citoquina designada lerk-6.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
A01N 43/04 (2006.01)
A61K 31/00 (2006.01)
A61K 31/70 (2006.01)
C07H 21/02 (2006.01)
C07H 21/04 (2006.01)
C07K 1/00 (2006.01)
C07K 14/00 (2006.01)
C07K 16/00 (2006.01)
C12N 1/00 (2006.01)
C12N 5/00 (2006.01)
C12N 15/00 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 277 335
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 95936253 .4
86
Fecha de presentación : 04.10.1995
87 Número de publicación de la solicitud: 0785716
87 Fecha de publicación de la solicitud: 30.07.1997
54 Título: Citoquina designada LERK-6.
30 Prioridad: 05.10.1994 US 318393
03.10.1995 US 538709
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
73 Titular/es: IMMUNEX CORPORATION
51 University Street
Seattle, Washington 98101, US
72 Inventor/es: Cerretti, Douglas, P.
01.07.2007
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel
ES 2 277 335 T3
01.07.2007
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Citoquina designada LERK-6.
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Campo de la invención
La presente invención se relaciona con polipéptidos de citoquina designados como LERK-6 que se unen al receptor
hek o elk, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, procesos para la producción de polipéptidos LERK-6
combinantes, y composiciones farmacéuticas que contienen tales polipéptidos.
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Antecedentes de la invención
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Las proteínas conocidas como las tirosinas quinasas receptoras tienen una actividad de quinasa intrínseca que
se activa luego de la unión de ligando. Esta clase de proteína se caracteriza por motivos estructurales conservados
dentro de los dominios catalíticos (Hanks et al., Science, 242:42, 1988) y se pueden subdividir en familias basadas en
características estructurales de las regiones N-terminales al dominio catalítico.
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Boyd et al (J. Biol. Chem., 267:3262, 1992) purificó una glicoproteína de superficie celular que exhibe actividad
de tirosina quinasa. La secuencia de aminoácido identificó esta proteína como un miembro de la familia eph/elk, y la
proteína fue designada así hek (quinasa similar a eph/elk humana). Un anticuerpo monoclonal y inmunoreactivo con
hek se utilizó para estudiar la expresión del hek en un número de tipos de célula humano (Body et al supra). El antígeno
hek se detectó sobre la línea de célula de leucemia de célula pre-B humana LK63 (la línea celular empleada como el
inmunógeno contra el cual se generó el anticuerpo) la línea de célula de leucemia de célula T humana, JM. La líneas de
célula de linfoma Raji B mostró una expresión de antígeno hek débil, y el resto de las lineas celulares ensayadas tanto
líneas celulares normales como tumorales, entre las cuales estaban las lineas celulares hematopoyéticas que incluyeron
las líneas celulares pre-B y T ensayadas (tanto las líneas celulares normales como tumorales., entre las cuales estaban
las líneas celulares hematopoyéticas que incluyeron las líneas celulares pre-B y T) fueron consistentemente negativas.
De os especímenes de biopsia de tejido normal y tumoral que también fueron ensayados para expresión de antígeno
hek, ninguno de los tejidos normales fue positivo y solamente una proporción muy baja de tumores hematopoyéticos
fue positivo.
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La expresión de los transcriptos hek en las lineas celulares LK63 y JM anteriormente descritas, así como también
la línea celular de leucemia de célula T humana HSB-2, ha sido demostrada mediante análisis northem blot (Wicks
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las secuencias de nucleótido y aminoácido para el clon de cADN
hek aislado están presentes en Wicks et al., Supra.
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La proteína de superficie celular designada a elk es otro miembro de la familia de proteínas del receptor de tirosina
quinasa relacionado con eph. Un clon parcial de elk fue primero descubierto en una librería de expresión de cADN de
cerebro de rata que se seleccionó para proteínas que expresan actividad de tirosina quinasa (Letwin et al., Oncogene
3:621, 1988.). Posteriormente, una secuencia de compuesto que alcanza la región codificante elk entera se derivó de
los clones parciales aislados de la librería cADN de cerebro de rata y una librería de cerebro de cerebelo de rata
utilizando el clon parcial como una sonda (Lhotak et al., Mol, Cell. Biol. 11:2496. 1991).
Las proteínas hek y elk están cercanamente relacionadas con un número de otras tirosina quinasas receptoras,
que incluyen los homólogos hek mek4 y cek4 (Sajjadi et al., New. Biol. 3:769, 1991); eek (Chan et al. Oncogene
6:1057, 1991); erk (Chan et al, supra.), eck (Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E.B.
Cell Regulation 2:253, 1991); y eph (Hirai et al. Science 238:1717, 1987). Las proteínas de estas subfamilias están
relacionadas no solamente en sus dominios citoplasmáticos sino también en sus dominios extracelulares, los cuales
son 41 a 68% idénticos. De manera interesante, las distribuciones de tejido de los varios receptores don diversas. Por
ejemplo, la expresión del mARN de elk se ha reportado por ser limitada a los testículos y el cerebro (Lhotak et al.
supra), mientras que el eck se encuentra no solamente en estos mismos dos tejidos sino en el pulmón, intestino, riñón,
vaso, ovario, y piel también. Además, la mayoría de los receptores relacionados con eph son primariamente expresados
en el cerebro. Debido a la homología de los receptores en la familia eph, el ligando dado para un receptor específico
también se puede unir a otros receptores.
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Aquellos ligandos que se han identificado para las citoquina quinasas receptoras son un grupo diverso de proteínas
que afectan el crecimiento, diferenciación, y supervivencia de las células que expresan los receptores. Los ligandos
para el hek y elk se han aislado, y discutido con más detalle adelante.
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La identificación de los ligandos adicionales para el hek y el elk que pueden existir probarían ser útiles para
investigar la naturaleza de los procesos celulares regulados por la señalización a través de estos receptores. Si el
mejoramiento o inhibición de una señal biológica particular mediada a través de estos receptores se desea, es ventajoso
identificar cada una de las proteínas que pueda jugar un papel en la transducción de tales señales. Además, es conocido
que ciertas proteínas se pueden unir a los receptores sin una transducción de señal de iniciación que incluyen la proteína
antagonista del receptor de interleuquina -1 (Eisenberg et al., Nature 343:341, 1990; Hannum et al., Nature 343; 336,
1990; y Carter et al., Nature 344:633, 1990), La identificación de las proteínas adicionales que se unen al hek o elk es
también redeseable con el fin de determinar si tales proteínas funcionan como antagonistas.
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Resumen de la invención
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La presente invención pertenece LERK-6 de mamífero como una proteína aislada y homogénea. Además, la invención está dirigida al ADN aislado que codifica el LERK-6 de mamífero y a vectores de expresión que comprenden
un cADN que codifica el LERK-6 de mamífero. Dentro del alcance de esta invención están las células huéspedes que
han sido transfectadas o transformadas con vectores de expresión que comprenden un cADN que codifican LERK-6,
y procesos para producir el LERK-6 al cultivar tales células huéspedes bajo condiciones que conducen a la expresión
del LERK-6.
Además, el LERK-6 se puede diluir a una matriz de fase sólida y utilizar para afinidad-purificación o separar
células que expresan hek o elk en su superficie celular. La invención comprende células separadoras que tienen el
receptor hek o elk sobre la superficie de ésta de una mezcla de células en solución, que comprenden poner en contacto
las células en la mezcla con una superficie de contacto que tiene una molécula de LERK-6 sobre esta, y separar la
superficie de contacto en la solución.
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Descripción detallada de la invención
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Un cADN que codifica el LERK-6 se ha aislado y se describe en la SEQ ID NO:1. Para comparación un exón
del LERK-6 humano ha sido aislado y descrito en la SEQ II) NO:7. Este descubrimiento del cADN que codifica el
LERK-6 posibilita la construcción de los vectores de expresión que comprenden los cADN que codifican el LERK6; las células huéspedes afectadas o transformadas con los vectores de expresión; el LERK-6 biológicamente activo
como proteínas homogéneas; y los anticuerpos inmunoreactivos con LERK-6.
El LERK-6 se puede utilizar en el mejoramiento, estímulo, proliferación o crecimiento de células que expresan
el receptor hek o elk. En razón a que el receptor hek o elk se encuentra en el tejido del cerebro y los testículos, el
tratamiento de una variedad de condiciones asociadas con el daño al tejido de éste es posible. Más aún, el ligando y
el complejo receptor se pueden involucrar en el crecimiento neuronal, desarrollo y/o mantenimiento. Aunque no está
limitado a tal, los usos particulares del LERK-6 se describen infra.
Como se utiliza aquí, el término “LERK-6” se refiere a un género de polipéptidos que se une a un complejo
independientemente con el receptor hek o elk encontrado en las células T o en las células de cerebro. El término
“LERK-6” comprende polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácido 1-184 de la SEQ ID:2. Las proteínas que
son codificadas por los ácidos nucleicos que contienen la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:7 se suministra
para comparación. Además, aquellos polipéptidos LERK-6 que tienen un alto grado de similitud o un alto grado de
identidad con las secuencias de aminoácido 1-184 de la SEQ ID NO:2, sobre la secuencia de aminoácido de la SEQ
ID NO:8 que es suministrada para comparación y cuyos polipéptidos son biológicamente activos y se unen al receptor
hek o elk. Además, el término “LERK-6 de murino” se refiere a productos de gen biológicamente activo del ADN
de la SEQ ID NO:1. Además comprendido por el término “LERK-6” están las proteínas ligadas a GPI (las cuales
incluyen una región extracelular y una región hidrófoba C-terminal), y proteínas solubles o truncadas que comprenden
primariamente la porción de unión del receptor de la proteína, retienen la actividad biológica y son capaces de ser
secretadas. Ejemplos específicos de tales proteínas solubles son aquellas que comprenden la secuencia de aminoácidos
1 (Ala) -145 (Asn) de la SEQ ID NO:2.
El término “hek/elk” significa hek o elk o ambos hek y elk. Por ejemplo, el término “anticuerpos anti-hekk/elk” se
refieren a anticuerpos contra hek o elk al termino “células que expresan hek/elk” se refiere a células que expresan el
receptor hek o elk o células que expresan tanto los receptores hek como elk.
El termino “biológicamente activo” en la medida en que este se refiere al LERK-6, significan que el LERK-6 es
capas de unirse al hek/elk.
