validacion de la metodología analítica para la determinación de

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGÍA QUÍMICA
LABORATORIO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Y MATERIAS GRASAS
VALIDACION DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA
DETERMINACIÓN DE ACIDOS GRASOS EN ACEITES DE OLIVA
EXTRA VIRGEN
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUIMICO FARMACÉUTICO
VIVIANA ROSARIO JOFRE REBOLLEDO
Director: Q. Dr. Paz Robert
Co- Director: QF. Nalda Romero
SANTIAGO, CHILE
ENERO DE 2009
LA
PRESENTE
INVESTIGACIÓN
SE
LLEVÓ
A
CABO
CON
EL
FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO INNOVA-CORFO FORTALECIMIENTO DE
LA INDUSTRIA OLIVINICOLA NACIONAL (07CN13IAM-10).
ii
DEDICATORIA
A herMario, mi padre Mario, mi Estrella del cielo y mi familia, los amo con todo mi
corazón…
iii
AGRADECIMIENTOS
Me gustaría agradecer:
A mi herMario por su apoyo, comprensión, amor y dedicación. A mi padre
Mario y mi madre Julia por incentivarme a estudiar y llegar más lejos siempre;
A todos los integrantes de mi familia, quienes me brindaron mucho amor,
amistad y apoyo durante todo el largo proceso de la universidad;
A la profesora Paz Robert, patrocinante y directora de la memoria, por
invitarme a trabajar junto a ella y estar dispuesta a ayudarme en cada momento que
lo necesité;
A los profesores del laboratorio, Sra. Lilia Masson, Sra. Nalda Romero y Sr.
Jaime Ortiz, por acompañarme durante este proceso con sus consejos;
A Juan Carlos Moreno y Javier Ubilla por brindarme su colaboración en cada
jornada de trabajo en el laboratorio de química de los alimentos;
A Arturo Fernández, por su gran ayuda, compañía y amistad durante este
año en el laboratorio;
A cada uno de los que de alguna forma se han hecho participes de mi vida
universitaria.
iv
INDICE
DEDICATORIA ........................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iv
INDICE ....................................................................................................................... v
INDICE DE TABLAS ................................................................................................. ix
INDICE DE FIGURAS .............................................................................................. xv
RESUMEN ..............................................................................................................xvii
SUMMARY ............................................................................................................. xviii
I. INTRODUCCION .................................................................................................... 1
1.1. Antecedentes generales ...................................................................................... 1
1.2. Distribución de Olivos en Chile............................................................................ 2
1.2.2. Norte Chico ........................................................................................... 3
1.2.3. Zona Central ......................................................................................... 3
1.3. Variedades de Olivos en Chile ............................................................................ 4
1.4. Variedades de Aceite de Oliva ............................................................................ 6
1.4.1. Aceites de oliva vírgenes: ..................................................................... 7
1.4.2. Aceite de oliva refinado: ....................................................................... 8
1.4.3. Aceite de oliva – contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y
aceites de oliva vírgenes: ............................................................................... 8
1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo: ............................................................. 8
1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado: ......................................................... 9
1.4.6. Aceite de orujo de oliva: ....................................................................... 9
1.5. Cualidades del aceite de oliva ............................................................................. 9
1.6. Legislación vigente para el aceite de oliva ........................................................ 11
v
1.7. Validación de métodos analíticos ...................................................................... 13
II. OBJETIVOS ......................................................................................................... 15
2.1. Objetivo general ................................................................................................ 15
2.2. Objetivos especificos ......................................................................................... 15
III. MATERIALES Y METODOS ............................................................................... 16
3.1. Materiales .......................................................................................................... 16
3.1.1 Reactivos: .................................................................................................... 16
3.1.2 Equipo ......................................................................................................... 16
3.1.3 Material de Laboratorio................................................................................ 17
3.2. Metodologia ....................................................................................................... 17
3.2.1 Implementación de la técnica analítica para la determinacion de la
composición en ácidos grasos de aceite de oliva extra virgen. ............................ 17
3.2.1.1. Preparación de la muestra............................................................... 17
3.2.1.2. Análisis Cromatográfico ................................................................... 18
3.2.2. Aplicación de los parámetros de desempeño a las metodologías analíticas
de determinación de ácidos grasos. ..................................................................... 19
3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del método. ............................ 19
3.2.2.2 Límite de detección y cuantificación del método .............................. 20
3.2.2.3 Medidas de precisión ........................................................................ 23
3.2.2.4.Medidas de exactitud: Recuperación................................................ 24
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES....................................................................... 26
4.1. Determinación de la linealidad y sensibilidad .................................................... 26
4.2 Limite de detección y de cuantificación .............................................................. 28
4.3 Medidas de Precisión ......................................................................................... 32
4.3.1 Repetibilidad ................................................................................................ 32
4.3.2 Replicabilidad .............................................................................................. 34
vi
4.4 Medidas de exactitud ......................................................................................... 35
4.4.1. Recuperación ............................................................................................. 35
4.4 Muestras analizadas .......................................................................................... 36
V. CONCLUSIONES ................................................................................................ 40
VI. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 41
VII. ANEXOS ............................................................................................................ 45
ANEXO 1 .............................................................................................................. 45
Determinación de la linealidad y sensibilidad ................................................... 45
1.1. Preparación de la solución madre de los principales ácidos grasos presentes en
el aceite de oliva extra virgen. .................................................................................. 45
1.2. Construcción de las curvas de calibración ........................................................ 46
ANEXO 2 .............................................................................................................. 48
Determinación del límite de detección y de cuantificación. .............................. 48
2.1. Preparación de la solución madre ..................................................................... 48
2.2. Construcción de las curvas de calibración ........................................................ 49
2.3. Cálculo de σy/x de la regresión para la determinación de los límites de detección
y cuantificación. ........................................................................................................ 51
2.4. Cálculo del límite de detección y de cuantificación ........................................... 53
ANEXO 3 .............................................................................................................. 55
Repetibilidad ..................................................................................................... 55
ANEXO 4 .............................................................................................................. 57
Replicabilidad ................................................................................................... 57
ANEXO 5 .............................................................................................................. 59
Recuperación ................................................................................................... 59
ANEXO 6 .............................................................................................................. 61
Muestras ........................................................................................................... 61
vii
6.1. Composición en porcentaje de los ácidos grasos de las muestras de aceite de
oliva analizadas ........................................................................................................ 61
6.2. Análisis estadístico ANOVA .............................................................................. 64
6.2.1. Análisis ANOVA para el ácido palmítico (C16:0) ................................ 64
6.2. 2. Análisis ANOVA para el ácido palmitoleico (C16:1 ) ........................ 65
6.2.3. Análisis ANOVA para el ácido heptadecanoico (C17:0) ..................... 66
6.2. 4. Análisis ANOVA para el ácido heptadecenoico (C17:1) .................... 67
6.2.5. Análisis ANOVA para el ácido esteárico (C18:0)................................ 68
6.2.6. Análisis ANOVA para el ácido oleico (C18:1) ..................................... 69
6.2.7. Análisis ANOVA para el ácido linoleico (C18:2) ................................. 70
6.2.8. Análisis ANOVA para el ácido linolénico (C18:3) ............................... 71
6.2.9. Análisis ANOVA para el ácido araquídico (20:0) ................................ 72
6.2.10. Análisis ANOVA para el ácido eicosenoico (C20:1) ......................... 73
6.2.11. Análisis ANOVA para el ácido behénico (C22:0).............................. 74
viii
INDICE DE TABLAS
Págs.
TABLA 1.
Número de plantaciones por variedad de olivo.
4
TABLA 2.
Composición de ácidos grasos, expresada en % de
9
ésteres metílicos según el CODEX STAN 33-1981,
COI y Reglamento Sanitario de los Alimentos Chile.
TABLA 3.
Concentración (mg/mL) y porcentaje de los ácidos
16
palmítico, esteárico, oleico y linoleico, expresados
como porcentaje de ésteres metílicos.
TABLA 4.
Intervalos de concentración de los principales ácidos
grasos
ácido
palmítico
(C16:0),
ácido
16
esteárico
(C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2).
TABLA 5.
Concentraciones de los ácidos grasos minoritarios
TABLA 6.
Intervalos de concentración de ésteres metílicos de los
ácidos
grasos
minoritarios:
palmitoleico
18
(C16:1),
linoleico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico
(C20:1), behénico (C22:0).
TABLA 7.
Intervalos de concentración (mg/mL), sensibilidad
21
(pendiente), intercepto, coeficiente de correlación y
error estándar de la sensibilidad y del intercepto, para
ix
la determinación de la linealidad de los ácidos
palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y
linoleico (C18:2).
TABLA 8.
Intervalos de concentración, sensibilidad (pendiente),
24
intercepto, coeficiente de correlación, error estándar de
la sensibilidad y del intercepto y desviación estándar
de la regresión para la determinación de la linealidad
de los ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3),
araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behénico
(C22:0).
TABLA 9.
Límites de detección y cuantificación del método
26
(mg/mL)
TABLA 10.
Resultados de repetibilidad. Se presenta el promedio
27
(X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la
desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación
(CV) de cada ácido graso
TABLA 11.
Resultados de replicabilidad. Se presenta el promedio
28
(X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la
desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación
(CV) de cada ácido graso
x
TABLA 12.
Porcentajes de recuperación (R) y desviación estandar
29
(DE) obtenido para los ácidos C16:0, C18:0, C18:1 y
C18:2.
TABLA 13.
Perfil en ácidos grasos de aceites de oliva extra virgen,
30
variedades arbequina, picual y frantoio, expresado
como % de ésteres metílicos
TABLA 14.
Preparación de solución madre, peso de cada
38
estándar (mg), concentración y composición en
porcentaje de los ésteres metílicos de los ácidos
palmítico, esteárico, oleico y linoleico.
TABLA 15.
Concentración y área obtenida para la curva de
39
calibración del ácido palmítico C16:0
TABLA 16.
Concentración y área obtenida para la curva de
39
calibración del ácido esteárico C18:0
TABLA 17.
Concentración y área obtenida para la curva de
40
calibración del ácido oleico C18:1
TABLA 18.
Concentración y área obtenida para la curva de
40
calibración del ácido linoleico C18:2
TABLA 19.
Cantidades pesadas [mg] y concentración [mg/mL] de
41
cada ácido graso
xi
TABLA 20.
Concentración y área obtenida para la curva de
42
calibración del ácido palmitoleico C16:1
TABLA 21.
Concentración y área obtenida para la curva de
42
calibración del ácido linolénico C18:3
TABLA 22.
Concentración y área obtenida para la curva de
42
calibración del ácido araquídico C20:0
TABLA 23.
Concentración y área obtenida para la curva de
43
calibración del ácido eicosenoico C20:1
TABLA 24.
Concentración y área obtenida para la curva de
43
calibración del ácido behénico C22:0
TABLA 25.
Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de
44
calibración del ácido palmitoleico.
TABLA 26.
Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de
44
calibración del ácido linolénico.
TABLA 27.
Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de
45
calibración del ácido araquídico.
xii
TABLA 28.
Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de
45
calibración del ácido eicosenoico
TABLA 29.
Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de
45
calibración del ácido behénico.
TABLA 30.
Valores de σy/x obtenido para cada ácido graso.
46
TABLA 31.
Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en
49
las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva
variedad arbequina
TABLA 32.
Composición en ácidos grasos expresada como
49
porcentaje de ésteres metílicos en las 10 muestras
analizadas,
promedio,
desviación
estándar
y
coeficiente de variación.
TABLA 33.
Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en
51
las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva
variedad arbequina
TABLA 34.
Composición en ácidos grasos expresada como
51
porcentaje de ésteres en las 10 muestras analizadas,
promedio,
desviación
estándar
y
coeficiente
de
variación.
xiii
TABLA 35.
Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del
52
ácido palmítico C16:0
TABLA 36.
Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del
53
ácido esteárico C18:0
TABLA 37.
Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del
53
ácido oleico C18:1
TABLA 38.
Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del
54
ácido linoleico C18:2
TABLA 39.
Composición de ácidos grasos expresado en
55
porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación
estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva
variedad picual
TABLA 40.
Composición de ácidos grasos expresado en
55
porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación
estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva
variedad arbequina
TABLA 41.
Composición de ácidos grasos expresado en
56
porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación
estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva
variedad frantoio
xiv
INDICE DE FIGURAS
Págs.
FIGURA 1.
Participación de las distintas regiones en el área
3
plantada con olivos
FIGURA 2.
Variedades de olivos más plantadas expresadas
4
en porcentaje.
FIGURA 3.
Curva de calibración para el ácido palmítico
22
(C16:0)
FIGURA 4.
Curva de calibración para el ácido esteárico
22
(C18:0)
FIGURA 5.
Curva de calibración para el ácido oleico (C18:1)
23
FIGURA 6.
Curva de calibración para el ácido linoleico
23
(C18:2)
FIGURA 7.
