PRT-712.02-023-V 11 RAM - Instituto de Salud Pública de Chile

PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS
EN PLACA METODO BAM ONLINE 2001
Sección Microbiología
Alimentos y Agua
1.
PRT-712.02-023
Fecha emisión:
Agosto de 2002
Revisión: 11
Fecha revisión:
10/01/2012
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OBJETIVO
Conocer el número de microorganismos aerobios mesófilos que contiene un alimento. Este
método es uno de los indicadores microbiológicos de calidad mas utilizado.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a alimentos congelados, enfriados, precocidos o preparados con
excepción de los productos fermentados o madurados tales como queso, ciertos tipos de
embutidos, yogurt, etc.
3.
FUNDAMENTO
Este en un método de recuento en placa y siembra en profundidad.
Los resultados de este análisis permiten:
-
Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección.
-
Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
-
Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los
alimentos.
-
Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte.
-
Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.
-
Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos.
4.
REFERENCIAS
4.1
Bacteriological Analytical Manual. Online Enero 2001.
4.2
Standard Methods for the Examination of Dairy Products.17 º ed. 2004. (Para cálculo de
resultados)
4.3
PRT-712.01-001 "Procedimiento de Recepción de las muestras".
4.4
PRT-712.01-002 "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua"
5.
TERMINOLOGÍA
No Aplica
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6.
6.1
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MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
MATERIALES Y EQUIPOS
6.1.1 Placas Petri estériles de vidrio o de plástico de 90-100 mm de diámetro.
6.1.2 Frascos de dilución de 160 mL de vidrio borosilicato con tapa rosca.
6.1.3 Frascos de vidrio con 90 mL de solución diluyente estéril.
6.1.4 Pipetas bacteriológicas estériles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 mL
6.1.5 Incubadora regulada a 35 ± 1ºC, y para muestras de leche regulada a 32 ± 1ºC
6.1.6 Baño de agua termorregulado a 45 ± 2 ºC.
6.1.7 Agitador de tubos
6.1.8 Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente
6.2
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
6.2.1 AGUA RECOMENDADA PARA USO EN MICROBIOLOGIA
Para preparar medios de cultivo, reactivos y blancos de dilución sólo se debe usar agua que ha
sido tratada por el desionizador Barnstead, para dejar libre de trazas de metales disueltos y
componentes bactericidas e inhibitorios.
6.2.2 DILUYENTE: Agua dilución fosfato buferada de Butterfield pH 7.2 ± 0.1 distribuida en
volúmenes de 9 mL en tubos de tapa rosca.
6.2.3 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Plate Count Agar o Standard Methods Agar
estéril, pH 7±0.1, distribuido en frasco Schott con 200 mL. (Anexo Nº 3).
7.
DESARROLLO
7.1
REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
VIABLES" (Ver Anexo N° 1)
7.2
PRECAUCIONES "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
VIABLES" (Ver Anexo Nº 2)
7.3
DILUCIONES Y SIEMBRA DE LA MUESTRA
7.3.1 Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras procesadas en el Laboratorio de
Recepción de Muestras de esta sección y dejar constancia de ello en el registro código
RG-712.00-037. Estas muestras son procesadas según el PRT-712.01-001 de
"Procedimiento de Recepción de las muestras" y el PRT-712.01-002 de "Procedimiento
de procesamiento de muestras de alimentos y agua".
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7.3.2 Anotar en cuaderno de inscripción y número de las muestras a sembrar.
7.3.3 Verificar que el volumen de cada tubo de dilución contengan 9 mL.
7.3.4 Preparar diluciones decimales de 10¯ ², 10 ¯ ³, etc. a partir del homogeneizado de la
muestra o de muestra líquida directa.
7.3.5 Para ello transferir 10 mL a un frasco con 90 mL de diluyente. Agitar y proceder de igual
forma para las diluciones siguientes. Evitar la formación de espuma.
7.3.6 Identificar las placas Petri, número de la muestra y dilución.
7.3.7 Sembrar 1 mL por duplicado de cada dilución en placas estériles previamente
identificadas. Sembrar como mínimo dos diluciones consecutivas. (Anexo Nº 4 Diagrama
Análisis Recuento de microorganismos aerobios mesófilos).
