BIO2-Temas_15-16_files/T. 16 Genética molecular
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En la siguiente dirección se pueden encontrar animaciones sobre los procesos de replicación, transcripción y traducción para ayudaros a entender estos mecanismos. Espero que os sean de gran utilidad. Cualquier duda la comentaremos en clase. http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/inicio.htm 1.-­‐ NATURALEZA DEL MATERIAL HEREDITARIO 1.1 INTRODUCCIÓN 1.2 PRUEBAS DIRECTAS 1.3 PRUEBAS INDIRECTAS 2.-­‐ BASE MOLECULAR DE LA HERENCIA. EL FLUJO DE LA INFORMACIÓN ( de los ácidos nucleicos a las proteínas) 3.-­‐ REPLICACIÓN DEL ADN 2.1 INTRODUCCIÓN 2.2 CARACTERÍSTICAS DE LA DUPLICACIÓN 2.3 DUPLICACIÓN EN PROCARIOTAS 2.4 DIFERENCIAS EN LA REPLICACIÓN DE EUCARIOTAS 4.-­‐ TRANSCRIPCIÓN 4.1 CARACTERÍSTICAS DE LA TRANSCRIPCIÓN 4.2 LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS 4.3 DIFERENCIAS EN LA TRANSCRIPCIÓN DE EUCARIOTAS 5.-­‐ EL CÓDIGO GENÉTICO: DESCIFRADO DE LA CLAVE GENÉTICA 6.-­‐ TRADUCCIÓN 6,1 INTRODUCCIÓN 6.2 TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS 6.3 DIFERENCIAS EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS 7.-­‐ MUTACIONES 7.1.-­‐ INTRODUCCIÓN 7.2.-­‐ LAS MUTACIONES COMO FUENTE PRIMARIA DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA: ALELOS. IMPLICACIONES DE LAS MUTACIONES EN LA EVOLUCIÓN Y APARICIÓN DE NUEVAS ESPECIES. 7.3.-­‐ TIPOS DE MUTACIONES 7.4.-­‐ AGENTES MUTAGÉNICOS 8.-­‐ BIOTECNOLOGÍA 9.-­‐ ADN E NGENIERÍA GENÉTICA 9,1 INTRODUCCIÓN 9.2 CONSTRUCCIÓN DE UN ADN RECOMBINANTE 9.3 TÉCNICA DE LA HIBRIDACIÓN 9.4 LA CLONACIÓN DEL ADN. VECTORES (PLÁSMIDOS) 10.-­‐ INGENIERÍA GENÉTICA : AGRICULTURA Y MEDIO AMBIENTE 10.1 PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRASNGÉNICAS 10.2 APLICACIONES MEDIOAMBIENTALES 11.-­‐ INGENIERÍA GENÉTICA EN MEDICINA 1 1.-NATURALEZA DEL MATERIAL HEREDITARIO 1.1.-INTRODUCCIÓN: El estudio de la división celular y de los ciclos biológicos, nos indican que los cromosomas son los principales portadores del material genético: -­‐ Se duplican con precisión y se dividen con exactitud en la mitosis, proporcionando a cada célula un juego completo de cromosomas. -­‐ Su comportamiento en la meiosis concuerda con lo que se espera de la herencia. -­‐ La mezcla al azar y el entrecruzamiento que sufren durante la meiosis proporciona la variabilidad que se observa en los individuos. Ahora bien, ¿son las proteínas o el ADN de los cromosomas los portadores de la información genética?. Numerosas pruebas, indirectas y directas, indican que el compuesto químico portador de la información genética es el ADN. En los virus con ARN, éste es el portador de la información genética. 1.2.-PRUEBAS DIRECTAS: En 1928, un bacteriólogo inglés, Fred Griffith, estudiaba la bacteria causante de la pneumonía, encontró dos cepas la cepa S, virulenta y la cepa R, no virulenta. Ambas mueren al calentarlas. Griffith inoculó ratones con una mezcla de bacterias S muertas por calor y bacterias R vivas, los animales morían de neumonía. Se había producido un cambio estable hereditario. Algún componente de las bacterias S había pasado a las bacterias R. Avery y col. se propusieron encontrar cual era ese componente que transmitía un carácter heredable. En 1944 publicaron los resultados de sus investigaciones, confirmando que es el ADN el portador de los caracteres heredables, además demostraron que las bacterias pueden intercambiar material genético. Posteriormente (1952) A.Hershey y M. Chase, mediante experimentos in vivo con el fago T2, probaron definitivamente que el ADN es el portador de la información genética; Es el nacimiento de la Genética molecular y Genética bacteriana. En 1953 Watson y Crick deducen la estructura secundaria del ADN. 1.3.