Curva de calibración para el ácido palmitoleico
24
(C16:1)
FIGURA 8.
Curva de calibración para el ácido linolénico
25
(C18:3)
xv
FIGURA 9.
Curva de calibración para el ácido araquídico
25
(C20:0)
FIGURA 10.
Curva de calibración para el ácido eicosenoico
25
(C20:1)
FIGURA 11.
Curva de calibración para el ácido behénico
25
(C22:0)
FIGURA 12.
Cromatograma aceite de oliva extra virgen,
33
variedad arbequina, (1) ác. Palmítico, (2) ác.
Palmitoleico,
(3)
ác.
Heptadecanoico
y
heptadecenoico, (4) ác. Esteárico, (5) ác. Oleico,
(6) ác. Linoleico, (7) ác. Araquídico, (8) ác.
Linolénico,
(9)
ác.
Eicosenoico,
(10)
ác.
Behénico.
xvi
RESUMEN
El presente trabajo tuvo por objetivo validar e implementar una metodología analítica
por cromatografía de gases para la composición en ácidos grasos de un aceite de oliva extra
virgen, variedad arbequina.
Se determinó la linealidad del método de detección para los principales ácidos
grasos presentes en el aceite de oliva extra virgen, utilizando ésteres metílicos de los ácidos
palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2) en contenidos similares
a los del aceite. Las curvas de calibración obtenidas presentaron un coeficiente de
correlación superior a 0,99.
Se determinó el límite de detección y de cuantificación para los ácidos grasos
minoritarios presentes en el aceite de oliva extra virgen, utilizando ésteres metílicos de los
ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y
behénico (C22:0) en contenidos similares a los del aceite. Las concentraciones del límite de
cuantificación (0,017-0,154 mg/ml) fueron superiores al límite de detección (0,005-0,046
mg/ml), cercanas al último punto de la curva de calibración.
La precisión se determinó por medio de la repetibilidad y la replicabilidad. La
repetibilidad se evaluó con 10 muestras de aceite de oliva extra virgen en un mismo día, por
un mismo analista y en el mismo instrumento. La replicabilidad se evaluó en 10 días
diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos en repetibilidad y replicabilidad para los
ácidos grasos se ajustaron a la norma de la AOCS, excepto el ácido esteárico, que superó el
CV máximo permitido de 4%.
La exactitud se evaluó a través de la determinación de la recuperación en una
muestra de aceite sin y con (fortificación) la adición de los ésteres metílicos de los ácidos
palmítico, esteárico, oleico y linoleico. Se obtuvieron valores de recuperación entre 77 y
109%.
Se analizaron 26 muestras de aceites de oliva de las variedades arbequina, picual y
frantoio, encontrando diferencias significativas en el porcentaje de ésteres metílicos de
algunos ácidos grasos. La variedad arbequina presentó valores significativamente mayores
(p<0.05) en C16:0, C16:1, C17:0, C17:1 con respecto a las variedades picual y frantoio. La
variedad picual presento valores significativamente mayores (p<0,05) en C18:0 y C18:1 y
significativamente menores (p<0,05) de C18:2 y C18:3, con respecto a las variedades de
arbequina y frantoio. Para los ácidos 20:0, 20:1 y 22:0 no se encontraron diferencias
significativas.
xvii
SUMMARY
VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF
FATTY ACIDS IN EXTRA VIRGIN OLIVE OIL.
The objective of the present work was to validate and to implement the fatty acid
composition of a virgin extra olive oil, arbequina variety by gas chromatography.
The linearity of the detection method for the main fatty acids in the virgin extra olive oil was
determined using methyl esters of the palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and
linoleic (C18:2) acids with similar contents to those of the oil. The correlation coefficient of the
calibration curves obtained was above to 0.99.
The quantification and detection limit was determined for fatty acids minority in the virgin
extra olive oil, using methyl esters of the palmitoleic (C16:1), linolenic (C18:3), araquidic
(C20:0), eicosenoic (C20:1) and behenic (C22: 0) acids, in similar contents to those of the oil.
The concentration of the quantification limit (0,017-0,154 mg/ml) was higher than the detection
limit (0,005-0,046 mg/ml), near to the last point of the calibration curves.
Repeatability and replicability were used as the precision parameter. The repeatability was
evaluated with 10 virgin extra olive oil samples in a same day, by a same analyst and
instrument. The replicability was evaluated in 10 days different. The variation coefficients
obtained in repeatability and replicability for fatty acids were in according with the AOCS,
except for the stearic acid, with CV above 4%.
The exactitude was evaluated through the determination of the recovery in an oil sample
without and with (fortification) the addition of methyl esters of palmitic, stearic, oleic and linoleic
acids. The recovery values were between 77 and 109%.
Twenty six olive oil samples of the arbequina, picual and frantoio varieties were analyzed,
significant differences in the percentage of methyl esters of fatty acids were found. The
arbequina variety showed values of C16:0, C16:1, C17:0, C17:1 significantly higher (p<0.05)
than picual and frantoio varieties. The picual variety showed values significantly higher
(p<0.05) for C18:0 and C18:1 and lower (p<0.05) for C18:2 and C18:3, respect to arbequina
and frantoio varieties. There were not significant differences for C20:0, C20:1 and C22:0
acids.
xviii
I. INTRODUCCION
1.1. Antecedentes generales
Desde su introducción en la Península Ibérica, probablemente por parte de
los romanos y árabes alrededor del siglo VI a.C., el olivo ha sido considerado como
símbolo de paz, felicidad y de la cultura mediterránea, además de producir aceite
de oliva. Del vocablo griego elaia deriva la palabra latina olea y olivum (olivo); de la
palabra hebrea zait viene la palabra árabe az-zait y zaitum que posteriormente han
dado lugar al nombre español de aceite y aceituna.
Grecia era una potencia en el cultivo de los olivos. Estos llevaron el olivo y
aceite de oliva por el Mediterráneo. Sin embargo, los romanos fueron los que se
encargaron de mejorar las técnicas de cultivo y de la elaboración de aceite de oliva,
el cual en la antigua Roma se utilizaba con fines terapéuticos, comestibles y
combustible. Durante la Edad Media la producción de aceite disminuyó
considerablemente ya que el mundo estaba dominado por las guerras, por lo cual el
aceite de oliva se consideraba un producto lujoso. Junto a la llegada de Cristóbal
Colón a América, a fines del siglo XV, llegaron olivos los cuales fueron distribuidos
principalmente en Perú, México, Argentina y Chile.
A pesar de que hoy en día los olivos se pueden encontrar en todos los
países del mundo, la zona Mediterránea sigue siendo el centro de mayor
producción, siendo España el país con más olivos y con mayor producción de
aceite de oliva. No obstante, existen países en donde la producción es más bien
pequeña pero creciente, Chile es un ejemplo.
1
El desarrollo de la producción del Aceite de Oliva ha venido evolucionando
de acuerdo al desempeño de la industria en los últimos años, dado el gran aumento
de la demanda tanto nacional como internacional, lo que incentiva a realizar
importantes inversiones en el nivel productivo, impulsándose así, a alcanzar
mayores volúmenes de producción.
Se estima que el 65% de las superficies plantadas están destinadas a la
producción de aceite de oliva y el resto a la elaboración de aceitunas de mesa.
Las exportaciones de aceite de oliva virgen chileno durante el año 2007
aumentaron un 58% y 70% en cantidad y valor respectivamente comparado con el
año 2006. Los principales países a los cuales Chile exporta son Estados Unidos
(42%), España (14%), Canadá, Venezuela y México con cifras cercanas al 5% cada
uno (Iglesias, 2008).
1.2. Distribución de Olivos en Chile
1.2.1. Norte Grande
I Región:
En esta zona la principal área productiva es el valle de Azapa, ya que las
condiciones agroclimáticas son excelentes, sin embargo el agua es escasa.
2
1.2.2. Norte Chico
III Región:
En la provincia de Huasco las plantaciones se encuentran distribuidas en
Freirina y Vallenar, pero la mayor superficie se encuentra en el valle de Huasco. En
esta zona el 80% de las plantaciones están destinadas a la producción de aceitunas
en salmuera, el restante 20% está dirigido a la producción de aceite de oliva,
encontrando variedades aceiteras tales como Empeltre y Liguria.
IV Región:
El 80% de la superficie plantada se encuentra en la comuna de Ovalle, la
cual se dedica principalmente a la producción de aceite. Las variedades aceiteras
que se pueden encontrar en esta zona son: Frantoio, Arbequina, Leccino, Empeltre
y Ascolano.
1.2.3. Zona Central
Región Metropolitana:
En la provincia de Melipilla se produce aceite principalmente con variedades
aceiteras tales como Frantoio, Leccino y Arbequina.
VII Región:
En la comuna de Sagrada Familia se localiza la mayoría de los olivos de la
región, ya que está la empresa olivícola, productora de aceite de
oliva, más
3
importante de la región. Las variedades aceiteras que se encuentran en esta región
son Leccino, Frantoio, Empeltre y Liguria.
La distribución de la superficie nacional de acuerdo al número de
plantaciones de olivos en las distintas regiones del país se observa en la figura 1.
FIGURA 1. Participación de las distintas regiones en el área plantada con olivos.
1.3. Variedades de Olivos en Chile
La mayor parte de las variedades de olivos presentes en el mundo
provienen de la zona mediterránea de Europa, principalmente España e Italia.
Actualmente los cultivos chilenos más importantes son Arbequina, Frantoio,
Leccino, Picual y Coratina. En la tabla 1 se indica el número de plantaciones
correspondiente a cada variedad de olivos, los porcentajes correspondientes a las
variedades de los olivos se presentan en la figura 2. El cultivo de estos se
desarrolla principalmente entre las regiones de Tarapacá y de La Araucanía.
4
TABLA 1. Número de plantaciones por variedad de olivo.
Variedad
N° Plantaciones
Arbequina
36
Frantoio
30
Leccino
23
Picual
18
Coratina
10
Otros
60
Fuente. Catastro asociación de olivicultores. Variedades desde 1940
hasta 2006, según datos encuesta.
Variedades más Plantadas
Arbequina
20%
34%
Frantoio
Leccino
17%
6%
Picual
Coratina
10%
13%
Otros
Fuente. Catastro asociación de olivicultores. Variedades desde 1940 hasta 2006, según
datos encuesta.
FIGURA 2. Variedades de olivos más plantadas expresadas en porcentaje.
Frantoio: Variedad italiana, muy común en la zona de La Toscana, y que se
ha propagado a numerosos países productores de aceite. Su fruto de tamaño
mediano, produce un aceite de mucha calidad organoléptica, muy frutal, de tonos
verdosos y muy estable, ya que es rico en polifenoles.
5
Leccino: Se cultiva en toda la península italiana, ya que se utiliza como
agente polinizador. Es una variedad de fruto grande y de maduración muy pareja.
Su aceite es bastante amargo y tiene un sabor muy verde.
Coratina: Otra variedad italiana, que se cultiva principalmente en la región
de La Puglia (Bari). Gracias a su altísimo contenido de polifenoles generalmente se
utiliza para enriquecer mezclas y no como monovarietal. Su fruto es grande y
produce un aceite de color muy amarillento.
Arbequina: Esta variedad es originaria de España y entrega un fruto ovalado
y pequeño. Su aceite ha tenido muy buena aceptación en los mercados poco
habituados al consumo de aceite de oliva.
Picual: Proveniente de España, es la variedad más importante del mundo,
representa el 20% del total mundial y el 50% de las plantaciones ibéricas. Su fruto
es mediano muy estable, de color verde y con un sabor picante bien acentuado.
Otros tipos de olivos plantados corresponden a Nocellara del Belice,
Empeltre, Liguria, Barnea, Hojiblanca, Arbosana, Manzanilla, Bosana, Biancolilla,
Picholine, Suri, Cerasuola, Racimo (Racimo negra, racimo verde, racimo grando),
Santa Emiliana, Sevillana, Pendolino, Grappoic y Taggiasca
1.4. Variedades de Aceite de Oliva
6
El COI/T.15/NC nº 3/Rev. 1. 2003 denomina los diferentes tipos de aceites
de oliva según el modo de obtención y la acidez de éste. A continuación se
presentan los criterios de clasificación:
1.4.1. Aceites de oliva vírgenes:
Aceite obtenido del fruto del olivo únicamente por procedimientos mecánicos
u otros procedimientos físicos en condiciones, sobre todo térmicas, que no implique
la alteración del aceite y no hayan sufrido tratamiento alguno distinto del lavado,
decantación, el centrifugado y la filtración, se excluyen de los aceites obtenidos
mediante disolventes o por procedimientos de reesterificación, y toda mezcla con
aceites de otra naturaleza.