7.3.8 Antes de sembrar en la placa volver a agitar la dilución si ésta lleva más de 3 minutos.
7.3.9 Verter aproximadamente 12-15 mL de agar previamente fundido y mantenido en baño de
agua a 47°C ± 2 ºC para cada placa dentro de 15 minutos a partir de la dilución inicial.
7.3.10 Añadir inmediatamente el agar a la placa cuando la dilución de la muestra contiene
material higroscópico, como por ejemplo harina o almidón.
7.3.11 No apilar las placas cuando se está vertiendo el agar o cuando éste se está solidificando.
7.3.12 Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma
adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente:
a) Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,
b) hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,
c) mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la
primera y
d) hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.
7.3.13 Las palcas sembradas en profundidad correspondientes a productos lácteos deshidratados
una vez solidificado el agar deben ser cubiertas con 3 a 5 mL de agar.
7.3.14 Una vez solidificado el agar, invertir las placas rápidamente para prevenir el crecimiento
de colonias invasivas por acumulación de humedad. Incubar a 35 ºC ±1ºC durante 48
horas ± 2 horas para matrices diferentes a productos lácteos.
7.3.15 Para los productos lácteos deshidratados incubar a 32 ± 1ºC por 72 h ± 3 h y para el resto
de los productos lácteos a 32 ± 1ºC por 48 h ± 3 h.
Con el fin de validar los resultados se recomienda realizar controles de: ambiente,
esterilidad del medio de cultivo, esterilidad del diluyente
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LECTURA Y RECUENTO DE COLONIAS
7.4.1 LECTURA DE LAS PLACAS
7.4.1.1
Luego de cumplir el período de incubación realizar la lectura de las placas.
7.4.1.2
Si no es posible leerlas prontamente, guardarlas a 4ºC por no más de 24 horas, pero
esto no hay que hacerlo de rutina.
7.4.1.3
Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro.
7.4.1.4
Examinar las muestras dudosas con mayor aumento para distinguir las colonias de
materias extrañas.
7.4.1.5
Evitar la fatiga ocular que puede causar imprecisiones.
7.4.1.6
Anotar la dilución usada y el número de colonias contadas en cada placa en el registro
código RG-712.00-023.
7.4.1.7
Anotar los resultados de los controles realizados en los siguientes registros según
corresponda: RG-.712.00-001, RG-712.00-009 y RG-712.00-010.
7.4.2
RECUENTO DE COLONIAS Y REGISTRO (Anexo Nº 5 Casos, lectura, registro
cálculo e informes de resultados)
El recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema:
7.4.2.1
Placas normales (25 - 250 colonias):
7.4.2.1.1
Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo.
7.4.2.1.2
Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño.
7.4.2.1.3
Anotar por dilución, el número de colonias contadas en cada placa.
7.4.2.2
Casos especiales
Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera:
7.4.2.2.1
a.
Placas sobrepobladas (mas de 250 colonias):
Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC)
cuando disponga de placas normales.
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Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en
porciones de la placa si su distribución es homogénea y calcular el recuento estimado en
placa (RPES).
•
Si hay menos de 10 colonias por cm², contar las colonias en 12 cuadrados,
seleccionar 6 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados
consecutivos formando ángulo recto, contar cada cuadrado sólo una vez
•
Si hay más de 10 colonias por cm² contar las colonias en cuatro de tales porciones.
•
En ambos casos, multiplicar el número promedio de las colonias contadas por cm²
por el área de la placa usada para estimar el número de colonias por placa. Cada
laboratorio debe determinar el área en cm² de las placas usadas. Registre los valores
obtenidos e indique como recuento estimado.
•
Si hay mas de 100 colonias por cm², registrar como >100 col / cm².
7.4.2.2.2
Placas con menos de 25 colonias (< 25 colonias)
Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, registre los valores
obtenidos e indique como recuento estimado.
7.4.2.2.3
Placas sin desarrollo de colonias
Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la
dilución correspondiente (SD) o < 1 por la correspondiente dilución más baja e indique como
recuento estimado.
7.4.2.2.4
Crecimiento invasivo
Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos:
a.
El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegración
de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alícuota
analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia. Si una o mas
cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia.
No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia.
b.
El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de agua entre el
agar y el fondo de la placa Petri.
c.
El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la superficie del
agar.
Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual se
origina el crecimiento invasivo.
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Cuando la alícuota de siembra es uniformemente distribuida en el medio, las bacterias
raramente desarrollan colonias invasivas.
d.
e.
Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias
solamente:
•
Si el área invadida no excede la mitad de la placa.
•
Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida.
•
Si las placas preparadas a partir de las muestras tienen un excesivo desarrollo
invasivo tal que:
-
el área cubierta por el desarrollo invasivo, incluye un área total que representa
sobre el 50% del área de la placa o;
-
el área que representa el desarrollo excede el 25% del área de la placa.
-
Registre en ambos casos las placas como desarrollo invasivo.
Cuando es necesario realizar el recuento en las placas que presentan invasión por a) o b)
de arriba, contar cada uno de los tres tipos diferentes de colonias invasivas como una
fuente.
•
Para el primer tipo, si una sola cadena aparece, contar como una sola colonia. Si una
o más cadena aparece originadas de fuentes separadas, contar cada fuente como una
colonia separada. No contar cada desarrollo individual presente en la cadena como
una colonia separada.
•
Los tipos 2 y 3 de colonias invasivas generalmente presentan colonias distintas y son
contadas como tales. Combinar el recuento de los distintos tipos de colonias y las
colonias contadas por separado para el cálculo de recuento en placa.
Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con más de 1/4 de las placas con crecimiento
invasivo, deberían tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad
ambiente en la cámara o estufa de incubación y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra).
7.4.2.2.5
Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano.
Cuando una placa presenta contaminación u otra condición insatisfactoria registrar como
"Accidente de Laboratorio". Especificar.
El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que están
siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos
crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debería ser interpretado como
evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto
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EXPRESION DE RESULTADOS
7.5.1 Cálculo y registro de resultados ( Ver Anexo Nº 5)
Para los cálculos del Recuento Standard en placa considerar sólo los dos primeros dígitos.
Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2,
3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una
unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par.
Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha.
Ejemplo
Lectura calculada
RAM
12.700
13.000
12.400
12.000
15.500
16.000
14.500
14.000
7.5.2
Placas normales
7.5.2.1 Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen
dentro del rango 25 a 250 colonias:
- Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales
- Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilución.
7.5.2.2
N=
Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango
25-250 colonias calcular el RAM según la siguiente fórmula:
ΣC
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
donde:
N = número de colonias por ml o g de producto
Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
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n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d
= dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento
Ejemplo
1 : 100
1 :1000
232 y 244
33 y 28
N = 232 + 244 + 33 + 28
[( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01
= 537
0.022
= 24.409
= 24000
7.5.2.3
Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del
rango 25-250 colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango.
7.5.3
Todas las placas con menos de 25 colonias.
Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, informar el
recuento como menor de 25 por el recíproco del factor de dilución menor.
Ejemplo
1 : 100
1 : 1.000
R A M ( mL o g )
18
2
< 2.500 recuento en placa estimado (RPES)
0
0
< 2.500 recuento en placa estimado (RPES)
7.5.4
Todas las placas con mas de 250 colonias
Cuando las placas de ambas diluciones tienen más de 250 colonias cada una (pero menos de 100
por cm²) contar las placas más cercanas a 250, sacar promedio y multiplicar por el recíproco de
la dilución.
Ejemplo
1 :100
1 : 1.000
MNPC
640
R A M ( mL o g )
640.000 recuento en placa estimado (RPES)
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(MNPC = Muy numeroso para contar)
7.5.5
Todas las placas con más de 100 colonias promedio por cm².
Estimar que el R A M es mayor de 100 veces la mayor dilución sembrada, por el área de placa
utilizada y por el recíproco de la dilución.
Ejemplo
1 : 100
1 : 1.000
R A M ( mL o g )
TNPC
7.150*
> 6.500.000 * ( RPES )
TNPC
6.490**
>5.700.000 **( RPES )
*
basado en un área de placa de 65 cm² ( 9 cm Ø )
**
basado en un área de placa de 57 cm² ( 8,5 cm Ø )
7.5.6
Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente
de laboratorio.
Informar según corresponda.
7.6
INFORME DE RESULTADOS (Anexo Nº 5)
7.6.1 Informar el recuento de aerobios mesófilos (RAM) en unidades formadoras de colonias
(ufc) por mililitro o gramo según corresponda.
Expresar el Resultado con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado
a la potencia correspondiente. Ej. 2.400 donde el resultado final corresponde a 2,4 x 103
ufc / g o mL.