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“Aislado” significa que el LERK-6 esta libre de asociación con otras proteínas de polipéptidos, por ejemplo, como
un producto de purificación de cultivo de célula huésped recombinante o un extracto purificado.
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Una “variante LERK-6” como se denomina aquí significa un polipéptido sustancialmente homólogo al LERK6 nativo, pero la cual tiene una secuencia de aminoácido diferente de aquella del LERK-6 nativo (humano, murino u otras especies de mamífero) en razón de una o más supresiones inserciones o sustituciones. La secuencia de
aminoácido variante preferiblemente es al menos 80% idéntica con la secuencia de aminoácido LERK-6 nativa, más
preferiblemente al menos 90% idéntica. La identidad porcentual se puede determinar, por ejemplo, al comparar la
información de secuencia que utiliza el programa de computadora GAP. Versión 6.0 descrita por Devereux et al.
(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de la Universidad del Grupo de Computación Genética de Wisconsin
(UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación
unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745. 1986. Es descrito por Schwartz y Dayhoff, eds.,
Atlas Of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358. 1979; (2) una pena
de 3.0 para cada espacio y una pena adicional de 0.10 para cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna pena para
los espacios finales. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de manera conservadora, significando
que el residuo de aminoácido dado es reemplazado por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares.
Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como He, Val, Leu
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o Ala uno para el otro, o sustituciones de un residuo por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otra
de tales sustituciones conservadoras, por ejemplo, las sustituciones de las regiones enteras que tienen características de
hidrofobicidad similares, son bien conocidas. Las variantes LERK-6 de ocurrencia natural o los alelos también están
comprendidas por la invención. Ejemplos de tales variantes son las proteínas que resultan de eventos de empalme de
mARN alterno o de clivaje proteolítico de la proteína LERK-6, en donde la propiedad de unión del LERK-6 se retiene. El empalme alternativo del mARN puede producir una proteína LERK-6 truncada pero biológicamente activa, tal
como una forma soluble de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo. Las variaciones atribuibles a la proteolisis
incluyen, por ejemplo, las diferencias en el C-terminal luego de la expresión en diferentes tipos de células huésped,
debido a la remoción proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína LERK-6 (generalmente de los
aminoácidos 1-5 terminales).
El LERK-6 se predice que se va anclar a la superficie celular por vía del enlace glicocil-fosfatidilinositol (GPI).
Los anclajes de membrana GPI, que incluyen la estructura química y el procesamiento de estos, se describen en
Ferguson, M. and Williams. A., Ann. Rev. Biochem., 57:285, 1988 (incorporada aquí como referencia). Cuando se
expresa inicialmente, ciertas proteínas comprenden un dominio hidrófobo C-terminal que contiene señales para el
anclaje GPI. Un sitio de clivaje esta localizado corriente arriba, a menudo de aproximadamente 10-12 aminoácidos
corriente arriba del N-terminal del dominio hidrófobo. El procesamiento post transduccional incluye el clivaje de la
proteína en este sitio de clivaje. Un anclaje GPI se une al aminoácido C-terminal recientemente expuesto de la proteína
madura procesada. Así, cuando las proteínas LERK-6 se expresan en las células que reconocen las señales de anclaje
GPI en el dominio hidrófobo, la secuencia de aminoácido de longitud completa de la SEQ ID NO:2 representa formas
precursoras de las proteínas.
Con base en las secuencias de consenso derivadas de otras proteínas de anclaje GPI, la región hidrófoba en el
LERK-6 de la presente invención probablemente esta entre e incluye, los aminoácidos 170 (Leu) y 184 (Ser). Entre
el dominio hidrófobo y el dominio de unión de receptor, está una región espaciadora de aproximadamente 22 a 25
aminoácidos de longitud. La región espaciadora se extiende desde aproximadamente el aminoácido 145 (Asn), 146
(Glu) o 147 (Thr) a aproximadamente el aminoácido 169 (His).
El ejemplo 3 describe la construcción de una proteína de fusión novedosa hek:Fc que se puede utilizar en la
selección de LERK-6. Otras regiones Fc de anticuerpos se pueden sustituir por la región IgGI Fc humana descrita en
el ejemplo. Otras regiones FC adecuadas son aquellas que se pueden unir con alta afinidad a la proteína A o proteína
G, e incluyen la región Fc del IgGI humano o los fragmentos de la región IgGI Fc humana o de murino, por ejemplo,
los fragmentos que comprenden al menos la región de pivoteo de tal forma que se formarán uniones de disulfuro
intercadena. La proteína de fusión hek:Fc ofrece la ventaja de ser fácilmente purificada. Además, las uniones disulfuro
se forman entre las regiones Fc de dos cadenas de proteína de fusión separadas, creando dímeros.
Como se describió supra un aspecto de la invención son los polipéptidos LERK-6 solubles. Los polipéptidos LERK
solubles comprenden todo o parte del dominio extracelular del LERK-6 nativo pero falta la señal GPI que originaria la
retención del polipéptido sobre la membrana celular. Los polipéptidos LERK-6 solubles comprenden ventajosamente
el péptido de señal nativo (o heterólogo) cuando se sintetiza inicialmente para promover la secreción pero el péptido de
señal es clivado luego de la secreción del LERK-6 de la célula. Los polipéptidos LERK-6 solubles comprendidos por
la invención retiene la capacidad de unirse al receptor hek o elk. De hecho, el LERK-6 soluble también puede incluir
parte de la señal GPI o parte del dominio citoplasmático u otras secuencias, siempre y cuando la proteína LERK-6
soluble se pueda secretar.
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El LERK-6 soluble se puede identificar (y distinguir de las contrapartes de unión de membrana no soluble) al separar las células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación,
y ensayando el medio (supernadante) para la presencia de la proteína deseada. La presencia del LERK-6 en el medio
indica que la proteína se secreta de las células y es así una forma soluble de la proteína deseada.
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Las formas solubles del LERK-6 poseen muchas ventajas sobre la proteína LERK-6 unida nativa. La purificación
de las proteínas provenientes de células huéspedes recombinantes es factible, en razón a que las proteínas solubles
son secretadas de las células. Además, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para administración
intravenosa.
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Ejemplos de polipéptidos LERK-6 solubles incluyen aquellos que comprenden una porción sustancial del dominio
extracelular de una proteína LERK-6 nativa. Un ejemplo de una proteína LERK-6 de minino soluble comprende los
aminoácidos 1-145 de la SEQ II) NO:2. Además, las proteínas LERK-6 solubles truncadas que comprenden menos
que el dominio extracelular completo están incluidas en la invención. Cuando se expresa inicialmente dentro de una
célula huésped, el LERK-6 soluble puede adicionalmente comprender uno de los péptidos de señal heteróloga descritos
adelante que es funcional dentro de la célula huésped empleada. Alternativamente, la proteína puede comprender el
péptido de señal nativa. En una modalidad de la invención, el LERK-6 soluble se puede expresar como una proteína
de fusión que comprende (desde el terminal N al C) el péptido de señal del factor α de levadura, un péptido FTAG®
descrito adelante en la patente U.S. No.5,011,912, y el LERK-6 que consiste de los aminoácidos 1-134 de la SEQ
ID NO:2. Esta proteína de fusión recombinante se expresa en y se secreta de las células de levadura. El péptido
FLAG® facilita la purificación de la proteína, y subsecuentemente se puede clivar del LERK-6 soluble que utiliza
enteroquinasa de mucosa de bovino. Las secuencias de ADN aisladas que codifican las proteínas LERK-6 solubles
están comprendidas por la invención.
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El LERK-6 truncado, que incluye los polipéptidos solubles, se puede preparar mediante cualquiera de un número
de técnicas convencionales. Una secuencia de ADN deseada puede ser químicamente sintetizada utilizando técnicas
conocidas per se. Los fragmentos ADN también se pueden producir mediante digestión de endonucleasa de restricción
de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y aislada mediante electroforesis sobre geles de agarosa. Los
ligadores que contienen el o los sitios de clivaje de endonucleasa de restricción se pueden emplear para insertar
el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o el fragmento se puede digerir en los sitios de clivaje
naturalmente presentes allí. El procedimiento de reacción de cadena de polimerasa bien conocido también se puede
amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Una modalidad alternativa, en
las técnicas de mutagénesis conocidas se puede emplear para insertar un codón de parada en un punto deseado, por
ejemplo inmediatamente corriente abajo del codón para el último aminoácido del dominio de unión de receptor.
Como se estableció anteriormente, la invención suministra polipéptidos LERK-6 aislados u homogéneos, tanto
recombinantes como no recombianantes. Las variantes y los derivados de las proteínas LERK-6 nativas que retienen
la actividad biológica deseada (por ejemplo la capacidad de unirse a hek/elk) se puede obtener mediante mutaciones
de secuencias de nucleótido que codifican para los polipéptidos LERK-6 nativos. Las alteraciones de las secuencias de
aminoácidos nativas se pueden lograr mediante cualquiera de un número de métodos convencionales. Las mutaciones
se pueden introducir en los locus particulares mediante oligonucleótido de sinterización que contienen una secuencia
mutante, flanqueada por sitios de restricción que posibilitan la ligación a los fragmentos de la secuencia nativa. Luego
de la ligación la secuencia reconstruida resultante que codifica un análogo que tiene la inserción del aminoácido
deseado inserción, sustitución o supresión.
Alternativamente, los procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótido se pueden emplear para suministrar un gen alterado en donde los codones predeterminados se pueden alterar mediante sustitución,
supresión o inserción. Los métodos de ejemplo para elaborar las alteraciones establecidas anteriormente se describen
por Walter et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (Bio Techniques, January 1985,12-19);
Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y las patentes U.S. Nos. 4,518,584 y 4,737,462.
El LERK-6 se puede modificar para crear los derivados de LERK-6 al formar conjugados covalentes o agregativos
con otras porciones químicas, tales como los grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados
covalentes del LERK-6 se pueden preparar en las porciones químicas a grupos funcionales sobre las cadenas laterales
de aminoácido LERK-6 o en el N-terminal o C-terminal de un polipéptido LERK-6 o el dominio extracelular de este.
