Pro-OMe
Se disolvieron 29,3 g (61,6 mmol) de Z-Val-MeVal-Pro-OMe en 230 ml de metanol. Después de la adición
de 1,15 g de paladio al 10%/carbón vegetal, se hidrogenó la mezcla de reacción. La filtración y evaporación
a sequedad produjo 21,96 g del producto.
15
e) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe
20
Se disolvieron 15,29 g (61 mmol) de Z-Val-OH y 21,96 g (61 mmol) de H-Val-MeVal-Pro-OMe en 610 ml
de diclorometano y se enfrió a 0ºC. Después de la adición de 8,16 ml (73,2 mmol) de N-metilmorfolina,
2,77 g (20,3 mmol) de HBOt y 11,74 g (61 mmol) de EDCI, la mezcla de reacción se agito toda la noche
a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano y se lavó minuciosamente con disolución acuosa
saturada de NaHCO3 (tres veces), agua (una vez), ácido cítrico al 5% (tres veces) y disolución saturada
de NaCl. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad para producir 31,96 g del
producto.
25
f) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH
30
Se disolvieron 31,96 g (57 mmol) de Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe en 250 ml de metanol. Se añadieron a la
disolución 102,6 ml de disolución 1 N de LiOH y la mezcla se agito toda la noche a temperatura ambiente.
Después de la adición de 500 ml de agua, la fase acuosa se lavó tres veces con acetato de etilo, se ajustó a
pH 2 a 0ºC y se extrajo tres veces con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se
evaporó a sequedad produciendo 30,62 g del producto deseado como un sólido blanco.
g) Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH3 )2
35
40
45
50
55
60
Se disolvieron 2 g (3,35 mmol) de Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH y 0,664 g (3,35 mmol) de H-Pro-NHCH
(CH3 )2 en 34 ml de diclorometano seco. Después de enfriar a 0ºC, se añadieron 1,35 ml (12,1 mmol) de Nmetilmorfolina, 0,114 g (0,84 mmol) de HOBt y 0,645 g (3,35 mmol) de EDCI y la mezcla de reacción se
agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadieron 80 ml de diclorometano y la fase orgánica se
lavó minuciosamente con disolución acuosa saturada de NaHCO3 (tres veces), agua (una vez), ácido cítrico
al 5% (tres veces) y disolución saturada de NaCl (una vez). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y
se evaporó a sequedad para producir 1,96 g del producto que se usó en la siguiente reacción sin purificación
adicional.
h) Me2 -Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH3 )2
Se disolvieron 1,96 g de Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH(CH3 )2 en 11 ml de metanol. Se añadieron 0,054
g de Pd al 10%/C en atmósfera de nitrógeno y la mezcla de reacción se hidrogenó a temperatura ambiente
durante 4 h. Después de la adición de 0,86 ml (11,24 mmol) de una disolución acuosa de formaldehído al
37% y de 0,281 g de Pd al 10%/C, se continuó la hidrogenación durante 5 h. La filtración y evaporación
del disolvente dio origen a 2,77 g de producto bruto. La purificación adicional se realizó disolviendo el
péptido en agua, ajustando el pH a 2 y extrayendo la fase acuosa tres veces con acetato de etilo. La fase
acuosa se ajustó después a pH 8-9 y se extrajo cuatro veces con diclorometano. La fase orgánica se secó
sobre sulfato sódico para producir 1,37 g del producto purificado como una espuma blanca. El compuesto
se purificó adicionalmente usando cromatografía líquida de presión media (10 - 50% de A en 10 min.; 50
- 90% de A en 320 min.). Las fracciones que contenían el producto se combinaron, liofilizaron, redisolvieron en agua y el pH se ajustó a 9 con LiOH 1 N. Después de la extracción con diclorometano, la fase
orgánica se secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. La liofilización produjo 500 mg de producto puro, que se caracterizó por espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos ([M+H]+ =
593).
65
7
ES 2 229 287 T3
Ejemplo 2
(SEQ ID NO: 1)
5
M2 Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH3 )3
i) Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH3 )3
Se disolvieron 2 g (3,35 mmol) de Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH y 0,692 g (3,35 mmol) de H-Pro-NHC
(CH3 )3 en 34 ml de diclorometano seco. Después de enfriar a 0ºC, se añadieron 1,35 ml (12,1 mmol)
de N-metilmorfolina, 0,114 g (0,84 mmol) de HOBt y 0,645 g (3,35 mmol) de EDCI y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadieron 80 ml de diclorometano y la fase
orgánica se lavó minuciosamente con disolución acuosa saturada de NaHCO3 (tres veces), agua (una vez),
ácido cítrico al 5% (tres veces) y disolución saturada de NaCl (una vez). La fase orgánica se secó sobre
sulfato sódico y se evaporó a sequedad para producir 1,8 g del producto que se usó en la siguiente reacción
sin purificación adicional.