-PRUEBAS INDIRECTAS: Existen varias pruebas indirectas que confirman que es, el ADN el portador de la información genética: -­‐ La cantidad de ADN se mantiene constante en todos los individuos de la misma especie. Además es una molécula estable que no se sintetiza ni se degrada con rapidez. -­‐ Los gametos poseen la mitad del número de cromosomas que las células somática. -­‐ El ADN permanece invariable en las células que no están en división. -­‐ Las mutaciones que se inducen en el ADN se traducen en alteraciones en el fenotipo de las células. 2 2.- BASE MOLECULAR DE LA HERENCIA. EL FLUJO DE LA INFORMACIÓN: DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS A LAS PROTEÍNAS Como hemos visto, la molécula portadora de la información genética es el ADN. La información genética es hereda por los descendientes mediante la replicación del ADN, por eso decimos que el ADN es la base molecular de la herencia. Sin la replicación no se podría conservar la información genética a través del tiempo, ya que las células e individuos tienen un tiempo limitado de vida y la única manera de que se conserve la información genética es pasarla a los descendientes, para ello debe previamente duplicarse. Sabemos que la información genética que lleva el ADN se manifiesta con la formación de proteínas (muchas de ellas enzimas) que serán responsables de los caracteres del individuo (color del pelo, altura, forma de la nariz,…). Pero las proteínas se forman en el citoplasma (ribosomas) y en las células eucariotas el ADN no sale del núcleo, por ello hace falta un intermediario, el ARNm. La síntesis de ARNm a partir del ADN se llama transcripción y la formación de proteínas gracias al ARNm, a los ARNt y a los ribosomas (ARNr y proteínas) se llama traducción. En resumen, el flujo de la información genética va desde el ADN al ARNm y desde el ARNm a las proteínas, como se aprecia en el siguiente diagrama: Replicación Transcripción ADN Traducción ARNm Proteína Esta forma de expresarlo ha tenido que ser cambiada por recientes investigaciones llevadas a cabo en virus que no contienen como material genético ADN, siendo algunos capaces de hacer copias de su ARN mediante una enzima llamada ARN replicasa y otros llamados retrovirus poseen la enzima transcriptasa inversa que sintetiza ADN a partir de su ARN, proceso llamado transcripción inversa. Quedando el flujo de información genética de la siguiente manera: Replicación del ARN Replicación del ADN Transcripción ADN Traducción ARNm Transcripción inversa 3 Proteína 3.-REPLICACIÓN DEL ADN 3.1.-INTRODUCCIÓN Cuando una célula se divide transmite su información genética a las células hijas, para ello previamente duplica el ADN, proceso conocido como Replicación. En su momento se plantearon tres hipótesis par intentar explicar el proceso de duplicación del ADN. a) Hipótesis semiconservativa: si las nuevas dobles hélices formadas tienen una hebra antigua y una moderna. b) Hipótesis conservadora: Cada una de las hebras del ADN progenitor se replica produciendo una molécula con las dos cadenas antiguas y la otra con las dos cadenas nuevas. c) Hipótesis dispersiva: Las cadenas progenitoras se rompen a intervalos, y los segmentos progenitores se combinan con los segmentos nuevos, para formar las cadenas hijas (ambas moléculas presentan trozos intercalados de cadenas progenitoras y recién sintetizadas). En 1958 Meselson y Stahl en experimentos llevados a cabo con E. coli demostraron que la replicación es semiconservativa. El genoma humano consta de unos 3000 millones de nucleótidos, y se replica unos 1000 billones de veces para desarrollar un ser humano a partir de un óvulo fecundado. 3.2.-­‐CARACTERÍSTICAS DE LA DUPLICACIÓN: -­‐ Sucede en la fase S del ciclo celular. Para replicar el ADN se separan sus 2 cadenas de nucleótidos enrolladas en hélice y cada cadena se usa de molde para fabricar su complementaria (otra nueva), resultando 2 hélices de ADN, cada una con 2 cadenas de dnucleótidos en la que una de las cadenas es la del ADN antiguo y la otra es la nueva cadena, por lo que se llama replicación semiconservativa. 