determinación voltamétrica directa de oligonucléotidos sobre

DETERMINACIÓN VOLTAMÉTRICA DIRECTA DE OLIGONUCLÉOTIDOS
SOBRE ELECTRODOS DE GRAFITO
P. de los Santos, M.J. Lobo, A.J. Miranda, P. Tuñón.
Departamento de Química Física y Analítica. Universidad de Oviedo. Asturias. España.
ELECTROOOXIDACIÓN DE (dA)20
INTRODUCCIÓN
600 ng (d A) 20 en 0,02 M fos fato p H 7,4, 0. 4 M NaC l, 2 m M A EDT
evaporado sobre el electrodo de gra fito
La detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos tiene sus
aplicaciones más importantes en el área de la medicina.
En muchos casos se están constituyendo como métodos
alternativos al diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Su principal ventaja radica en su rapidez frente a la
utilización de cultivos o el desarrollo de reacciones
inmunológicas. La detección de oncogenes con fines de
diagnóstico precoz o el control de la respuesta de un
paciente a un tratamiento antiviral constituyen algunos
ejemplos de su contribución al avance en el diagnóstico y
tratamientos clínicos.
Elevado potencial
Irreversible
150
125
I / mA
100
CARACTERIZACIÓN ELECTROQUÍMICA
DE SUS PRODUCTOS DE OXIDACIÓN
75
50
25
0
Las técnicas que utilizan la electroactividad intrínseca de
los ácidos nucleicos se basan casi exclusivamente en las
propiedades redox de las bases que los componen sin
necesidad de emplear secuencias marcadas. Sin
embargo, su sensibilidad se ve limitada debido a que la
oxidación de las bases tiene lugar de forma irreversible a
potenciales muy elevados.
En nuestro grupo de investigación se ha descubierto que
la electrooxidación de derivados de adenina sobre
electrodos de carbono da lugar a productos de oxidación
electroactivos a bajos potenciales.
4
-25
-0,50
-0,25
0
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
2
i / µA
E /V
Fosfato 0,1 M pH 12; v=0,05 V/s
-2
Ventajas
-4
Sensiblilidad
Detectabilidad
Selectividad, separación etapas oxidación y detección
Bajo potencial
Reversible
Fuerte adsorción
0
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
E/V
n
Sis tema red ox revers ible
Eº’=(0,126 ± 0,003) V; pH 7
n
En el presente trabajo se demuestra que la
electrooxidación de oligonucleótidos que contienen
adenina da lugar a procesos análogos y que éstos
pueden ser utilizados como señal analítica para la
detección de la secuencia de origen a bajos potenciales.
La metodología desarrollada se aplica a la detección de
secuencias específicas de diversos patógenos.
Part icipación del mismo número de H+ que e- en el
proceso redo x
Eº’(V) = 0,51 – 0,055 pH; r = 0,9991; n = 7
7 ≤ pH ≤ 1 2
n
PROCEDIMIENTO OPERATORIO
n
Constante ci nética de tran sferenci a el ectróni ca
OXIDACIÓN
EVAPOR ACIÓN
R
I
A
En corrien te d e aire
caliente, a s equedad
Adsorción
ip , an (A) = 1,1· 10 -4 v(V/s) -5· 10-7
r = 0,998; n = 14
pH 7
pH 1 0,1 3
Fosf ato 0,1 M, pH 12, sin O 2 disuelto
(corriente de N 2 )
Método d e Laviron
(15 ± 3) s- 1
(18 ± 3) s- 1
Aco ndi ciona mie nto:
Método d e Komorsky-Loric
(19 ± 2) s- 1
(24 ± 3) s- 1
E= -0,4 V ; t= 30 s; 400 r.p .m.
Oxi da ció n:
E inicial: -0,45 V
E pulso: +1 ,1 V ; t= 5 s
E final: -0, 45 V
DETECCIÓN VOLTAMÉTRICA DE
SECUENCIAS ESPECÍFICAS
dA2 0
Técnic a
a
a
DPV
-2,1⋅10-7
SWV
-2⋅10-6
a.c. V
-5⋅10-7
b
b
110
r
n
Intervalo lineal /ng
0,9993 9
2 - 100
2930 0,9992 6
330
0,999
R
DEPOSICIÓN
5
L. D./ng
b
aa
b
DPV
-5 ⋅10-8
15,8
SWV
-4 ⋅10-7
a.c. V
2 ⋅10-6
r
n
MEDIDAS
Fosf ato 0,1 M; pH 7
2
2 - 40
1,9
2 - 20
1,9
REG ENERACIÓN
Intervalo lineal /ng
L. D./ng
0,9992 7
10 - 120
10
6800
0,998
5
10 - 100
10
72
0,999
4
20 - 100
20
Intervalo lineal /ng
L. D./ng
C.Trachomatis
Técnic a
a
a
b
b
r
n
pulido lija de ag ua;
ultrason id os 2 min
SECUENCIAS DE BASES DE LOS
OLIGONUCLEÓTIDOS
CONCLUSIONES
• Los productos de la oxidación del ácido 5’icosadesoxiadenílico dA20 en fosfato 0,1 M, pH 12,
sobre electrodos de grafito dan lugar a un sistema
redox reversible de potencial formal (0,126 ± 0,003)
V a pH 7, que se adsorben sobre dicha superficie. La
constante de transferencia electrónica obtenida a
pH 7 fue de (19 ± 2) s-1.
dA20
DPV
-1,0⋅10-7
14,2 0,9991 6
10 - 200
10
SWV
-9⋅10-7
482 0,9995 5
10 - 100
10
a.c. V
-3⋅10-8
32,6 0,9992 5
10 - 100
10
5’-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA-3’
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
5’-ATG TGG AAA ATC TCT AGC AGT-3’
C.Trachomatis
a
A
10 µ L disolución
de o ligonu cleótido
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Técnic a
I
ordenada en el origen en Amperios. b sensibilidad expresada en
Amperios/g.
5’-CAC AGG CAG AGC TTG CAA GGA-3’
• Se ha desarrollado un método voltamétrico sencillo
para la determinación de secuencias específicas de
oligonucleótidos que contienen adenina utilizando
como señal analítica el proceso reversible que
originan, a potenciales próximos a 0 V en medios
neutros y alcalinos, los productos de su oxidación
electroquímica sobre electrodos de grafito. La técnica
de voltamperometría de onda cuadrada ofreció la
mejor sensibilidad. Se han conseguido límites de
detección de hasta 10 ng para secuencias específicas
de patógenos.