10
15
k) M2 Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH3 )3
Se disolvieron 1,8 g de Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHC(CH3 )3 en 10 ml de metanol. Se añadieron 0,049 g
de Pd al 10%/C en atmósfera de nitrógeno y la mezcla de reacción se hidrogenó a temperatura ambiente
durante 4 h. Después de la adición de 0,86 ml (11,24 mmol) de una disolución acuosa de formaldehído al
37% y de 0,252 g de Pd al 10%/C, se continuó la hidrogenación durante 5 h. La filtración y evaporación
del disolvente dio origen a 1,82 g de producto bruto. El compuesto se purificó adicionalmente usando
cromatografía líquida de presión media (10 - 50% de A en 10 min.; 50 - 90% de A en 320 min.). Las
fracciones que contenían el producto se combinaron, liofilizaron, redisolvieron en agua y el pH se ajustó
a 9 con LiOH 1 N. Después de la extracción con diclorometano, la fase orgánica se secó sobre sulfato
sódico y se evaporó a sequedad. La liofilización produjo 547 mg de producto puro, que se caracterizó por
espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos ([M+H]+ = 607).
20
25
30
Los siguientes compuestos se prepararon o se pueden preparar según los ejemplos 1 y 2:
35
40
45
50
55
60
65
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
Xaa Val Xab Pro Xac
Xaa Val Xab Pro Xad
Xaa Val Xab Pro Xae
Xaa Val Xab Pro Xaf
Xaa Val Xab Pro Xag
Xaa Val Xab Pro Xah
Xaa Val Xab Pro Xai
Xaa Val Xab Pro Xak
Xaa Val Xab Pro Xal
Xaa Val Xab Pro Xam
Xaa Val Xab Pro Xan
Xaa Val Xab Pro Xao
Xaa Val Xab Pro Xap
Xaa Val Xab Pro Xaq
Xaa Val Xab Pro Xar
Xaa Val Xab Pro Xas
Xaa Val Xab Pro Xat
Xaa Val Xab Pro Xau
Xaa Val Xab Pro Xav
Xaa Val Xab Pro Xaw
Xaa Val Xab Pro Xax
Xdd Val Xab Pro Xay
Xaa Val Xab Pro Xaz
Xaa Val Xab Pro Xba
Xaa Val Xab Pro Xbb
Xaa Val Xbc Pro Xay
Xaa Val Xab Pro Xbd
8
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
Xaa Val Xab Pro Xbe
Xaa Val Xab Pro Xbf
Xaa Val Xab Pro Xbg
Xaa Val Xab Pro Xbh
Xaa Val Xab Pro Xbi
Xaa Val Xab Pro Xbk
Xaa Val Xab Pro Xbl
Xaa Val Xab Pro Xbm
Xaa Val Xab Pro Xbn
Xaa Val Xab Pro Xbo
Xaa Val Xab Pro Xbp
Xaa Val Xab Pro Xbq
Xaa Val Xab Pro Xbr
Xaa Val Xab Pro Xbs
Xaa Val Xab Pro Xbt
Xaa Val Xab Pro Xbu
Xaa Val Xab Pro Xbv
Xaa Val Xab Pro Xbw
Xaa Val Xab Pro Xbx
Xaa Val Xab Pro Xby
Xaa Val Xab Pro Xbz
Xaa Val Xab Pro Xca
Xaa Val Xab Pro Xcb
Xaa Val Xab Pro Xcc
Xaa Val Xab Pro Xcd
Xaa Val Xab Pro Xce
Xaa Val Xab Pro Xcf
Xaa Xdf Xab Pro Xay
Xaa Val Xab Pro Xch
Xaa Val Xab Pro Xci
Xaa Val Xab Pro Xck
Xaa Val Xab Pro Xcl
Xaa Val Xab Pro Xcm
Xaa Val Xab Pro Xcn
Xaa Val Xab Pro Xco
Xaa Val Xab Pro Xcp