4 -­‐ Es bidireccional: a partir de un punto dado del cromosoma la replicación avanza en dos sentidos. -­‐ En virus y bacterias hay un único punto de inicio (Ori-­‐C) de la replicación, en eucariotas hay varios. -­‐Los dnucleótidos se añaden en el sentido 5´ 3´ -­‐ Es semidiscontinua: en una de las cadenas (llamada hebra continua) se sintetizan fragmentos bastantes grandes de forma continua, mientras que en la otra (llamada hebra retardada) la síntesis es discontinua, es decir, se van incorporando nucleótidos que dan lugar a fragmentos pequeños que se disponen de forma separada (fragmentos de Okazaki) -­‐ La iniciación de la síntesis de cada fragmento requiere un extremo hidroxilo libre que es proporcionado por un ARN cebador. 3.3.-DUPLICACIÓN EN PROCARIOTAS: Los primeros estudios se llevaron a cabo en E. Coli observándose que la replicación comienza en un solo punto, el origen de replicación a partir del cual se sintetizan complementariamente a la cadena molde, las cadenas hijas. El proceso tiene lugar en varias etapas: 1.-­‐ Fase de iniciación: Consiste en el desenrollamiento y apertura de la doble hélice. Se inicia en una región del ADN llamada oriC o punto de iniciación. Es una zona donde abundan las secuencias de bases GATC. Se producen varios acontecimientos: Ø Las enzimas helicasas reconocen el punto de iniciación y rompen los enlaces de hidrógeno que hay entre las bases nitrogenadas, como consecuencia de esto la doble hélice se abre como una cremallera ( burbuja de replicación) Ø Se produce el desenrollamiento en esa zona, lo que crea en las zonas próximas unas tensiones que podrían provocar un mayor enrollamiento, sin embargo, otras enzimas como las girasas y las topoisomerasas, evitan estas tensiones. Ø Las proteínas SSB, se unen a las hebras molde e impiden que se vuelvan a enrollar. Dejan libre la parte de la hebra que lleva las bases, de modo que estas sean accesibles para otras moléculas. Como hemos dicho, alrededor de oriC, se forma una burbuja de replicación o replicón , en la que hay dos zonas en forma de Y, denominadas horquillas de replicación, donde se van a sintetizar las nuevas hebras de ADN, en dos sentidos. Por eso la replicación es bidireccional. 5 2.-­‐ Fase de elongación: Es la fase en la que se sintetiza una nueva hebra de ADN sobre cada hebra de la doble hebra original. El proceso se lleva acabo mediante la enzima ADNpolimerasa III, que presenta las siguientes características. § No puede comenzar la síntesis por sí misma, pues solo puede añadir dnucleótidos sobre el extremo 3´libre de una cadena de polinucleótidos previa. Por ello, se sintetiza primero una cadena corta de ARN, denominada ARN cebador. Este fragmento es sintetizado por la enzima primasa (ARN polimerasa ADN dependiente). § Utiliza nucleótidos trifosfato, los cuales proporcionan, al mismo tiempo, la energía necesaria para la unión. § Une nucleótidos en sentido 5´ -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à3´; es decir, la nueva hebra formada crece en este sentido. De esta manera va añadiendo los dnucleótidos complementarios del ADN molde. Como las cadenas son antiparalelas, y la ADN polimerasa III recorre el ADN molde en sentido 3´ -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à 5´; en una cadena (hebra conductora) la síntesis es continua en la dirección 5´ -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à 3´, pero en la otra que es la complementaria (hebra retardada) y va en sentido opuesto no se pueden colocar los nucleótidos, el problema se soluciona formando hebras retardadas, en las que se sintetizan pequeños segmentos en la dirección 5’-­‐-­‐-­‐-­‐à3’ , son los fragmentos de Okazaki (en honor a su descubridor) y constan de 1000 a 2000 nucleótidos. Es decir la replicación de esta hebra es discontinua ( a trozos). Cada fragmento requiere por supuesto su ARN cebador. Como en una hebra la replicación es continua y en la otra discontinua se dice que en conjunto la replicación o es semidiscontinua. Posteriormente la enzima ADN polimerasa I elimina los ARN cebadores, gracias a su acción exonucleasa(rompe enlaces fosfodiester). La misma enzima posee actividad polimerasa, por lo que puede rellenar el hueco dejado por el ARN cebador eliminado. 