Dichos aceites son objeto de la clasificación y de las denominaciones
siguientes:
Aceite de Oliva Virgen Extra: aceite de oliva virgen con una acidez libre,
expresada en cantidad de ácido oleico, como máximo de 0,8g por 100g, siendo la
mediana de sus defectos 0, y la del atributo frutado superior a 0.
Aceite de Oliva Virgen: aceite de oliva virgen con una acidez libre máxima
de 2g por 100g, siendo la mediana de sus defectos inferior o igual a 2,5, y la del
atributo frutado superior a 0
7
Aceite de oliva Lampante: aceite de oliva virgen con una acidez libre,
superior a 2g por 100g siendo la mediana de sus defectos superior a 2,5, y la del
atributo frutado superior a 0.
1.4.2. Aceite de oliva refinado:
Aceite de oliva obtenido mediante el refinado de aceites de oliva vírgenes,
cuya acidez no podrá ser superior a 0,3 g por 100g, y cuyas otras características
son conformes a las establecidas por esta categoría.
1.4.3. Aceite de oliva – contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites
de oliva vírgenes:
Aceite de oliva constituido por una mezcla de aceite de oliva refinado y de
aceites de oliva vírgenes distintos del aceite lampante, cuya acidez libre no podrá
ser superior a 1g por 100g, y cuyas otras características son conformes a las
establecidas por esta categoría.
1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo:
Aceite obtenido a partir del orujo de oliva mediante tratamiento con
disolvente o por medios físicos, o que corresponda, con excepción de algunas
características determinadas, a un aceite de oliva lampante.
8
1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado:
Aceite obtenido mediante refino de aceite de oliva de orujo crudo, cuya
acidez libre, expresada en ácido oleico, no podrá ser superior a 0,3g por 100g y
cuyas otras características son conformes a esta categoría.
1.4.6. Aceite de orujo de oliva:
Aceite constituido por una mezcla de aceite de orujo de oliva refinado y de
aceites de oliva vírgenes distintos del lampante, cuya acidez libre, expresada en
ácido oleico, no podrá ser superior a 1g por 100g y cuyas otras características son
conformes a las establecidas para esta categoría.
De lo anterior se deduce que la Industria Olivícola Chilena posee un enorme
potencial de desarrollo, el cual requiere apoyo tecnológico de última generación
para mejorar la calidad de sus productos y defenderse de medidas paraarancelarias que contribuyan en la penetración de los mercados internacionales.
1.5. Cualidades del aceite de oliva
El aceite de oliva es un alimento que posee grandes cualidades nutricionales
benéficas para la salud, que se basan en el contenido y composición de sus ácidos
grasos. Estos forman parte de los fosfolípidos de la membrana, siendo precursores
de sustancias de gran importancia y de diversas funciones fisiológicas, como las
prostaglandinas, prostaciclinas, tombroxanos y leucotrienos, sustancias a las que
9
se atribuyen funciones como las agregación y antiagregación plaquetaria, la
vasoconstricción o vasodilatación, respuestas de mayor o menor carácter
inflamatorio o antiinflamatorio.
Un aceite de oliva de excelente calidad (extra virgen) está compuesto
principalmente, por un ácido monoinsaturado, que es el ácido oleico (65-85%), de la
familia omega 9 y un ácido poliinsaturado, que es el linoleico (4-14%), el cual
pertenece al grupo de los omega 6, ambos con una marcada acción benéfica sobre
el sistema cardiovascular, además de que no contiene ácidos grasos trans. Se sabe
que una dieta rica en aceite de oliva, disminuye las concentraciones de colesterol
plasmático, tanto del total como del LDL, el cual es aterogénico, además mantiene y
eleva la concentración de colesterol HDL, el cual es antiaterogénico. Otro efecto de
una dieta rica en ácidos grasos monoinsaturados es que se favorece la formación
de compuestos con acción antiagregante y vasodilatadora, es decir, tiene un efecto
antitrombogénico. Así mismo, a nivel vascular el acido oleico disminuye la presión
sistólica y la diastólica. También muestra una influencia positiva en funciones
digestivas: gástricas, biliares, pancreáticas e intestinales (Serra, 2006).
Los ácidos grasos trans son ácidos grasos que contienen al menos un doble
enlace trans, a pesar de ser insaturados se comportan como ácidos grasos
saturados, aumentando el riesgo de enfermedades cardiovasculares, además la
incorporación de los ácidos grasos trans a los fosfolipidos de la membrana celular
provoca cambios en la permeabilidad y la hace más fácilmente oxidable, proceso
que acelera el envejecimiento celular (Hernández, 1999). Son producidos durante
los procesos de hidrogenación o de refinación de aceites y grasas. Sin embargo,
10
están presentes naturalmente en productos como la mantequilla y la carne de
rumiantes.
La presencia de isomeros trans de los ácidos oleico, linoleico y linolénico en
el aceite de oliva por sobre los niveles permitidos, podría indicar que existe alguna
adulteración con aceites vegetales hidrogenado ó aceites de oliva refinados, donde
se han aplicado altas temperaturas.
1.6. Legislación vigente para el aceite de oliva
En la tabla 2, se presenta la composición en ácidos grasos por
cromatografía de gases (% esteres metílicos), de acuerdo con el CODEX STAN 331981 (Rev. 2-2003), COI/T.15/NC nº 3/Rev. 1 2003 y Reglamento Sanitario de los
Alimentos Decreto Supremo 977-96 Chile.
11
TABLA 2. Composición de ácidos grasos, expresada en % de ésteres
metílicos según el CODEX STAN 33-1981, COI y Reglamento Sanitario de
los Alimentos Chile.
Acido Graso
CODEX
COI
DS 977 96
C14:0 (Mirístico)
0 - 0,05
≤0,05
< 0,1
C16:0 (Palmítico)
7,5 - 20,0
7,5 - 20,0
7 - 17
C16:1 (Palmitoleico)
0,3 - 3,5
0,3 - 3,5
0,3 - 4
C17:0 (Heptadecanoico)
0,0 - 0,3
≤0,03
NE
C17:1 (Heptadecenoico)
0,0 - 0,3
≤0,03
NE
C18:0 (Esteárico)
0,5 - 5,0
0,5 - 5,0
1-3
C18:1 (Oleico)
55,0 - 83,0
55,0 - 83,0
65 - 85
C18:2 (Linoleico)
3,5 - 21,0
3,5 - 21,0
4 - 14
C18:3 (Linolénico)
NE
≤ 1,0
0,5 - 1,5
C20:0 (Araquídico)
0,0 - 0,6
≤ 0,6
< 0,5
C20:1 (Eicosenoico)
0,0 - 0,4
≤ 0,4
< 0,2
C22:0 (Behénico)
0,0 - 0,2
≤ 0,2
< 0,2
C24:0 (Lignocérico)
0,0 - 0,2
≤ 0,2
< 0,1
C18:1t
0,0 - 0,05
≤0,05
NE
C18:2t + C18:3t
0,0 - 0,05
≤0,05
NE
NE= no especificado
Para dar cumplimiento a estas especificaciones es que se hace importante
caracterizar los atributos de calidad de los aceites de esta industria como producto
de consumo nacional y de exportación. Para la caracterización es necesario llevar
a cabo procesos de análisis de los aceites en cuestión, a través de métodos
debidamente validados.
12
1.7. Validación de métodos analíticos
La validación según la FDA es el establecimiento de la evidencia
documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de
seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las
especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. Otra definición
de una validación es “el procedimiento para demostrar que el método analítico es
aceptable para el fin que se pretende” (Harris, 2006).
La validación de los métodos analíticos es una actividad fundamental en los
sistemas de calidad de los laboratorios. El proceso de validación, guarda una
estrecha relación con la representatividad de los resultados, dependiendo del
objetivo de los análisis y del tipo de muestra (San Martín, 2000).
Existen dos tipos de validación: prospectiva y retrospectiva.
Una validación prospectiva es la que se realiza cuando la verificación del
cumplimiento de las condiciones establecidas para un proceso o método analítico,
se llevan a cabo antes de la comercialización del producto. Este tipo de validación
se aplica cuando se elabora un nuevo método analítico. Es típico en los
laboratorios de investigación y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un protocolo
perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios necesarios
para demostrar el buen funcionamiento del método.
Una validación retrospectiva es la que se realiza para verificar la idoneidad
del proceso analítico. La garantía de la calidad de un producto queda constatada a
13
través de los datos analíticos del producto ya comercializado. Se aplica a métodos
no validados previamente y de los que se tiene una amplia historia de resultados.
En una validación de métodos analíticos se miden los siguientes
parámetros: exactitud, precisión, selectividad, limite de detección y cuantificación.
La exactitud evalúa la cercanía existente entre el valor hallado en el analísis
respecto al valor verdadero o valor de referencia.
La precisión permite conocer la variabilidad del método determinando
replicabilidad y repetibilidad, en las que se evalúa la variabilidad del método
efectuando el analisis en las mismas condiciones (analista, instrumentos, reactivos,
dia) y la variabilidad del método sobre la misma muestra pero en diferentes
condiciones respectivamente.
Limite de detección determina la mínima cantidad del analito en la muestra
que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada.
Límite de cuantificación determina la mínima cantidad del analito que puede
ser determinada con precisión y exactitud.
Selectividad determina si el método analítico en desarrollo entrega una
señal medible correspondiente sólo a la presencia de los analitos de la muestra sin
interferencias de impurezas, productos de degradación u otras sustancias
presentes en ella.
14
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Validar e implementar una metodología por CG para Ácidos Grasos en
Aceite de Oliva extra virgen, variedad Arbequina.
2.2. Objetivos especificos
•
Implementar la metodología analitica por CG para la determinación
de la composición en ácidos grasos en aceite de oliva extra virgen.
•
Validar
la
metodología
analítica
mediante
la
aplicación
de
parámetros de desempeño:
•
Determinar el Intervalo de linealidad
y sensibilidad del
método mediante una curva de calibración.
•
Determinar el límite de detección y cuantificación del método.
•
Determinar la precisión del método a partir de la replicabilidad
y la repetibilidad.
•
Determinar
la
exactitud
del
método
en
términos
de
recuperación.
15
III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales
-
Aceite de Oliva extra virgen variedad Arbequina, cosecha 2007, obtenido de
Chile-Oliva, que se utilizó para la validación.
-
26 muestras de aceite de oliva extra-virgen, 10 muestras de variedad
arbequina, 10 muestras de variedad picual y 6 muestras de variedad frantoio,
obtenidas de Chile-Oliva.
3.1.1 Reactivos:
-
Stándares de ésteres metílicos: ácido palmítico (C16:0), ácido
palmitoléico (C16:1), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico
(C18:2), ácido linolénico (C18:3), ácido araquídico (C 20:0), ácido eicosenoico
(C20:1), ácido behénico (C22:0) (Sigma).
-
Hexano para análisis
-
Metanol para análisis
-
KOH para análisis
3.1.2 Equipo
Cromatografo: Hewlett Packard (HP) 5890 serie II con detector FID,
integrador HP 3395, con columna SP-2560 (100 m x 0,25 µm film x 0,20 d.i.;
SUPELCO, USA)
16
3.1.3 Material de Laboratorio
-
Jeringa 1 µL para GC (SGE)
-
Pipetas pasteur
-
Micropipetas 200 y 1000 µL
-
Tubos tapa rosca 5 mL
-
Matraces aforados 5, 10 y 25 mL
3.2. Metodologia
3.2.1 Implementación de la técnica analítica para la determinacion de la
composición en ácidos grasos de aceite de oliva extra virgen.
Se implementó la metodología para la determinación de la composición en
ácidos grasos por cromatografía de gases considerando las recomendaciones del
Diario Oficial de las Comunidades Europeas REGLAMENTO (CE) Nº 796/2002 DE
LA COMISIÓN de 6 de mayo de 2002 por el que se modifica el Reglamento (CEE)
Nº 2568/91.
3.2.1.1. Preparación de la muestra
Los
ésteres
metílicos
de
los
ácidos
grasos
se
prepararon
por
transesterificación en frio con una solución metanólica de hidróxido potásico, de
acuerdo al método, descrito en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.
17
Procedimiento
En un tubo con tapa rosca de 5 ml se pesó aproximadamente 0,1g (7 gotas)
de la muestra de aceite. Se agregó 3 ml de hexano y se agitó. Luego, se añadió 0,5
ml de la solución metanólica 2 N de hidróxido potásico, se tapó, se cerró bien y se
agitó enérgicamente durante 30 segundos. Se dejó reposar hasta que la parte
superior de la solución quedó clara, aproximadamente 45 minutos. Luego, se
extrajo la fase de hexano que contenía los ésteres metílicos y se inyectó en el
cromatógrafo de gases. Es aconsejable mantener la solución en el frigorífico (<5ºC)
hasta el momento de realizar el análisis cromatográfico. No se recomienda guardar
la solución durante más de 12 horas.