Xaa Val Xab Pro Xcq
Xaa Val Xab Pro Xcr
Xaa Val Xab Pro Xcs
Xaa Val Xab Pro Xct
Xaa Val Xab Pro Xcu
Xcw Val Xab Pro Xcv
Xcx Val Xab Pro Xcv
Xaa Val Xab Pro Pro Xcy
Xaa Val Xab Pro Pro Xcz
Xaa Val Xda Pro Xcv
Xaa Xdb Xab Pro Xcv
Xdc Val Xab Pro Xcv
Xaa Ile Xab Pro Xcv
Xdd Val Xab Pro Xcv
Xde Val Xab Pro Xcv
Xaa Xdf Xab Pro Xcv
Xaa Val Xab Pro Xcg
Xaa Val Xab Pro Pro Xdg
Xaa Val Xab Pro Pro Xdh
Xaa Val Xab Pro Pro Xdi
9
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
Xaa Val Xab Pro Pro Xdk
Xaa Val Xdl Pro Xcv
Xde Val Xab Pro Xay
Xaa Val Xdl Pro Xay
Xaa Val Xab Pro Xdm
Xaa Val Xab Pro Xdn
Xaa Val Xab Pro Xdo
Xaa Val Xab Pro Xdp
Xaa Val Xab Pro Xdq
Xaa Val Xab Pro Pro Xdr
Xaa Val Xab Pro Xds
Xaa Val Xbc Pro Xcv
Xaa Ile Xab Pro Xay
Xcw Val Xab Pro Xay
Xaa Val Xbc Pro Xal
Xaa Val Xdl Pro Xal
Xaa Xdf Xab Pro Xal
Xaa Ile Xab Pro Xal
Xdd Val Xab Pro Xal
Xde Val Xab Pro Xal
Xcx Val Xab Pro Xcy
Xcw Val Xab Pro Xal
Xcx Val Xab Pro Xal
Xcw Val Xab Pro Xav
Xcx Val Xab Pro Xav
Xcw Val Xab Pro Xaw
Xcx Val Xab Pro Xaw
Xab Val Xab Pro Xay
Xab Val Xab Pro Xcv
Xab Val Xab Pro Xal
Xab Val Xab Pro Xam
Xab Val Xab Pro Xan
Xab Val Xab Pro Xao
Xab Val Xab Pro Xav
Xab Val Xab Pro Xaw
Xab Val Xab Pro Xat
Xab Val Xab Pro Xau
Xab Val Xab Pro Xbf
Xab Val Xab Pro Xbm
Xab Val Xab Pro Xbn
Xab Val Xab Pro Xbo
Xab Val Xab Pro Xch
Xaa Val Xab Pro Xdt
Xaa Val Xab Pro Xdu
Xaa Val Xab Pro Xdv
Xaa Val Xab Pro Xdw
Xaa Val Xab Pro Xdx
Xaa Val Xab Pro Xdy
Xaa Val Xab Pro Xdz
Xaa Val Xab Pro Xea
Xaa Val Xab Pro Xeb
Xaa Val Xab Pro Xec
Xaa Val Xab Pro Xed
Xaa Val Xab Pro Xef
Xaa Val Xab Pro Xeg
Xaa Val Xab Pro Xeh
10
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
151.
Xaa Val Xab Pro Xei
Xaa Val Xab Pro Xek
Xaa Val Xab Pro Xel
Xaa Val Xab Pro Xem
Xaa Val Xab Pro Xen
Xaa Val Xab Pro Xeo
Xaa Val Xab Pro Xep
Xaa Val Xab Pro Xeq
Xaa Val Xab Pro Xer
Xaa Val Xab Pro Xcg
Los ejemplos para la caracterización por espectrometría de masas de los nuevos compuestos sintetizados se dan en
la siguiente tabla:
Ejemplo
[Número]
3.
4.
5.
6.
7.
8.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
25.
26.
27.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
Análisis por MS por bombardeo con átomos rápidos
[Peso molecular (medido)]
565
579
593
607
621
635
607
607
621
649
635
635
635
635
621
621
635
635
633
647
661
623
671
667
681
655
655
669
621
635
649
621
633
667
607
647
668
655
669
685
629
11
ES 2 229 287 T3
(Continuación)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo
[Número]
52.
53.
55.
58.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
90.
92.
93.
94.
95.
128.
131.
139.
151.