Otros derivados del LERK-6 dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de
LERK-6 o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante
como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo el conjugado puede comprender una señal o secuencia de
polipéptido líder (por ejemplo el líder factor α de Saccharomyces) en el N-terminal de un polipéptido de LERK-6.
y la señal o el péptido líder dirige co-transduccionalmente o post transduccionalmente la transferencia del conjugado
desde su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.
Las fusiones de polipéptido LERK-6 se pueden comprender péptidos agregados para facilitar la purificación he
identificación del LERK-6, tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica
descritos en la patente U.S. No. 5,011,912 y en Hopp et al., Biol Technology 6:1204, 1988.
La invención incluye además los polipéptidos LERK- 6 con glicosilación de patrón nativo asociado. El LERK6 expresado en levadura o en sistemas de expresión de mamífero (por ejemplo células COS-7) puede ser similar a
o significativamente diferente de un polipéptido LERK-6 nativo en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la escogencia del sistema de expresión. La expresión de los polipéptidos LERK-6 en sistemas de expresión
bacterianos, tales como E. coli, suministra moléculas no glicosiladas.
Las construcciones de ADN equivalente que codifica en varias adiciones o sustituciones de residuos o secuencias
de aminoácido, o supresiones de residuos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica o
que se unen están comprendidas por la invención. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular
de LERK-6 se pueden modificar para precluir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidratos
reducido en sistemas de expresión de mamífero y levadura, los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos
se caracterizan por un triplete de aminoácido Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser
o Thr. La proteína LERK-6 de minino comprende tres de tales tripletes, en los aminoácidos 13-15 145-147 y 159-161
de la SEQ ID NO:2. Las sustituciones, adiciones a supresiones apropiadas a la secuencia de nucleótido que codifica
estos tripletes dará como resultado la prevención de la unión del residuo de carbohidratos en la cadena lateral Asn. La
alteración de un nucleótido simple escogido de tal forma que el Asn es reemplazado por un aminoácido diferente, por
ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. En los procedimientos conocidos para inactivar los
sitios de N-glicosilación en proteínas incluye aquellos descritos en la patente U.S. No. 5,071,972 y EP 276,846.
En otro ejemplo, los residuos Cys que codifican secuencias que no son esenciales para la actividad biológica se
pueden alterar para originar que los residuos Cys sean suprimidos o reemplazados con otros aminoácidos, evitando
la formación de puentes de disulfuro intramolecular incorrecto luego de la renaturalización. Otros equivalentes se
preparan mediante la modificación de residuos de aminoácido dibásicos adyacentes para mejorar la expresión en
sistemas de levadura en los cuales está presente la actividad de proteasa KEX2. La EP 212,914 describe el uso de
mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los
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sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 son inactivados al suprimir, agregar o sustituir los residuos para alterar
los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. Los pareados
Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles al clivaje de KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a LysLys representa una aproximación conservadora y preferida para inactivar los sitios KEX2. El LERK-6 de murino
contiene sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en los aminoácidos 81-82 de la SEQ ID NO:2.
Las secuencias de ácido nucleico dentro del alcance de la invención incluyen secuencias de ADN y ARN aislado
que hibridizan las secuencias de nucleótido LERK-6 descritas aquí bajo condiciones de exigencia moderada o severa,
y que codifican el LERK-6 biológicamente activo. Las condiciones de la exigencia moderada, como se define en
Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, (1989), incluye el uso de una solución de prelavado de 5 x SSc, 0.5% de SDS, 1.0 mM de EDTA (pH 8.0)
y las condiciones de hibridización de aproximadamente 55◦ C, 5 x SSc, durante toda la noche. Las condiciones de
exigencia severas incluyen temperaturas más altas de hibridización y lavado. El experto reconocerá que la temperatura
y la concentración de sal de solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo a factores tales como
la longitud de la molécula de ácido nucleico.
Debido a la degeneración conocida del código genético en donde más de un codón puede codificar el mismo
aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de aquella mostrada en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:7 que se
suministra para comparación y aun codificar una proteína LERK-6 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ
ID NO:2 o la SEQ ID NO:8, que se suministra para comparación respectivamente. Tales secuencias de ADN variantes
pueden resultar de mutaciones silentes (por ejemplo que ocurren durante la amplificación PCR), o pueden ser el
producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.
La invención suministra secuencias de ADN aislado equivalentes que codifican el LERK-6 biológicamente activo,
seleccionado de:
(a) el cADN que comprende la secuencia de nucleótido presentada en la SEQ ID NO:1; (b) el ADN capas de
hibridización a un ADN de (a) bajo condiciones moderadamente exigentes y que codifiquen el LERK-6 biológicamente
activo; y (c) el ADN que se degenera como resultado del código genético a un ADN definido en (a) o (b) y que codifica
el LERK-6 biológicamente activo. Las proteínas LERK-6 codificadas por tales secuencias equivalentes de ADN están
comprendidas por la invención. Por comparación, se suministra el cADN que comprende la secuencia de nucleótido
presentada en la SEQ ID NO:7.
Los ADN que son equivalentes a la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:7, que se suministra
para comparación, hibridizará bajo condiciones moderada y severamente exigentes a la secuencia de ADN que codifica
los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácido de 1-184 SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8, que se
suministra para comparación. Ejemplos de las proteínas LERK-6 codificadas por tal ADN, incluyen opero no están
limitadas a, los fragmentos de LERK-6 (solubles de GPI-ligado) y las proteína LERK-6 que comprenden el o los sitios
de N-glicosilación inactivado, el o los sitios de procesamiento de proteasa de KEX2 inactivado, o el o las sustituciones
de aminoácido conservador, como se describió anteriormente. Las proteínas LERK-6 codificadas por el ADN derivado
de otras especies de mamífero en donde el ADN hibridizará el cADN de la SEQ ID NO:1 o el SEQ ID NO:7 están
también comprendidos por las proteínas LERK-6 codificadas por el ADN derivado de otras especies de mamífero, en
donde el ADN hibridizará el cADN de la SEQ ID NO:7 se suministran para comparación.
Las variantes que poseen el requisito de capacidad de unirse al receptor hek/elk se pueden identificar mediante
cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica del LERK-6 se puede determinar, por ejemplo, por la competición
para unir el dominio de unión de ligando del receptor hek/elk (es decir ensayos de unión competitivos).
Un tipo de ensayo de unión competitivo para el polipéptido LERK-6 utiliza un LERK-6 soluble radiomarcado y
una proteína de fusión hck:Fc o elk:Fc unida a una fase sólida a través de la interacción de una proteína A, proteína G
o un anticuerpo al hek, elk o porciones Fc de la molécula, con la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de ensayo
de unión competitivo utiliza receptores hek o elk solubles radiomarcados tales como la proteína de fusión hek:Fc o
elk:Fc, y las células intactas que expresan el LERK-6.
Los ensayos de unión competitiva se pueden desarrollar siguiendo metodología convencional. Por ejemplo, el
LERK-6 radiomarcado se puede utilizar para completar con una homología LERK-6 putativa para ensayar para la
actividad de unión contra el hek/elk unido a superficie. Los resultados cualitativos se pueden obtener mediante ensayos de unión de placa autoradiográfica competitiva o se pueden utilizar gráficas Scatchard para generar resultados
cuantitativos.
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Alternativamente, las proteínas de unión hek/elk, tal como la LERK-6 y los anticuerpos anti-hek/elk, se pueden
unir a una fase sólida tal como una matriz de cromatografia de columna o un sustrato similar adecuado para identificar,
separa o purificar las células que expresan hek/elk sobre su superficie. La unión de una proteína de unión hek/elk a
una superficie de contacto de fase sólida se puede lograr mediante cualquiera medios, por ejemplo, al construir una
proteína de fusión LERK-6:Fc y unir tal a la fase sólida a través de la interacción de la proteína A o proteína G. otros
varios medios para fijar proteínas a una fase sólida son bien conocidos en la técnica y son adecuados para el uso en
la presente invención. Por ejemplo, las microesferas magnéticas se pueden recubrir con LERK-6 y mantener en un
recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezcla de células que contienen las
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células que expresan hek/elk son puestas en contacto con la fase sólida que tiene en los polipéptidos LERK-6 sobre
estos. Las células que tienen hek/elk sobre su superficie se unen al LERK-6 fijo y 1 las células no unidas que luego son
lavadas. Este método de unión de afinidad es útil para purificar, seleccionar y separar tales células que expresan hek/elk
de la solución. Los métodos para liberar las células positivamente seleccionadas de la fase sólida son conocidos en
la técnica y comprenden, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no toxicas y no dañinas
a las células y están preferiblemente dirigidas a clivar el compañero de unión de superficie celular. En el caso de las
interacciones hek/elk:LERK-6, la enzima preferiblemente se clivaria del receptor hek/elk, liberando de esta manera
la suspensión de célula resultante del material LERK-6 “extraño”. La población de célula purificada, especialmente
si se obtiene de tejido fetal, puede luego ser utilizada para repopular (adulto). Por ejemplo, tales células neuronales
purificadas se pueden administrar a un paciente que tiene un desorden neurodegenerativo tal como la enfermedad de
Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Lou Gehrig, etc.
Alternativamente, las mezclas de células que se sospechan que contienen células hek/elk+ pueden ser primero
incubadas con LERK-6 biotinilado. Los periodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración
para asegurar la unión suficiente al hek/elk. La mezcla resultante es entonces pasada a través de una columna empacada
de glóbulos recubiertos con avidina, por medio de los cuales la alta afinidad de biotina para la avidina suministra la
unión de las células a los glóbulos. El uso de glóbulos recubiertos con avidina es conocido en la técnica. Ver Berenson,
et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado de material no unido y la liberación de las células unidas se
desarrolla utilizando métodos convencionales.
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Como se describió anteriormente el LERK-6 se puede utilizar para separar células que expresan hek/elk. En un
método alternativo, el LERK-6 o un dominio extracelular o un fragmento de este se puede conjugar a una porción
detectable tal como 125 I para detectar lasa células que expresan hek/elk. El radiomarcado con 125 I se puede desarrollar
mediante varias metodologías estándar que producen una molécula 125 I-LERK-6 funcional marcada para alta actividad
específica o un cuerpo yodinado o biotinilado contra la región hek/elk o la región Fc de la molécula se puede utilizar
otra porción detectable tal como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorimétrica, biotina
a avidina. Las células pueden ser ensayadas para expresión hek/elk que se pueden contactar con LERK-6 marcado.
