introducción - genoma . unsam . edu . ar

INTRODUCCIÓN
DAr
y Aislamiento de genes
台大農藝系Molecular
遺傳學 601 20000- Marzo
Chapter 2010
7 slide 1
Genética
Clon=gemelo= colección de moléculas, células u organismos IDÉTICOS a uno original.
Que es clonar?
Por analogía, clonar DNA implica
la separación de un gen o
fragmento de DA de su
cromosoma (mucho mayor), y la
unión a una molécula pequeña
portadora,
para
amplificar
selectivamente ese DNA.
Cómo?
Dónde?
Método para cortar el DNA en una localización precisa;
Método para unir dos fragmentos de DNA;
Molécula capaz de autoreplicarse;
Método para replicar el DNA in vivo;
Método para seleccionar
Tecnología DNAr
Ingeniería genética
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Chapter 7 slide 2
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Chapter 7 slide 3
Por qué clonar DNA?
Determinación de la secuencia nucleotídica de un gen en
particular, o un organismo completo
Puede investigarse la función de
Proteínas/enzimas/RNA
Pueden identificarse mutaciones, e.g.
defectos en genes que darían origen a
enfermedades específicas
Organismos pueden ser
‘ingenierizados’ con propósitos
específicos e.g. producción de
insulina, resistencia a insectos,
etc.
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Chapter 7 slide 4
遺傳學 601 20000 - ligación
Chapter 7 slide 5
Ezimas台大農藝系
de restricción
Las enzimas de restricción son un sistema
de defensa bacteriano contra DNA foráneo
( r e s t r i n ge n r e p lic a c i ó n v ir a l) .
Aplicaciones.
Ingeniería genética: Construcción de moléculas
recombinantes
M apeos de restricción: Ordenar y comparar
fragmentos de ADN sin conocer su
secuencia.
Las endonucleasas de restricción reconocen
una secuencia específica de DNA (sitio de
restricción), y rompen el enlace fosfodiester
entre dos nucleótidos generando un -OH 3’ y
un fosfato 5’.
El nombre deriva del género y especie del
organismo del cual fue aislada (código de 3
letras). Se incluyen números romanos u otras
letras para designar una cepa bacteriana en
particular
Ej. EcoRI Escherichia coli RY13
StyI Salmonella typhi
Enzima
Restriction
Enzima
Restriction
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Chapter 7 slide 6
Tipo I
Poseen actividad metilasa y de restricción;
ATP-dependientes;
Rompen el DA lejos del sitio que reconocen (>1Kbp) de
manera aleatoria, por lo tanto carecen de interés práctico.
Tipo III
Poseen actividad de restricción y modificación;
Cortan fuera de la secuencia que reconocen;
Requieren dos secuencias de reconocimiento
orientación opuesta en la misma cadena de DNA;
SonATP-dependientes.
en
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Chapter 7 slide 7
Tipo II
Sólo activ idad de restricción;
No ATP-dependientes;
Reconocen secuencias palindóm icas específicas de DNA (de 4 a
8 bp). Asumiendo un contenido de GC del 50%, una enzima con
un sitio de reconocimiento de 4 bases cortará cada 256 nt, y una
con un sitio de 8 bases lo hará cada 68.000 nt);
Clivan en la misma secuencia que reconocen dando lugar a
fragmentos discretos.
Ambas cadenas de DNA son
cortadas en la misma base
EXTREMOS ROMOS
Ambas cadenas de DNA son
cortadas entre distintos
pares de bases
EXTREMOS COHESIVOS
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Chapter 7 slide 8
Consideraciones experimentales:
Enzimas
Sitio de corte presente en DNA.
M antenerse en freezer (o hielo). Son provistas en glicerol 50%, y concentradas;
Debe ser lo ultimo en agregar;
Unidades a utilizar. Teoría 1U/µg de DNA (en 1hs). Práctica 5U/µg de DNA (calidad)
OJO. Star activity por exceso de glicerol (se debe mantener >5% v/v), o enzima (>100U/yg DNA). Otros
factores: sv. Orgánicos, pH elevado, etc.
DA
Libre de contaminantes. Debe evitarse la presencia de solventes orgánicos (fenol, cloroformo), EDTA, sales
en exceso ya que pueden interferir con la actividad enzimática.
Buffer de reacción y BSA
Buffer optimo que asegure 100% de actividad (cofactores, DTT, etc)
Algunas enzimas requieren BSA para su actividad (la presencia de BSA no afecta la actividad de aquellas
enzimas que no la necesitan)
Volúmen de reacción
En teoría: 1U/µg de DNA en 50µl.