Análisis por MS por bombardeo con átomos rápidos
[Peso molecular (medido)]
625
721
579
623
597
621
609
625
635
591
715
685
685
591
607
621
706
579
579
579
607
607
607
607
637
692
706
706
706
607
635
659
617
636
678
671
625
625
637
TABLA I
55
60
65
Secuencia de identificación de los compuestos preparados según los Ejemplos 1 y 2
Compuesto número(s)
1-56, 58-72, 75, 77, 79, 80, 82, 87-94, 96, 97, 99-101, 104-151
73, 74, 83-86, 95,
57, 76, 81, 102
78, 98, 103
Los símbolos Xaa en el resumen tienen los siguientes significados:
Xaa:
Xab:
N,N-dimetilvalina
N-metilvalina
12
Número de Secuencia ID
1
2
3
4
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
13
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
14
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
15
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
16
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
17
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
18
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
19
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
20
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
21
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
22
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
23
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
24
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
25
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
26
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
27
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
28
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
29
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
30
ES 2 229 287 T3
5
10
15
20
25
30
35
Los compuestos de esta invención se pueden ensayar para la actividad anti-cáncer por métodos convencionales,
incluyendo, por ejemplo, los métodos descritos a continuación.
40
45
50
A. Metodología in vitro
La citotoxicidad se midió usando una metodología estándar para las estirpes celulares adherentes tal como el
ensayo de microcultivo con tetrazolio (MTT). Se han publicado los detalles de este ensayo (Alley, MC et al., Cancer
Research 48:589-601, 1988). Los cultivos de crecimiento exponencial de células tumorales tales como el carcinoma
de colon HT-29 o el tumor de pulmón LX-1 se usan para hacer cultivos en placas de microtitulación. Las celdas se
siembran con 3.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos (en 150 µl de medio), y se cultivan durante la noche a
37ºC. Se añaden los compuestos de ensayo, en diluciones de 10 veces cariando desde 10−4 M a 10−10 M. Las celdas se
incuban después durante 72 horas. Para determinar el número de células viables en cada pocillo, se añade el colorante
MTT (50 µl de disolución de 3 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio en disolución
salina). Esta mezcla se incuba a 37ºC durante 5 horas, y después se añade a cada pocillo 50 µl de SDS al 25%, pH
2. Después de una incubación durante toda la noche, se lee la absorbancia de cada pocillo a 550 nm usando un lector
ELISA. Se calculan los valores para la media +/- SD de los datos de los pocillos replicados, usando la fórmula %T/C
(% de células viables tratadas/control).
55
60
Densidad óptica de las células tratadas
x 100 = %T/C
Densidad óptica de las células control
La concentración del compuesto ensayado que da un T/C de 50% de inhibición del crecimiento se designó como
el valor IC50 .
B. Metodología in vivo
65
Los compuestos de la invención de ensayaron adicionalmente en ensayos pre-clínicos para la actividad in vivo
que es indicativa de la utilidad clínica. Tales ensayos se llevaron a cabo con ratones desnudos en los que se había
transplantado (xenoinjertado) tejidos tumorales, preferiblemente de origen humano, como es bien conocido en este
campo. Los compuestos de ensayo se evaluaron para su eficacia anti-tumoral después de la administración a los
ratones portadores del xenoinjerto.
31
ES 2 229 287 T3
5
Más específicamente, los tumores de mama humanos (MX-1) que habían crecido en ratones desnudos atímicos
se trasplantaron a nuevos ratones receptores, usando fragmentos del tumor que eran de aproximadamente 50 mg de
tamaño. El día del trasplante se designó como día 0. Seis a diez días después, los ratones se trataron con los compuestos
de ensayo administrados como una inyección intravenosa u oralmente, en grupos de 5-10 ratones para cada dosis. Los
compuestos se administraron cada dos días, durante 3 semanas, en dosis de 1-200 mg/kg de peso corporal.
Los diámetros tumorales y los pesos corporales se midieron dos veces a la semana. Los volúmenes tumorales se
calcularon usando los diámetros medidos con calibradores de Vernier, y la fórmula:
10
(longitud x anchura2 )/2 = mm3 de volumen tumoral
Los volúmenes tumorales medios se calcularon para cada grupo de tratamiento, y los valores T/C se determinaron
para cada grupo en relación a los tumores de control sin tratar.
15
Los nuevos compuestos poseen buenas propiedades de inhibición tumoral.