7.6.2 Siempre que se utilice el método de recuento en placa para decidir si una partida de
alimentos se acepta o se rechaza, debe considerarse únicamente recuentos realizados dentro
del rango 25-250 colonias y nunca los recuentos estimados. Desde el punto de vista de un
Organismo Oficial, el recuento estimado es sólo útil como una aproximación inicial para
valorar la calidad bacteriológica de un alimento.
7.6.3 En el caso de que se utilice el recuento en placa para establecer si un alimento determinado
cumple una norma microbiológica, debe tomarse en cuenta los planes de muestreo
especificados para ese alimento
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REPRODUCIBILIDAD Y ERROR PERSONAL
El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada debe
presentar:
7.7.1 Una diferencia máxima del 5% en el caso de que este recuento lo realice la misma persona.
7.7.2 Una diferencia máxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra u
otras personas.
Cuando la diferencia entre ambos es superior a estos límites, puede deberse a defectos
visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeñas o lo que es mas frecuente,
a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partículas más pequeñas
7.8
CONTROLES
7.8.1 Chequear esterilidad de:
- Agua de dilución
- Agar para recuento en placa (Plate Count o agar Standard Methods)
- Pipetas
- Placas Petri
7.8.2 Control de ambiente por método de sedimentación en placa :
- Mesón de siembra
- Flujo laminar
7.8.3 Control de temperatura de incubadora diariamente.
7.8.4 Control temperatura baño termorregulado cada vez que se siembre muestras
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8.
8.1
8.2
8.3
REGISTROS
Registro control de ambiente
Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis
Registro análisis de muestras de alimentos
9.
ANEXOS
Anexo N° 1 “Requisitos “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos viables”.
Anexo N° 2 “Precauciones “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos viables”.
Anexo N° 3 “Características del agar Standard.
Anexo N°4 “Recuento de microorganismos aerobios mesófilos: Técnica Recuento en placa
siembra en profundidad”.
Anexo N° 5 “Lectura, registro, cálculo e informe de resultados recuento de microorganismos
aerobios mesofilos”.
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ANEXO Nº 1
REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
VIABLES"
AUTOCLAVE :
El autoclave debe ser de tamaño suficiente para prevenir el
amontonamiento de material en su interior y ser construido de
forma que provea temperaturas uniformes. Este equipo debe
constar de un termómetro registrador de temperatura.
HORNO
De tamaño suficiente para evitar que se amontone el material en su
ESTERILIZADOR :
interior, que provea una temperatura uniforme. Debe tener
termómetro registrador de temperatura.
BALANZA :
Con sensibilidad de 0,1 g capacidad de 200 g de carga. Es
preferible de un sólo plato.
CONTADOR DE
Se prefiere el modelo "Quebec" o uno que tenga aumento y
COLONIA :
visibilidad equivalente.
TUBOS DE DILUCION:
Deben tener una capacidad aproximada de 20 mL, de vidrio de
borosilicato con tapa de rosca. Verificar que los tubos contengan
la cantidad adecuada. Se recomienda tubos marcados
indeleblemente a 9 mL y 10 mL ± 0,1 mL.
INCUBADORA :
La temperatura dentro de la incubadora no debe variar mas de 35
±1 ºC.
La temperatura dentro de la incubadora no debe variar mas de 32
±1 ºC para productos lácteos.
La temperatura dentro de la incubadora se determina cuando está
llena a su capacidad máxima.
Las placas deben llegar a la temperatura de incubación dentro de 2
horas. Evitar la humedad excesiva dentro de la incubadora, para
reducir la tendencia de crecimiento de colonias invasivas. Prevenir
el desecamiento excesivo del medio, controlando la ventilación y
circulación de aire.
El agar de las placas incubadas no debe perder más del 15 % del
peso durante las 48 horas de incubación.
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REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
VIABLES"
La incubadora debe cargarse de manera que quede no menos de
2,5 cm de espacio entre los grupos de placas o entre las placas y
las paredes del incubador.
Las incubadoras deben estar aisladas, equipadas con unidades bien
distribuidas de calefacción y deben tener una circulación mecánica
de aire.
Las incubadoras deben mantenerse en salas donde la temperatura
tenga un rango de 16 - 27 ºC.