En general: se utilizan volúmenes menores. Lo importante es mantener glicerol por debajo del 5%.
Tiempo y temperatura de incubación
Temp. óptima: 37 ºC (para bacterias). Para organismos termófilos se requieren mayores T.
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Tiempo: 2-4 hs a la temperatura adecuada
Chapter 7 slide 9
DNA ligase
Cataliza la formación de enlaces fosfodiester
en moléculas de DNA de doble cadena entre
extremos próximos cohesivos 3’-hidroxilo y 5’fosfato
USO EN TECNOLOGÍA RECOMBINANTE:
-de E.coli (NAD como cofactor)
-de fago T4 (ATP como energía)
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Chapter 7 slide 10
Una reacción de ligación requiere de 3 ingredientes (además de agua):
1.Dos o mas fragmentos de DNA con extremos compatibles.
2.Un buffer conteniendo ATP. El buffer se prepara concentrado (10x) y tras la
dilución proporciona una concentración de 0.25 a1 mM.
3.T4 DNA ligase. Una reacción típica para insertar un fragmento en un plásmido
puede necesitar en teoría entre:
Extremos romos >Extremos cohesivos
La temperatura optima de incubación depende del tipo de extremo a ligar (rango
4-37 ºC):
Extremos cohesivos
16 ºC
Extremos romos
25 ºC
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7 slide 12
Clonado de DNAChapter
(DNAr)
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Chapter 7 slide 13
Vectores de clonado
Existen numerosos vectores de clonado, y cada uno de ellos con
diferentes porpiedades moleculares y capacidades de clonado.
PLASMIDOS
.DNAds extracromosomal presente en bacterias y
hongos;
.de replicación autónoma;
.heredables;
.# copias definido (alto /bajo #copias);
.en gral. no son esenciales para viabilidad celular.
Algunas características deseables que deben poseer como
vehículos de clonado:
a. Un ori de replicación;
b. Un marcador de selección (ATBr);
c. Sitios unicos de restricción o MCS – multiple
cloning site -;
d. Secuencia conocida;
e. Otras (promotores – trasncripción y secuenciación,
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lacZ –screening)
Chapter 7 slide 14
Otros vectores de clonado
FAGOS
Ventajas como alta eficiencia y rápida multiplicación.
Este sistema tolera aprox. 20-100 kb de DA.
COSMIDOS
Vectores con características similares a los plásmidos y fagos (ori;
marcador de selección; MCS y sitio cos.
Los cósmidos toleran de forma estable aprox. 32-47kb de DA.
YACs (Yeast Artificial Chromosomes)
Vectores que en levaduras funcionan como cromosomas artificiales.
Características:
a.
Secuencias TEL (2 telómeros) y CE ( centrómero) necesarias
para la replicación del vector como un cromosoma artificial
linear ;
c.
Un marcador de selección para levaduras en cada brazo (e.j.
TRP1 y URA3);
d.
Un origen de replicación autónomo (ARS); y
e.
Unique restriction sites for inserting foreign DNA.
Es posible clonar 150-1000 kb.
BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)
Los BACs se emplean, en E .coli, para el clonado de fragmentos de aprox. 400 kb.
Características similares a los plásmidos. Sólo hay un plásmido/célula.
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Chapter 7 slide 15
Transformación bacteriana
M ecanismo natural que se emplea en el
laboratorio con el fin de amplificar
el DNA recombinante de interés;
Electroporación. Se aplica un puls o de
alto voltaje durante milisegundos. Se
puede utilizar para células eucariotas
(mamiferos y vegetales).
Sólo celulas competentes son capaces de
adquirir DNA extraño;
La competencia puede ser natural o inducida.
Cohen descubrió que cuando: 1) bacterias
tratadas con sales de Ca2+ se combinan
con los productos de ligación (en
hielo); 2) luego son sometidas a un
shock térmico y 3) finalmente se
incuban a 37ºC por ≈ 45 min.,
RES ULTADO: PLAS MIDO
RECOMBIATE ETRA E
LA CÉLULA.
Ligación y Transformación
son ineficientes
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(vector re-ligado – DNA no incorporado)
Chapter 7 slide 16
Aislamiento DNA plasmídico recombinante: Selección y screening
•
Las células transformadas son crecidas en LB +
ATB con el fin de amplificar el DNA.