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
32
ES 2 229 287 T3
REIVINDICACIONES
1. Un péptido de la fórmula (Ia)
5
(CH3 )2 N-CH(CH(CH3 )2 )-CO-(valil)-(N-metil-valil)-(prolil)-(prolil)-K
(Ia)
en el que
10
15
K es -NHC(CH3 )3 , -NHCH(CH2 CH3 )2 CH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )C(CH3 )3 , -N(CH3 )OCH2 CH3 , -N(CH3 )OCH2 CH2 CH3 ,
-N(CH3 )OCH(CH3 )2 , -N(CH3 )O(CH2 )3 CH3 , -N(CH3 )OCH2 C6 H5 , -NHC(CH3 )2 C6 H5 , -NHC(CH3 )2 CH2 CH3 , -NHC
(CH3 )(CH2 CH3 )2 , -NHCH[CH(CH3 )2 ]2 , -NHC(CH3 )2 CN, -NHCH(CH3 )CH(OH)C6 H5 , -NH-C(CH3 )2 CH=CH2 , -NHC
(CH3 )2 C≡CH, -NHC(CH2 CH3 )2 C≡CH, -NHC(CH3 )2 CH2 CH2 OH, -NHC(CH3 )2 CH(CH3 )2 , -NHC(CH3 )2 CH2 CH2 CH3 ,
-NHC(CH3 )2 CH2 C6 H5 , -N(OCH3 )CH(CH3 )2 , -N(OCH3 )CH2 CH3 , -N(OCH3 )CH2 CH2 CH3 , -N(OCH3 )CH2 C6 H5 , -N
(OCH3 )C6 H5 , -N(CH3 )OC6 H5 , -N(OCH3 )CH2 CH2 CH2 CH3 ,
o K es: -NHCH(C2 H5 )2 , -NHCH(C2 H5 )CH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )CH(CH3 )2 , -NHC(CH3 )2 C2 H5 , -NHC(CH3 )2 CH
(CH3 )2 , -NHCH(C3 H7 )2 , -NHCH(C2 H5 )C3 H7 , -NHCH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )C2 H5 , NH-ciclohexilo, NH-cicloheptilo,
20
o K es:
25
30
35
40
45
50
o K es
55
y sus sales con ácidos fisiológicamente tolerados.
60
65
2. Un péptido según la reivindicación 1, en el que
K es -NHC(CH3 )3 , -NHCH(CH3 )C2 H5 , -NHCH(C2 H5 )2 , -NHCH(C2 H5 )CH(CH3 )2 , -NHCH(CH3 )CH(CH3 )2 , -NHCH
(CH3 )C(CH3 )3 , -NHC(CH3 )2 -C2 H5 , -NHCH[CH(CH3 )2 ]2 , -NHC(CH3 )2 -CH(CH3 )2 , -NHCH(C3 H7 )2 , -NHCH(C2 H5 )
C3 H7 , -NH-ciclohexilo, -NH-cicloheptilo, -N(CH3 )OC3 H7 , -NHC(CH3 ) 2 C6 H5 , -NHC(CH3 )(CH2 CH3 ) 2 , -NHC
(CH3 )2 C≡CH, -NHC(CH3 )2 CH2 CH2 OH, -NHCH(CH3 )2 , -N(OCH3 )CH2 C6 H5 .
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o K es
5
10
15
y sus sales con ácidos fisiológicamente tolerados.
20
3. El péptido según la reivindicación 1, en el que K es -NHC(CH3 )3 , y sus sales con ácidos fisiológicamente
tolerados.
4. Un péptido o una sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para usar en terapia.
25
5. Una composición farmacéutica, que comprende un péptido o una sal según una cualquiera de la reivindicaciones
1 a 3 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. El uso de un péptido o una sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar el cáncer.
30
7. Un procedimiento para preparar un péptido o una sal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que
comprende ensamblar secuencialmente aminoácidos adecuados o sus derivados y/o unir fragmentos de péptidos adecuados por síntesis en disolución o en fase sólida, y recuperar el péptido resultante.
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40
45
50
55
60
65
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LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL
5
(i) SOLICITANTE:
(A) BASF Aktiengesellschaft
(B) CALLE: Carl-Bosch-Strasse 38
10
(C) CIUDAD: Ludwigshafen
(E) PAÍS: Bundesrepublik Deutschland
(F) ZIP: D-67056
(G) TELEFONO: 0621/6048526
15
(H) TELEFAX: 0621/6043123
(I) TELEX: 1762175170
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos péptidos, la preparación y el uso de ellos
20
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
(iv) FORMULARIO LEGIBLE DEL ORDENADOR
(A) TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 2 DD
25
(B) ORDENADOR: IBM AT compatible, procesador 80286
(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS versión 5.0
(E) SOFTWARE: WordPerfect
30
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 5 aminoácidos
35
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
40
(iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
Xaa Val Xaa Pro Xaa
45
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 6 aminoácidos
50
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
55
(iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
Xaa Val Xaa Pro Pro Xaa
60
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 5 aminoácidos
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(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
1
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(iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
Xaa Xaa Xaa Pro Xaa
5
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 5 aminoácidos
10
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
15
(iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
Xaa Ile Xaa Pro Xaa
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