Producción de anticuerpos específicos anti pla2 en conejos

Resumen: E-046
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Producción de anticuerpos específicos
anti pla2 en conejos
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Rodríguez, Juan P. - Leiva, Laura C. - Acosta, Ofelia
1. Cátedra de Química Biológica I, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, U.N.N.E.
Av. Libertad 5400, Corrientes. TE 03783 457996 Int 112. e-mail: [email protected]
2. Cátedra de Patología Médica, Facultad de Ciencias Veterinarias, U.N.N.E.
Sgto. Cabral 2139, (3400) Corrientes. Argentina. TE 03783 452753. Int 169 e-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
En la intoxicación por veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) de Sud América se presentan efectos sobre
sistema nervioso (Vital Brasil, 1972). El veneno constituye un paquete de sustancias tóxicas tales como: crotoxina,
crotamina, convulsina y giroxina. Tanto la crotamina como la crotoxina son las que causan alteraciones en la
neurotransmisión periférica (Habermann, E. and Breithaupt, 1978).
La crotoxina, principal componente del veneno, exhibe actividad neurotóxica (Brazil, 1966). Es un complejo
formado por dos proteínas unidas de modo no covalente, una básica y otra acídica. El componente básico (crotoxina B)
con un pI de 8.6 (Horst et al, 1972) o 9.7 (Breithaupt et al, 1975) es una fosfolipasa A2. Esta enzima puede reproducir
todos los efectos farmacodinámicos de la crotoxina aunque a dosis más altas de las requeridas por el complejo crotoxina
(Rübsamen et al, 1971; Frenkel-Conrat y Singer, 1956; Habermann y Breithauopt, 1978). El componente acídico
(crotoxina A), denominado crotapotín, con un pI de 3.4-3.7 (Horst et al, 1972; Breithauopt et al, 1974) es un
polipéptido que no presenta actividad enzimática ni posee toxicidad. En presencia de la fosfolipasa A2, la proteína
acídica, crotapotín forma un complejo en el cual se restablecen las propiedades fisicoquímicas y la alta toxicidad que
exhibe la crotoxina, aunque reduce la actividad que exhibe la fosfolipasa A2 cuando está libre (Breithaupt and
Habermann, 1972).
La crotoxina también presenta actividad hemolítica (Rosenfeld, 1971). Este efecto es debido principalmente a
los productos formados por la acción fosfolipásica sobre glicerofosfolípidos, esto es, ácidos grasos y lisofosfolípidos.
Los lisofosfolípidos emulsionan los fosfolípidos de la membrana, alterando así la estructura de la membrana del
eritrocito, lo que conlleva a la lisis celular. Por lo tanto, se trata de una hemólisis indirecta.
El veneno de C. d. t. tiene una letalidad elevada, medida a través de la dosis letal 50 (LD50, cantidad de veneno
que produce la muerte del 50% de animales inoculados 48hs antes), correspondiéndole un valor 0,073 µg/g ratón
(Santoro et al, 1999), mientras que ensayos realizados en nuestro laboratorio, correspondientes a especimenes que
habitan la región nordeste de Argentina, arrojan una dosis aún menor, de 0,048 µg de veneno por gramo de ratón. La
crotoxina es un componente letal, principalmente responsable de la toxicidad del veneno, (Canziani et al 1982)
determinaron su LD50 (0,050 + 0,03 µg/g ratón) siendo marcadamente menor que la de la fosfolipasa A2 (crotoxina B)
(0,54 + 0,15 µg/g ratón).
Los sueros actualmente disponibles en el comercio son heterólogos, por lo que están constituidos por gran
variedad de inmunoglobulinas capaces de reconocer y neutralizar los distintos componentes del veneno. Si bien este
tipo de suero genera una protección inmediata frente a la toxicidad del veneno, puede generar secuelas dado que
simultáneamente se convierten en un paquete proteico exógeno contra los cuales el organismo ha de reaccionar
formando inmunocomplejos. Estos complejos pueden depositarse en riñón y desencadenar daño renal a largo plazo.
Es de interés producir un suero específico contra el componente letal del veneno a fin de anular su acción y con
ello evitar el suministro excesivo de proteínas heterólogas. Teniendo en cuenta que la PLA2 (crotoxina B) posee una
toxicidad menor que el complejo que ésta forma con el crotapotín (crotoxina A), lo cual permite suministrar mayor
dosis de antígeno con menor riesgo de muerte en animales de experimentación, en este trabajo se han de producir
anticuerpos anti-PLA2 del complejo crotoxina de Crotalus durisus terrificus y evaluar su capacidad neutralizante de la
letalidad del veneno.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del antígeno
El antígeno, PLA2, enzima presente en el veneno de C. d. t. se aisló y purificó mediante técnicas de cromatografía en
columna según adaptación de la técnica de Landucci et al (1994).
