La información genética radica en el DNA que se encuentra
Anuncio
El diagnóstico genómico de las enfermedades (Seminario práctico) La información genética radica en el DNA que se encuentra empaquetado en el núcleo de las células 1 Si todas las células del organismo poseen la misma información genética, por qué tienen un fenotipo distinto...? Páncreas Hepatocito Neurona 9 Las células de los distintos tejidos están especializadas en llevar a cabo funciones muy diferentes. 9 En última instancia esas diferencias radican en las proteínas que se expresan en cada célula, que son distintas. 9 Ello es consecuencia de diferencias de expresión de los genes. Ciertos genes se expresan en todas las células. Otros, por el contrario, solo lo hacen en células muy determinadas • Por qué la albúmina sérica solo se expresa en los hepatocitos...? • Por qué la insulina solo se produce en las células beta...? Páncreas Hepatocito Neurona • Por qué el receptor del GABA solo se encuentra en las neuronas...? 2 El control de la expresión génica en eucariotas Promotor TATAAT Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 3 Stop AAAAAAAAAAA • Factores de transcripció transcripción hnRNA • Receptores nucleares mRNA AAAAAAAAAAA • Inhibidores Proteí Proteína Gen 1: solo se expresa en hí hígado Promotor TATAAT Gen 2: solo se expresa en pá páncreas Promotor TATAAT Gen 3: se expresa en ambas cé células Promotor TATAAT 3 Los principios de la regulación de genes típicamente hepáticos Albúmina DBP HN F3 NF-Y C/EBPα NF-1 F-4 HN C/EBPα C/EBPα HNF-1 TATAA Xanthopoulos & Mirkovitch Eur. J. Biochem. (1993) C/EBPβ (LAP) Factores de transcripción hepáticos • C/EBP: C/EBP: Basic leucine zipper protein • HNF1: HNF1: Homeodomain homolog • HNF4: HNF4: Orphan nuclear receptor • HNF3: HNF3: Forkhead homolog El axioma... DNA RNA Proteína Acción celular Los cambios observables en la célula son consecuencia de la expresión de genes... Efecto observable 4 DNA RNA Cambios en la proteína Efecto sobre las células Pero el DNA es estable... Acción externa Genómica DNA Transcriptómica RNA Proteómica Proteí Proteína Citómica Respuesta celular Efecto, acción externa 5 Genómica/ genómica funcional: 1. Existencia, expresión de un determinado gen 2. Identificación de polimorfismos, mutaciones, secuencias alteradas etc. (genes anormales) Métodos basados en la hibridización: 6 El fenómeno de la complementariedad de las bases - Timina/ Uracilo Adenina Citosina Guanina La hibridización DNA/RNA DNA/DNA DNA/RNA Solo secuencias complementarias hibridizan y forman complejos estables 7 Medida de los niveles de mRNA: “Southern Blot” Sonda cDNA marcada (radioactiva) acgataagcatgacct tgctattcgtactgga Extracción de DNA acgataagcatgacct Desnaturalizació Desnaturalización (95º (95º C) tgctattcgtactgga Incubació Incubación con la membrana (40º (40º C) Aplicación en gel de agarosa Revelado Transferencia + + electroforesis Nitrocelulosa Medida de los niveles de mRNA: “Northern Blot” Sonda cDNA marcada acgataagcatgacct tgctattcgtactgga Extracción de RNA acgataagcatgacct Desnaturalizació Desnaturalización (95º (95º C) tgctattcgtactgga Incubació Incubación con la membrana (40º (40º C) Aplicación en gel de agarosa Revelado Transferencia + + electroforesis Nitrocelulosa 8 Métodos basados en la amplificación: Medida de la expresión de genes La medida de la expresió expresión de genes se puede hacer de varias maneras: • Midiendo cambios en los niveles de proteí proteína (proteó (proteómica), • Midiendo cambios en la expresió expresión de mRNA (inestable!) • o bien conversió conversión del RNA a cDNA y su posterior medida 9 Medida de los niveles de cDNA: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • Es una té técnica de biologí biología molecular desarrollada