3.-­‐ Fase de terminación Una ADN ligasa une todos los fragmentos, este proceso requiere energía (ATP). Posteriormente las hebras se vuelven a enrollar. 6 El proceso de replicación es muy rápido. En E.coli, se unen 45000nucleótidos /minuto 4.-­‐ Corrección de errores: Durante la replicación se pueden producir errores e incorporarse nucleótidos que no tengan correctamente apareadas sus bases. La ADN polimerasa actúa entonces como exonucleasa y elimina los nucleótidos mal apareados. Aunque el mecanismo de corrección es muy eficiente, se producen errores que son heredables (mutación puntual o génica) y que generan variabilidad en la descendencia tan importante en el proceso evolutivo de las especies. 2.4.-DIFERENCIAS EN LA REPLICACIÓN DE EUCARIOTAS Las diferencias respecto a la replicación en procariotas, son las siguientes: -­‐ El ADN en eucariotas es lineal, de mayor tamaño, tiene varios cromosomas y se empaqueta con histonas, mientras en procariotas es un único cromosoma, circular, de menor tamaño y carece de histonas. -­‐ En procariotas, generalmente hay un solo origen de replicación, mientras que en eucariotas muchos (unos 30.000 orígenes de replicación) para compensar que la replicación en eucariotas es mucho más lenta (10 veces más lenta) posiblemente debido al empaquetamiento con histonas y no solamente a su mayor tamaño. -­‐ Los procariotas tienen 3 tipos de ADN polimerasas, mientras que los eucariotas 5. -­‐ Al ser lineales los cromosomas de eucariotas, se pierden en cada duplicación fragmentos de ADN de los extremos (telómeros), ya que al eliminar el cebador de cada extremo, la ADN polimerasa no tiene extremo 3´ para que se puedan añadir nucleótidos. Por eso los telómeros llevan secuencias repetidas de nucleótidos (muchas repeticiones de la secuencia TTAGGG) que no codifican (no llevan información 7 genética). El acortamiento de los telómeros tras cada replicación hace que una célula eucariota solo pueda dividirse un número limitado de veces; cuando los telómeros se acortan más allá de un punto crítico, los cromosomas se vuelven inestables, sufren fusiones y se produce la muerte celular. Por eso, el acortamiento de los telómeros se ha relacionado con el envejecimiento celular. En ciertos tipos celulares que deben dividirse muchas veces, como las células hematopoyéticas (las que fabrican células de la sangre) o las células cancerígenas, presentan la enzima telomerasa que evita el acortamiento de los telómeros (añade a los telómeros más copias de la secuencia que se repite). Cuando las células del cuerpo se diferencian, la telomerasa se inactiva. -­‐ El tamaño de los fragmentos de Okazaki es menor en eucariotas. -­‐ Los nucleosomas suponen un obstáculo al avance de las horquillas de replicación, esto hace que las ADN pol. actúen más lentamente. 4.- TRANSCRIPCIÓN 4.1.- CARACTERÍSTICAS DE LA TRANSCRPCIÓN Es el proceso mediante el cual el ARNm copia la información del ADN. Posee una serie de características: - Es selectivo: Sólo se transcriben algunas regiones del ADN - Sólo se copia una de las cadenas del ADN, las enzimas que intervienen son ARN polimerasas , que unen entre sí ribonucleótidos. - Es reiterativo: Un gen puede transcribirse muchas veces. Sucede en 3 fases la iniciación, la elongación y la terminación, en eucariotas sucede una cuarta fase llamada maduración del ARN: 8 4.2.