3.2.1.2. Análisis Cromatográfico
Los ésteres metílicos se analizaron por cromatografía de gases de acuerdo
al siguiente programa:
Temperatura del inyector
: 230ºC.
Temperatura del detector
: 250ºC.
Programación de la temperatura del horno: temperatura inicial de 180ºC
durante 15 minutos y luego se aumentó a razón de 0,5ºC/min hasta 193ºC.
Gas portador: hidrógeno a una presión de 30 psi
Se inyectó un volumen de 1,0 µL de las soluciones Standard y de la
muestra. La identificación de los ésteres metílicos, se realizó con soluciones
patrones.
18
3.2.2. Aplicación de los parámetros de desempeño a las metodologías analíticas de
determinación de ácidos grasos.
3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del método.
El intervalo de linealidad y sensibilidad del método se realizó para los
principales
ácidos grasos
presentes en
el
aceite
de
oliva
extra-virgen,
correspondientes a los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y
linoleico (C18:2), en porcentajes similares a los del aceite de oliva.
Para realizar la curva de calibración se preparó una solución estándar con
los ésteres metílicos de los ácidos grasos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2 en hexano.
La tabla 3 muestra la concentración y porcentaje de los ácidos grasos, expresados
como ésteres metílicos.
TABLA 3. Concentración (mg/mL) y porcentaje de
los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico,
expresados como porcentaje de ésteres metílicos.
Acido Graso
mg/mL
%
C16:0 (Ac. Palmítico)
8,28
12,4
C18:0 (Ac. Esteárico)
2,04
3,1
C18:1 (Ac. Oleico)
49,97
74,9
C18:2 (Ac. Linoleico)
6,44
9,6
Cada curva de calibración se construyó realizando 6 diluciones de la
solución estándar y se aforaron a 5 mL, de tal manera que el área de los ésteres
metílicos del aceite de oliva (muestra) pudiera ser interpolada en ella. En la tabla 4
se presenta el intervalo de concentración de cada éster metílico de ácido graso.
19
Cada dilución se inyectó en el CG, registrándose las áreas obtenidas, y
graficándolas frente a la concentración (mg/mL). De éstos gráficos se calculó la,
pendiente, intercepto y coeficiente de correlación (r).
TABLA 4. Intervalos de concentración de los principales ésteres
metílicos de los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico
(C18:1) y linoleico (C18:2).
Concentración
Concentración
Acido Graso
mínima (mg/mL)
máxima (mg/mL)
C16:0
0,83
7,45
C18:0
0,20
1,84
C18:1
5,00
44,97
C18:2
0,64
5,80
El valor de la sensibilidad se obtuvo de la pendiente de la curva de
calibración de cada éster de ácido graso, de acuerdo a la ecuación.
Y = S* x + b
(1)
Donde:
Y= Área
S= Sensibilidad (área*mL/mg)
X= Concentración (mg/mL)
b= Intercepto
3.2.2.2 Límite de detección y cuantificación del método
El límite de detección corresponde a la concentración mínima que puede
ser detectada por el instrumento usado en el análisis, y que arroja una señal
cualitativa. El límite de cuantificación corresponde a la concentración mínima en
que el instrumento puede producir una señal cuantificable.
20
El límite de detección y cuantificación del método para la determinación de
la composición en ésteres metílicos, en aceite de oliva extra virgen variedad
Arbequina, se calculó para las señales más pequeñas, correspondientes a los
ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico
(C20:1) y behénico (C22:0). Se realizó el cálculo de los límites de detección y
cuantificación, a través de una curva de calibración de estos ácidos grasos, en
concentraciones cercanas a la real en Aceite de Oliva.
Para determinar el límite de detección y de cuantificación, se preparó una
solución estándar con los ésteres metílicos de los ácidos grasos C16:1, C18:3,
C20:0, C20:1, C22:0, en hexano. En la tabla 5 se presenta la concentración de los
ésteres metílicos de los ácidos grasos en mg/mL.
TABLA 5. Concentraciones de los ésteres
metílicos de los ácidos grasos minoritarios.
Concentración
Ácido graso
[mg/mL]
C16:1 (Ac. Palmitoleico)
2,0
C18:3 (Ac. Linolénico)
4,9
C20:0 (Ac. Araquídico)
0,1
C20:1 (Ac. Eicosenoico)
1,0
C22:0 (Ac. Behénico)
2,1
La curva de calibración se preparó tomando 6 alícuotas de la solución
estándar, y se aforaron a 5 mL. En la tabla 6, se presentan los intervalos de
concentración utilizados en la curva de calibración. Cada dilución se inyectó en el
CG, registrándose las áreas obtenidas, y graficándolas frente a la concentración
(mg/mL). De éstos gráficos se calculó la pendiente, intercepto, coeficiente de
correlación (r) y desviación estándar.
21
TABLA 6. Intervalos de concentración de ésteres metílicos
de los ácidos grasos minoritarios: palmitoleico (C16:1),
linoleico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1),
behénico (C22:0).
Ácidos
Concentración
Concentración
Grasos
mínima (mg/mL)
máxima (mg/mL)
C16:1
0,080
1,00
C18:3
0,020
0,69
C20:0
0, 016
0, 56
C20:1
0, 020
0, 40
C22:0
0, 009
0, 30
Se utilizó la desviación estándar de la regresión de las curvas de calibración
de cada ácido graso, la cual se calculó de acuerdo a la ecuación 2.
σy/x=√
Σ(yi - y’i)2
(n-2)
(2)
Donde:
σ = Desviación estándar de la regresión
yi = Valor observado del punto en la ordenada
y’i= Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de
regresión
n = Número de puntos de la curva de calibración.
Los límites de detección y cuantificación se calcularon a través de las
ecuaciones 3 y 4.
Límite de detección (LD) es:
CLD= 3σ
S
(3)
22
Límite de cuantificación (LC) es:
CLC= 10σ
S
(4)
Donde:
CLD= Concentración del limite de detección (mg/mL)
CLC= Concentración del limite de cuantificación (mg/mL)
σ = Desviación estándar de la regresión (área).
b = intercepto de la curva de calibración (área)
S= pendiente de la curva de calibración (área* mL/mg)
3.2.2.3 Medidas de precisión
Precisión: es el parámetro que expresa la cercanía de coincidencia o grado
de dispersión, entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestreos de
una misma muestra homogenea bajo condiciones establecidas. Se evalúa a través
de los parámetros de replicabilidad y repetibilidad.
Repetibilidad: Se determinó la repetibilidad de ésteres metílicos de una
misma muestra de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina. Se metilaron 10
muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo al método
de metilación detallado en 2.1.1 y se inyectaron en el cromatógrafo de gases, de
acuerdo al método detallado en 2.1.3, en el mismo día. Se calcularon, los valores
promedio, desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación.
Replicabilidad: Se determinó la replicabilidad de ésteres metílicos de una
misma muestra de aceite de oliva extra virgen variedad arbequina. Se metilaron 10
23
muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo al método
de metilación detallado en 2.1.1 y se inyectaron en el cromatógrafo de gases, de
acuerdo al método detallado en 2.1.3, en distintos días. Se calcularon los valores
promedio, desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación.
3.2.2.4.Medidas de exactitud: Recuperación.
Se metilaron dos muestras de aceite de oliva en paralelo, una real y una
fortificada con estándares dentro del intervalo de linealidad del método. Se
obtuvieron los datos de las áreas de ésteres metílicos de los ácidos grasos: ácido
palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), y ácido linoleico
(C18:2) y se calcularon los porcentajes (%) de recuperación.
Para el cálculo de los porcentajes de recuperación, se procedió de la
siguiente forma:
1º Se inyectó en el CG una muestra real y se obtuvo un área para cada
éster metílico del ácido graso a medir.
2º Se agregó una cantidad conocida de cada éster metílico de ácido graso a
la muestra (concentración fortificación agregada), se inyectó en el CG y se obtuvo
el área correspondiente a cada ácido graso con la respectiva fortificación.
3º Las áreas fueron restadas y con este resultado (área de la fortificación) se
calculó la concentración obtenida de cada ácido graso, utilizando las curvas de
calibración de ellos (concentración fortificación obtenida).
24
El porcentaje de recuperación se calculó de acuerdo con la ecuación 5
% Recuperación =
Cfo * 100
(5)
Cfa
Donde:
Cfo= Concentración fortificación obtenida
Cfa= Concentración fortificación agregada
25
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1. Determinación de la linealidad y sensibilidad
En la tabla 7 se muestra el intervalo de concentración (mg/mL) de los
estándares de los ésteres metílicos de los ácidos grasos, sensibilidad (pendiente),
intercepto, coeficiente de correlación y error estándar de la sensibilidad y del
intercepto, para la determinación de los ácidos palmítico, esteárico, oleico y
linoleico, los cuales corresponden a los principales ácidos grasos presentes en el
aceite de oliva. El intervalo de concentración estudiado correspondió al que
generalmente presentan los aceites de oliva extra virgen (variedad arbequina)
TABLA 7. Intervalos de concentración (mg/mL), sensibilidad (pendiente), intercepto,
coeficiente de correlación y error estándar de la sensibilidad y del intercepto, para la
determinación de la linealidad de los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0),
oleico (C18:1) y linoleico (C18:2).
Acido
graso
C16:0
C18:0
C18:1
C18:2
Intervalo de
concentración
(mg/mL)
S
ES*
N
ES**
r
7,45 - 0,83
1,84 - 0,20
44,97 - 5,00
5,80 - 0,64
607561
811465
587630
480022
7888
49715
12506
4925
63450
155547
-100040
-27759
37892
58864
362599
18282
0,9996
0,9923
0,9991
0,9998
S= sensibilidad (pendiente de la curva), n= intercepto, ES= error estándar, ES* de la pendiente,
ES** del intercepto
En las figuras 3, 4, 5 y 6, se muestran los gráficos de área versus
concentración (mg/mL) para los estándares de los ésteres metílicos de los ácidos
palmítico, esteárico, oleico y linoleico, respectivamente.
26
En la tabla 7 y las figuras 3-6, se observa una alta correlación, dada por el
coeficiente de correlación r para las curvas de calibración de cada uno de los ácidos
grasos e intervalo de concentración estudiados.
área
Curva Calibración C16:0
5000000
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Concentración [mg/mL]
FIGURA 3. Curva de calibración para el ácido palmítico (C16:0)
áreas
Curva Calibración C18:0
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
Concentración [mg/mL]
FIGURA 4. Curva de calibración para el ácido esteárico (C18:0)
27
Curva Calibración C18:1
30000000
áreas
25000000
20000000
15000000
10000000
5000000
0
0,00
5,00
10,00
15,00 20,00
25,00 30,00
35,00
40,00
45,00 50,00
Concentración [mg/mL]
FIGURA 5. Curva de calibración para el ácido oleico (C18:1)
Curva Calibración C18:2
3000000
áreas
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Concentración [mg/mL]
FIGURA 6. Curva de calibración para el ácido linoleico (C18:2)
4.2 Limite de detección y de cuantificación
En la tabla 8 se muestra el intervalo de concentración (mg/mL) de los
estándares de los ésteres metílicos de los ácidos grasos, sensibilidad (pendiente),
intercepto, coeficiente de correlación, error estándar de la sensibilidad y del
intercepto y desviación estándar de la regresión, para la determinación de los
28
ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico, los cuales
corresponden a los ácidos grasos presentes en menor concentración en aceites de
oliva. El intervalo de concentración estudiado correspondió al que generalmente
presentan los aceites de oliva extra-virgen (variedad arbequina).
TABLA 8. Intervalos de concentración, sensibilidad (pendiente), intercepto,
coeficiente de correlación, error estándar de la sensibilidad y del intercepto y
desviación estándar de la regresión para la determinación de la linealidad de los
ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico
(C20:1) y behénico (C22:0).
Acido
graso
C16:1
C18:3
C20:0
C20:1
C22:0
Intervalo de
concentración
(mg/mL)
S
ES*
n
ES**
r
σ
1,00 - 0,20
0,692 - 0,099
0,563 - 0,040
0,200 - 0,020
0,300 - 0,128
324939
34484
377935
576894
381434
5466
673
15667
18522
14319
1682
14914
1622
-3581
-1236
3314
227
5171
4367
2809
0,9999
0,9998
0,9974
0,9987
0,9986
4989
188
1061
983
2174
S= sensibilidad (pendiente del gráfico área vs concentración), n= intercepto (del gráfico área vs concentración),
ES= desviación estándar, ES* de la pendiente, ES** del intercepto, σ = desviación estándar de la regresión.
En las figuras 7, 8, 9, 10 y 11 se muestran los gráficos de área versus
concentración (mg/mL) para los ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico,
eicosenoico y behénico, respectivamente.
En la tabla 8 y las figuras 7-11, se observa una alta correlación, dada por el
coeficiente de correlación (r) para las curvas de calibración de cada uno de los
ácidos grasos e intervalos de concentración estudiados.
