Receptores de Hormonas Esteroides

Laboratorio de Biología Celular y Molecular
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional del Litoral
Maestría en Ciencias Veterinarias
Biología Celular y Molecular 2012
Mecanismo de Acción de los Receptores de Hormonas Esteroides.
Dra. Natalia R. Salvetti
Receptores Nucleares
Los receptores de hormonas nucleares son miembros de la
superfamilia de activadores transcripcionales dependientes de
ligando.
Regulan la expresión de genes específicos en respuesta a
pequeñas moléculas lipofílicas (ligando u hormona) que incluyen:
Hormonas Esteroides Hormonas Tiroideas
Ácido Retinóico
Vitamina D
Repaso: transcripción
Regiones de control transcripcional: secuencias del ADN que permiten la unión de proteínas que regulan el proceso de transcripción, aquí se incluyen promotores, elementos proximales al promotor y amplificadores.
Sitio de Inicio de la trascripción: lugar en donde la ARN POLII inicia la trascripción dando origen a la primera base del exón del ARNm que se esta transcribiendo en sentido 5’ a 3’.
Promotor: secuencia río arriba del inicio de la transcripción donde se une el complejo de transcripción incluyendo la RNA polimerasa. (TATA box)
5’
3’
Repaso: transcripción
TATA box o elemento iniciador: secuencia que indica a la ARN POLII en
donde ubicarse. TATA box es la más encontrada y generalmente se
encuentra a 25-35 pb del sitio de inicio de la trascripción en dirección 5’.
Elementos proximales al promotor: regiones de control (dentro del
ADN) que se encuentran entre 100-200pb en dirección 5’ del sitio de inicio
de la trascripción.
Amplificadores: son elementos de control de la trascripción que
amplifican la trascripción. Pueden estar muy alejados del sitio de inicio de
la transcripcion, en dirección 5’ o 3’.
TBP
ADN
Figura 6-16 (parte 1 de 3) Biología molecular de la célula, quinta edición (© Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)
Figura 6-16 (parte 2 de 3) Biología molecular de la célula, quinta edición (© Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)
Figura 6-16 (parte 3 de 3) Biología molecular de la célula, quinta edición (© Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)
Repaso: transcripción
Repaso: transcripción
Factores de transcripción: proteínas que regulan la expresión génica,
se unen a secuencias del DNA río arriba del sitio de inicio de la
transcripción o al complejo de transcripción, estimulando o
reprimiendo la actividad del complejo.
Receptores Nucleares
Existen mas de 60 factores de transcripción dependientes de ligando,
entre los que se pueden encontrar:
Ligando
Receptor
Estradiol
Receptor de Estrógenos (RE)
Progesterona
Receptor de Progesterona (RP)
Cortisol
Receptor de Glucocorticoides (RG)
Aldosterona
Receptor de Mineralocorticoides (RM)
Testosterona y DHT
Receptor de Andrógenos (RA)
Vitamina D
Receptor de Vit D (VDR)
T3 y T4
Receptor de hormonas tiroideas (TR)
Ácidos Retinoicos 9- Cis
Receptor de ácido retinoico (RAR)
Ácidos Retinoicos trans
Receptor de retinoide X (RXR)
La superfamilia de los receptores hormonales nucleares
Los genes regulados por los receptores nucleares están
relacionados con una gran variedad de procesos incluyendo
metabolismo, desarrollo, crecimiento y diferenciación.
Los receptores nucleares están constituidos por tres principales
dominios funcionales además de dos zonas de activación
transcripcional:
Dominio de Unión al ADN (DBD): C
Dominio de Unión al Ligando (LBD): E
Dominio Amino Terminal
Dominios de activación transcripcional: AF (AF1 y AF2)
Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides
Dominio de unión al ADN (DBD): la estructura del DBD consiste en dos dedos
de zinc formados por cuatro residuos de cisteínas con un átomo de zinc. La
región aminoterminal del dedo de zinc contacta con el surco mayor de la doble
hélice de DNA, constituyendo la caja P. La especificidad de la unión del receptor
a la secuencia del Elemento de Respuesta a Hormona (ERH) del ADN viene
también determinada, en parte por los tres aminoácidos adyacentes al primer
dedo de zinc. El segundo dedo de zinc en la región carboxiterminal también es
necesario para la unión del DNA, ya que mutaciones en esta región generan un
receptor inactivo.
Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides
N
Dominio N
DBD
AF-1
H
Región
Bisagra
C
LBD
AF-2
Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides
Dominio de unión a la hormona (LBD): está localizado en la región
carboxiterminal del receptor. Aquí se ubican las proteínas inhibidoras (HSP90)
para evitar la activación del receptor.
N
Dominio N
AF-1
DBD
H
Región
Bisagra
LBD
AF-2
C
Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides
Dominios de transactivación (AF1 y AF2): son esenciales para la
transactivación y actúan independientemente de la posición que ocupen. El AF2
es dependiente del ligando, no así el AF1.
Receptores Nucleares
Los receptores nucleares han sido clasificados en cuatro clases
de acuerdo a:
Interacción con HSPs
Tendencia a formar homodímeros o heterodímeros
Especificidad de unión al ADN
Receptores Nucleares
Clase I:
Tienen largos dominios A/B.
Cuando no están unidos al ligando permanecen secuestrados por
grandes heterocomplejos 9S (proteasa resistentes) que contienen HSP
(HSP70, HSP90, p23,p60), inmunofilinas (CyP40, etc) y otras chaperonas.
Luego de la unión del ligando se produce la disociación del
heterocomplejo y los receptores pueden dimerizar y unirse al ADN.
En ausencia del ligando los receptores se trasladan entre el núcleo y el
citoplasma con una cantidad constitutiva citoplasmática dependiendo del
tipo de receptor.
Ligandos y receptores: Los receptores de esteroides (Receptores de
Andrógenos,
Estrógenos,
Progesterona,
Mineralocorticoides,
Glucocorticoides).
Receptores Nucleares
Clase II:
Tienen cortos dominios A/B.
No se relacionan con Heat Shock Proteins
Permanecen unidos a elemento de respuesta del ADN formando
homodímeros o monómeros pero de preferencia formando heterodímeros
con RXR.
Esperan in situ la unión y consiguiente activación por el ligando.
Ligandos y receptores: hormona tiroidea (RT), dihidroxivitamina D (VDR),
Ácidos retinoicos trans (RXR), y la mayoría de los receptores huérfanos.
Receptores Nucleares
Clase III:
Funcionan primariamente como monómeros aunque pueden dimerizar
con RXR.
Producen transcripción constitutiva.
Ligandos y receptores: Factor esteroidogénico -1 (SF-1).
Clase VI:
Muestran características similares a los de clase I y II pero se unen al
ADN exclusivamente como monómeros en medios sitios con repeticiones
directas.
Ligandos y receptores: Algunos de los receptores huérfanos tales como
el HNF-4 (Factor nuclear de hepatocitos 4)
Receptores de Hormonas Esteroides
Los receptores de hormonas esteroides se clasifican dentro de los
de Clase I.
Receptores de Estrógenos (RE)
Receptores de Andrógenos (RA)
Receptores de Progesterona (RP)
Receptores de Mineralocorticoides (RM)
Receptores de Glucocorticoides (RG)
Receptores de Hormonas Esteroides
En los mamíferos, las adrenales, las gónadas y la placenta producen
cinco grandes grupos de hormonas esteroides.
Estas hormonas regulan numerosos procesos fisiológicos en las células
blanco equipadas con los correspondientes receptores hormonales.
Estrógenos
Progesterona
Mineralocorticoides
Andrógenos
Glucocorticoides
Receptores de Hormonas Esteroides
Factores de transcripción dependientes de ligando: Hormonas
Esteroides.
