Fecha emisión: 06/2002 Revisión: 5 ENUMERACIÓN DE

ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
Microbiología de
Alimentos
PRT-712.03-040
Fecha emisión:
06/2002
Revisión: 5
Fecha revisión:
08/05/2008
Página 1 de 6
1.
OBJETIVO
Determinar el número de Enterobactereaceae presentes en un alimento.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos donde se espere encontrar más de
100 microorganismos por gramo o mL de muestra
3.
FUNDAMENTO
Esta metodología tiene una etapa presuntiva de siembra en agar selectivo en profundidad y una
etapa confirmativa con pruebas bioquímicas
4.
4.1
REFERENCIAS
General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation.–MPN
technique and colony -count technique-ISO 7402 punto 4.2.2.
5.
TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
EQUIPOS
6.1.1 Baño de agua 45 ºC.
6.1.2 Incubadora 35 a 37 ºC ± 1 °C.
6.1.3 Vortex mixer
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
6.2.7
MATERIAL DE LABORATORIO
Placas Petri de 15x100mm.
Pipetas estériles de 1 y 10 mL graduadas en 0,1 y o,5 mL
Asa de nicrón (aprox de 3mm de diámetro).
Tubos estériles de 16x160 mm.
Mondadientes de madera o asa de vidrio
Mecheros Bunsen
Frascos de capacidad ± 160 mL.
ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
Microbiología de
Alimentos
PRT-712.03-040
Fecha emisión:
06/2002
Revisión: 5
Fecha revisión:
08/05/2008
Página 2 de 6
6.3
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.
6.3.1 Agar Bilis Glucosa Rojo neutro Cristal Violeta (VRBG). Este debe ser preparado justo
antes de usar.
6.3.2 Agar nutritivo o agar BAB (en placa Petri con 15 a 18 mL)
6.3.3 Agar glucosa, previo a su uso calentar en baño de agua hirviendo para eliminar el aire y
luego enfriarlo rápidamente.
6.3.4 Solución acuosa de dihidrocloruro de tetrametilparafenilendiamina al 1%
6.3.5 Etanol 70 %
7.
DESARROLLO
7.1 Etapa presuntiva
7.1.1 Preparar diluciones decimales de la muestra de alimento ( 10-1 a 10-6). Sembrar 1 mL en
duplicado en placas Petri estériles de las diluciones 10-1a 10-6.
7.1.2 Verter en cada placa Petri 15 mL de agar VRBG previamente fundido y enfriado a 45
ºC en baño de agua. El tiempo entre la dilución inicial y el vertido del medio no debe ser
superior a 15 minutos.
7.1.3 Mezclar el inóculo con el agar siguiendo las siguientes instrucciones
a) mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,
b) hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj
c) mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la
primera y
d) hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.
7.1.4
7.1.5
7.1.6
7.1.7
7.1.8
Esperar que se haya solidificado el agar con el inóculo y agregar una segunda capa con
4 a 5 mL del mismo agar.
Esperar que solidifique la segunda capa e incubar las placas invertidas a 35 a 37ºC por
24 ± 2 hrs.
Inocular una placa con una cepa de E. coli, otra con S. aureus Anotar en el RG-712.00004. En paralelo incubar una placa sin inocular como control de esterilidad del medio,
anotar en el RG-712.00-006.
Leer las placas que presenten entre 15 a 150 colonias. Contar aquellas que contienen
colonias de color púrpura.
Registrar el resultado de cada placa por dilución en registro RG-702.00-024.
7.2 Etapa confirmativa
7.2.1 Subcultivo
7.2.1.1 Repicar 5 colonias características para realizar pruebas bioquímicas confirmativas en
agar nutritivo en placa.
7.2.1.2 Incubar las placas a 35 a 37 º C por 24 ± 2 hrs.
ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
Microbiología de
Alimentos
PRT-712.03-040
Fecha emisión:
06/2002
Revisión: 5
Fecha revisión:
08/05/2008
Página 3 de 6
7.2.1.3 Agregar control positivo E. coli y Control negativo S aureus.
7.2.1.4 Seleccionar una colonia aislada desde cada una de las placas incubadas, para la
confirmación bioquímica.
7.2.2 Prueba de oxidasa
7.2.2.1 Usar asa de inoculación de platino/iridio o de vidrio, tomar una porción de cada colonia
aislada y colocar en contacto con papel filtro recientemente humedecido con el reactivo
de oxidasa. No se debe usar asa de inoculación de níquel /cromo.
7.2.2.2 Considerar que la prueba es negativa cuando el color del papel filtro no se ha tornado
azul en 10 segundos. Las Enterobacterias son oxidasa negativas, se puede utilizar como
control positivo de reacción, una cepa Pseudomona aeruginosa y como control negativo
una cepa de E. coli.
7.2.2.3 Anotar en el Registro RG-02.00-024.
7.2.3 Prueba de fermentación
7.2.3.1 Repicar en profundidad, usando un asa de inoculación, las mismas colonias
seleccionadas para la prueba de oxidasa (7.2.1.4) en tubos de agar glucosa. Incluir como
control positivo una cepa de E. coli y como control negativo una cepa de Pseudomona
aeruginosa.
7.2.3.2 Incubar a 35 a 37 ºC por 24 ± 2 hrs.
7.2.3.3 Si se desarrolla un color amarillo a lo largo del contenido del tubo, la reacción se
considera positiva. La mayoría de las cepas producen gas.
7.2.3.4 Anotar en el Registro RG-02.00-024.
7.3 EXPRESIÓN DE RESULTADOS
7.3.1 Criterio general
7.3.1.1 Si por lo menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas como oxidasa negativa y
glucosa positiva y así confirmadas como Enterobacteriaceae, el número de
microorganismos presentes será el mismo que resultó en el recuento hecho en 7.1.6.