•
La presión de selección es importante.
•
La amplificación del plásmido ocurre gracias a:
• La división celular (las células se multiplican
en cultivo)
• Replicación del plásmido elevada (multiples
copias por célula)
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Screening
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7 slide 19
AislamientoChapter
de genes
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Selección del AD de interés
Conocida
PCR
DNA / cADN
Secuencia
Desconocida
SB - Library
(Hibridacion )
Library expresión
(Antigenicidad/Actividad Biológica)
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Hibridización de Acidos nucleicos
Identificación de secuencias específicas dentro de una
población mayor utilizando DNA similar/idéntico
Aplicaciones básicas:
– Southern blot. El ADN es digerido por enzimas de
restricción y luego separado en un gel:
Aislamiento de un DNA específico
Organización ADN genómico (por ejemplo, genes en tandem),
Determinación del nro de copias de un gen.
–
–
–
–
–
Northern blot: se resuelve ARN en el gel en lugar de ADN,
Hibridización in situ: análisis de tejidos,
colony hybridization: detección de colonias recombinantes y
Microarrays
PCR
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Chapter 7 slide 21
PCR ….que es??
. Amplificación in vitro de un fragmento de ADN acotado por dos oligonucleótidos
. Es extremadamente sensible, con la capacidad de amplificar
(exponencialmente) millones de veces cantidades minúsculas de DNA, en un
período de tiempo relativamente corto.
1º ciclo
2 moléculas
DNA doble
cadena
2º ciclo
4 moléculas
3º ciclo
DNA doble
8 moléculas
cadena
doble cadena
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(solo 2 amplicones)
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Southern Blotting
1. Extracción y purif icación de ADN
2. Fragmentación enzimática
3. Separación de los f ragmentos
según su tamaño por electroforesis
4. Fotografía de la corrida al UV.
Curv a de calibración
5. Transf erencia a un soporte sólido
a. Desnat. en el gel
b. Transf erencia propiamente dicha
c. Fijación (unión covalente al filtro)
6. Hibridización con sondas marcadas
a. Pre-hibridización
b. Hibridización prop. dicha
c. Lavados
7. Rev elado
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Chapter 7 slide 24
3. Separación de los f ragmentos
según su tamaño por electroforesis
4. Fotografía de la corrida al UV.
Curv a de calibración
•
Visualización de la corrida electroforetica por fluorescencia por expos ición del
bromuro de etidio al UV
•
Fotografía del gel con regla graduada
•
Construcción de la curva de calibración con los tamaños de los marcadores de PM
23
9
6
4
2
d1
d2
d3
Log PM
Mk
1
0.8
Distancia (cm)
0.5
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5. Transf erencia a un soporte sólido
a. Desnat. en el gel
b. Transf erencia propiamente dicha
c. Fijación (unión covalente al filtro)
Pre-tratamiento
Depurinización (ClH 0.2M)
- Se introducen nicks en el DNA cuando se desena transferir fragmento grandes (aprox. 15kb) )
Desnaturalización (NaOH / NaCl) (depende del tipo de soporte – con o sin q)
- El ADN se une a los soportes sólidos en forma de cadena simple. (Luego del tratamiento observar el
gel en el transiluminador UV para determinar desnaturalización total)
eutralización (Tris-HCl pH 7.6 / NaCl)
Transferencia
Capilaridad
Electroforética
Vacío
En solución alcalina (soportes c/q)
Asegura la desnaturalización
o salina (SSC) (soportes con o s/q)
La fuerza iónica a utilizar durante la transferencia dependerá del tipo de
soporte que se utilice.
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Chapter 7 slide 26
Transferencia por capilaridad
Transferencia electroforética
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Chapter 7 slide 27
Soportes sólidos
-Nitrocelulosa (soporte neutro):
- Une ARN y ADN con alta eficiencia (80 mg/ cm2)
- Frágil (limita el uso repetido)
- Fragmentos < 500 nt se unen poco eficientemente.
-Requiere alta fuerza iónica para unir nucleótidos.
-Nylon (soporte neutro o q+):
- Une el ADN más fuertemente
- Fácil de manejar (más resistente)
- Requiere menor fuerza iónica para unir nucleótidos.
La unión del ADN al soporte se produce por cargas.
Unión no covalente.