-­‐ LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS Las etapas podemos resumirlas de la siguiente manera: Iniciación: comienza cuando la ARN polimerasa reconoce un centro promotor que es una secuencia de bases que señala el lugar donde tiene que empezar y coloca el primer nucleótido, este es un nucleótido trifosfato que utiliza la energía de uno de sus enlaces fosfato para dirigir la reacción hacia la síntesis. La ARN pol. presenta una estructura compleja y está formada por varias subunidades, la subunidad σ, es la que reconoce el promotor. Elongación: la subunidad σ de la ARN pol se libera y el resto de las subunidades, van recorriendo la hebra molde del gen que se está transcribiendo en el sentido (3´ -­‐-­‐-­‐à 5´) y va añadiendo nucleótidos de ARN (recuerda que la pentosa es ribosa en vez de desoxirribosa y en lugar de timina tiene uracilo) en los extremos 3´ formándose, por lo tanto, en el sentido (5´-­‐ -­‐-­‐à3´) igual que sucedía con la replicación del ADN. Los nucleótidos los añade de manera que sean complementarias sus bases con las bases de la cadena de ADN usada como molde (G con C, C con G , A con T y U con A), los nucleótidos deben tener 3 grupos fosfato para poder añadirse (ATP, CTP, GTP y UTP) y pierden 2 fosfatos al ser añadidos (al perderse los fosfatos se aporta la energía necesaria para la reacción). En eucariotas después de 30 nucleótidos se le añade al ARNm una “cabeza” (caperuza) de metil-­‐GTP en el extremo 5’ con función protectora. Terminación: para terminar la ARN polimerasa reconoce secuencias de terminación en la cadena molde de ADN, se detiene, se suelta del ADN y libera el ARN transcrito. N procariotas la secuencia que indica el fin de la transcripción es una secuencia palindrómica ( se lee igual de derecha a izquierda y viceversa). En eucariotas una poliA-­‐polimerasa añade en el extremo 3’ unos 200 nucleótidos de adenina “cola poli-­‐A”. Esta interviene en la maduración y trasnsporte del ARNm fuera del núcleo. Maduración: en eucariotas, el ARN debe madurar para poder usarse, para ello se eliminan unos trozos que no se van a traducir (intrones) para que se unan los fragmentos que se van a traducir (exones) mediante un proceso llamado splicing (empalme en inglés). La velocidad de transcripción es alta, 30 a 40 ribonucleótidos/segundo. La transcripción es necesaria para obtener los tres tipos de ARN. En el caso del ARNm , la cadena sintetizada se utiliza para la síntesis de proteínas. Sin embargo, los ARN transcritos que originará los ARNt y ARNr requieren un proceso de maduración para ser funcionales, donde se producen recortes y uniones de fragmentos que permiten obtener los ARN definitivos. 9 Fíjate en el dibujo de la izquierda como la ARN polimerasa se mueve a lo largo del ADN en el sentido (3´ -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à5´) y va añadiendo nucleótidos de ARN en los extremos 3´ formándose, por lo tanto, en el sentido (5´ -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à3´). De esto se deduce que la cadena molde de ADN es la que va de (3´-­‐-­‐-­‐-­‐à5´) tenlo en cuenta cuando se hagan ejercicios de escribir el ARN y te dan el ADN sin indicar cuál es la cadena molde. 4.3.-­‐DIFERENCIAS EN LA TRANSCRIPCIÓN DE EUCARIOTAS a) La transcripción en eucariotas tiene lugar en el interior del núcleo, por lo que el ARNm debe atravesar la envoltura nuclear para llegar a los ribosomas del citoplasma donde tiene lugar la traducción. Es decir, transcripción y traducción van separadas en el tiempo y en el espacio. En las células procariotas tiene lugar en la región nucleoide (citoplasma) y antes de terminar ya se está produciendo la traducción . b) En eucariotas hay tres tipos de ARN polimerasas (en procariotas un tipo) -­‐ ARN pol I se encarga de transcribir la mayoría de los ARNr -­‐ ARN pol II “ “ “ los genes estructurales -­‐ ARN pol. III “ “ “ “ “ del ARNt y un ARNr c) En procariotas es muy frecuente que una sola molécula de ARNm lleve información para la