Después de la incubación, el LERK-6 marcado no unido se remueve y la unión se mide utilizando la porción detectable.
Las características de unión del LERK-6 (que incluyen variantes) también se pueden determinar utilizando el
hek/elk soluble conjugado (por ejemplo, 125 I- hek/elk:Fc) en ensayos de competición similares a aquellos descritos
anteriormente. En este caso, sin embargo, las células intactas que expresan hek/elk unidas a un sustrato sólido, son
utilizadas para medir la extensión en la cual una muestra que contiene una variante LERK-6 compite por unión con un
hek/elk soluble conjugado a LERK-6.
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Otros medios para ensayar el LERK-6 incluyen el uso de anticuerpos anti-LERK-6, líneas celulares que proliferan
en respuesta al LERK-6 o líneas de células recombinantes que expresan hek/elk y proliferan en presencia de LERK-6.
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Las proteínas LERK-6 descritas aquí también se pueden emplear para medir la actividad biológica de las proteínas
hek/elk en términos de su afinidad de unión para el LERK-6. Como un ejemplo, el LERK-6 se puede utilizar para
determinar si la actividad biológica se retiene después de la modificación de una proteína hek o elk (por ejemplo la
modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La actividad biológica de una proteína hek o elk se puede así
precisar antes que esta sea utilizada en estudios de investigación, o posiblemente en la clínica, por ejemplo.
Las proteínas LERK-6 encuentran uso como reactivos que se pueden emplear por aquellos que conducen estudios
de “aseguramiento de calidad”, por ejemplo monitorear la vida de estante y la estabilidad de la proteína elk bajo
diferentes condiciones. Para ilustrar, el LERK-6 se puede emplear en un estudio de afinidad de unión para medir la
actividad biológica de una proteína elk que ha sido almacenada a diferentes temperaturas, o producida en diferentes
tipos de célula. La afinidad de unión de la proteína elk modificad para LERK-6 se compara con aquella de una proteína
elk no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones sobre la actividad biológica del elk.
De manera similar, la actividad biológica de la proteína hek se puede evaluar utilizando LERK-6.
Los polipéptidos LERK-6 también encuentran uso como vehículos para suministrar agentes unidos a este a células
que llevan el receptor de superficie de célula hek o elk. La expresión del antígeno hek ha sido reportada para ciertas
líneas de célula leucémica, que incluyen la línea de célula de leucemia de célula T humana designada JM y la línea de
célula de leucemia de célula pre-B humana designada LK63 (Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992 and Wicks et
al., Proc Nati. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992). Las proteínas LERK-6 se pueden así utilizar para suministrar agentes
de diagnóstico o terapéutico a estas células (o a otros tipos de célula encontrados que expresan hek sobre la superficie
de la célula) o en procedimientos in vitro o in vivo.
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Un ejemplo de tal uso es exponer un alinea de célula leucémica hek+ o elk+ a un agente terapéutico/conjugado de
LERK-6 para evaluar si el agente exhibe citotoxicidad hacia las células leucémicas. Un número de diferentes agentes
terapéuticos unidos al LERK-6 puede ser incluido en un ensayo para detectar y comparar el efecto citotóxico de
los agentes sobre las células leucémicas. Los conjugados de LERK-6 agente de diagnóstico se pueden emplear para
detectar la presencia de células hek+ in vitro o in vivo.
Los agentes de diagnóstico y terapéuticos que se pueden unir al polipéptido LERK-6 incluyen pero no están
limitados a, drogas, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catolizan una reacción colorimétrica y fluorimé7
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trica, y similares, con el agente particular siendo escogido de acuerdo a la aplicación pretendida. Ejemplos de drogas
que incluyen aquellas utilizadas para tratar varias formas de cáncer, por ejemplo, mostazas de nitrógeno tales como
mostaza de nitrógeno de L-fenilalanina o ciclofosfamida, agentes intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino,
antimetabolitos tales como 5-florouacit, alcaloides vinca tales como vincristina y antibióticos tales como bleomicina,
doxorubicina, daunorubicina, y derivados de estos. Entre las toxinas están la ricina, abrina y toxina de difteria, La
exotoxina A de P Pseudomonas aeruginosa, las proteínas de inactivación ribosomal, las micotoxinas tales como trichotecenes y derivados y fragmentos (por ejemplo cadenas simples) de estas. Los radionúclidos adecuados para uso
diagnóstico incluyen, pero no están limitados a, 123 I, 131 I, 99m Tc, 111 In, y 76 Br. Los radionúclidos adecuados para uso
terapéutico incluyen, pero no están limitados a, 131 I, 211 At, 77 Br, 186 Re, 188 Re, 212 Pb, 212 Bi, 109 Pd, 64 Cu, y 67 Cu.
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Tales agentes se pueden unir al LERK-6 mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. El LERK-6,
que es una proteína, comprende grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácido que se pueden hacer reaccionar con grupos funcionales sobre un agente deseado para formar uniones covalentes, por ejemplo, alternativamente,
la proteína o el agente se puede derivar para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatisación
puede involucrar la unión de uno de los reactivos acoplantes bifuncionales disponible para unir varias moléculas a
proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Un número de técnicas para proteínas de radiomercado son
conocidas. Los metales de radionúclidos se pueden unir a LERK-6 al utilizar un agente bifuncional adecuado, por
ejemplo.
Los conjugados que comprenden el LERK-6 y un agente de diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente
ligado covalente mente) son así preparados. Los conjugados se administran o se emplean de otra forma en una cantidad
apropiada para la aplicación particular.
Otro uso del LERK-6 de la presente invención es como herramienta de investigación para estudiar el papel del
LERK-6, en conjunto con el hek o elk puede jugar en el crecimiento o diferenciación de las células que llevan el
receptor a hek o elk. Los polipéptidos LERK-6 de la presente invención también se pueden emplear en ensayos in
vitro para la detección de elk o LERK-6 sobre las interacciones de este. De manera similar, el LERK-6 encuentra uso
en ensayos para hek o la interacción de LERK-6 con hek.
Como se discutió anteriormente, cuando varios tejidos de rata fueron analizados para los transcritos elk mARN se
detectaron solamente en cerebro y testículos (Lhotak et al., supra). La unión del LERK-6 a los receptores relacionados
con eph sobre tejido neuronal se cree que ejerce un efecto neuroprotector o neurotrófico.
El LERK-6 encuentra uso como reactivo de cultivo de tejido. En la proteína LERK-6 se puede agregar a neuronas
cultivadas in vitro para mejorar la viabilidad o prolongar el espectro de vida de neuronas cultivadas, facilitando así los
estudios de investigación, y el posible tratamiento clínico del tejido neuronal.
Una modalidad de la presente invención esta dirigida a un método para tratar desordenes del tejido neuronal, que
involucra poner en contacto el tejido neuronal con LERK-6. Tales desordenes incluyen daño o enfermedades neurológicas, crónicas o agudas. Una proteína LERK-6 se puede administrar a un mamífero para tratar tal daño o enfermedad.
En una modalidad de la invención, el LERK-6 se emplea para tratar condiciones neurodegenerativas caracterizadas o
mediadas, al menos en parte, por el mecanismo de la enfermedad neuronal conocido como excitotoxicidad. Además.
El LERK-6 se puede administrar a un mamífero para ejercer un efecto trópico sobre la enfermedad neuronal. En un
paciente que sufre perdida o daño de neuronas debido al daño o enfermedad, el LERK-6 puede mejorar la viabilidad
de aquellas neuronas que han sobrevivido.
Los polipéptidos LERK-6 de la invención se pueden formular de acuerdo a métodos conocidos utilizados para
preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El LERK-6 se puede combinar en mezcla, como el material activo
solo o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo Tris-Hcl,
acetato, fosfato), preservativos (por ejemplo timerosal, benzil alcohol, parabenos), emulsificadores, solubilizadores,
adyuvantes y/o vehículos. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington’s Pharmaceutical
Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co. Además, tales composiciones pueden contener LERK-6 en complejo
con polietilenglicol (PEG), iones de metal, o incorporado en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético,
ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o incorporado en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares
o multi lamelares, fantasmas de eritrocito o esferoblastos. Tales composiciones influenciaran el estado físico, la solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo, y la tasa de limpieza in vivo del LERK-6. El LERK-6 también se
puede conjugar a anticuerpos contra receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos, o acoplado a ligandos de
los receptores específicos de tejido. Donde se encuentra el hek/elk sobre las células neoplásicas, el LERK-6 se puede
conjugar a una toxina por medio de la cual el LERK-6 se utiliza para suministrar la toxina al sitio especifico, o se
puede utilizar para sensibilizar tales células neoplásicas para subsecuentemente administrar agentes antineoplásicos.
El LERK-6 se puede administrar tópicamente, parenteralmente, o mediante inhalación. El término “parenteral”
incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intracisternal o técnicas de infusión. Estas
Composiciones contendrán típicamente una cantidad efectiva del LERK-6, sola o en combinación con una cantidad
efectiva de cualquier otro material activo. Tales dosis y concentraciones de drogas deseadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, que incluyen el uso pretendido, el peso del cuerpo del paciente
y la edad, y la ruta de administración. Las dosis preliminares se pueden determinar de acuerdo a ensayos en animales,
y el escalamiento de las dosis para administración en humanos se puede desarrollar a prácticas aceptadas.
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Los polipéptidos LERK-6 pueden existir como oligómeros tales como dímeros o trímeros covalentemente ligados
o no covalentemente ligados. Los oligómeros se pueden ligar mediante enlaces de disulfuro formados entre residuos
de cisteína sobre diferentes polipéptidos LERK-6. en una modalidad de la invención, un dímero LERK-6 se crea al
fusionar el LERK-6 a la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo IgGI) de manera que no interfiera con la unión LERK6 a 1 dominio de unión de ligando hek/elk. Los polipéptidos Fc preferiblemente se fusionan al C-terminal de un LERK6 soluble (que comprende solamente una unión de receptor). La preparación general de las proteínas de fusión que
comprenden los polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de los polipéptidos derivados de anticuerpo
(que incluye el dominio Fc), se incorporan aquí como referencia Ashkenazi et al., (PNAS USA 88:10535, 1991) y
Byrn et al. (Nature 344:677, 1990). Una fusión de gen que codifica la proteína de fusión LERK-6:FC se inserta en un
vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión LERK-6:Fc se les permite ensamblarse más como moléculas
de anticuerpo, por medio de la cual se forman las uniones disulfuro intercadena entre los polipéptidos Fc, produciendo
LERK-6 divalente si las proteínas de fusiones hacen tanto con cadenas pesadas como ligera de un anticuerpo, es
posible formar un oligómero LERK-6 con tanto como cuatro regiones extracelulares LERK-6. Alternativamente, uno
puede enlazar dos dominios LERK-6 solubles con un ligador de péptido.