Fijación
Unión covalente (por UV ó calor)
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Chapter 7 slide 28
Pre- Hibridización
6. Hibridización con sondas marcadas
a. Pre-hibridización
b. Hibridización prop. dicha
c. Lavados
ADN heterólogo, BSA, SDS
Hibridización
Dependencia de la temperatura. En la práctica:
- para Alta rigurosidad: 62-65ºC
-para Baja rigurosidad: 50-55ºC
Dependencia de la Fuerza iónica. A > concentración salina > estabilidad del
híbrido.
*En la práctica: trabajando a una conc. iónica de 0.1M Na+; un aumento
de 2 veces la conc. salina aumenta la tasa de hibrid. 5-10 veces.
Alta rigurosidad: ALTA HOMOLOGÍA = alta T, baja sal
Baja rigurosidad: BAJA HOMOLOGIA
= baja T, alta sal
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Chapter 7 slide 29
Condiciones que afectan la tasa de hibridización
Composición de bases de la sonda: > % G + C > estabilidad del híbr ido
Adición de formamida: disminuye el Tm de los híbridos.
*En la práctica: utilizando 30-50% de formamida la Temp. de incubación puede
reducirse a 30-42ºC.
Ventajas: a. Las sondas son más estables a temp. + bajas.
b. Ma yor vida útil del filtro.
Utilización de polímeros inertes: aumenta la tasa de hibridación.
*En la práctica: el agregado de 10% dextrán sulfato aumenta 10 veces
la tasa de reasociación.
Desventaja: puede aumentar el fondo del ensayo.
Existencia de mismatch: disminuye la tasa de hibridación.
*La curva: tasa de hibrid. en fn de la Temp. se corre hacia la izq.
Viscosidad: A >viscosidad < tasa de hibridación.
pH: 6.8-7.4.
台大農藝系
601 5-9)
20000
*En la práctica: se observa una independencia del
pH (en 遺傳學
el rango:
Chapter 7 slide 30
> temperatura de hibridización
Lavados
Alta rigurosidad: ALTA HOMOLOGÍA = alta T, baja sal
Baja rigurosidad: BAJA HOMOLOGIA = baja T, alta sal
Rigurosidad…depende de los objetivos del experimento
*Para estudiar miembros cercanos o lejanos de una familia de genes.
*Para screening de una biblioteca con sondas homólogas o heterólogas.
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Chapter 7 slide 31
Sondas radioactivas
Actividad específica: Es función del total de la marca incorporada (eficiencia de
incorporación).
Actividad específica (dpm/mg) = dpm incorporado
masa de ADN
Afecta la SENSIBILIDAD de la técnica: A mayor actividad
específica, más sensible es la sonda.
Tipos de sondas
-ADN doble cadena
-ADN simple cadena
-Oligonucleótidos sintéticos
-ARNm
-ARN sintetizado in vitro
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Chapter 7 slide 32
Marcación de sondas radioactivas (32P)
1. Nick traslation
a) DNAsa I genera “nicks” simple cadena en el
ADNdc.
b) DNA pol I (5´- 3´ e xo y 5´-3´pol) elimina
fragmentos simple cadena a partir del nick
(enausencia de dNTPs) y los reemplaza
por cadenas nuevas donde se incorporan
los nucleótidos marcados.
-Ventajas:
a. Técnica simple.
b. El DNA se marca uniformemente.
c. Se logra alta actividad especifica.
d. Pueden utilizarse los 3 radioisotopos.
e.Purificacion
aplicación
del
templado
depende
-Desventaja:
Se obtienen sondas cortas de cadena simple.
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Chapter 7 slide 33
2. Marcado con T4 DNA polimerasa
T4 DNA pol (3´-5´ exo y 5´-3´pol) en ausencia de dNTPs es activa la exonucleasa (200
veces + activa que la DNA pol I) y en presencia de los dNTPs predomina la actividad
polimerasa.
- Ventajas:
a. Produce moléculas sin nicks
b. Pueden marcarse regiones definidas del
DNA controlando las condiciones
de reacción.
c. Se obtiene alta actividad específica.
- Desventaja :
Dificultad para marcar segmentos largos
de DNA (debido a la posible presencia de
estructuras secundarias que inhiben la
polimerasa).
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Chapter 7 slide 34
3. PCR
Taq pol (5´-3´pol) en presencia de los dNTPs actividad polimerasa.
-Ventajas:
a. Se obtienen sondas intactas (sin nicks).
b. Se controla tamaño de la sonda.
c. Se obtiene alta actividad específica.
-Desventaja:
Se requiere conocer la secuencia blanco.