Ligando
Receptor
Estradiol
Receptor de Estrógenos (RE)
Progesterona
Receptor de Progesterona (RP)
Cortisol
Receptor de Glucocorticoides (RG)
Aldosterona
Receptor de Mineralocorticoides (RM)
Testosterona y DHT
Receptor de Andrógenos (RA)
Receptores de Hormonas Esteroides
La unión de las hormonas esteroides (HE) a los receptores nucleares
de esteroides (RNE) se realiza según un modelo de dos pasos:
1. Unión de la hormona al receptor específico dentro de la
célula blanco (puede ser en el citoplasma o en el núcleo,
de acuerdo al receptor).
2. Activación del complejo hormona-receptor para inducir la
expresión génica en respuesta a hormonas.
Receptores de Hormonas Esteroides
Homología en las secuencias de los distintos
receptores de hormonas esteroides
Regulación de la transcripción génica mediada por
Receptores de hormonas esteroides
Las hormonas esteroides cumplen su función mediante la activación de
los receptores hormonales, los cuales van a unirse, luego de la
dimerización, al Elemento de Respuesta a Hormonas (ERH) localizado
en promotores de los genes blanco.
Los receptores GR, MR, AR y PR
se
unen
al
mismo
ERH
originalmente denominado ERG
(Elemento
de
Respuesta
a
Glucocorticoides).
Este
está
compuesto por mitades invertidas
(palindrómicas,
IR3=
inverted
repeat 3) de la secuencia TGTYCT
(esta ultima base poco conservada)
separadas por tres pares de bases
no conservadas NNN.
Y= cualquier base pirimídica (C o T)
R= cualquier base purínica (G o A)
Regulación de la transcripción génica mediada por
Receptores de hormonas esteroides
Los receptores de estrógenos así como también los receptores
relacionados a estrógenos (receptores huérfanos, RRE) interaccionan
con elementos de respuesta específicos, ya sea como homodímeros o
heterodímeros (cada monómero se une a una mitad).
Los receptores ER y los RRE se
unen al ERE (Elemento de
respuesta a estrógenos). Este está
compuesto por mitades invertidas
(palindrómicas,
IR3=
inverted
repeat 3) de la secuencia TGRCC
separadas por tres pares de bases
no conservadas NNN.
Y= cualquier base pirimídica (C o T)
R= cualquier base purínica (G o A)
Regulación de la transcripción génica mediada por
Receptores de hormonas esteroides
El descubrimiento de los huérfanos RRE α y β (receptores relacionados
a estrógenos) llevó a la identificación de un elemento de respuesta
exclusivo para estos.
Los RRE α y β (receptores
relacionados a estrógenos) se unen
al ERRE (Elemento de respuesta
relacionado a estrógenos) como
monómeros o dímeros. Además el
REα
puede
unirse
como
homodímero a este. El ERRE está
compuesto por una mitad del ERE
que continúa hacia el extremo 5’,
separada por 1 par de bases N.
Y= cualquier base pirimídica (C o T)
R= cualquier base purínica (G o A)
Correguladores
Los correguladores son proteínas que interactúan con factores de
transcripción y modulan su actividad positiva o negativamente, y que
desde un punto de vista funcional se clasifican en dos tipos:
Coactivadores.
Correpresores.
Correguladores
Los coactivadores, no interactúan directamente con el DNA sino que
lo hacen de manera indirecta a través de su asociación con factores
de transcripción, entre los que se encuentra el receptor de
estrógenos.
Se sabe que la unión del ligando al ER genera un cambio
conformacional en su LBD, formando una cavidad hidrofóbica que
permite la interacción con coactivadores a través de una secuencia o
motivo LxxLL (donde L es leucina y x es cualquier aminoácido)
llamada caja NR. Esta caja NR está presente en una o varias copias
en un gran número de coactivadores.
Correguladores
Los co-activadores usualmente se presentan en complejos
multiprotéicos que interactúan con factores de transcripción y
modifican la cromatina para facilitar la transcripción, a través de
mecanismos de:
Remodelación de cromatina
Acetilación y metilación de histonas.
Facilitación del reclutamiento de la maquinaria general de la
transcripción y la activación de Pol II.
Estabilización de los complejos sobre el DNA.
Estabilización del ARNm.
Regulación del recambio de complejos proteicos sobre los
promotores.