La técnica adaptada empleada constó de una sola etapa, en la que se realizó una cromatografía de exclusión molecular,
en Columna de Sephadex G-75.
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Detección de la actividad enzimática.
La detección y cuantificación de la actividad fosfolipásica en el veneno entero, en las fracciones recolectadas durante el
aislamiento y en la enzima purificada, se llevaron a cabo con el test de coagulación de la yema de huevo (Vidal y
Stoppani, 1971). Los tubos que contenían la enzima volvieron incoagulable la solución de yema de huevo, indicando
elevada actividad fosfolipásica.
Preparación de la vacuna
Un mg. del antígeno (PLA2) se disolvió en 5 mL de buffer PBS. A esta solución se le agregaron 100 µL de Tween 20, y
luego gota a gota, sobre el vórtex, se agregaron 5 mL de FCA. Se agitó hasta formar una emulsión evitando que se
separe el aceite del adyuvante en una fase y, el PBS, en otra. Las vacunaciones de refuerzo, se realizaron de la misma
manera, con la utilización de FIA.
Obtención del antisuero. (Suero hiperinmune de conejo)
Animales: se trabajó con conejos mestizos machos en grupos de 5 (cinco), distribuidos en dos grupos.
Protocolo de inmunización: los conejos se inmunizaron mediante la inoculación de 0.6 mL intramuscular en cada pata
y 0,8 mL aplicados en 3 inyecciones subcutáneas en distintos lugares del lomo. A los 15, 21, 30 y 40 días se aplicaron
los refuerzos de igual volumen de vacuna. A los 60 días se sangraron los conejos por vena yugular. Los sueros de los
respectivos conejos inmunizados se mezclaron en un pool, sometiendo el mismo a test de detección de anticuerpos.
Purificación de Anticuerpos: (gammaglobulina anti-PLA2)
Para separar las inmunoglobulinas del resto de las proteínas séricas, a 3 mL de suero inmune se agregó lentamente
SO4(NH4)2 hasta completar igual volumen al del suero, efectuando la mezcla en un vórtex. Se ajustó el pH a 7.8 y se
dejó en reposo en heladera dos horas. Se centrifugó a 5000 r.p.m. durante 30 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se
resuspendió el precipitado en una solución de SO4(NH4)2 al 50% .Este procedimiento se repitió hasta que el
sobrenadante a descartar fuera límpido. El precipitado final obtenido se reconstituyó en agua destilada, y luego se
desionizó en columna de Sephadex G-25. Igual procedimiento se llevó a cabo con pool de suero de conejos control.
Detección de anticuerpos producidos:
Electroforesis en acetato de celulosa. Se corrió un suero control, junto al suero hiperinmune. Se utilizó la técnica
semimicro. Tiempo de corrida: 45 minutos en Buffer Veronal sódico (8,24 g/l) pH: 8.6. Intensidad de corriente: 1.5 mA
por tira.
Precipitación en medios gelosados (Método de Ouchterlony). En caja de Petri estéril se depositaron 5 mL de agar
fundido (2%, en solución buffer de NaOH y H3BO3, pH= 8.6) y una vez enfriado se agregaron 15 mL de agar fundido al
1% a 60 °C. Se dejó solidificar y se confeccionaron pares de orificios de 5 mm de diámetro, que se separaron 1 cm
entre sí. En los distintos orificios se sembraron 0,1 mL de antígeno enfrentados a 0,1 mL de suero hiperinmune de
conejo a testear y a 0,1mL de gammaglobulina anti-PLA2 obtenida por precipitación, en dicho suero. Las placas se
mantuvieron en cámaras húmedas. Las lecturas de los resultados se efectuaron a las 24-72 horas
Neutralización de la actividad hemolítica del veneno de C. d t.
En placas plásticas, se depositaron 25 mL de agar al 1% (previamente fundido y enfriado a 50 °C) pH: 7,2 conteniendo
0,3 mL de solución 1:3 de yema de huevo en solución Fisiológica, 0,3 mL de paquete del glóbulos rojos, 0,25 mL de
CaCl2 0,01M y 5 mg. de Azida sódica. Se dejo solidificar y se confeccionaron 4 pares de orificios con un sacabocados
de 3 mm de diámetro. En cada uno de los pares de orificios se sembraron diluciones del veneno entero y diluciones de
veneno entero preincubadas durante 30 minutos a 37°C en partes iguales, con el suero hiperinmune de conejo obtenido,
y con gammaglobulina anti-PLA2 obtenida. Las placas fueron incubadas en cámara húmeda durante 20 hs. a 37°C.,
midiéndose luego los diámetros de los halos de hemólisis.