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Chapter 7 slide 35
Otros métodos:
-Fragmento Klenow (DNA pol I de E. coli
(5’-3’ pol y 3’-5’exo)
Random primer
-T4 polinucleotido quinasa.
Se obtienen sondas con menor AE
-Clonado en M13.
Obtención sondas de ADNss
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Chapter 7 slide 36
Marcación de sondas NO radioactivas
•
Incorporación de nucle ótidos modificados (ej. DIG-dUT P)
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Chapter 7 slide 37
Ventajas:
- No se utiliza radioactivo
- Sondas estables (uso no restringido a la vida media del radioisotopo).
- Puede aumentarse la sensibilidad utilizando altas concentraciones de sonda sin causar
problemas de fondo (???)
-Detección rápida (3h) no requiere obtener autoradiografia.
- Método barato.
Desventajas:
-Presenta una sensibilidad menor respecto de los métodos que utilizan radioisotopos.
-Dificultad para cuantificar las bandas coloreadas a partir del filtro de nitrocelulosa.
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Chapter 7 slide 38
Bibliotecas de AD
Bibliotecas de AD
= Genotecas = bancos de secuencias = libraries
“colección de fragmentos de ADN de un determinado organismo contenidos en bacterias o
virus ”
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Chapter 7 slide 39
Plásmido,
cósmido
Construcción
de una library
Genómica
Genote cas de AD
genómico: contiene al
menos una copia de las
secuencias contenidas
en el genoma, en
forma estable y en un
número manejable de
clones.
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Chapter 7 slide 41
Screening de la library
DNA hybridization to a
(radio-)labeled DNA probe
Construcción de una
library
de cDNA
Genote ca es la de AD copia (o AD complementario):
contiene todos los ARNm bajo la forma de ADNc en un tipo
celular dado y en un momento determinado de la vida
celular, en forma estable y en un número manejable de
clones.
Primer paso:
Purification of poly-adenylated mRNA
using oligo(dT)-cellulose
Nota: selección adecuada de la fuente de
RNA (organ, tissue, estadio) es CRITICA!
Clonado del DNA
copia or cDNA :
cDNA library
construction
Nota: Genrealmente
el ds cDNAs es
clonado en vectores
como bacteriophage
lambda (λ) o plasmido
Plásmido,
cósmido
cDNA - DN A copia o complementario
• DNA derivado de la copia del mRNA
Cómo se realiza el cDNA de mRNAs?
1. Los mRNAs se aislan a partir de un
extracto celular.
3. La enzima transcriptasa reversa
hace una copia de DNA a partir de
una molécula de mRNA, en un
proceso denominado trasncripción
reversa.
4. El mRNA es removido, quedando
moléculas de cDNA simple cadena
5. Usando la enzima polimersa puede
hacerse un DNA copia del cDNA,
dando lugar al cDNA doble cadena
6.
El cDNA doble cadena es
manipulado y está listo para ser
clonado.
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Chapter 7 slide 45
Screening de una cDNA library
•DNA probe: secuencia homóloga
•Oligonucleotide probe: se basa en la secuencia de
aa (requiere purificacion y secuenciación de la
proteina o peptido)
•Antibody: dirigido contra la proteina de interés
(nota: USO DE VECTOR DE EXPRESIÓN)
Screening a cDNA
library using DNA
hybridization to a
(radio-)labeled
DNA probe
Screening con un oligonucleotido marcado
basado en una secuencia conocida (peptido o proteina)
Marcación de oligonucleotidos con polynucleotide kinase
and
γ-32P-labeled ATP
Marco abierto de lectura (ORF - Open reading frame): secuencias de ADN comprendida
entre un codón ATG (inicio de la traducción) y un codón de terminación, descontando las
secuencias intronicas en caso de haberlas.
•Generalmente se encuentra acotado por secuencias no traducidas;
•En una secuencia de ADN cualquiera hay, a priori, 6 posibles sentidos en los que pueden
aparecer ORFs. Cada ORF se denominan +1, +2, +3, -1, -2 y -3.
En un ejemplo con la secuencia 5' aactgcagtacgtaacgtca 3'
5' a ↓act gca gta cgt aac gtc a 3'
5' aa ↓ ctg cag tac gta acg tca 3'
5' aac ↓ tgc agt acg taa cgt ca 3'
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Chapter 7 slide 50
Immunological screening de una library de
expresión
can fold independently of the rest of the protein
can fold when:
the polypeptide
chain
is incomplete
台大農藝系
遺傳學
601 20000
Chapter 7 slide 51
expressed as a fusion with another protein
Objetivos de estudio con cada tipo de biblioteca
- Genotecas de ADc:
- Análisis de estructura y función de
secuencias
exónicas,
deducción
de
secuencias proteicas
- Obtención de sondas de ADNc
- Identificación de genes que se
expresan en un determinado tipo o estadío
celular.