Correguladores
Los correpresores: Cuando los receptores nucleares (RN) actúan como
represores transcripcionales, los correpresores tienen un papel
importante en esta regulación negativa. Muchos de los RN reprimen la
transcripción en ausencia de su ligando o en presencia de ligandos
antagonistas, como el tamoxifeno. Esta regulación negativa está
mediada en parte por los co-represores.
La unión de antiestrógenos causa un cambio conformacional en AF-2
diferente al creado por la unión de ligandos agonistas lo cual bloquea la
interacción con coactivadores de AF-2 y permite la entrada de
correpresores. Los correpresores se unen a los receptores por medio de
una caja CoRNR que tiene una secuencia similar a las cajas RN: LxxxI/
HIxxxI/L.
Correguladores
Los correpresores forman parte de complejos multiprotéicos y reclutan
desacetilasas de histonas (HDAC) que evitan el acceso a factores de
transcripción críticos sobre el ADN, y así se ve reprimida la transcripción.
El reclutamiento de complejos que contienen HDAC está implicado en la
represión por un número de silenciadores en mamíferos.
Existen otros represores que inhiben la actividad transcripcional de los
receptores nucleares mediante diferentes mecanismos. Estos incluyen:
Interrumpir la unión al DNA o la translocación al núcleo del receptor.
Inhibir las interacciones entre los receptores y sus coactivadores.
Interrumpir el reclutamiento de la maquinaria basal de transcripción.
Correguladores
Co-activadores
A- Remodeladores y modificadores de cromatina:
La cromatina juega un papel importante en la regulación de la actividad
basal de muchos promotores, y moléculas diseñadas para vencer las
coacciones termodinámicas que esto produce, son reclutadas en un
punto temprano en el modelo de acción del RE. Quizás el mejor
caracterizado entre estas moléculas es el complejo de proteínas
SWI/SNF que relajan la cromatina con gasto de ATP.
Co-activadores
B- Actividad de acetilasa de histonas:
Las histonas mantienen un ambiente heterocromático (represivo de
transcripción) debido a las cargas electrostáticas conferidas por las cargas
positivas de las lisinas de histonas y por las cargas negativas de los grupos
fostato del DNA. Miembros de la familia SRC y proteínas de unión a CREB
(CBP) y p300, poseen actividad como acetilasas de histonas.
Son consideradas las responsables
de interrumpir las interacciones que
mantienen la región del promotor en
un estado cerrado, es decir relajan
la cadena del DNA, convirtiendo un
ambiente heterocromático en
eucromático, promoviendo así el
inicio de la transcripción.
Co-activadores
C- Actividad de metilasa:
En regiones “silenciosas”, donde el DNA está fuertemente empaquetado
por la histona H3, los genes están inactivados. Por el contrario, en las
regiones activas donde los genes se expresan, existe una variedad
levemente distinta de la histona H3, debido a que la histona H3 tiene
metilado el aminoácido lisina de la posición 9 en regiones cerradas,
mientras en las regiones activas o abiertas tiene metilado la lisina 4.
Co-activadores
C- Actividad de metilasa:
Además de las marcas sobre las lisinas, también puede existir metilación
sobre las argininas, como es el caso del coactivador metiltransferasa
arginina 1 (PRMT1) que metila la arginina 3 de la histona 4, que es una
marca de cromatina abierta. Otro ejemplo es la metil-transferasa arginina
2 (PRMT2), que interacciona con ERα, activando la transcripción de
genes blanco de E2 y el CARM1 (coactivator associated arginine (R)
methyltransferase).
Co-activadores
D- Adaptadores de Maquinaria basal de la Transcripción (MBT):
Los co-activadores pueden estabilizar la unión o ayudar a reclutar factores
de transcripción basal, ya que presentan interacción directa con
complejos iniciadores como es el caso de las proteínas asociadas al
receptor de hormonas tiroides (TRAPs) y las proteínas que interactúan
con la vitamina D (DRIP).
Algunos estudios han demostrado
que complejos que contienen
TRAP/DRIP son capaces de
mejorar la actividad transcripcional
de varios tipos de receptores.