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Las células huéspedes adecuadas para la expresión de los polipéptidos LERK-6 incluyen procariotes, levaduras o
células eucarióticas superiores. La clonación apropiada y los factores de expresión para uso con bacterias, hongos,
levaduras y huéspedes celulares de mamífero son descritos, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Los sistemas de traducción de célula libre también se podrían emplear
para producir los polipéptidos LERK-6 utilizando los ARN derivados de las construcciones de ADN descritas aquí.
Los procariotes incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células
huéspedes procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis. La Psahnonella typhimurium, y varias otras especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una
célula huésped procariótica tal como la E. coli, un polipéptido LERK-6 puede incluir un residuo de metionina Nterminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. El Met N-terminal
se puede clivar desde el polipéptido LERK-6 recombinante expresado.
Los polipéptidos LERK-6 se pueden expresar en células huéspedes de levadura preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo S. cerevisiae). Otros géneros de levadura, tal como Pichia, K. lactis o Kluiberomyces, también se
pueden emplear. Los vectores de levadura contendrán a menudo un origen de secuencia de replicación de un plásmido
de levadura de 2 µ, una secuencia autónomamente replicante (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de transcripción, y un gen marcador
seleccionable. Las frecuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980), u otras enzimas
glicolíticas (Hess et al., J. Adv.Enzyme Red. 7:149, 1968); y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, y glucosa-6
fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutara, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura son adicionalmente descritos en
Hitzeman, EPA-73,657 O EN Fleer et al., Gene, 107:258-195 (1991); y van den Berg et al., Biol Technology, 8:135139 (1990). Otra alternativa es el promotor ADH2 expresable en glucosa descrito por Russsell et al., (J. Biol. Chem.
258:2674, 1982) y Beber et al., (Nature 300:724, 1992). Los vectores de lanzadera replicables tanto en levaduras como
en E. Coli se pueden construir al insertar las secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. Coli
(el gen Ampr y el origen de replicación) en los vectores de levadura anteriormente descritos.
Una secuencia líder factor α de levadura se puede emplear para dirigir la secreción del polipéptido LERK-6. La
secuencia líder del factor α es a menudo insertada entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Ver,
por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; U. S. Patent 4,
546,082; y EP 324,274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de los polipéptidos recombinantes
de huéspedes de levadura son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Una secuencia líder se puede modificar
cerca de s extremo 3’ para contener uno más sitios de restricción. Esto facilitará la función de la secuencia líder al gen
estructural.
Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Uno de tales
protocolos se describe en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo Hinnen et al selecciona
para transformar Trp+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de base de nitrógeno de
levadura, 0.5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 µg/ml de adenina y 20 µg/ml de uracilo.
Las células huésped de levadura transformadas mediante vectores que contienen la secuencia promotora ADH2 se
puede hacer crecer para inducir la expresión en un medio “rico”. Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de
1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementada con 80 µg/ml de adenina y 80 µg/ml de
uracilo. La depresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio.
Los sistemas de cultivo de célula huésped de mamífero o insecto también se podrían emplear para expresar polipéptidos LERK-6 recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células
de insectos son revisados por Luckow y Sunimers. Biol Technology 6:47 (1988). Las líneas celulares establecidas de
origen mamífero también se pueden emplear. Ejemplo de lineas cellares huéspedes de mamífero adecuadas incluyen
la línea COS-7 de callos de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), Las células L,
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las células C 127, las células 3T3 (ATCC CCL 163). Las células de ovario de conejillo de indias (CHO). Las células
HeLa, y las líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV-1/EBNA-1 derivadas de la línea celular de
riñón de mono verde Africano CVI (ATCC CCL 70) como se describió en McMahan et al (EMBO J. 10:2821, 1991).
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Las secuencias de control transcripcionales y transduccionales para los vectores de expresión de células huésped de
mamífero se pueden escindir de genomas virales. Las secuencias promotoras comúnmente utilizadas y las secuencias
mejoradoras se derivan del virus Polioma. El adenovirus 2, el virus de Simio 40 (SV 40), y el citomegalovirus humano.
Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SD 40, por ejemplo, de origen SV 40, el promotor temprano y
tardío mejorador, empalme, y sitios de poliadenilación se pueden utilizar para suministrar otros elementos genéticos
para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores tempranos y
tardíos virales son particularmente útiles por que ambos son fácilmente obtenidos del genoma viral como un fragmento
el cual también puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al, Nature 273:113, 1978). Los fragmentos SV
40 más grandes o más pequeños también se pueden utilizar, siempre y cuando la secuencia de aproximadamente 250
Bp que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl 1 localizado en el origen viral SV 40 del sitio de replicación
se incluya.
Los vectores de expresión de ejemplo para uso en células huésped de mamífero se pueden construir como se
describió por Okayama y Berg (Mol, Cell. Biol. 3:280, 1.983). Un sistema útil para el alto nivel de expresión estable
de cADN de mamífero en células epiteliales de mamífero de murino C127 se pueden construir sustancialmente como
se describió en Cosman et al., (Mol Immunol. 23:935, 1986). Un vector de expresión alto. PMLSV N1 /N4, descrito por
Cosman et al, Nature 312:768, 1984 ha sido depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero
útiles adicionales se describen en la EP-A-0367566, y en la solicitud de Patente U.S. Serie No. 07/701.415. Presentada
en Mayo 16, 1991. Los vectores se pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia de señal nativa, y además de
un iniciador metionina, una secuencia de señal heteróloga se puede agregar, tal como la secuencia de señal para el IL-7
descrito en la Patente de los Estados Unidos 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor IL-2 descrita en Cosman
et al; Nature 312: 768 (1984); El péptido de señal IL-4 descrito en la EP367, 566; el péptido de señal de receptor IL-2
tipo 1 descrito en la Patente U.S. 4,968,607; y el péptido de señal de receptor IL-1 tipo 2 descrita en la EP 460,846.
El LERK-6 como una proteína aislada, purificada u homogénea de acuerdo con la invención se puede producir
mediante sistemas de expresión recombinantes como se describieron anteriormente o se purificaron de las células de
ocurrencia natural. El LERK-6 se puede purificar hasta homogeneidad sustancial, como se indica mediante una banda
de proteína simple luego de análisis mediante electroforesis de gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).
Un proceso para producir LERK-6 comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica el LERK-6 bajo condiciones suficientes para promover la
expresión del LERK-6. El LERK-6 es luego recuperado del medio de cultivo por los extractos de célula., dependiendo
del sistema de expresión empleado. Como es conocido para el experto, los procedimientos para purificar una proteína
recombinante variaran de acuerdo a tales factores como el tipo de células huéspedes empleadas y si o no la proteína
recombínate se secreta en el medio de cultivo.
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Por ejemplo, cuando los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante se emplea, el medio de
cultivo primero se puede concentrar utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por
ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Luego de la etapa de concentración, el concentrado
se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, luego de la
etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración
de gel. Alternativamente, una resina de intercambio de anión se puede emplear, por ejemplo, una matriz o sustrato
que tiene grupos dietilaminoetil pendientes (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa
u otros tipos comúnmente moleados en purificación de proteína. Alternativamente, la etapa de intercambio de catión
puede ser empleada. Los intercambiadores de catión adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden
los grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son los preferidos. Finalmente, una o más etapas de
cromatografia líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean los medios RP-HPLC hidrófobos,
(por ejemplo gel de sílice que tiene los grupos etilo u otros grupos alifáticos pendientes) se pueden emplear para
purificar adicionalmente el LERK-6. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones,
son bien conocidas y se pueden emplear para suministrar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.
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Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión de ligando de los receptores
hek/elk para purificar con afinidad los polipéptidos LERK-6 expresados. Los polipéptidos LERK-6 se pueden remover
de una columna de afinidad que utiliza técnicas convencionales, por ejemplo, en un amortiguador de elusión alta en
sal y luego dializar en un amortiguador más bajo en sal o al cambiar el pH u otros componentes dependiendo de la
matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la curva de afinidad puede comprender un anticuerpo que se une al
LERK-6. El ejemplo 5 describe un procedimiento para emplear el LERK-6 de la invención para generar anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el LERK-6.
La proteína recombinante producida en cultivo bacterial se puede aislar mediante disrupción inicial de las células
huéspedes, centrifugación, extracción de los lóbulos de célula si el es un polipéptido insoluble o de el fluido sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido por una o más etapas de concentración, salteado, intercambio de ión,
purificación de afinidad o cromatografia de descripción de tamaño. Finamente, el R y el HPLC se pueden emplear
para las etapas de purificación final. Las células microbianas pueden ser irrumpidas por un método conveniente, que
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incluye el ciclo de congelado- descongelado, sonicación, irrupción mecánica, o el uso de agentes lisantes de célula.
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Las células huésped de levadura transformada son preferiblemente empleadas para expresar el LERK-6 como un
polipéptido secretado con el fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de célula huésped de levadura se puede purificar mediante métodos análogos a aquellos descritos por Urdal
et al., (J. Choromatog. 296:171, 1984). Urdal et al, describe dos etapas de HPLC de fase inversa secuencial para la
purificación del IL-2 humano recombinante sobre una columna de HPLC preparativa.
De los ácidos nucleicos del LERK-6 incluyen oligonucleótidos anti sentido o con sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra simple (ARN o ADN) capaz de unirse al mARn del LERK-6 blanco) o con sentido
las secuencias de LERK-6 (anti sentido). Los oligonucleótidos con sentido o anti sentido, de acuerdo con la presente
invención, comprenden un fragmento de la región codificante del cADN de LERK-6. Tal fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente desde aproximadamente 14 a aproximadamente
30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido anti sentido o con sentido, con base en la secuencia de
ADN que codifica una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein and Cohen (Cáncer Res. 48:2659). Y van der
Krol et al (Bio Technique 6:958. 1988).