La temperatura de la estufa o cámara de incubación debería
chequearse dos veces al día; una antes de sacar el material en la
mañana y otra en la tarde al finalizar la jornada trabajo. Esto debe
ser realizado con termómetros de registro de temperatura máxima
y mínima.
Los termómetros deben ser sumergidos en un recipiente con agua
herméticamente cerrado. La temperatura del aire no es un buen
índice de la temperatura real del agar.
HOMOGENIZADOR
MECANICO:
Warring blender con vaso de vidrio o de acero inoxidable.
STOMACHER:
De capacidad 400 g.
PLACAS PETRI:
Los fondos de las placas Petri deben tener por lo menos 85 mm de
diámetro interior y una profundidad de 12 mm con superficies
interiores y exteriores libres de burbujas, rayaduras u otros
defectos. Pueden ser de vidrio o desechables.
CONTENEDORES DE
PLACAS PETRI.:
PIPETAS:
De acero inoxidable o aluminio, con tapa.
Para este análisis se usan pipetas de 1 mL ± 0,25 mL, la que debe
entregar su contenido en máximo 4 segundos.
Usar sólo pipetas intactas, taponadas, de material no torcido,
calibradas para uso bacteriológico y en conformidad con las
especificaciones de APHA.
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REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
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PROPIPETAS O PIPETAS No está permitido pipetear con la boca. El tipo de propipeta o
AUTOMATICAS.
pipeta automática no debe alterar las características
y
especificaciones APHA.
CONTENEDOR DE
De acero inoxidable.
PIPETAS:
REFRIGERADOR :
Debe mantener las muestras a una temperatura de 0 -4.4 ºC hasta
ser analizadas. Se debe chequear la temperatura diariamente.
ESPACIO DE
ALMACENAJE:
Libre de polvo e insectos y adecuados para guardar material.
TERMOMETROS
Los termómetros deben tener un rango de -1,1 a 55 ºC. La
graduación no debe exceder de 1 ºC. Los termómetros deben ser
chequeados con un termómetro certificado por lo menos una vez al
año.
AREA DE TRABAJO:
Debe ser un mesón nivelado, con amplia superficie de trabajo,
limpio, iluminado. El laboratorio debe tener buena ventilación,
libre de polvo y de corrientes de aire. El número de
microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) en el aire del
área de trabajo no debe exceder de 15 colonias por placa expuesta
durante 15 minutos.
BAÑO DE AGUA
TERMORREGULADO:
De dimensiones adecuadas, con control termostático para
mantener el medio a 47°C ± 2°C.
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ANEXO Nº 2
PRECAUCIONES
"RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES"
-
Al realizar las siembras usar propipeta. No pipetear con la boca.
-
Al retirar una pipeta estéril de su contenedor evite contaminar la punta con las superficies
exteriores del envase.
-
No flamear pipetas estériles.
-
Introducir la pipeta no más de 2,5 cm. dentro del homogeneizado de la muestra o dilución.
-
Extraer un volumen ligeramente mayor a la alícuota deseada. Retirar la pipeta por sobre el
nivel del líquido y enrasar tocando con la punta de ésta la pared interior del tubo o frasco de
dilución.
-
Al inocular las diluciones, mantener la pipeta en un ángulo de 45 º, y con la punta de ésta
tocar el fondo de la placa Petri o la pared interior del envase de dilución.
-
Levantar la tapa de la placa Petri lo necesario para introducir la pipeta. El tiempo que debe
transcurrir para que la pipeta entregue el volumen de 1 mL es de 2-4 segundos. Tocar un
punto seco de la placa manteniendo la pipeta en posición vertical.
-
No expulsar la gota que queda en la punta de la pipeta.
-
Fundir la cantidad de medio de cultivo necesario para ser usada en un período de 3 horas y
mantenerlo en baño de agua a 47 ºC ± 2ºC.
-
Evitar exposiciones prolongadas del medio a altas temperaturas.
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ANEXO Nº 3
CARACTERÍSTICAS DEL AGAR STANDARD
Si el medio de cultivo es preparado por ingredientes éstos deben tener las siguientes
especificaciones:
1-Caseína pancreática: debe ser de calidad USP dada en la U.S. Pharmacopoeia, 1975 XIX p. 744.
2-Extracto de levadura: conforme a normas dadas por la U.S. Pharmacopoeia, 1975 XIX p. 758.