Co-activadores
E- Actividad de Ubiquitina ligasa:
Algunos co-activadores pueden reclutar a enzimas con actividad de
ligasas de ubiquitina, como es el caso de E6-AP que estimula la
transcripción por medio de ERα de manera dependiente al ligando.
Este corregulador está involucrado en
marcar un sustrato para ser procesado por
el sistema de degradación ubiquitinaproteasoma y así renovar el ciclo
transcripcional de los genes blanco. Este
proceso asegura el recambio de los
complejos de la transcripción unidos a los
promotores blanco.
Co-activadores
F- Adaptadores de splicing:
Aun no está bien dilucidado este mecanismo; sin embargo, se ha sugerido
que proteínas como la helicasa p72 o el coactivador PGC-1, puedan estar
involucradas en este tipo de procesamiento del mRNA en algunos genes
blanco para estrógenos.
Heterodímeros de RXR-VDR
Co-activadores
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
Estas proteínas se unen de manera hormonodependiente a un amplio
rango de receptores hormonales, en la zona AF2 (zona de activación de la
transcripción dependiente de ligando) para intensificar la trascripción.
Los componentes de esta familia son denominados Coactivadores de
Receptores Esteroides (SRC), y esta compuesta por tres miembros
estrechamente relacionados:
SRC-1 (interacciona principalmente con RP)
SRC-2 (GRIP-1 y TIF-2, interaccionan con el RG)
SRC-3 (relacionado con REα en SNC)
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
Los SRC son
proteínas que
presentan solo un
40% de homología
entre los
componentes de la
familia pero
presentan dominios
altamente
conservados en
cuanto a las
funciones que
cumplen.
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
Región N-terminal (bHLH/PAS): es indispensable para la unión al
receptor
Dominio de interacción con los receptores nucleares (NID): contiene 3
porciones LXXLL denominadas NR boxes que interactúan con el LBD
del RN en AF-2 para mejorar la transcripción (el motivo NR boxes de
cada miembro de SRC tiene afinidad por distintos receptores).
Dominios de activación de
la transcripción autónoma:
AD1
y
AD2.
Estos
interactúan
con
otros
coactivadores (AD1: CBP,
p300; AD2:CARM1)
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
SRC-1 y SRC-3 tienen actividad enzimática de acetiltransferasa de
histonas.
CARM1 es un coactivador secundario que trabaja asociado a p160
para aumentar la transcripción por medio de reacciones de metilación
de Histona 3.
Si bien la acción principal de los componentes de la familia p160 es a
través de AF-2, existe algo de activación a través de AF-1, sobretodo
el RA que utiliza este factor de transcripción como el principal en la
interacción con SRC, siendo el AF2 menos eficiente.
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
Mecanismo de Acción de los coactivadores p160: Los coactivadores
actúan en una secuencia de dos pasos:
1- Primero promueven el remodelamiento de la estructura de la
cromatina y habilitan el acceso al ADN de los factores generales de
transcripción.
2- Reclutan y estabilizan los factores asociados a la maquinaria de
transcripción basal de la ARN polimerasa II mediante interacciones
proteína-proteína directas o indirectas.
Coactivadores de la familia p160 (SRC)
Mecanismo de Acción de los coactivadores p160
Coactivadores que actúan a través de AF-1
p68 ARN helicasa: interactúa con AF-1 del REα selectivamente (con
ningún otro).
SRA (steroid receptor RNA coactivator): interactúa con AF-1 de
Receptores Esteroides pero no con los de otras clases de receptores
nucleares, lo hace a través de su unión con SRC-1.
Co-represores
A- Remodelación de cromatina:
Mecanismo por el cual se mantiene una heterocromatina (cromatina
cerrada), evitando así la transcripción de genes susceptibles a E2. Para
ello la cromatina sufre tanto cambios estructurales como bioquímicos.
Actividades de HDAC (desacetilasas de histonas) o metilación de
histonas y/o DNA, evitan la entrada de los complejos transcripcionales
sobre el promotor cerrado.
NCoR (Correpresor nuclear),
SMRT, RIP140, etc son algunos
de los correpresores que poseen
actividad desacetilasa.