Neutralización de la actividad letal del veneno de C. d t. Grupos de 6 ratones machos (20 + 2 g.) fueron inoculados con
0,5 mL i.p. de solución de veneno conteniendo una dosis de reto de 2 µg (dos veces la DL50) preincubados con
gammaglobulina anti-PLA2 obtenida, 30 minutos a 37 ºC. Los ratones controles recibieron iguales cantidades de
veneno entero preincubados con PBS. El número de muertes fue contabilizado a las 24 hs. y 48 hs.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La metodología empleada para el aislamiento de la enzima, llevada a cabo en una sola etapa (Figura 1), permitió
obtener el antígeno con alta pureza, cuya homogeneidad se comprobó por SDS-PAGE (Figura 2), con un peso
molecular de 16 kDa, comparable con la obtenida por otros autores, 16,2 kDa (Habermann and Rübsamen, 1971;
Omori-Satoh et al, 1975). El pH del buffer de elusión, permitió una adecuada disociación del complejo crotoxina,
separándose la PLA2 del crotapotin. Este último debido a su menor peso molecular, (9 KD) eluyó en las fracciones
posteriores (Figura 2, fracciones 22 y 23)
El proteinograma del suero hiperinmune de conejo, mostró un aumento en la fracción de las gamaglobulinas respecto al
de los conejos control, indicando probable respuesta inmune al antígeno inoculado (PLA2) (resultados no mostrados) El
test para detección de anticuerpos específicos (método de Outcherlony) mostró una sola banda de precipitación para los
anticuerpos del suero hiperinmune de conejo obtenido en este trabajo (Figura 3), lo cual no solo demuestra
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especificidad del suero para su correspondiente antígeno sino también la pureza antigénica inoculada. El mismo test
realizado con gamaglobulina obtenida a partir del suero, con una concentración de 26 mg./mL, mostró bandas de
precipitación mas intensas que aquellas que produjo el suero, estos resultados demuestran que el suero de conejo
presenta menor tenor de inmunoglobulinas circulantes.
La capacidad neutralizante de la actividad hemolítica del suero hiperinmune de conejo, fue demostrada por la
considerable reducción de los halos de hemólisis que se obtuvieron al comparar la actividad hemolítica de diferentes
diluciones del veneno entero, diferentes diluciones del veneno preincubado con el suero hiperinmune de conejo, y
diferentes diluciones del veneno preincubados con gamaglobulina anti-PLA2 (Tabla 1).
Ratones controles inoculados con la dosis de reto de veneno de C.d.t. murieron antes de las 24 hs., mientras que
aquellos a los que se les suministró veneno preincubado con gamaglobulina anti-PLA2 mostraron una superviviencia del
100% a las 48 hs. de inyección. Estos resultados demuestran la efectividad de los anticuerpos producidos, capaces de
neutralizar la letalidad del veneno.
CONCLUSIONES
Se obtuvo un suero de conejo hiperinmune constituidos por anticuerpos anti-PLA2 de C.d.t. capaz de neutralizar la
actividad hemolítica, y letal del veneno.
AGRADECIMIENTOS
A la Secretaría General de Ciencia y Técnica de la UNNE por el apoyo financiero a través del Proyecto PI 610 y de la
beca de Pre-Grado otorgada a J. P. Rodríguez.
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2,5
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2
Abs.
1,5
18
1
0,5
0
0
10
20
30
Nº de Tubo
40
50
Figura 1. Perfil de elusión de veneno de Crotaluss durissus terrificus en
columna de Sephadex G-75 (20 x 1 cm) estabilizada con buffer glicina 20 mM,
150mM NaCl, pH 1.9.
: Tubos con actividad PLA2
Figura 2. SDS-PAGE. Perfiles electroforéticos obtenidos a partir de
cromatografía de filtración por gel. A: Veneno entero de Crotaluss
durissus terrificus B: Fracciones 18 – 23 (de izquierda a derecha).
Figura 3. Test de Oucherlony.
PLA2 (1). Suero anti-PLA2 (2).
Tabla 1: Neutralización de la Actividad hemolítica del veneno de C.d.t. expresado en % de neutralización.
0,8
0,4
0,2
Suero de Conejo 6.25 11.2 28.5
Gamaglobulina 56.25 78.57 83.3
Veneno (mg/mL)
0,1
36.6
100
0,05 0,025 0,0125 0.006
100 100
100
100
100 100
100
100