Producción
de
proteínas
eucariotas en bacterias
ventajas
- tamaño pequeño
- enriquecidas en
secuencias según la
expresión
desventajas
- Genotecas de ADg:
- Análisis de estructura y función
de genes (intrones, exones, secuencias
regulatorias), regiones intergénicas, etc.
- Organización del genoma
ventajas
-fácil degradación del
ARNm (procariota)
- sólo se pueden
analizar secuencias
codificantes
- es difícil identificar
secuencias de muy bajo
nivel de expresión
desventajas
- construcción y
screening laborioso
-están representadas
todas las secuencias
del genoma
- no todos los clones
pueden expresarse en
procariotas
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Chapter 7 slide 52
台大農藝系
601 20000 procariota
Chapter 7 slide 53
Vectores
de 遺傳學
expresión
Diseño de una estrategia para expresión de proteínas
Elección del vector
Aplicación u objetivos experimentales con la proteína expresada
Preparación del vector
corte con ER/desfosforilación/purificación
Preparación del inserto de DNA
plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación
Clonado del inserto dentro del vector
Ligación/transformación en huesped/identificación de
clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación.
Transformación dentro del huesped para expresión.
Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés
análisis cuantitativos de niveles de expresión y acti vidad biológica.
Scale-up
Purificaión de la proteína y análisis funcional
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Chapter 7 slide 54
Sistemas de expresión de proteínas
Sistema
Vel. de crecimiento/ Costo
ivel de expresión
Modificaciones posttraduccionales
E. coli
30 min./Bajo
Alto
O
Levaduras
90 min./Bajo
Medio
≠ glicosilación
Alta manosa
Células insectos
18-24 hs. /Alto
Medio
≠ glicosilación
(largo, contenido manosa)
Células mamíferos
24 hs. /Alto
Bajo
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Si
Chapter 7 slide 55
Algunos Sistemas de expresión …….
Prokaryotic Expression vector
Eukaryotic Expression vector
(mamiferos)
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Chapter 7 slide 56
Objetivo general del TP
screening
W.B.
y corte
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Chapter 7 slide 57
Proteínas de fusión:
Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la
proteína target.
Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión
purificación
protege de proteólisis a la proteína de interés
mejora la solubilidad de la proteína
estabiliza a la proteína de interés
Esquema genérico del vector
A
Promotor
ATG
A
B
MCS
B
ori
Ampr
MCS
Secuencia “tag”:
*Dominio con función enzimática
*Señales topogénicas
Secuencias consenso para
Corte con una proteasa
Sitio múltiple de clonado
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Chapter 7 slide 58
Construcción de una proteína de fusión
Fusion partner
gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of fusion partner gene must be removed
Note: reading frame of fusion protein must be contiguous
Secuencias consenso para el corte con una proteasa
•
Clivan una secuencia corta y definida de aa
•
La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés
protease cleavage sequence
fusion partner
gene of interest
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Chapter 7 slide 59
g/gatcc ATG ccc-----ggg TAA a/agctt
g/gatcc ATG ccc------ggg g/gatcc
g/gatcc ccc------ggg a/agctt
g/gatcc ATG ccc------ggg a/agctt
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Chapter 7 slide 60
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Chapter 7 slide 61
pGEX
Promotor Ptac/IPTG:
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Chapter 7 slide 62
Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac
•
Híbrido de promotores lac y trp
•
Regulado por el represor lac
•
Independiente de la regulación por cAMP
Gen de interés
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
-35 promotor trp
-10 promotor lac
Separación
16 pb=promotor tac
17 pb=promotor trc
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Chapter 7 slide 63
Promotores basados en la Polimerasa T7:
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Chapter 7 slide 64
T7 promoter
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Chapter 7 slide 65
TP#1
Sub-clonado del gen gfp en vector de expresión pGEX
1. Digestión de inserto y vector
Selección de ER adecuadas para construir proteina de fusión gst-gfp
Reacción de digestión
2. Verificación de la restricción
Corrida en geles de agarosa
3. Desfosforilación del vector
Tratamiento con CIP del vector digerido
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Chapter 7 slide 66