3-Glucosa: según normas de U.S. Pharmacopoeia XIX p. 128. Debe ser anhidra.
4- Agar: conforme a las siguientes especificaciones.
a) Características generales:
El material seco debería ser granulado o en escamas, de color blanco cremoso. Una cantidad de 2 g
suspendida en 100 mL de agua destilada fría. Debería disolverse completamente en 5 minutos a 100
ºC. Después de autoclavar esta solución debe estar libre de materias extrañas o partículas en
suspensión las cuales pueden interferir en la lectura. El pH de esta solución al 2% no debe ser
menos de 6,0.
b) Temperatura de gelificación y fundido
La gelificación de solución acuosa caliente al 1.5% no debería ser sobre 43 º C y no menor de 33 º
C. Luego de solidificado el medio no debería fundirse a menos de 70ºC.
c) Recuento de esporas viables
Este recuento no debería ser superior a 50.
A 2 g de agar agregar 100 mL de caldo soya y autoclavar la mezcla a 121 ºC por 15 minutos. Luego
enfriar a 45 ºC y distribuir en 3 o 4 placas estériles. Incubar las placas por 48 horas a 35 º C y contar
las colonias. El total de colonias dividido por 2 no debería ser superior a 50.
CARACTERISTICAS FISICAS DEL AGAR STANDARD
1- Debería ser preparado con ingredientes que tengan las características anteriormente mencionadas.
2- El polvo debe ser beige claro o amarillo pálido.
3- El contenido de humedad no debería ser menos del 5 %.
4- Debe ser soluble la solución al 2,35 % al hervir 1 a 2 minutos. Esta solución debe ser clara y libre
de precipitados.
5- Debe tener un pH final 7 ± 0,2 a 25 ºC, después de ser esterilizado a 121 por 15 minutos.
6- No debe presentar precipitado cuando es mantenido a 50-56 ºC, por 2 hrs. después de ser
esterilizado.
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ANEXO Nº 4
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
Técnica Recuento en placa siembra en profundidad
1 mL
HOMOGENEIZADO:
450 mL de Solución de
Butterfield
9 mL de
Solución de Butterfield
50 g muestra
Dil 10 -1
10 -2
10 -3
SIEMBRA :
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Agar Plate Count
INCUBACION:
35 ºC +-0,5ºC por 48 horas
LECTURA PLACAS :
Leer placas Petri según anexo Nº 5
CALCULO :
Realizar los cálculos según anexo Nº 5
INFORME
Informar como Nº de UFC/g o mL de producto
:
1 mL
1 mL
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ANEXO Nº 5
LECTURA, REGISTRO, CÁLCULO E INFORME DE RESULTADOS RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
Lic. T.M. Mariana Fernández C. Instituto de Salud Pública de Chile
CASOS
LECTURA Y REGISTRO
CALCULO Y REGISTRO
INFORME
1-Placas normales
ufc /g o mL
25-250 colonias
-Utilizar para el cálculo los recuentos
a) Cuando los recuentos de los
obtenidos en placas normales.
duplicados de placas de sólo
una de las diluciones caen
dentro del rango 25-250
-Si el tercer dígito es 6 , 7, 8 , o 9 adicionar
colonias
Ej. 2 10¯ ²= 301 y 289
2,4 x 10 ^5
10¯ ³= 244 y 232
1 unidad al segundo dígito
Ej. 1 = 238 x 1000 = 238.000
= 240.000
Ej. 2 10¯ ²= 301 y 289
10¯ ³= 203 y 199
-Si el tercer dígito es 1, 2 , 3 , o 4 sólo
considerar los dos primeros dígitos
Ej. 2 = 201 x 1000 = 201.000
= 200.000
Ej. 3 10¯ ²= 301 y 289
10¯ ³= 210 y 220
- Si el tercer dígito es 5, agregar 1 unidad al
2,2 x 10 ^5
segundo dígito si éste es impar y
mantener el segundo dígito si éste es par
Ej. 3 = 215 x 1000 = 215.000
= 220.000
2,0 x 10 ^5
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CASOS
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LECTURA Y REGISTRO
b) Si los recuentos de las placas de Ej.
dos diluciones consecutivas
caen dentro del rango 25 - 250
colonias
10¯ ²= 232
244
10¯ ³=
CALCULO Y REGISTRO
INFORME
ufc /g o mL
Calcular según la siguiente fórmula:
33
28
N= ____________Σ C___________
2,4 x 10^4
[ ( 1x n1 ) + ( 0,1 x n2 ) ] x d
N=
232 + 244 + 33 + 28
[ ( 1x 2 ) + ( 0,1 x 2 ) ] x 0,01
N= 24.409
c) Cuando los recuentos de las
Ej.
placas en duplicado caen tanto
dentro como fuera del rango 25
- 250 colonias, usar sólo
aquellos recuentos que estén
dentro de este rango .