por Karry Mullis en 1985. • Consiste en una amplificació amplificación repetida y selectiva de un fragmento de ADN (gen) especí específico partiendo de una mí mínima cantidad de muestra muestra • Tambié También es aplicable a la amplificació amplificación de RNA, pero requiere un paso previo de transcripció transcripción reversa (RT(RT-PCR). A partir de RNA es posible obtener un DNA complementario (cDNA) Reacción de transcriptasa reversa 10 La reacción PCR amplifica un fragmento específico de DNA. Se requiere: • DNA (cDNA) cDNA) que contiene el fragmento a amplificar 5’ 3’ 3’ 5’ Fragmento a amplificar • Oligos o cebadores (20 b) diseñ diseñados para hibridizar de manera selectiva con ambos extremos de la secuencia de DNA que se quiere amplificar amplificar Down Up • ADN Polimerasa termoestable (“Taq” Taq”). Actú Actúa a una temperatura de 72 ºC y resiste 95 ºC. Taq Etapas de la PCR Desnaturalización: las muestras se someten a una temperatura de 95 ºC para que las hebras se separen 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 1 minuto 95 ºC 11 2º Hibridación: la temperatura baja rápidamente, y los primers reconocen a sus secuencias complementarias en el DNA 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 40-65 ºC 3º Elongación: la tº aumenta y la taq polimerasa adiciona nucleótidos en sentido 5’ a 3’ ...... 5’ 3’ Taq 5’ 3’ 5’ Taq 5’ 72 ºC 12 .......... dando lugar a dos hebras dobles 5’ 3’ Taq 5’ 5’ Taq 3’ 5’ 72 ºC Primer ciclo 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 72 ºC 13 2º ciclo 1º Desnaturalización 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 1 minuto 95 ºC 2º ciclo Desnaturalización 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 1 minuto 95 ºC 14 2º ciclo 2º Hibridación 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 40-65 ºC 2º ciclo 3º Elongación 5’ 3’ Taq 3’ 5’ Taq 3’ 5’ 5’ 3’ Taq 5’ 5’ Taq 72 ºC 3’ 5’ 15 Fin del segundo ciclo 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 72 ºC 3’ - 5’ - Resumen 1º Desnaturalizació Desnaturalizaci 2º Hibridació Hibridaciónón 3º Elongació Elongación Muestra amplificada Marker 16 Ejemplo de amplificación de productos por PCR 1A1 1A2 2A6 2B6 M PCR en tiempo real 2C9 2C19 2D6 M 2E1 3A4 3A5 B-Act SYBR Green I 17 18 Aplicaciones: • 1. Determinació Determinación de los niveles de virus en biopsias hepá hepáticas de + pacientes hcv mediante rtrt-pcr cuantitativo. • El mé método se basa en la amplificació amplificación de una secuencia especí específica del genoma del virus mediante RTRT-PCR a tiempo real con un termociclador rápido (LightCycler ®). (LightCycler® • El mé método puesto a punto permite la detecció detección de secuencias de HCVHCV-RNA en biopsias hepá hepáticas y tiene una sensibilidad suficiente para evitar falsos negativos. • Seguimiento de enfermos tratados con interferó interferón 19 PCR cuantitativo Estrategia Biopsia hepática •Etapa RT estandarizada • Extracción de RNA total • Cuantificación del RNA • Control RNA exógeno Monitorización de la eficiencia •Diseño de primers • Transcripción reversa (RT) •PCR standards Medida de la fluorescencia en tiempo real de los productos de PCR Estándares de cDNA para el gen a medir • Amplificación PCR •Estimar la cantidad de cDNA en la muestra por interpolación en la curva • Determinar la eficiencia de la RT 150 100 50 0 .00 0 0 .0 0 4 0.0 0 8 0 .0 12 •Calcular el nº de copias por µg total RNA Pacientes HCV + Control sanos Pacientes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pool sanos prom edio Copias HCV/B Actina 2.3 5.5 1.6 7.6 1.0 4.2 0.8 2.4 11.4 2.6 0 3.95 20 • 2. Polimorfismos génicos. • Método 1: Amplificació Amplificación por PCR de la regió región del DNA que contiene la secuencia polimó polimórfica • Digestió Digestión