Co-represores
B- Regulación de la maquinaria basal de la transcripción:
Uno de los mecanismos involucrados en la actividad represora de los RN
es mediada por el efecto que los co-represores ejercen sobre la
maquinaria basal transcripcional, por ejemplo, NCoR interactúa con
factores de transcripción basal, impidiendo que las uniones entre estos
factores sean estables.
Adicionalmente, BRCA-1 se ha encontrado
presente en el complejo de la RNA Pol II. SAFBI
se une al dominio C-terminal de la RNA pol II.
Estas interacciones hacen suponer que los
correpresores inhiben la acción de la maquinaria
basal de la transcripción, y así evitan la
transcripción de genes blancos ER-dependientes.
Co-represores
C- Competencia con proteínas co-activadoras:
Los correpresores compiten con los coactivadores por los sitios de unión
en los RN. Ejemplos claros de competencia directa son REA y SHP que
compiten con los coactivadores SRC-1 y TIF-2, respectivamente. RIP140
y TIF2 han mostrado competencia por la unión a c-Jun y a ERα, para
modular la actividad transcripcional E2-dependiente por medio de AP-1.
Otro ejemplo es el del correpresor erbB2, que se expresa en ausencia de
estrógenos o en presencia de antiestrógenos, el cual secuestra a SRC-1
Co-represores
D- Procesamiento de RNA:
Se ha demostrado que las hormonas esteroides pueden afectar el
procesamiento del RNA y que los coreguladores pueden estar
íntimamente relacionados en estos procesos. Aún cuando no se conoce
mucho sobre este mecanismo, se ha demostrado en diferentes
correpresores la presencia de motivos de unión a RNA (RRM), tal es el
caso de SHARP, RTA y SAFB1/2.
E- Secuestro del RN en el citoplasma:
Una medida para evitar que RN actúe sobre su gen blanco, es evitar la
entrada de este al núcleo, tal es el caso del corregulador MTA1s, que
secuestra al ERα antes de su translocación al núcleo.
Co-represores
F- Bloqueo de la dimerización de ER y su unión al DNA:
Como ya se mencionó, es necesario que el ER forme dímeros o
heterodímeros para poder ser activado y unirse a los promotores blancos.
Correguladores como TR2 y SHP, inhiben la dimerización de ERα y otros
como SHP, TR2 o p53, evitan la unión del ERα al DNA.
G- Otros mecanismos:
También existen otros tipos de mecanismos por los cuales los
correpresores podrían influir sobre la actividad de RN. BRCA-1 y
NEDD8, desestabilizan al ERα o simplemente actúan como proteínas de
andamiaje para reclutar complejos multiproteicos inhibidores como es el
caso del correpresor SHARP.
Receptores de Estrógenos
Se conocen dos subtipos: REα y β. Provienen de diferentes genes y a
su vez expresan isoformas mediante splicing alternativo.
Se encuentran en el núcleo y en el citoplasma, hasta que se produce
la unión con el ligando. Una vez unido el ligando se produce la
dimerización (hetero u homodimerización)
Receptores de Estrógenos
Receptores de Estrógenos
Interacciones Receptor de Estrógenos-ADN
Mecanismo Clásico (el más estudiado):
El complejo E2-RE se une directamente al EREs en los
promotores génicos.
Mecanismo de Unión Indirecto al ADN :
Acción Genómica independiente del ERE. Interacciones
proteína-proteína con otros factores de transcripción (SP1).
Acción Genómica independiente de ligando
Ciertos factores de crecimiento activan la cascada de la
protein-quinasa llevando a la fosforilación del RE al ERE.
Mecanismo No Genómico:
Acciones mediadas por los RE asociados a la
membrana.
ER ER
ERE
TF
ER
P
P
ER ER
TF
P
X
Receptores
de
Estrógenos
Receptores de Estrógenos
Unión Directa con ERE como homo o heterodímeros
Asociación con otros factores de transcripción
Receptores de Estrógenos
ERα
ERα
ERβ
ERα
Muchas Gracias!