La unión de los oligonucleótidos anti sentido o con sentido a las secuencias de ácido nucleico blanco dan como resultado la formación de duplex que bloquean la trascripción o traducción de la secuencia blanco mediante uno o varios
medios que incluyen la degradación mejorada de los duplex, la terminación prematura de la trascripción o traducción
o mediante otros medios. Los oligonucleótidos anti sentido pueden ser así utilizados para bloquear la expresión de
las proteínas LERK-6. Los oligonucleótidos anti sentido o con sentido comprenden además oligonucleótidos que han
modificado las estructuras de azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellas descritas en la WO
91/06629) y en donde los enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistente son estables in vivo (es decir capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la
especificidad de la secuencia para ser capaz de unirse a secuencias de nucleótido blanco. Otros ejemplos de oligonucleótidos con sentido o anti sentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están covalentemente ligados a cuestiones
orgánicas, tales como aquellas descritas en la WO 90/10448, y otras porciones que incrementan la afinidad de los
oligonucleótidos para la secuencia de ácido nucleico blanco, tal como poli-(L-lisina). Aún adicionalmente, los agentes
intercalantes, tales como la elipticina y los agentes alquilatantes o los complejos de metal se pueden unir a oligonucleótidos con sentido o anti sentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido anti sentido o con
sentido para la secuencia de nucleótido blanco.
Los oligonucleótidos anti sentido o con sentido se pueden introducir en una célula que contiene una secuencia de
ácido nucleico o blanco mediante cualquier método de transferencia de gen, que incluye, por ejemplo, transfección
de ADN mediada por CaPo4 , electroporación, o al utilizar vectores de transferencia de gen tales como los virus de
Epstein-Barr. Los oligonucleótidos anti sentido o con sentido son preferiblemente introducidos en una célula que
contiene la secuencia de ácido nucleico blanco mediante la inserción del oligonucleótido anti sentido o con sentido
en un vector de retroviral adecuado, poniendo en contacto entonces la célula con el vector retroviral que contiene la
frecuencia insertada, in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos
derivados del retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble
designados DCT5, DCT5B, y DCT5C (ver solicitud presente US 90/02656).
50
Los oligonucleótidos con sentido o anti sentido también se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de nucleótido blanco mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión de ligando, como se
describe en la WO 91/04753. Las moléculas de unión de ligando adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de superficie celular, receptores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de
superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula que se une al ligando no interfiere sustancialmente
con la capacidad de la molécula que se une al ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquea
la entrada del oligonucleótido con sentido o anti sentido a su versión conjugada en las célula.
55
Alternativamente, un oligonucleótido con sentido o contrasentido se puede introducir en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico blanco mediante la formulación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describió
en la WO 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido con sentido o anti sentido está preferiblemente asociado dentro
de la célula por una lipasa endógena.
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Además de lo anterior, los siguientes ejemplos se suministran para ilustrar las modalidades particulares y no limitar
el alcance de la invención.
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Ejemplo 1
Clonación del cADN de LERK-6 de Murino
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Este ejemplo describe un procedimiento para aislar la secuencia de ADN que codifica el LERK-6 de murino
de la invención. Una librería de cADN embriónica de murino de 11.5 días comercialmente disponible se obtuvo de
Clonetech Laboratories, Inc, Palo Alto. California. La librería se plateo de acuerdo a los procedimientos detallados
en el manual suministrado por Clonetech, y se seleccionaron utilizando las sondas radiomarcadas con 32 P. Cada una
de las sondas fue generada utilizando técnicas estándar. En general, las amplificaciones de la reacción de cadena de
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polimerasa (PCR) (Mullis and Faloona, Meth. Enzymol. 155:333-350, 1987) se desarrollaron utilizando dos conjuntos
de anunciadores.
El primer conjunto.
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GATATTTACTGCCCGCACTACAACAGCT
AGAGAAGGCGCTGTAGCGCT GGAAC
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SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
Se utilizaron para generar fragmentos de ADN de hebra doble amplificados del ADN del LERK-3. El LERK-3 es
el sujeto de la solicitud de patente copendiente series Serial Nos. 08/109, 745; 08/114,426; 08/161, 132 y 08/240,124
presentada en Mayo 9, 1994. La sonda del LERK-3 comprendía los nucleótidos 260 a 481 de la SEQ ID NO: de la
solicitud copendiente Serie no. 08/240, 124 presentada en Mayo 9, 1994. El segundo conjunto de iniciadores,
ACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCCA G
AGCCTCAAGCACTGGCCAGAACTCTCTCTGGAGT
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
Se utilizaron para generar fragmentos de ADN de hebra doble amplificados del ADN del LERK-4. El LERK-4
también es el sujeto de la solicitud de patente copendiente Seriales No. 08/104,745; 08/114, 426 y 08/161,132 y 08/24,
124 presentada en Mayo 9, 1994. La sonda de LERK-3 comprendida los nucleótidos 110 a 467 de la SEQ ID NO:3
de la solicitud copendiente Serie NO. 08/240, 124 presentada en Mayo 9, 1994. Los fragmentos fueron radiomarcados
con 32 P, y utilizados con sondas para seleccionar una librería embriónica de murino.
La selección con las sondas fue conducida mediante procedimientos convencionales, y fueron identificados los
clones hibridizantes. Las condiciones hibridizantes consistieron de 42◦ C Y 50% DE Starks lavado a 0.1 X SSC a
63◦ C. La secuencia de nucleótido del inserto de cADN de un clon individual aislado de la librería embriónica de
murino, el clon designado λ 13, fue determinada. Una secuencia de cADN sustancialmente completa de la región
codificante del clon λ 13 cADN, y la secuencia de aminoácido codificada de esta manera, se presenta en la SEQ ID
NO:1 en la SEQ ID NO:2, respectivamente. La estructura de lectura abierta dentro de esta secuencia codifica una
proteína de 184 aminoácidos. En razón a que el N-terminal de las proteínas de la familia LERK son no homólogos,
se cree que el primer aminoácido de la SEQ ID NO:1 (Ala) se localiza en o muy cerca al terminal N nativo. Además,
en razón a que el LERK-6 de esta invención es homólogo con otras moléculas LERK biológicamente activas, existe
una probabilidad significativa de que el cADN de la SEQ ID NO:1 codifique una proteína biológicamente activa. La
secreción de tal proteína activa es posible a través del procedimiento descrito anteriormente con respecto a la adición
de una metionina iniciadora y una secuencia de señal adecuada tal como aquella para el murino IL-7, la secuencia de
aminoácido de LERK-6 es 58% homóloga con aquella de la citoquina denominada Lerk-3.
Un clon que contiene lisado de célula λ 13 ADN (El cADN LBRK-6 en λ gt10) se depositó con el American Type
Culture Colecction, Rockville. MD. USA en Junio 15, 1994, y se le asignó el número de acceso aATCC 75829. El
depósito fue hecho bajo los términos del tratado de Budapest.
Ejemplo Comparativo 2
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Clonación de LERK-6 humano
Este ejemplo describe la clonación de ácidos nucleicos que codifican LERK-6 humano. La secuencia de LERK-6
humano es de un clon genómico aislado al sondear una librería genómica humana con una sonda de cADN de LERK6 DE murino que codifica los aminoácidos 30-173. La placa que contiene los filtros fue hibridizada a una sonda
marcada con 32 P a 55◦ C durante 24 h. lavada a 0.5 x SSC a 55◦ C, y expuesta a una película de rayos X (Kodak XAR5). Una secuencia de ácidos nucleicos contenidos en tal clon se muestra adelante. También en la SEQ ID NO:7, y los
aminoácidos codificados de esta manera se muestran en la SEQ ID NO:8.
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Comparado con el LERK-6 de murino, el LERK-6 DE HUMANO POSEE 98.77 similitudes porcentuales y 93.269
identidades porcentuales.
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Ejemplo 3
Preparación de la Proteína de Fusión elk:Fc Soluble
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45
Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión elk-Fc soluble.
Esta proteína de fusión se puede emplear en los ensayos de unión del ejemplo 5, para determinar las características de
unión del LERK-6.
Un ADN y ka secuencia de aminoácido codificada para el cADN elk de rata se presenta en Lhotak et al. (Mol.
Cell. Biol. 11:2496, 1991), incorporada aquí como referencia.
La proteína elk de rata tiene un dominio extracelular de 538 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 25
aminoácidos, y un dominio citoplasmático de 419 aminoácidos.
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Un fragmento de cADN elk de rata se fusionó al extremo 5 del cADN que codifica la porción Fc de un anticuerpo
IgG1 humano. El cADN elk de rata puede ser obtenido de T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute. Mt. Sinai.
Hospital, Toronto). Un sitio de clivaje de de endonucleasa de restricción Asp 718-se introdujo corriente arriba de la
región codificante elk. Se aisla un fragmento Asp 718-BgIII CADN elk de rata (que comprende el dominio extracelular
completo, la región de transmembrana y la porción pequeña del dominio citoplasmático).
El ADN que codifica la cadena de polipéptido simple que comprende la región Fc del anticuerpo IgG1 humano
se clona en el sitio SpeI del vector pBLUESCRIPT sk®, que está comercialmente disponible de Stratagene Cloning
System, La Jolla, California. El vector de plásmido es replicable en E. Coli y contiene un segmento poliligador que
incluye 21 sitio de restricción únicos. La secuencia de nucleótido del ADN clonado, junto con la secuencia de aminoácido del polipéptido Fc codificado de ésta manera, se describe en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporado
aquí como referencia. Un sitio BglII ha sido introducido, y comprende los codones para los aminoácidos 3 y 4 del
polipéptido Fc. El polipéptido Fc codificado se extiende desde la región de pivoteo N-terminal al C-terminal activo, es
decir, en una región Fc de anticuerpo de longitud esencialmente completa.
El fragmento de cADN Asp718- BglII elk descrito anteriormente se clonó en un vector pBLUESCRIPT sk® que
contiene el Fc cADN, de tal forma que el cADN del elk se ubica corriente arriba del cADN del Fc cADN. El ADN
de hebra simple derivado de la fusión de gen resultante se mutagenizó mediante el método descrito en Kunkel (Proc.