29
Curva Calibración C16:1
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0,150
0,250
0,350
0,450
0,550
0,650
0,750
0,850
0,950
1,050
Concentración (mg/ mL)
FIGURA 7. Curva de calibración para el ácido palmitoleico (C16:1)
Curva Calibración C18:3
35000
Area
30000
25000
20000
15000
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
Concentración (mg/mL)
0,500
0,600
FIGURA 8. Curva de calibración para el ácido linolénico (C18:3)
Curva Calibración C20:0
250000
Area
200000
150000
100000
50000
0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
Concentración (mg/mL)
0,500
0,600
FIGURA 9. Curva de calibración para el ácido araquídico (C20:0)
Curva Calibración C20:1
150000
130000
Area
110000
90000
70000
50000
30000
10000
-10000
0,000
0,050
0,100
0,150
Concentración (mg/mL)
0,200
0,250
FIGURA 10. Curva de calibración para el ácido eicosenoico (C20:1)
30
Curva Calibración C22:0
120000
Area
100000
80000
60000
40000
20000
0
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
Concentración (mg/mL)
0,250
0,300
0,350
FIGURA 11. Curva de calibración para el ácido behénico (C22:0)
En la tabla 9 se presenta el limite de detección y de cuantificación (mg/ mL)
determinado para los ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y
behénico, calculado en relación a la desviación estándar de la regresión con la que
se obtuvo la curva de calibración de cada ácido graso.
TABLA 9.Límites de detección y
cuantificación del método (mg/mL)
Acido graso
LD
LC
C16:1
0,046
0,154
C18:3
0,016
0,055
C20:0
0,009
0,029
C20:1
0,005
0,017
C22:0
0,017
0,057
LD= límite de detección; LC= Límite de cuantificación
Los valores de limite de detección y cuantificación se encuentran debajo del
último punto de la curva de calibración de todos los ácidos grasos. Los ácidos
palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico tienen un limite de
detección de 0,046, 0,016, 0,009, 0,005, 0,017 mg/mL respectivamente, lo cual
quiere decir que si la concentración de estos ácidos grasos en un aceite de oliva
está por debajo de estos valores, no serán detectados, es decir, no arrojarán una
31
señal detectable. Si bién un valor mayor al límite de detección arroja una señal,
ésta es sólo una medida cualitativa, ya que los valores de límite de cuantificación
son mayores. Los valores de límite de cuantificación para los ácidos palmitoleico,
linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico son 0,154, 0,055, 0,029, 0,017,
0,057 mg/mL, de tal forma que cuando la concentración de estos ácidos grasos en
el aceite de oliva se encuentra sobre estos valores se podrá asegurar que se está
cuantificando certeramente.
4.3 Medidas de Precisión
4.3.1 Replicabilidad
En la tabla 10 se presenta el promedio del porcentaje de ésteres metílicos,
la desviación estándar y el coeficiente de variación para los ácidos grasos mirístico,
palmítico,
palmitoleico,
heptadecanoico,
heptadecenoico,
esteárico,
oleico,
linoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico, behénico y lignocérico. Estos valores
fueron calculados para la determinación de la replicabilidad del método.
32
TABLA 10. Resultados de replicabilidad. Se presenta el promedio
(X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la desviación estándar
(DE) y el coeficiente de variación (CV) de cada ácido graso
Ac.Graso
X
DE
CV
C14:0 (ác. Mirístico)
tz
--
--
C16:0 (ác. Palmítico)
12,45
0,14
1,11
C16:1 (ác. Palmitoleico)
1,08
0,01
1,04
C17:0 (ác. Heptadecanoico)
0,10
0,00
1,94
C17:1 (ác. Heptadecenoico)
0,22
0,00
1,85
C18:0 (ác. Esteárico)
2,11
0,09
4,16
C18:1 (ác. Oleico)
73,15
0,12
0,17
C18:2 (ác. Linoleico)
8,97
0,16
1,74
C18:3 (ác. Linolénico)
0,31
0,00
0,88
C20:0 (ác. Araquídico)
0,40
0,00
0,83
C20:1 (ác. Eicosenoico)
0,47
0,01
2,86
C22:0 (ác. Behénico)
0,14
0,00
3,07
tz
--
--
C24:0 (ác. Lignocérico)
tz: trazas
La AOAC (Association of Official Analytical Chemists) indica que para los
analitos que se encuentran entre un 0,1 - 1,0%, 1,0 - 10,0% y sobre 10%, el CV
máximo permitido es de un 8%, 4% y 2%, respectivamente. En este contexto la
mayoría de los ácidos grasos que componen el aceite de oliva, C17:0, C17:1,
C18:3, C20:0, C20:1 y C22:0, se encuentran en el rango entre 0,1-1% y
presentaron CV menores a un 3%. Los ácidos C16:1 y C18:0, en un rango entre 110% presentaron CV de 1 y 4,2%, respectivamente. Para el caso de los que se
encuentran sobre un 10%, como los ácidos C16:0 y C18:1, el CV fue de 1 y 0,17%,
respectivamente. Por lo tanto el ácido esteárico es el único que no cumple con
estos criterios.
33
4.3.2 Repetibilidad
En la tabla 11 se presenta el promedio del porcentaje de ésteres metílicos,
la desviación estándar, coeficiente de variación de los porcentajes de los ácidos
grasos
mirístico,
esteárico,
oleico,
palmítico,
palmitoleico,
linoleico,
linolénico,
heptadecanoico,
araquídico,
heptadecenoico,
eicosenoico,
behénico,
lignocérico. Estos valores fueron calculados para la determinación de la
repetibilidad del método.
TABLA 11. Resultados de repetibilidad. Se presenta el promedio (X) de
los porcentajes de ésteres metílicos, la desviación estándar (DE) y el
coeficiente de variación (CV) de cada ácido graso
Ac. Graso
X (%)
DE
CV
C14:0 (ác. mirístico)
tz
--
--
C16:0 (ác. palmítico)
12,56
0,21
1,70
C16:1 (ác. palmitoleico)
1,09
0,02
1,58
C17:0 (ác. heptadecanoico)
0,10
0,00
1,96
C17:1 (ác. heptadecenoico)
0,21
0,00
2,33
C18:0 (ác. esteárico)
2,33
0,33
14,10
C18:1 (ác. oleico)
72,73
0,48
0,66
C18:2 (ác. linoleico)
8,77
0,29
3,26
C18:3 (ác. linolénico)
0,31
0,02
6,14
C20:0 (ác. araquídico)
0,40
0,01
1,77
C20:1 (ác. eicosenoico)
0,45
0,03
6,30
C22:0 (ác. behénico)
0,13
0,01
5,98
tz
--
--
C24:0 (ác. lignocérico)
tz: trazas
Los ácidos C17:0, C17:1, C18:3, C20:0, C20:1 y C22:0, en un rango de 0,11%, presentaron valores de CV menores a un 7%, respondiendo satisfactoriamente
al criterio del valor máximo del coeficiente de variación permitido (<8%) por la
34
AOAC para este rango de concentración del analito. Para los ácidos grasos en el
intervalo de concentración de 1-10%, el ácido C16:1, cumple con tener un CV< 4%,
en cambio, el ácido C18:0 presentó un valor muy superior (14%) al aceptado. Los
ácidos C16:0 y C18:1, con porcentajes sobre 10%, presentaron valores de CV
menores al 2%. Por lo tanto el ácido esteárico es el único que no cumple con estos
criterios.
Los valores obtenidos de CV para la repetibilidad fueron superiores a los de
replicabilidad, lo que se puede explicar por el cambio de día, ya que las otras
condiciones (analista e instrumento) no fueron variadas durante el estudio. De esta
forma se puede concluir que el cambio de día de análisis de una muestra de aceite
de oliva afecta los parámetros que se está midiendo, sin perjuicio de que los
resultados que se obtengan sean certeros.
4.4 Medidas de exactitud
4.4.1. Recuperación
En la tabla 12 se presentan los porcentajes de recuperación,
desviación estándar y coeficiente de variación de los ácidos palmítico, oleico,
linoleico y linolénico, los cuales se presentan en mayor porcentaje en el aceite de
oliva.
35
TABLA 12. Porcentajes de recuperación (R) y
desviación estandar (DE) obtenido para los
ácidos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2.
Acido Graso
%R
DE
C16:0
109
9,6
C18:0
77
9,3
C18:1
101
14,9
C18:2
91
18,2
Los resultados de recuperación obtenidos (Tabla 12), alcanzaron valores
entre un 77 y 109%. El ácido esteárico presentó el menor valor de recuperación.
Los ácidos palmítico, oleico y linoleico presentan un alto valor de recuperación, lo
que se traduce en que el método es exacto para estos ácidos grasos, pero es
poco exacto para el ácido esteárico que presenta una recuperación más baja.
4.4 Muestras analizadas
Se analizó el perfil en ácidos grasos de un conjunto de muestras (n= 26) de
aceites de oliva extra virgen, de las variedades arbequina, frantoio y picual. La
distribución de los ácidos grasos y su desviación estándar se muestra en la tabla
13. La composición en ácidos grasos de cada muestra se detalla en anexo 6.1.
36
TABLA 13. Perfil en ácidos grasos de aceites de oliva extra virgen, variedades
arbequina, picual y frantoio, expresado como % de ésteres metílicos
Variedad aceite /
ácido graso
Arbequina
(n=10)
Picual
(n=10)
Frantoio
(n=6)
C16:0 (Ác. Palmítico)
12,5 ± 1,10a
11,2 ± 0,83b
11,3 ± 0,56b
C16:1 (Ác. Palmitoleico)
1,0 ± 0,21a
0,9 ± 0,14b
0,9 ± 0,09b
C17:0 (Ác. Heptadecanoico)
0,1 ± 0,03a
0,04 ± 0,02b
0,06 ± 0,01b
C17:1 (Ác. Heptadecenoico)
0,2 ± 0,06a
0,09 ± 0,03b
0,09 ± 0,03b
C18:0 (Ác. Esteárico)
2,5 ± 0,27b
2,9 ± 0,30a
2,5 ± 0,35b
C18:1 (Ác. Oleico)
74,7 ± 2,50a
79,6 ± 0,88b
76,5 ± 1,04c
C18:2 (Ác. Linoleico)
6,8 ± 1,18b
3,4 ± 0,38a
6,5 ± 0,67b
C18:3 (Ác. Linolénico)
0,3 ± 0,05b
0,2 ± 0,04b
0,3 ± 0,04a
C20:0 (Ác. Araquídico)
0,4 ± 0,04a
0,4 ± 0,03a
0,4 ± 0,03a
C20:1 (Ác. Eicosenoico)
0,7 ± 0,17a
0,8 ± 0,12a
0,8 ± 0,10a
C22:0 (Ác. Behénico)
0,1 ± 0,05a
0,09 ± 0,05a
0,1 ± 0,06a
Letras distintas significa diferencia estadística significativa a un nivel de confianza de 95%
En la tabla 13 se observa que la variedad arbequina presentó un contenido
significativamente mayor (p<0,05) de ácidos palmítico, palmitoleico, heptadecanoico
y heptadecenoico con respecto a las variedades picual y frantoio. La variedad picual
presentó un contenido significativamente mayor (p<0,05) de ácido esteárico y un
contenido significativamente menor (p<0,05) de ácido linoleico, con respecto a las
variedades arbequina y frantoio. El ácido oleico presentó diferencias significativas
en las tres variedades. Los ácidos araquídico, eicosenoico y behénico no presentan
diferencias estadísticas significativas (Anexo 6.2). Uno de los factores que más
afecta a la distribución de ácidos grasos, es la variedad de la aceituna y su grado
de maduración (Pérez- Arquillué et al, 2003).
El CODEX STAN 33-19818(Rev. 2-2003) indica intervalos de concentración
para cada ácido graso. La media de concentración de los ácidos grasos de las
muestras de las variedades arbequina, picual y frantoio cumplen con estos
37
intervalos, con excepción del C20:1(0,7%; 0,8%; 0,8%, respectivamente) valores
superiores al rango establecido por esta norma para este ácido graso (0,0-0,4%).
La variedad picual presentó un contenido de ácido linoleico menor (3,4%) al
establecido por el reglamento (3,5- 21,0%). Un comportamiento similar para el
C20:1 (≤0,4%) y C18:2 (3,5-21,0%) se observó al comparar los valores de
composición en ácidos grasos con la norma COI/T.15/NC nº3/Rev.15 de diciembre
de 2003.