de dicho fragmento con un enzima de restricció restricción, que reconozca la secuencia polimó polimórfica (por ejemplo corte el DNA si tal secuencia existe) • Electroforesis del fragmento de Dna amplificado y tratado con el enzima de restricció restricción. • Método 2. Amplificació Amplificación por PCR de la regió región del DNA con un primer que contiene la secuencia polimó ó polim rfica • Medida de la temperatura de melting, melting, que será será menor si no existe complementariedad de bases Genotipación CYP2D6*4 Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente Heterocigoto Wild type 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 wt wt wt/mut wt mut wt wt wt wt wt wt wt wt: wt: wild type wt/ wt/mut: mut: heterocigoto mut: mut: homocigoto Homocigoto 21 Melting curve CYP2D6*4 isoforms Wild tipe Homocigoto Heterocigoto Tecnología basada en detección sobre soporte sólido 22 Hay dos variantes de la tecnología: Tipo I: muestras de cDNA de secuencias especí específicas (500~5,000 bases) son depositadas en forma de microgotas sobre una superficie só sólida (porta de cristal) e inmovilizadas. Este método se le conoce como “DNA microarray” microarray”, y fue desarrollado por la Universidad de Stanford. Stanford. Generación de microarrays por impresión • Oligos o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio (50(50-100 micras, 0,20,2-0,5 ng) • Cientos a unos pocos miles de secuencias • Se pueden crear nuevos arrays en meses 23 Equipo robotizado para el procesamiento de las muestras Hay dos variantes de la tecnología... Tipo II: oligonucleó oligonucleótidos (20~80(20~80-bases) o nucleonucleo-péptidos se sintetizan bien in situ (sobre el soporte) o se sintetizan de manera convencional y se inmovilizan sobre el soporte. Se hibridiza con una muestra de cDNA marcado fluorescente, y se identifica la identidad del oligonuclé oligonucléotido al que se une y la intensidad de la señ señal Este mé método se le conoce como “DNA chips” chips”, y fue desarrollado por Affymetrix quien lo comercializa con el nombre de Gene chip® chip® . 24 Chips fotolitográficos T A A T A A A G C G T A C G A A G T G A T A G A TA A G A C GT T A GT T TA Chips fotolitográficos GTATTC TATTC TGGTC ATCCGTC GTGGTC • • • ATCCTTA ATCCTTA TGGTC TACCTA ATCCGTC GTGGTC TACCTA GTATTC TATTC Entre 40.000 y 400.000 secuencias equivalentes a 30.000 genes Deposición fotolitográfica de oligonucleótidos base a base El diseño y producción de nuevos chips lleva entre 1 y 2 años. 25 Genechip, Affymetrix Chips de DNA (DNA Microarray) Hígado humano Hepatoma Hepatocitos Extracción de RNA RNA 26 Hepatocitos Hepatoma • Transcripció Transcripción reversa de mRNA a cDNA mediante RTRT-PCR utilizando nucleó nucleótidos modificados • Generació Generación de un cDNA coloreado VERDE ROJO 53’’ TTTT AAAA 35’’ 35’’ 35’’ TTTT AAAA 53’’ 53’’ 53’’ 53’’ 53’’ TTTT AAAA TTTT AAAA 53’’ 35’’ TTTT AAAA 35’’ TTTT AAAA RNA seguido de degradación del mRNA... VERDE ROJO 5’ 3’ TTTT AAAA 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ TTTT AAAA 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ TTTT AAAA 5’ 3’ TTTT AAAA 5’ 3’ TTTT AAAA 5’ 3’ TTTT AAAA cDNA 27 Ambos cDNA se mezclan en un eppendorf 5’ 5’ TTTT TTTT 3’ 3’ TTTT 3’3’ 5’ 5’ TTTT 3’3’ 5’ 5’ TTTT TTTT TTTT ... y se aplican en el chip de DNA • Cada punto del chip contiene una secuencia que es específica de un solo gen • En un chip de DNA pueden alojarse hasta 30.000 genes Chip DNA TTTT 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ T TTTT 5’ 5’ ’ T 28 Aplicar la muestra en el chip de DNA • Si existe complementariedad, el cDNA marcado se unirá al chip en un punto determinado ...GATC... CTAG 3’ ...GATC... 5’ TTTT 3’ 3’ TT TT 5’ ...GATC... ...ATGC... TACG 3’ ...ATGC... 3’ TACG 