Natl. Sci. USA 82:488) y Kunkel et al (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) con el fin de fusionar perfectamente
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el dominio extracelular completo de elk a la secuencia Fc. El ADN mutagenizado se secuenció para confirmar que
los propios nucleótidos habían sido removidos (es decir que la región de transmembrana y el dominio citoplasmático
parcial fueron suprimidos) y que la secuencia elk y Fc estuvieron en la misma estructura de lectura.
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La proteína de fusión elk:Fc preferiblemente se sintetiza en células huésped de mamífero, tales como las células
CVI-EBNA o COS-7. La fusión de gen elk:Fc se escindió e insertó en un vector de expresión de mamífero designado
HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142:4314, 1989). Las células huésped de mamífero fueron transfectadas con el
vector de expresión recombinante resultante y cultivadas ara permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión,
que se secretó en el medio de cultivo por vía del péptido de señal elk La proteína de fusión elk:Fc se purificó mediante
cromatografia de afinidad utilizando una columna de sefarosa de proteína A.
Ejemplo 4
Preparación de la proteína de fusión hek:Fc Soluble
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Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión hek-Fc soluble.
Esta proteína de fusión se puede emplear en los ensayos de unión del Ejemplo 5 para determinar las características de
unión de LERK-6.
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Un ADN y una secuencia de aminoácido codificada para cADN de hek humano se presenta en Wicks et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611 (1992), incorporada aquí como referencia. Esta proteína hek comprende (desde el
terminal N al c) un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, y un dominio citoplasmático.
Dos fragmentos de ADN, uno que codifica un fragmento n-terminal del dominio extracelular hek y el otro que
codifica un fragmento C-terminal del dominio extracelular hek, fueron aislados mediante reacciones de cadena de
polimerasa (PCR) conocidas bajo condiciones estándar, utilizando los iniciadores de oligonucleótido con base en la
secuencia de nucleótido hek publicada por Wicks et al, supra. El molde para el PCR fue el cADN preparado del
mARN aislado de una línea celular leucémica de célula T humana designada CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1). Los
productos PCR que contienen el extremo 5’ del ADN fueron digeridos con Sp1 y HindIII para aislar el fragmento de
ADN que se extiende desde el terminal 5’ de la secuencia hek humana madura (es decir a la que le faltan el ADN
que codifica la secuencia de señal) al sitio HindIII encontrado en el gen hek. Los productos PCR que contienen el
extremo 3’ del ADN de dominio extracelular hek fueron digeridos con HindIII y CalI para aislar un fragmento que se
extiende desde el sitio HindIII interno al sitio ClaI justo corriente abajo del extremo 3’ de la secuencia que codifica el
dominio extracelular. El sitio ClaI es un sitio de clonación múltiple (mes) introducido justo corriente abajo del dominio
extracelular.
El ADN que codifica una muteina de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano se aisló. Este ADN de muteina
Fc y el polipéptido codificado de esta manera se describen en la solicitud de Patente U.S. Serie No. 08/09, 827,
titulada “Novel Citoquin Vich is ligand for OX 40” presentada en Julio 23, 1993, cuya solicitud se incorpora aquí
como referencia. El ADN de luteína se derivó de un ADN que codifica el polipéptido Fc nativo mediante mutagénesis
dirigida de sitio conducida esencialmente como se describió por Deng y Nickoloff, Anal, Biochem. 200:81 (1992). La
secuencia de aminoácido del polipéptido de muteina FC es idéntica a aquella del polipéptido Fc nativo descrita en la
solicitud PCT WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido
cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. Esta muteina FC exhibe afinidad reducida
por los receptores de inmunoglobulina.
Un vector recombinante que contiene el ADN de muteina Fc fue clivado con ClaI y NotI, el cual clivó el vector
en una región poliligadora inmediatamente corriente arriba y corriente abajo respectivamente, del inserto de ADN de
muteina Fc. El fragmento que codifica la muteina Fc deseada se aisló.
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El polipéptido Fc de muteina se extiende desde la región de pivoteo N-terminal al terminal C nativo, es decir,
es una región Fc de anticuerpo longitud esencialmente completa. Los fragmentos de las Fc, por ejemplo, aquellos
que son truncados en el extremo C-terminal, también se pueden emplear. Los fragmentos preferiblemente contienen
residuos de cisteína múltiple (al menos los residuos de cisteína en la región de pivoteo) para permitir a los enlaces
disulfuro de inter cadena formarse entre las porciones de polipéptido Fc de las dos proteínas de fusión hek:Fc, creando
dímeros.
Un vector de expresión de mamífero designado SMAG4 se clivó con SpeI y NotI. El vector SMAG4 comprende
una secuencia que codifica al péptido de señal 7 de interleuquina de murino (descrito en la patente U.S. 4,965,195)
insertado en el vector de expresión alto de mamífero pDC 201 (descrito en Sims et al. Science 241:585, 1988, y la
solicitud PCT WO 89/03884), que también es capaz de replicación de E. Coli. El SpeI oliva el vector inmediatamente
corriente abajo de las secuencias que codifica el péptido de señal IL-7. El NotI oliva aproximadamente 155 bp corriente
abajo del sitio SpeI un sitio de clonación múltiple del vector. El fragmentó SpeI/NotI largo que contiene las secuencias
del vector y el ADN que codifica el péptido de señal IL-7 se aisló.
65
Una ligación de 4 días se condujo al insertar los dos fragmentos de ADN que codifican el hek y el fragmento
de ADN que codifica la muteina Fc descrita anteriormente en el vector de expresión SMAG4 clivado SpeI/NotI. Las
células de E. Coli fueron transfectadas con una mezcla de ligación y el vector recombinante deseado s aisló de éste.
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El vector aislado codifica una proteína de fusión que comprende (desde el Terminal N al C) del péptido de señal IL-7
de murino, el dominio extracelular hek, cuatro aminoácidos codificados por el mcs introducidos, y la luteína Fc.
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El vector de expresión fue luego cotransfectado con el plásmido pSV3.NEO en células CV1/EBNA. La línea celular
CV1/EBNA (ARCC CRL 10478) se derivó de una línea celular de riñón de mono como se describió en McMahan
et al. (EMBO J., 10:2821, 1991). El vector pSV3.NEO expresa el antígeno T SV40, el cual no es producido por las
células huéspedes. El vector pSV3.NEO es similar al pSV3 (Mulligan and Berg, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 78:2072,
1981), pero adicionalmente contiene un gen de resistencia a la neomicina. Las células transformadas fueron cultivas
para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión, que se secretó en el medio de cultivo por vía del péptido
de señal IL-7 de murino. La proteína de fusión se puede purificar sobre una columna de proteína A sefarosa, eluida, y
utilizada para seleccionar células por la capacidad de unirse a la proteína hek:Fc o la proteína elk:Fc.
Ejemplo 5
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Estudio de Unión
La capacidad del LERK-6 a unirse al elk o hek se puede determinar al utilizar el siguiente ensayo. Las células
que expresan el LERK-6 sobre la superficie celular se preparan. El ADN del LERK-6 se amplifica mediante PCR.
Los iniciadores empleados en el PCR son seleccionados para definir el terminal de la región codificante del ADN del
LERK-6, y también incluyen el sitio de restricción Xho I en el extremo 5’ y el sitio Not I en el extremo 3’ del ADN
amplificado. El iniciador 5’ adicionalmente incluyó una secuencia Kozak de consenso corriente arriba del codón de
iniciación.
Los productos de reacción son digeridos con Xho I y Not I e insertados en un vector de expresión clivado con Sal I
(que es compatible con Xho 1) y el Not I. El vector de expresión puede ser pDC410, que es un vector de expresión de
mamífero que también se replica en el E. Coli. El pDC410 es similar al pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821,
1991). El sitio de clonación múltiple pDC410 (mcs) difiere de aquel del pDC406 en que éste contiene unos sitios
de restricción adicionales y tres codones de parada (uno en cada estructura de lectura). El promotor de polimerasa
T7 corriente abajo del mcs facilita la secuenciación del inserto de ADN en el mcs. Además, el origen EBV de la
replicación se reemplaza mediante el ADN que codifica el antígeno T largo de SV40 (manejado desde un promotor
SV40) en pDC410.
Las células CV1-EBNA-1 en platos de 10 cm2 se transfectan con un vector de expresión recombinante que contiene
el ADN del LERK-6. La línea celular CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresa constitutivamente el antígeno1 nuclear EBV manejado desde el mejorador/promotor inmediato-temprano CMV. El CV1-EBNA-1 se deriva de la
línea celular de riñón de Mono Verde Africano CV-1 (ATCC CCL 70), como se describió en McMahan et al. (EMBO
J. 10:2821, 1991).
Las células transfectadas son cultivadas durante 24 horas, y las células en cada plato son entonces divididas en
una placa de 24 pozos. Después de cultivar 48 horas adicionales, se condujo un ensayo de unión mediante el siguiente
procedimiento. Las células transfectadas (aproximadamente 4x104 células/pozo) son lavadas con BM-NFDM, que es
un medio de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de ácida de sodio,
20 mM de Hepes pH 7.2) al cual había sido agregados 50 mg/ml de leche seca sin grasa. Las células son entonces
incubadas durante 1 hora a 37◦ C con varias concentraciones de proteína de fusión elk:Fc preparada en el Ejemplo
2 de la proteína de fusión hek:Fc preparada en el Ejemplo 3. Las células son entonces lavadas e incubadas con una
concentración saturante constante de un medio de unión IgG antihumano 125 I-ratón, con una agitación suave durante 1
hora a 37◦ C. Después de un lavado extensivo, las células son liberadas vía tripsinización.
El IgG antihumano de ratón empleado anteriormente está dirigido contra la región Fc del IgG humano y se puede
obtener del Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo es radioyodinado utilizando el
método de cloramina-T estándar. El anticuerpo se unirá a la porción Fc de cualquier proteína de fusión elk:Fc o hek:Fc
que se haya unido a las células. En todos los ensayos, la unión no específica del anticuerpo125 I se ensaya en ausencia
del elk:Fc (o el hek:Fc), así como también en la presencia del elk:Fc (o hek:Fc) y un exceso molar de 200 veces de
anticuerpo IgG antihumano de ratón no marcado.