El DS 977-96 Reglamento Sanitario de los Alimentos, establece que los
aceites de oliva vírgenes deben cumplir con intervalos de concentración de los
ácidos grasos, expresados en % de ésteres metílicos. La media de las muestras
analizadas de las variedades arbequina, picual y frantoio cumplen estos
parámetros, con excepción del C20:1(0,7%; 0,8%; 0,8%) en cada una de ellas,
cuyos valores son superiores a los limites establecidos por esta norma (<0,2%), y
del C18:3 (0,3%; 0,2%; 0,3%), cuyos porcentajes son inferiores a los límites
establecidos por esta normativa para este ácido graso (0,5 - 1,5%). En esta
normativa no se consideran los ácidos C17:0 y C17:1, por lo que no se puede
establecer si los valores obtenidos están dentro o fuera del intervalo de aceptación.
El ácido palmítico, principal ácido graso saturado en los aceites de oliva,
presenta valores medios de 12,5, 11,2 y 11,3% para arbequina, picual y frantoio,
respectivamente. Se trata de valores medios que concuerdan a los descritos para
las variedades picual (11,9%) y frantoio (10,9%), pero no para arbequina (20,1%)
(Moyano et al., 2005; Sánchez Casas 2003, Aguilera 2003). Otro de los principales
ácidos grasos saturados es el ácido esteárico, cuyo rango varía entre 2,2 - 2,8 %;
2.6 - 3.2% y 2,2 - 2,9% para los aceites de las variedades arbequina, picual y
38
frantoio, respectivamente. Estos resultados son similares a los descritos para la
variedad picual (2,7%) y superiores a los descritos para arbequina (1,38%) y
frantoio (1,5%) (Moyano et al 2005, Sánchez Casas 2003, Aguilera 2003).
En cuanto a los ácidos insaturados destaca, por su importancia nutricional
(antes mencionada), el ácido oleico, el cual se encuentra por sobre un 70% en las
muestras de las tres variedades, de éstas, picual presenta el valor más elevado
(79,7%), le sigue frantoio (76,5%) y finalmente arbequina (74,7%). Estos resultados
concuerdan con diversos autores (INIA Uruguay 2007, Aguilera 2003, Sánchez
Casas 2003, Matías et al 2003) para la variedad picual (79,31%), pero no para las
variedades arbequina (66,96%) y frantoio (78,32%). El contenido de ácido linoleico
de la variedad picual (3,4%) está de acuerdo con el perfil descrito por Sánchez
Casas (2003) (3,48%) y el de la variedad frantoio (6,5%) con el de Aguilera (2003)
(6,79%).
La variedad arbequina (6,8%) se aleja de los valores descritos como
aceptables para esta variedad (10,75%) (INIA Uruguay 2007).
El ácido linolénico, que presenta el mayor grado de insaturación del aceite
de oliva, muestra un contenido de 0,3% para la variedad arbequina, similar a los
valores reportados por Motilva (2001) de 0,34%. Sin embargo para las variedades
picual (0,2%) y frantoio (0,3%) se han encontrado valores mayores (0,73%) y
menores (0,48%), respectivamente.(INIA Uruguay, 2007).
En la figura 12, se muestra un cromatograma de aceite de oliva, en donde
se ve claramente el predominio de los ácidos grasos insaturados (C16:1, C17:1,
C18:1, C18:2, C18:3, C201) por sobre los saturados, (C16:0, C17:0, C18:0, C20:0,
39
C22:0), en especial del ácido monoinsaturado C18:1, que es el que caracteriza al
aceite de oliva, por su alto contenido.
FIGURA 12. Cromatograma aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, (1) ác.
Palmítico, (2) ác. Palmitoleico, (3) ác. Heptadecanoico y heptadecenoico, (4) ác.
Esteárico, (5) ác. Oleico, (6) ác. Linoleico, (7) ác. Araquídico, (8) ác. Linolénico, (9)
ác. Eicosenoico, (10) ác. Behénico.
40
V. CONCLUSIONES
La metodología analítica implementada resultó ser adecuada para cumplir
con los objetivos propuestos en este estudio ya que permitió la determinación de los
ácidos grasos del aceite de oliva dentro del rango que pueden esperarse en un
aceite de oliva comercial, con excepción del ácido esteárico que no cumplió con los
valores normados de CV en repetibilidad y replicabilidad.
Las técnicas para la determinación de los ácidos grasos resultaron ser
lineales, entre 0,83 - 7,45 mg/mL; 0,20 - 1,84 mg/mL; 5,00 - 44,97 mg/mL y 0,64 5,80 mg/mL para los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico, respectivamente,
presentando en todos los casos un coeficiente de correlación superior a 0,99.
Los ácidos mirístico y lignocérico no arrojaron señal detectable por el
integrador, en ninguna de las muestras analizadas para la determinación de la
repetibilidad y reproducibilidad, por lo que se concluye que se encuentran en trazas.
Con los resultados obtenidos en la repetibilidad y replicabilidad se afirma
que la metodología cumple con la precisión por repetibilidad y replicabilidad para
todos los ácidos grasos, excepto para el ácido esteárico.
Los valores obtenidos para la recuperación de los ácidos palmítico (109%),
oleico (101%) y linoleico (91%) son aceptables, y se puede concluir que el método
es exacto para la determinación
de estos ácidos grasos. El ácido esteárico
presentó una recuperación baja de (77%).
41
VI. BIBLIOGRAFIA
1. AGUILERA M., ORTEGA D. y BELTRAN G. 2003. Caracterización del aceite de
oliva de variedades italianas (frantoio y leccino) cultivadas en Andalucia. En: XI
SIMPOSIUM CIENTÍFICO-TÉCNICO Expoliva 2003 Feria internacional del aceite
de oliva. 14 a 16 de Mayo de 2003. Jaén, España. pp. s.p.
2. APARICIO Ramón. Authentication of vegetable oils by chromatographic
techniques. Journal of Chromatography (881) 93–104. 2000
3. AZOCAR J. Aceite de oliva/chile: industria apunta a crear una marca ligada a
altos precios, insistir en la calidad y aumentar la oferta. Septiembre 2007
4. Decreto Supremo Nº977-96. CHILE. Reglamento sanitario de los alimentos.
195p.
5. DETECCION de adulteraciones y/o contaminaciones del aceite de oliva virgen
extra con aceites de semillas y aceite de orujo de oliva por A. Contiñas et al. Grasas
y Aceites. 59(2): 97-103. 2008.
6. ESTUDIO de la calidad de aceite de oliva virgen en Aragón. PEREZARQUILLUE C., et al. Grasas y Aceites. 54(2): 151-60. 2003
7. ESTUDIO del contenido de ácidos grasos de aceites monovarietales
elaborados a partir de aceitunas producidas en la región extremeña. SANCHEZ C.,
Jacinto et al. Grasas y Aceites. 54(4):371-77. 2003
8. ESTUDIO preliminar de mezclas varietales de aceites de oliva catamarqueñoscampaña 2005. Primera parte: Composición en ácidos grasos. MOYANO P.L.
9. FERNANDEZ J., AGUILAR M. y PINEDA M. Caracterización de aceites de oliva
vírgenes de la provincia de Córdoba y uso de antioxidantes como marcadores de
42
autentificación. En: XI SIMPOSIUM CIENTÍFICO-TÉCNICO Expoliva 2003 Feria
internacional del aceite de oliva. 14 a 16 de Mayo de 2003. Jaén, España. pp. s.p.
10. HARRIS, Daniel. Análisis químico cuantitativo. 3ª ed. Barcelona. Reverté, 2006.
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11. HERNANDEZ, Manuel. Tratado de nutrición y salud pública. 2ª ed. Madrid, Díaz
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12. IGLESIAS R. Mercado del aceite de oliva. Mercados Agropecuarios 187 Febrero
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13. MATIAS et al. Calidad de aceites de arbequinas en relación a la madurez de las
aceitunas En: CONGRESO REGIONAL de ciencia y tecnología 3-4 julio 2003.
Catamarca, Universidad Nacional de Catamarca, Secretaría de Ciencia y
Tecnología. pp. s.p.
14. MORALES M. y LEON-CAMACHO M. Cromatografía de gases y liquidos:
Metodología aplicada al Aceite de Oliva En APARICIO R. y HARWOOD J. Manual
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15. MOTILVA María José, RAMO Tomás, ROMERO María Paz. Caracterización
geográfica de los aceites de oliva vírgenes de la denominación de origen protegida
“Les Garrigues” por su perfil de ácidos grasos. Grasas y Aceites. 52 (1): 26-32.
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16. Norma para los aceites de oliva y aceites de orujo de oliva CODEX STAN 331981 (rev. 2-2003).
17. REGLAMENTO (CE) No 796/2002 de la comisión por el que se modifica el
Reglamento (CEE) no 2568/91 relativo a las características de los aceites de oliva y
de los aceites de orujo de oliva y sobre sus métodos de análisis. Diario de las
Comunidades Europeas. Bruselas, Bélgica. 6 mayo 2002
43
18. Resolución nº RES-3/89-IV/03. ESPAÑA. Norma comercial aplicable a los
aceites de oliva y los aceites de orujo de oliva. Consejo Oleicota Internacional,
Madrid, España, diciembre de 2005.
19. SAN MARTÍN B y CAÑÓN H. Métodos de análisis para el control de residuos
químicos en productos de origen animal. Tecno vet. 6 (2), agosto 2000
20. SERRA, Lluis y Aranceta, Javier. Nutrición y salud pública: métodos, bases
científicas y aplicaciones. 2ª ed. Barcelona, Masson, 2006. 826p.
21. STENDER, Steen and Dyerberg, Jorn. The influence of trans fatty acids on
health. 4th ed. Denmark, the Danish nutrition council. 2003. 86p
22. TARDÁGUILA J., Montero F., Olmeda M., Alba J., Análisis del sector del aceite
de oliva. Alimentación, Equipos y Tecnología, Abril, 1996.
23. VILLAMIL, J.J., CABRERA D., RODRIGUEZ, P. Resultados experimentales en
olivos. En: JORNADA DE DIVULGACION programa nacional de producción
frutícola. INIA Las Brujas, Uruguay 5 de octubre de 2007.
44
VII. ANEXOS
ANEXO 1
Determinación de la linealidad y sensibilidad
La determinación de la linealidad y la sensibilidad se realizó a través de una
curva de calibración para cada éster metílico de ácido graso que se analizó. (ácidos
palmítico, esteárico, oleico y linoleico)
1.1. Preparación de la solución madre de los principales ácidos grasos presentes en
el aceite de oliva extra virgen.
Se preparó 25 mL de la solución de los ésteres metílicos de los ácidos
palmítico, esteárico, oleico y linoleico, los cuales se encontraban en una
composición porcentual similar a la del aceite de oliva. Las cantidades pesadas, la
concentración [mg/mL] y el porcentaje de cada éster de ácido graso en la solución
se presentan en la tabla 14.
TABLA 14. Preparación de solución madre, peso de
cada estándar (mg), concentración y composición en
porcentaje de los ésteres metílicos de los ácidos
palmítico, esteárico, oleico y linoleico.
Ácido graso Peso (mg)
mg/ mL % solución
C16:0
206,90
8,28
12,40
C18:0
51
2,04
3,06
C18:1
1249,30
49,97
74,89
C18:2
161
6,44
9,65
45
1.2. Construcción de las curvas de calibración
Se prepararon entre 4 y 7 diluciones de la solución madre y se inyectaron en
el CG. Con los datos de área obtenidos para cada concentración de cada éster de
ácido graso, se construyó una curva de calibración que se usó en la determinación
de la linealidad y la sensibilidad. Las tablas 15, 16, 17 y 18 muestran la
concentración del éster metílico del ácido graso en la solución y el área obtenida
para cada una de ellas, presentándose además la ecuación de la curva de
calibración obtenida y el coeficiente de correlación.
TABLA 15. Concentración y área
obtenida para la curva de calibración
del ácido palmítico C16:0
Conc[mg/mL]
Área
7,45
4566179
6,62
4143296
4,97
3020626
3,31
2106970
1,66
1071276
0,83
564173
Y= 607561X + 63450
r= 0,9996
46
TABLA 16. Concentración y área
obtenida para la curva de calibración
del ácido esteárico C18:0
Conc[mg/mL]
Área
1,22
1261959
0,82
826872
0,41
488378
0,20
280290
Y= 811465X + 155547
r= 0,9923
TABLA 17. Concentración y área
obtenida para la curva de calibración
del ácido oleico C18:1
Conc[mg/mL]
Área
44,97
26393072
39,98
23796528
29,98
16750704
19,99
11816640
9,99
5730778
5,00
3003653
Y= 587630X - 100040
r= 0,9991
TABLA 18. Concentración y área
obtenida para la curva de calibración
del ácido linoleico C18:2
Conc[mg/mL]
Área
5,80
2743378
5,15
2467896
2,58
1195356
1,29
577057
0,64
298660
Y= 480022X - 27759
r= 0,9998
47
ANEXO 2
Determinación del límite de detección y de cuantificación.
La determinación de los límites de detección y de cuantificación se realizó a
través de la construcción de curvas de calibración para los ácidos grasos en menor
porcentaje en el aceite de oliva(ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico,
eicosenoico y behénico).