N
ΣC
n1
n2
d
10¯ ²= 238
263
10¯ ³=
15
17
=Número de colonias / g o mL
= Suma de todas las colonias contadas en todas las placas
=Número de placas contadas de la menor dilución
=Número de placas contadas de la dilución consecutiva
=dilución de la cual fue obtenido el primer recuento
=238 x 100 = 23.800
=24.000
2,4 x 10^4
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2- Casos especiales
a) Placas sobrepobladas
( > 250 colonias )
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CASOS
c) >100 colonias / cm ².
* Basado en un área de 65 cm² (9 cm de diámetro.)
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LECTURA Y REGISTRO
1- Mas de 250 colonias y disponga > 250
de placas normales
2- Si no dispone de placas
normales en las diluciones
sembradas y las placas
sembradas presentan mas de
250 colonias contar las mas
cercanas a 250 :
Contar 6 cuadrados
consecutivos horizontal y 6
a) < 10 colonias / cm ².
consecutivos vertical
Ej.
10¯ ³ horiz.5, 7, 8, 3, 5, 6
Vert. 6, 7, 3, 4, 4, 5
b) > 10 colonias / cm ²
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Contar las colonias en
cuatro de éstos cuadrados
Ej.
10¯ ³ 77 , 46 , 38 , 67
Registrar como >100/cm ²
Ej. 10¯ ² MNPC
10¯ ³ >100 col / cm ².
CALCULO Y REGISTRO
5+7+8+3+5+6++6+7+3+4+4+5=63
63 / 12 x 65*x 1000 = 341000
77+46+38+67 = 288
288 / 4 x 65*x 1000 = 3705000
INFORME
ufc / g o mL
MNPC
(RPES)
3,4 x 10^5
(RPES)
3,7 x 10^6
(RPES)
> 100 x 65*x 1000 = > 6.500.000
MNPC = Muy numeroso para contar
>6,5 x 10^6
(RPES)
RPES = Recuento en placa estimado
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CASOS
LECTURA Y REGISTRO
b) Todas las placas con
Placas de las diluciones sembradas Ej
menos de 25 colonias presentan menos de 25 colonias
cada una .
10¯ ²
10¯ ³
10 y 15
3y5
c) Placas sin desarrollo
de colonias
Ninguna de las placas presenta
desarrollo de colonias
Ej
d) Crecimiento invasivo
Tipos de crecimiento invasivo :
Sólo contar sí :
a) Colonias en cadenas
10¯ ²
10¯ ³
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0y0
0y0
- El área invadida no
excede la mitad de la
b) Colonia entre el agar y fondo de
placa.
la placa Petri
- Si las colonias están bien
c) Colonia en una película de agua
distribuidas fuera del área
en el costado o en la superficie
invadida.
del agar
- Si no , registrar como
crecimiento invasivo (CI )
CALCULO Y REGISTRO
< 25 x el recíproco del factor de dilución
menor
< 1,0 x por el recíproco de dilución menor
INFORME
ufc / g o mL
< 2,5 x 10^3
(RPES)
< 2,5 x 10^3
(RPES)
Crecimiento
Invasivo
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Continuación
e) Accidente de
laboratorio o
inhibidores de
crecimiento
bacteriano
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CASOS
LECTURA Y REGISTRO
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CALCULO Y REGISTRO
INFORME
ufc / g o mL
Accidente de laboratorio :
- Presencia de contaminación u
otra condición insatisfactoria.
Especificar
Accidente de
laboratorio
- Presencia de inhibidores
bacterianos
Cuando las placas no tienen
crecimiento o tienen
proporcionalmente menos
crecimiento en las
diluciones mas bajas
No informar
hasta confirmar
su presencia
REF: Standard Methods for the Examination of Dairy Products.17 º ed. 2004. (Para cálculo de resultados)