3’ 5’ ...ATGC... TT TT TT ’ 5’ 3 ...GATC... TT TT gen # X TT 5’ TTTT 5’ 3’ 5’ ...ATGC... 3’ 3’ TTTT 3’ ...TCAG... T TT T 5’ TT TT 5’ ...TCAG... 5’ TT TT 3’ ...TCAG...3’ AGTC ...TCAG... gen # Y gen # Z Lavado del chip para eliminar el cDNA no unido ...GATC... CTAG 3’ ...GATC... 5’ TTTT 3’ 3’ TT TT 5’ ...GATC... ...ATGC... 3’ TACG 3’ ...ATGC... 3’ 3’ TACG 3’ ...ATGC... 5’ TT TT TT 3’ 5’ ...GATC... TT TT gen # X TT 5’ TTTT 5’ 3’ 5’ ...ATGC... 3’ 3’ TTTT gen # Y 3’ ...TCAG... T TT T 5’ TT TT 5’ ...TCAG... 5’ TT TT 3’ ...TCAG...3’ AGTC ...TCAG... gen # Z 29 Dicha unión no es perceptible a simple vista... 1. El chip es excitado por un haz de lá láser 2. La fluorescencia emitida por el cDNA unido es registrada. gen # X gen # Y gen # Z Laser de Verde Cámara oscura Rojo Superposición las 2 imágenes 30 Imagen real de un ensayo con chip de ADN Interpretación gen # X gen # Y gen # Z • El gen X solo lo expresan las cé células normales (hepatocitos) • El gen Z solo lo expresan las cé células tumorales (hepatoma) • El gen Y lo expresan ambos tipos de cé células 31 Aplicaciones básicas de la tecnología de DNA microarrays • Descubrimiento de nuevos genes o genes modificados (genó (genómica funcional) Polimorfismos, mutaciones puntuales (SNPs, snips), sustituciones, elecciones, inserciones • Diagnó Diagnóstico de enfermedades Identificar patologías a través de la expresión de determinados genes. Identificación de cambios genéticos asociados a un determinado Proceso Patológico. • Farmacogenó Farmacogenómica: (análisis genómico + farmacología molecular). Su objetivo es establecer correlaciones entre respuestas terapéuticas a fármacos y perfil genético de los pacientes. • Toxicogenó Toxicogenómica: mica: (análisis genómico + toxicología molecular). Su objetivo, establecer correlaciones entre respuestas tóxicas y cambios en la expresión de genes. DNA-chip Clasificación de leucemias y linfomas Diferencias de Expresión Génica de RNA específicos • Representados 400 genes • Oligos de 50 bases • Localizados en extremo 3’ • Blast < 70 % 32 DNA-chip para el Diagnóstico de una enfermedad congénita (Polimorfismos en nucleótidos aislados (SNPs, snips), sustituciones, delecciones, inserciones) • Representadas 125 mutaciones del gen asociadas a la enfermedad, y la correspondiente secuencia wt • 250 (x10) oligos DNADNA-chip para anticipar riesgos gené genéticos del cá cáncer • Las enfermedades genéticas con frecuencia están originadas por genes que o bien se transcriben de manera inapropiada (o mucho, o poco) o simplemente que no se expresan. • Este tipo de anomalías son muy frecuentes en el cáncer en donde puede haber alteraciones en la expresión de genes reguladores clave. A diferencia de otras enfermedades en las que un solo gen defectuoso es responsable de la patogenia de la enfermedad, cánceres que clínicamente parecen ser iguales, pueden ser muy genómicamente muy distintos • Por lo general en el cáncer están implicados genes que afectan a la estimulación y al bloqueo del ciclo celular, apoptosis, angiogénesis y metastatización 33 TOXICOGENOMICA Cambios en la expresió expresión diferencial de genes identificados Compuesto tóxico Compuesto no tóxico Fármaco nuevo Toxico? NO TOXIC 34 GENEGENE-PERPER-GENE comparison Gene expression TOTAL PROFILE comparison In vitro 35 La limitaciones del análisis genómico. ¿Qué no puede detectar el análisis genómico...? • Cambios postranscripcionales y postranslacionales • Correlación mRNA y proteína Principle of PROTEIN ARRAYS Array support Cocktail of Biotin-Ab Labeled- Samples Incubation of Sample with arrayed antibody supports Incubation with Biotinylated Ab 1-2 hrs. 1-2 hrs. streptavidin Incubation with Labeled-Streptavidin 1 hrs. Detection of signals Data analysis and graph 36