2.1. Preparación de la solución madre
Se preparó 5 mL de solución de los estándares de los ésteres metílicos de
los ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico, con una
concentración parecida al aceite de oliva. Las cantidades pesadas y la
concentración de cada éster metílico de ácido graso en la solución se presentan en
la tabla 19.
TABLA 19. Cantidades pesadas [mg] y
concentración [mg/mL] de cada ácido
graso
Acido graso
Peso (mg)
mg/mL
C16:1
10,0
2,0
C18:3
24,7
4,94
C20:0
20,1
4,02
C20:1
5,0
1,0
C22:0
10,7
2,14
48
2.2. Construcción de las curvas de calibración
Se prepararon entre 3 y 5 diluciones de la solución madre y se inyectaron en
el CG. Con los datos de área obtenidos para cada concentración de los ésteres
metílicos de los ésteres metílicos de los ácidos grasos, se construyó una curva de
calibración que se usó en la determinación de la linealidad y la sensibilidad. Las
tablas 20, 21, 22, 23 y 24 muestran la concentración del éster metílico del ácido
graso en la solución y el área obtenida para cada una de ellas, presentándose
además la ecuación de la curva de calibración obtenida y el coeficiente de
correlación.
TABLA 20. Concentración y área
obtenida para la curva de
calibración del ácido palmitoleico
C16:1
mg/ml
área
1,000
321665
0,800
264676
0,600
201271
0,400
133115
0,200
62506
Y= 324939X + 1682
r= 0,9999
TABLA 21. Concentración y área
obtenida para la curva de
calibración del ácido linolénico
C18:3
mg/ml
Área
0,494
32026
0,296
24968
0,099
18405
Y= 34484X + 14914
r= 0,9998
49
TABLA 22. Concentración y área
obtenida para la curva de
calibración del ácido araquídico
C20:0
mg/ml
área
0,563
208480
0,241
90230
0,080
31951
0,040
15124
Y= 377935X + 5171
r= 0,9974
TABLA 23. Concentración y área
obtenida para la curva de
calibración del ácido eicosenoico
C20:1
mg/ml
área
0,200
112243
0,120
64845
0,020
8313
Y= 576894X - 3581
r= 0,9987
TABLA 24. Concentración y área
obtenida para la curva de
calibración del ácido behénico
C22:0
mg/ml
área
0,300
112043
0,214
82841
0,128
46136
Y= 381434X – 1236
r= 0,9986
50
2.3. Cálculo de σy/x de la regresión para la determinación de los límites de detección
y cuantificación.
Para calcular los límites de detección y cuantificación de los ácidos grasos
palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico se utilizó la siguiente
ecuación (2):
σy/x= √
Σ(yi - y’i)2
(n-2)
Donde:
σ = Desviación estándar de la regresión
yi = Valor observado del punto en la ordenada
y’i= Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de regresión
n = Número de puntos de la curva de calibración.
En las tablas 25, 26, 27, 28 y 29 se muestran los datos de yi e y’i para cada
concentración usada en la curva de calibración, además se muestra el valor del σy/x,
y un ejemplo de su cálculo con el ácido palmitoleico.
TABLA 25. Valores de yi e y’i obtenidos
mediante la curva de calibración del
ácido palmitoleico.
Conc.[mg/mL]
yi
y'i
1,0
321665
326621
0,8
264676
261633
0,6
201271
196645
0,4
133115
131657
0,2
62506
66669
51
n= 5
Ejemplo para el cálculo de σy/x
σy/x= √ ( ( (321665-326621)+ (264676- 261633)+ (201271- 196645)+ (133115131657)+ (62506- 66669))2/ 3)
σy/x = 4989
TABLA 26. Valores de yi e y’i obtenidos
mediante la curva de calibración del ácido
linolénico.
Conc.[mg/mL]
yi
y'i
0,494
32026
31949
0,296
24968
25121
0,099
18405
18327
n=3
σy/x=188
TABLA 27. Valores de yi e y’i obtenidos
mediante la curva de calibración del ácido
araquídico.
Conc.[mg/mL]
yi
y'i
0,563
208480
208600
0,241
90230
90124
0,080
31951
30886
0,040
15124
16169
σy/x= 1061
n=4
TABLA 28. Valores de yi e y’i obtenidos
mediante la curva de calibración del ácido
eicosenoico
Conc.[mg/mL]
yi
y'i
n= 3
0,20
112243
111634
0,12
64845
65941
0,02
8313
8826
σy/x= 983
52
TABLA 29. Valores de yi e y’i obtenidos
mediante la curva de calibración del ácido
behénico.
Conc.[mg/mL]
yi
y'i
0,300
112043
113194
0,214
82841
80390
0,128
46136
47587
n= 3
σy/x= 2174
2.4. Cálculo del límite de detección y de cuantificación
Los límites de detección y de cuantificación se calcularon con las
ecuaciones 3 y 4. En la tabla 30 se presenta un resumen de los valores de σy/x de
cada ácido graso. Luego se presenta el cálculo del σy/x para ácido palmitoleico
como ejemplo, y los valores de los σy/x de los restantes ácidos grasos.
Limite de detección (LD)
CLD= (b + 3σ)- b
S
(3)
Límite de cuantificación (LC) es:
CLC= (b + 10σ)- b
S
(4)
En donde:
CLD= Concentración del limite de detección (mg/mL)
CLC= Concentración del limite de cuantificación (mg/mL)
σ = Desviación estándar de la regresión (área).
b = intercepto de la curva de calibración (área)
S= pendiente de la curva de calibración (área* mL/mg)
53
TABLA 30. Valores de σy/x
obtenido para cada ácido
graso.
Ácido graso
σ
C16:0
4989
C18:3
188
C20:0
1061
C20:1
983
C22:0
2174
a) Cálculo de la concentración de los límites de detección y de cuantificación del
ácido palmitoleico
Ejemplo cálculo concentración del límite de detección.
CLD= 3σ
S
CLD= (4989 *3)/324939
CLD= 0,046 mg/mL
Ejemplo cálculo concentración del límite de cuantificación.
CLC= 10σ
S
CLC= (4989*10) /324939
CLC= 0,154 mg/mL
b) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido linolénico
CLD= 0,016 mg/mL
CLC= 0,055 mg/mL
54
c) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido araquídico
CLD= 0,009 mg/mL
CLC= 0,029 mg/mL
d) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido eicosenoico
CLD= 0,005 mg/mL
CLC= 0,017 mg/mL
e) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido behénico
CLD= 0,017 mg/mL
CLC= 0,057 mg/mL
ANEXO 3
Replicabilidad
En la tabla 31 se muestran los datos de área obtenidos en cada análisis de
las 10 muestras de aceite de oliva variedad arbequina, analizadas en el mismo
día, por el mismo analista y en el mismo equipo, con los cuales se elaboró la
tabla 32 que muestra el porcentaje, promedio, desviación estándar y coeficiente
de variación de cada ácido graso, parámetros con los cuales se evaluó la
replicabilidad para ellos.
55
TABLA 31. Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite
de oliva variedad arbequina
Ácido graso
M1
C16:0
2012573
C16:1
2012573
C17:0
16126
C17:1
34808
C18:0
341843
C18:1
376651
C18:2
1454939
C20:0
65806
C18:3
51288
C20:1
75431
C22:0
23617
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
2667760 2034201 3057822 2020763 2801558 1906268 3534246 2543189 3393582
2667760 2034201 3057822 2020763 2801558 1906268 3534246 2543189 3393582
21931
16198
24726
16237
22300
15303
27663
20432
25572
46451
35338
53967
36130
48412
33544
61136
41525
58391
446921 341973 520424 335901 472833 308427 572208 461367 595223
493372 377311 574391 372031 521245 341971 633344 502892 465912
1966151 1419001 2192077 1495458 2033634 1409283 2579901 1759385 2395621
87614
65468 101548
66035
91982
60790 112992
80712 107947
68305
50002
77489
51193
71136
47106
87673
61874
82807
103638
73178 113323
79054 107278
75602 137967
93202 127918
30883
21527
34581
23034
31569
20272
38396
27959
35641
TABLA 32. Composición en ácidos grasos expresada como porcentaje de ésteres metílicos en las 10
muestras analizadas, promedio, desviación estándar y coeficiente de variación.
Ácido graso
C16:0
C16:1
C17:0
C17:1
C18:0
C18:1
C18:2
C20:0
C18:3
C20:1
C22:0
M1
12,34
1,08
0,10
0,21
2,10
73,14
8,92
0,40
0,31
0,46
0,14
M2
12,29
1,07
0,10
0,21
2,06
73,31
9,06
0,40
0,31
0,48
0,14
M3
12,60
1,09
0,10
0,22
2,12
72,93
8,79
0,41
0,31
0,45
0,13
M4
12,32
1,06
0,10
0,22
2,10
73,22
8,83
0,41
0,31
0,46
0,14
M5
12,32
1,07
0,10
0,22
2,05
73,26
9,12
0,40
0,31
0,48
0,14
M6
12,37
1,07
0,10
0,21
2,09
73,19
8,98
0,41
0,31
0,47
0,14
M7
12,49
1,10
0,10
0,22
2,02
73,15
9,23
0,40
0,31
0,50
0,13
M8
12,47
1,08
0,10
0,22
2,02
73,25
9,10
0,40
0,31
0,49
0,14
M9
12,66
1,09
0,10
0,21
2,30
72,98
8,76
0,40
0,31
0,46
0,14
M10
12,61
1,08
0,10
0,22
2,21
73,09
8,90
0,40
0,31
0,48
0,13
X
12,45
1,08
0,10
0,22
2,11
73,15
8,97
0,40
0,31
0,47
0,14
DE
0,14
0,01
0,00
0,00
0,09
0,12
0,16
0,00
0,00
0,01
0,00
CV
1,11
1,04
1,94
1,85
4,16
0,17
1,74
0,83
0,88
2,86
3,07
56
ANEXO 4
Repetibilidad
En la tabla 33 se muestran los datos de área obtenidos en cada análisis de
las 10 muestras de aceite de oliva variedad arbequina, analizadas en distintos días,
por el mismo analista y en el mismo equipo, con los cuales se elaboró la tabla 34
que muestra el porcentaje (éster metílico), promedio, desviación estándar y
coeficiente de variación de cada ácido graso, parámetros con los cuales se evaluó
la repetibilidad para ellos.
57
TABLA 33. Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite
de oliva variedad arbequina
Ácido Graso
C16:0
C16:1
C17:0
C17:1
C18:0
C18:1
C18:2
C18:3
C20:0
C20:1
C22:0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
2012573 2593842 3030786 1498130 1899213 1327606 1374582 1963211 1642686 1443481
2012573 2593842 3030786 1498130 1899213 1327606 1374582 1963211 1642686 1443481
16126
21124
24456
12001
14633
10517
10976
16345
12997
11596
34808
46111
50732
25500
32709
21515
22807
33503
27678
24955
341843 448636 478784 296136 311246 322217 269376 348418 315122 265253
376651 494747 529516 321636 343955 343732 292183 381921 342800 290208
1454939 1914712 2233285 971796 1324896 881477 909267 1362056 1167796 1020766
51288
67076
75835
33634
45699
36898
31607
46988
40738
34378
65806
85457
96612
45518
58429
42542
42294
62404
54126
46468
75431 103832 121369
49762
68529
44744
44156
69520
60693
53104
23617
29440
32177
15165
19759
12482
13489
21053
19283
15184
TABLA 34. Composición en ácidos grasos expresada como porcentaje de ésteres en las 10
muestras analizadas, promedio, desviación estándar y coeficiente de variación.
Ácido Graso
C16:0
C16:1
C17:0
C17:1
C18:0
C18:1
C18:2
C18:3
C20:0
C20:1
C22:0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9 M10
X
DE
CV
12,34 12,34 12,48 12,93 12,77 12,80 12,66 12,45 12,36 12,51 12,56 0,21 1,70
1,08 1,07 1,09 1,11 1,13 1,09 1,08 1,08 1,07 1,09 1,09 0,02 1,58
0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,00 1,96
0,21 0,22 0,21 0,22 0,22 0,21 0,21 0,21 0,21 0,22 0,21 0,00 2,33
2,10 2,13 1,97 2,56 2,09 3,11 2,48 2,21 2,37 2,30 2,33 0,33 14,10
73,14 73,11 73,39 72,00 73,12 72,66 72,02 72,81 72,51 72,54 72,73 0,48 0,66
8,92 9,11 9,20 8,39 8,91 8,50 8,38 8,64 8,79 8,85 8,77 0,29 3,26
0,31 0,32 0,31 0,29 0,31 0,36 0,29 0,30 0,31 0,30 0,31 0,02 6,14
0,40 0,41 0,40 0,39 0,39 0,41 0,39 0,40 0,41 0,40 0,40 0,01 1,77
0,46 0,49 0,50 0,43 0,46 0,43 0,41 0,44 0,46 0,46 0,45 0,03 6,30
0,14 0,14 0,13 0,13 0,13 0,12 0,12 0,13 0,15 0,13 0,13 0,01 5,98
58
ANEXO 5
Recuperación
Para la evaluación de la recuperación se inyectó una muestra de aceite de oliva
sin fortificar y una fortificada con una solución estándar de los ésteres metílicos de los
ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico, de concentración conocida, cada una de
ellas se realizó en triplicado. En las tablas 35, 36, 37 y 38 se muestran los datos del
área del aceite de oliva natural y la muestra con estándar, el área correspondiente a la
fortificación, la concentración recuperada del estándar, el porcentaje de recuperación,
el promedio de la recuperación de las tres muestras analizadas, indicándose además la
concentración inicial del estándar.