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El anticuerpo 125 I unido a célula se cuantifica sobre un contador Packard Autogarnma. Los cálculos de afinidad
(Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) son generados sobre RS/1 (BBN Software, Boston, MA) corridos
sobre un computador Microvax.
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Ejemplo 6
Anticuerpos Monoclonales LERK-6
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Este ejemplo ilustra un método para preparar los anticuerpos monoclonales LERK-6. El LERK-6 purificado, un
fragmento de éste tal como el dominio extracelular, los péptidos sintéticos o células que expresan LERK-6 se pueden
utilizar para generar anticuerpos monoclonales contra el LERK-6 que utiliza técnicas convencionales, por ejemplo,
aquellas técnicas descritas en la Patente U.S. 4,411,993. En resumen, los ratones son inmunizados con LERK-6 como
un inmunógeno emulsificado en un adyuvante de Freund completo, e inyectado en cantidades que varían desde 10-100
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µg subcutáneamente o intraperitonealmente. Diez a doce días más tarde, los animales inmunizados son reforzados con
LERK-6 adicional emulsificado en un adyuvante de Freund incompleto. Los ratones son periódicamente reforzados
posteriormente con un programa de inmunización semanal o bisemanal. Las muestras de suero son periódicamente
tomadas en un sangrado retro-orbital o una excisión de punta de cola para ensayar los anticuerpos LERK-6 mediante
ensayo dot blot, ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima) o inhibición de unión de hek o elk.
Luego de la detección de un título de anticuerpo apropiado, a los animales positivos le es suministrada una inyección intravenosa final del LERK-6 en solución salina. Tres a cuatro días más tarde, los animales son sacrificados,
las células de bazo cosechadas, y las células de bazo son fusión das a una línea celular de mieloma de murino, por
ejemplo, NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, las
cuales son puestas en placa en placas de microtítulo múltiple en medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y
timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de célula de bazo.
Las células de hibridoma son seleccionadas mediante ELISA para reactividad contra LERK-6 purificado mediante
las adaptaciones a las técnicas descritas en Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 y en la Patente U.S. 4,703,004.
Una técnica de selección preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al., (J. Immunol.
144:4212, 1990). Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en los ratones BALB/c
singeneicos para producir ascitos que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LERK-6-L.
Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer en recipientes in vitro o en botellas de rodillo mediante varias
técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitos de ratón se pueden purificar mediante precipitación de
sulfato de amonio, seguido por cromatografia de exclusión de gel. Alternativamente, la cromatografia de afinidad
basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o a la proteína G también se puede utilizar, como lo puede la
cromatografia de afinidad basada en la unión al LERK-6.
Muestra 7
Generación de Ratones Transgénicos que Sobreexpresan LERK-6
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Este ejemplo describe un procedimiento para generar ratones transgénicos que sobreexpresan LERK-6. Los ratones
transgénicos que sobreexpresan LERK-6 se pueden estudiar para determinar los efectos biológicos de la sobreexpresión. Los pronúcleos de ratón (B 16/J) son microinyectados con ADN de LERK-6 de acuerdo al método descrito por
Gordon et al., Science 214:1244-1246, (1981). En general, los huevos de ratón fertilizados que tienen pronúcleos visibles son primero colocados en una cámara de inyección y mantenidos en su lugar con una pequeña pipeta. Se utiliza
un pipeta de inyección para inyectar el gen que codifica el LERK-6 (por ejemplo, el clon #6C) en los pronucleos
del huevo. Los huevos inyectados son (i) transfectados en el oviducto de una hembra seudopreñada p.c. de 0.5 días;
(ii) cultivada in vitro en la etapa de dos células (durante toda la noche) y transfectadas en el oviducto una hembra
seudopreñada p.c. de 0.5 días; o (iii) cultivado in vitro la etapa de blastocito y transferida al útero de una hembra
seudopreñada p.c. de 2.5 días. Preferiblemente, cualquiera de las dos primeras opciones se puede utilizar en razón a
que ellas evitan el cultivo in vitro extendido, y preferiblemente, aproximadamente 20-30 huevos microinyectados se
deben transferir para evitar las camadas pequeñas.
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REIVINDICACIONES
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1. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que une hek/elk en donde el polipéptido es al
menos 90% idéntico con una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
(a) aminoácidos 1-134 de la SEQ ID NO:2;
(b) aminoácidos 1-145 de la SEQ ID NO:2; y
10
(c) aminoácidos 1-184 de la SEQ ID NO.2.
2. Secuencia de ácido nucleico aislado que codifica un Polipéptido que se une al hek/elk, seleccionado de:
15
(a) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;
(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2;
20
(c) una secuencia de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de alta exigencia al complemento de la secuencia de ácido nucleico de (a) o (b); y
(d) una secuencia de ácido nucleico que, debido a la degeneración del código genético, codifica un polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácido de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de (a) o (c).
25
3. Un polipéptido aislado que une hek/elk, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que
es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácido seleccionada de:
(a) aminoácidos 1-134 de la SEQ ID NO:2;
30
(b) aminoácidos 1-145 de la SEQ ID NO:2; y
(c) aminoácidos 1-184 de la SEQ ID NO:2.
4. Un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo a la reivindicación 2.
35
5. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de cuerdo a la reivindicación 1 o la
reivindicación 2.
6. Una célula huésped transfectada o transformada con el vector de expresión de acuerdo a la reivindicación 5.
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45
7. Un proceso para producir un polipéptido que se une al hek/elk que comprende cultivar una célula huésped de
acuerdo a la reivindicación 6 bajo condiciones que promueven la expresión, y recuperar en el polipéptido el medio de
cultivo.
8. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 3 o a la
reivindicación 4.
9. Un anticuerpo aislado de acuerdo a la reivindicación 8 que es un anticuerpo monoclonal.
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10. Un mamífero no humano transgénico todas cuyas células germinales y somáticas contienen una secuencia de
ADN que codifica a la reivindicación 1 o la reivindicación 2 introducida en dicho mamífero, o un ancestro de dicho
mamífero, en una etapa embrional.
11. Un método para separar células que tienen un receptor hek/elk sobre la superficie de éste de una mezcla de
células en suspensión, que comprende poner en contacto las células en la mezcla con una superficie de contacto que
tiene un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 3 o reivindicación 4 sobre éste, y separar la superficie de contacto
de la suspensión.
12. Un método in vitro para suministrar una molécula deseada a una célula que tiene hek/elk sobre su superficie,
que comprende poner en contacto la célula con una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo a la
reivindicación 3 o a la reivindicación 4 y la molécula deseada.
13. Una composición que comprende un polipéptido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4 y uno o más diluyentes farmacéuticamente adecuados, emulsificadores, solubilizadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
adecuados.
14. El polipéptido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4 para uso como un medicamento.
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15. El polipéptido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4 para la elaboración de un medicamento para uso en
terapia.
5
16. Una secuencia de ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que se
une a hek/elk en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de:
(a) los aminoácidos 1-134 de la SEQ ID NO:2;
(b) los aminoácidos 1-145 de la SEQ ID NO:2; y
10
(c) los aminoácidos 1-184 de la SEQ ID NO:2.
17. Un polipéptido aislado de acuerdo a la reivindicación 3 que une hek/elk, en donde el polipéptido comprende
una secuencia de aminoácido seleccionada de:
15
(a) los aminoácidos 1-134 de la SEQ ID NO:2;
(b) los aminoácidos 1-145 de la SEQ ID NO:2; y
20
(c) los aminoácidos 1-184 de la SEQ ID NO:2.
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LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL
5
(i) SOLICITANTE: Cerretti, Douglas P.
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citoquina Designada como LERK-6
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
10
(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Immunex Corporation
(B) CALLE: 51 University Street
15
(C) CIUDAD: Seattle
(D) ESTADO: WA
(E) PAÍS: USA
(F) ZIP: 98101
20
(v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA:
(A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk
(B) COMPUTADORA: Apple Macintosh
25
(C) SISTEMA OPERATIVO: System 7.1
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
(vi) DATOS DE APLICACIÓN HABITUALES:
30
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US-a ser asignada(B) FECHA DE PRESENTACIÓN:
(C) CLASIFICACIÓN:
35
(vii) INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
(A) NOMBRE: Malaska, Stephen L.
(B) NÚMERO DE REGISTRO: 32,655
40
(C) NÚMERO DE REFERENCIA: 2826
(viii) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
(A) TELÉFONO: (206)587-0430
45
(B) TELEFAX: (206)233-0644
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
50
(A) LONGITUD: 555 pares base
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) HEBRA: simple
55
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLECULA: cADN
(iii) HIPOTÉTICA: NO
60
(iv) CONTRASENTIDO: NO
(vii) FUENTE INMEDIATA:
(B) CLON: LERK-6
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(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE: CDS
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(B) UBICACIÓN: 1.552
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
5
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15
20
25
30
35
40
45
50
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
55
(A) LONGITUD: 184 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
60
(ii) TIPO DE MOLECULA: proteína
(x) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
65
2
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5
10
15
20
25
30
35
40
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO:3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 28 pares base
45
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
50
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: Cadn
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
GATATTTACT GCCCGCACACTA CAACAGCT
55
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
60
(A) LONGITUD: 25 pares base
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) HEBRA: simple
65
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN,
(iii) HIPOTÉTICA: no
3
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(iv) ANTI SENTIDO: Nno
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4
5
AGAGAAGGCG CTGTAGCGCT GGAAC
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
10
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 31 pares base
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) HEBRA: simple
15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN
20
(iii) HIPOTETICA: NO
(iv) ANTI SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO:5:
25
ACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCA G
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
30
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 34 pares base
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) HEBRA: simple
35
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN
40
(iii) HIPOTÉTICO: NO
(iv) ANTI SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO:6:
45
AGCCTCAAGC ACTGGCCAGA ACTCTCTCTG GAGT
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
50
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 314 pares base
(B) TIPO: ácido nucleico
55
(C) HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
60
(iii) HIPOTÉTICO: NO
(iv) ANTI SENTIDO: NO
(ix) CARACTERÍSTICAS:
65
(A) NOMBRE/LLAVE: CDS
(B) SITIO: 2..313
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
4
ES 2 277 335 T3
5
10
15
20
25
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
30
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 104 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
35
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
40
45
50
55
60
65
5