7.3.1.2 En todos los otros casos, el número se calculará desde el porcentaje de colonias oxidasa
negativa y glucosa positiva en relación al número total de colonias seleccionadas.
7.3.1.3 Aproximar el resultado a un número entero de colonias.
7.3.2 Caso general-Placas que contienen hasta 150 colonias típicas
7.3.2.1 Calcular para cada placa, el número de microorganismos confirmados, usando la
expresión siguiente:
N = Σ a /(n1+ 0,1 n2) x d
en que :
ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
Microbiología de
Alimentos
PRT-712.03-040
Fecha emisión:
06/2002
Revisión: 5
Fecha revisión:
08/05/2008
Página 4 de 6
Σ a = suma de colonias contadas después de la identificación en todas las placas
seleccionadas.
n1 = número de placas seleccionadas en la primera dilución
n2 = número de placas seleccionadas en la segunda dilución
d = factor de dilución que corresponde a la primera dilución.
Aproximar el resultado calculado a dos cifras significativas
7.3.3 Estimación de pequeños números
7.3.3.1
Si las dos placas que corresponden a la suspensión inicial, contienen menos de 15
colonias, calcular el promedio aritmético (m) de las colonias contadas en ambas
placas.
7.3.3.2 Informar el resultado como se indica a continuación:
Número estimado, NE Enterobacteriaceae por gramo
NE = m x d-1
En que
m = promedio aritmético
d = factor de dilución de la suspensión inicial
7.3.4 Placas sin colonias características o sin desarrollo de colonias
7.3.4.1 Si las dos placas, que corresponden a la suspensión inicial, no contienen colonias
características o no presentan desarrollo de colonias, informar el resultado como se
indica a continuación:
- Menos de 1 x d-1 microorganismo por gramo, donde “d” es el factor de dilución de la
suspensión inicial.
7.3.5 Precisión
7.3.5.1 Sólo por razones estadísticas, en el 95 % de casos los límites de confianza de la técnica
recuento en placas varía desde ± 16 a ± 52 %, para los recuentos de colonias de menos
de 15 por placa, los límites de confianza se dan en tabla N° 1. En la práctica, se puede
encontrar una variación aún mayor, especialmente entre resultados obtenidos por
diferentes analistas.
ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
Microbiología de
Alimentos
PRT-712.03-040
Fecha emisión:
06/2002
Revisión: 5
Fecha revisión:
08/05/2008
Página 5 de 6
Tabla N° 1
Límites de confianza para la estimación de números pequeños de colonias
Número de microorganismos
Límites de confianza al nivel 95 %
Mas bajo
Mas alto
1
<1
2
2
<1
4
3
<1
5
4
1
6
5
2
9
6
2
10
7
2
12
8
3
13
9
4
14
10
4
16
11
5
18
12
6
19
13
7
20
14
7
21
15
8
23
8.
REGISTROS
Identificación Almacenamiento
Protección
Recuperación
del registro
RG-712.00-004 Archivador
rojo Acceso libre al Papel
rotulado Registro de personal
del
Controles laboratorio laboratorio 348.
348
RG-712.00-006 Archivador
rojo Acceso libre al Papel
rotulado Registro de personal
del
Controles laboratorio laboratorio 348.
348
RG-712.00-024 Archivador
azul Bajo
custodia Papel
rotulado “Registro de laboratorio 348
lecturas de informes acceso restringido
de
resultados. a personal sección
Laboratorio
microbiología
Tiempo retención y
disposición
Almacenar por 5 años
y disponer en la basura
cortado en trozos.
Almacenar por 5 años
y disponer en la basura
cortado en trozos.
Almacenar por 5 años
y disponer en la basura
picada en trozos
ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
Microbiología de
Alimentos
Identificación
del registro
Almacenamiento
PRT-712.03-040
Protección
Fecha revisión:
08/05/2008
Página 6 de 6
Recuperación Tiempo retención y
disposición
Enterobacterias
(Nº
348)
RG-712.00-050 Archivador
azul Bajo
custodia Papel
rotulado “Registro de laboratorio 348
lecturas de informes acceso restringido
de
resultados. a personal sección
Laboratorio
microbiología
Enterobacterias
(Nº
348)
9.
Fecha emisión:
06/2002
Revisión: 5
Almacenar por 5 años
y disponer en la basura
picada en trozos
TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº
4
4
4
4
Pág.
Modificada
1
Motivo del cambio
Se elimina formato página 1 por cambio en
formato de documento institucional
todas
Cambio de formato de todas las páginas por
cambio de formato a nivel institucional.
2
Se incluyen recomendaciones en el uso de
los medios VRBG y agar glucosa
En Etapa presuntiva se inclyen los controles
a realizar
Página 4,
Se agrega los controles de calidad
puntos 7.3.2.2 y necesarios para las pruebas bioquímicas.
7.3.3.1
Fecha Aprobación
08/05/2008
08/05/2008
08/05/2008
08/05/2008
10. ANEXOS
10.1 Anexo Nº 1 RG-712.00-024 Registro de análisis de muestras de alimentos laboratorio
Enterobacteria.
10.2 Anexo Nº 2 RG-712.00-050
Registro Control de
Ambiente Laboratorio de
Enterobacterias.
10.3 General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation.–MPN
technique and colony -count technique-ISO 7402 punto 4.2.2.
10.4 Anexo Nº 4 RG-712.00-004 Registro cepas control de Incubadoras.
10.5 Anexo Nº5 RG-712.00-006 Registro de Control de Esterilidad de Medios Cultivo
utilizados en el Análisis de coliformes, coliformes fecales, E. coli y Eterobacterias.