TABLA 35. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido
palmítico C16:0
Nº Muestra
1
1*
2
2*
3
3*
Área
muestra
213288
1449604
301332
1353641
404755
1596809
Área muestra
fortificada - Área
muestra sin
fortificar
Concentración
recuperada
estándar
% de
Recuperación
1236316
1,93
116,62
1052309
1,62
98,33
1192054
1,85
112,22
X=
DE=
109,06
9,55
* muestra fortificada con estándar
Concentración verdadera estándar = 1,65 mg/mL
59
TABLA 36. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido
esteárico C18:0
Nº Muestra
1
1*
2
2*
3
3*
Área
muestra
54161
392555
64978
342210
84780
412227
Área muestra
fortificada - Área
muestra sin
fortificar
Concentración
recuperada
estándar
% de
Recuperación
338394
0,32
79,20
277232
0,27
66,17
327447
0,34
84,30
X=
DE=
76,56
9,35
* muestra fortificada con estándar
Concentración verdadera estándar = 0,41 mg/mL
TABLA 37. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido oleico
C18:1
Nº Muestra
1
1*
2
2*
3
3*
Área
muestra
11842616
28812352
13645272
28361232
14777456
27347696
Área muestra
fortificada - Área
muestra sin
fortificar
Concentración
recuperada
estándar
% de
Recuperación
16969736
29,05
116,26
14715960
25,21
100,91
12570240
21,56
86,29
X=
DE=
101,15
14,99
* muestra fortificada con estándar
Concentración verdadera estándar = 24,99 mg/mL
60
TABLA 38. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido
linoleico C18:2
Nº Muestra
Área
muestra
1
1*
2
2*
3
3*
1568088
3199901
1750203
3147066
1936868
3003093
Área muestra
fortificada - Área
muestra sin
fortificar
Concentración
recuperada
estándar
% de
Recuperación
1631813
3,46
107,68
1396863
2,98
92,61
1066225
2,29
71,40
X=
DE=
90,56
18,23
* muestra fortificada con estándar
Concentración verdadera estándar = 3,22 mg/mL
ANEXO 6
Muestras
6.1. Composición en porcentaje de los ácidos grasos de las muestras de aceite de oliva
analizadas
Se analizaron 26 muestras de aceite de oliva de las variedades picual (n=10),
arbequina (n=10) y frantoio (n=6), el porcentaje, promedio y desviación estándar de los
ácidos grasos de cada una de las muestras de las variedades se presentan en las
tablas 38, 39 y 40.
61
TABLA 39. Composición de ácidos grasos expresado en porcentaje de ésteres
metílicos, promedio y desviación estándar de 10 muestras analizadas de aceite de
oliva variedad picual
Ac. Graso MP1 MP2 MP3 MP4 MP5 MP6 MP7 MP8 MP9 MP10 PROM
C16:0
12,00 12,28 11,49 11,45 11,43 9,52 10,37 10,44 11,50 11,23 11,17
C16:1
0,97 0,97 0,92 0,93 0,82 0,49 0,81 0,80 0,89 0,87
0,85
C17:0
0,05 0,05 0,05 0,04 0,03 0,00 0,05 0,04 0,06 0,05
0,04
C17:1
0,11 0,11 0,08 0,09 0,08 0,00 0,08 0,09 0,10 0,10
0,09
C18:0
2,43 2,49 2,89 2,67 2,96 3,47 2,98 3,01 2,81 2,75
2,85
C18:1
79,11 78,60 79,30 79,87 79,44 81,00 80,69 80,52 78,63 78,84 79,60
C18:2
3,17 3,09 3,23 3,29 3,42 3,63 3,14 3,09 4,12 4,02
3,42
C18:3
0,25 0,00 0,17 0,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,20
C20:0
0,36 0,35 0,36 0,35 0,38 0,45 0,39 0,39 0,38 0,38
0,38
C20:1
0,64 0,86 0,56 0,56 0,79 0,83 0,87 0,86 0,82 0,80
0,76
C22:0
0,12 0,11 0,10 0,10 0,11 0,00 0,12 0,11 0,00 0,13
0,09
DE
0,83
0,14
0,02
0,03
0,30
0,88
0,38
0,04
0,03
0,12
0,05
TABLA 40. Composición de ácidos grasos expresado en porcentaje de ésteres
metílicos, promedio y desviación estándar de 10 muestras analizadas de aceite de
oliva variedad arbequina
Ac. Graso
C16:0
C16:1
C17:0
C17:1
C18:0
C18:1
C18:2
C18:3
C20:0
C20:1
C22:0
MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 MA7 MA8 MA9 MA10
12,95 12,18 9,78 11,67 13,30 13,52 12,88 12,55 12,72 13,34
1,12 0,89 0,58 0,95 1,00 1,37 0,96 1,11 1,12 1,10
0,11 0,12 0,14 0,05 0,15 0,11 0,15 0,09 0,09 0,12
0,18 0,28 0,21 0,09 0,29 0,25 0,27 0,20 0,19 0,25
2,74 2,03 2,91 2,57 2,83 2,43 2,37 2,22 2,37 2,50
73,43 75,35 78,81 79,04 72,35 71,50 73,46 74,41 73,76 74,42
7,12 7,22 6,08 4,02 6,49 8,02 8,11 7,32 7,01 6,24
0,27 0,34 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,39 0,42 0,50 0,36 0,42 0,40 0,42 0,38 0,39 0,39
0,57 0,60 0,27 0,77 0,66 0,82 0,86 0,78 0,75 0,67
0,14 0,15 0,19 0,10 0,15 0,12 0,00 0,13 0,13 0,14
PROM
12,49
1,02
0,11
0,22
2,50
74,65
6,76
0,31
0,41
0,67
0,13
62
DE
1,10
0,21
0,03
0,06
0,27
2,50
1,18
0,05
0,04
0,17
0,05
TABLA 41. Composición de ácidos grasos expresado en porcentaje de
ésteres metílicos, promedio y desviación estándar de 10 muestras
analizadas de aceite de oliva variedad frantoio
Ac. Graso MF1 MF2 MF3 MF4 MF5 MF6 PROM DE
C16:0
11,30 12,09 11,09 10,90 11,90 10,70 11,33 0,56
C16:1
0,93 0,92 0,76 0,73 0,84 0,90 0,85
0,09
C17:0
0,08 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,06
0,01
C17:1
0,04 0,12 0,09 0,09 0,10 0,12 0,09
0,03
C18:0
2,53 1,92 2,94 2,76 2,51 2,39 2,51
0,35
C18:1
77,94 76,13 75,72 75,92 75,73 77,79 76,54 1,04
C18:2
5,18 6,71 6,94 6,87 6,72 6,26 6,45
0,67
C18:3
0,27 0,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,30
0,04
C20:0
0,41 0,36 0,41 0,00 0,41 0,34 0,39
0,03
C20:1
0,62 0,66 0,86 0,80 0,85 0,76 0,76
0,10
C22:0
0,14 0,12 0,15 0,15 0,14 0,00 0,12
0,06
63
6.2. Análisis estadístico ANOVA
6.2.1. Análisis ANOVA para el ácido palmítico (C16:0)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
9,83947
2
4,91973
6,05
0,0077
Within groups
18,6924 23 0,812712
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
28,5318 25
Multiple Range Tests for C16:0 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
11,171
X
3
6
11,33
X
1
10
12,489
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*1,318
0,834013
1-3
*1,159
0,963035
2-3
-0,159
0,963035
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
64
6.2. 2. Análisis ANOVA para el ácido palmitoleico (C16:1 )
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,184445
2 0,0922226
3,60
0,0437
Within groups
0,589343 23 0,0256236
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,773788 25
Multiple Range Tests for C16:1 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------3
6
0,846667
X
2
10
0,847
X
1
10
1,02
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*0,173
0,14809
1-3
*0,173333
0,170999
2-3
0,000333333
0,170999
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
65
6.2.3. Análisis ANOVA para el ácido heptadecanoico (C17:0)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,0275415
2 0,0137708
26,57
Within groups
0,01192 23 0,000518261
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,0394615 25
P-Value
0,0000
Multiple Range Tests for C17:0 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
0,042
X
3
6
0,055
X
1
10
0,113
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*0,071
0,021061
1-3
*0,058
0,0243191
2-3
-0,013
0,0243191
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
66
6.2. 4. Análisis ANOVA para el ácido heptadecenoico (C17:1)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,110002
2 0,055001
27,46
0,0000
Within groups
0,0460633 23 0,00200275
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,156065 25
Multiple Range Tests for C17:1 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
0,084
X
3
6
0,0933333 X
1
10
0,221
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*0,137
0,0414017
1-3
*0,127667
0,0478066
2-3
-0,00933333
0,0478066
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
67
6.2.5. Análisis ANOVA para el ácido esteárico (C18:0)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,731882
2 0,365941
4,05
0,0311
Within groups
2,07813 23 0,0903536
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
2,81002 25
Multiple Range Tests for C18:0 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------1
10
2,497
X
3
6
2,50833
X
2
10
2,846
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*-0,349
0,278085
1-3
-0,0113333
0,321105
2-3
*0,337667
0,321105
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
68
6.2.6. Análisis ANOVA para el ácido oleico (C18:1)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
126,314
2
63,1569
22,52
0,0000
Within groups
64,5003 23
2,80436
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
190,814 25
Multiple Range Tests for C18:1 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------1
10
74,603
X
3
6
76,5383
X
2
10
79,6
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*-4,997
1,54925
1-3
*-1,93533
1,78892
2-3
*3,06167
1,78892
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
69
6.2.7. Análisis ANOVA para el ácido linoleico (C18:2)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
64,3543
2
32,1771
46,39
0,0000
Within groups
15,9523 23
0,69358
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
80,3066 25
Multiple Range Tests for C18:2 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
3,42
X
3
6
6,44667
X
1
10
6,763
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
*3,343
0,770465
1-3
0,316333
0,889656
2-3
*-3,02667
0,889656
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
70
6.2.8. Análisis ANOVA para el ácido linolénico (C18:3)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,459902
2 0,229951
5,56
0,0107
Within groups
0,951713 23 0,0413788
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
1,41162 25
Multiple Range Tests for C18:3 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
0,061
X
1
10
0,061
X
3
6
0,376667
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
0,0
0,188189
1-3
*-0,315667
0,217302
2-3
*-0,315667
0,217302
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
71
6.2.9. Análisis ANOVA para el ácido araquídico (20:0)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,00396154
2 0,00198077
1,77
Within groups
0,0257 23 0,00111739
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,0296615 25
P-Value
0,1923
Multiple Range Tests for C20:0 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
0,379
X
3
6
0,39
X
1
10
0,407
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
0,028
0,0309248
1-3
0,017
0,0357089
2-3
-0,011
0,0357089
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
72
6.2.10. Análisis ANOVA para el ácido eicosenoico (C20:1)
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
----------------------------------------------------------------------------Between groups
0,288728
2 0,144364
2,35
0,1177
Within groups
1,41173 23 0,0613797
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
1,70046 25
Multiple Range Tests for C20:1 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------3
6
0,481667
X
1
10
0,648
XX
2
10
0,759
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
-0,111
0,229201
1-3
0,166333
0,264659
2-3
*0,277333
0,264659
-------------------------------------------------------------------------------• denotes a statistically significant difference.
73
6.2.11. Análisis ANOVA para el ácido behénico (C22:0)
Analysis of Variance
-------------------------------------------------------------------------------------------------Source
Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio
P-Value
--------------------------------------------------------------------------------------------------Between groups
0,00651282
2 0,00325641
1,24
0,3068
Within groups
0,0601833 23 0,00261667
----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.)
0,0666962 25
Multiple Range Tests for C22:0 by Muestras
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSD
Muestras
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------2
10
0,09
X
3
6
0,116667
X
1
10
0,125
X
-------------------------------------------------------------------------------Contrast
Difference
+/- Limits
-------------------------------------------------------------------------------1-2
0,035
0,0473237
1-3
0,00833333
0,0546447
2-3
-0,0266667
0,0546447
-------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.
74