síntesis de varias proteínas (ARNm policistrónico), en eucariotas cada ARNm lleva información para una sola proteína (ARNm monocistrónico). d) En eucariotas, las secuencias de terminación son diferentes a procariotas (la señal de corte en eucariotas es la secuencia de bases AAUAA que aparece en el ARN y en procariotas es una secuencia rica en C y G). Al terminar se añade en el final muchos nucleótidos de adenina (cola poli-­‐A) que interviene en procesos de maduración y 10 transporte del ARN. Los procariotas carecen de caperuza y cola poli-­‐A. d) En procariotas los genes son continuos, es decir, la secuencia de ADN que codifica una proteína es un fragmento continuo y el ARNm transcrito se utiliza directamente para la traducción, mientras que en eucariotas los genes estructurales son discontinuos, es decir, están constituidos por intrones (secuencias que no contienen información) y exones ( secuencias que contienen información), y antes de la traducción, los intrones deben ser eliminados hasta formar el ARNm maduro. Este proceso se llama Procesado o Maduración del ARNm. Para ello, este ARN se combina con unas proteínas que hacen que los intrones adopten forma de bucle, posteriormente unas enzimas rompen los bucles y los exones se sueldan. La maduración final implica la adicción de una caperuza en el extremo 5` que lo protege de la degradación prematura. e) Parece ser que los nucleosomas juegan un papel regulador en la transcripción en eucariotas. Eucariotas Procariotas Existen 3 ARN polimerasas Sólo tiene una ARN polimerasa La señal de terminación son las bases AAUAA Señal de terminación rica en C y G Presenta caperuza Sin caperuza con cola poli-­‐A Sin cola poli-­‐A Con maduración (eliminación de los intrones) Se usa directamente el ARNm formado ARNm monocistrónico ARNm policistrónico Transcripción y traducción separados Transcripción y traducción acoplados 5.- EL CÓDIGO GENÉTICO. CLAVE GENÉTICA DESCIFRADO DE LA ¿Cómo el ARNm traduce la secuencia de aminoácidos que se tiene que formar? Mediante el código genético. Si consideramos que el lenguaje que usa el ADN está representado por el 11 diferente orden y proporción de las bases nitrogenadas. El ADN da las órdenes utilizando un “alfabeto” de 4 “letras”, las bases nitrogenadas: A,T,C y G. que pueden formar “palabras”, las cuales a su vez pueden construir “frases” que encierran un mensaje. Se debe poder construir 20 “palabras” ( aminoácidos ), ¿de cuantas letras debe constar cada palabra del lenguaje genético?. -­‐ Si cada palabra consta de 1 letra se podrían formar 4 palabras -­‐ Si cada palabra consta de 2 letras se podrían formar 16 palabras -­‐ Si “ “ “ de 3 “ “ “ “ 64 “ Así que podemos deducir que cada “palabra” debe estar constituida por 3 letras, formando un triplete. Por lo tanto, cada triplete de bases del ADN codifica la información correspondiente a un aminoácido. El conjunto de 64 tripletes con sus correspondientes aminoácidos constituye el Código o Clave Genética. . Características del código genético: v Es un código de tripletes v No es ambiguo, es decir es específico: no hay ningún triplete que codifique a 2 o más aminoácidos diferentes. v No tiene superposiciones: Una mutación única en un nucleótido afecta tan sólo a un aminoácido de la cadena proteica. v Es “degenerado” , pues existen 64 tripletes para 20 aminoácidos, es decir, todos los aminoácidos , excepto metionina y triptófano están codificados por más de un codón (codones sinónimos), podemos decir que hay una pérdida de información,. v Es universal, Todos los organismos incluidos los virus tienen el mismo código genético, es decir los tripletes codifican los mismos aminoácidos. v Existen tres tripletes “sin sentido “, no se leen e indican que la síntesis ha terminado. Son UAA, UAG y UGA. v La secuencia de bases es leída secuencialmente, es decir entre los grupos de tres bases no hay ninguna base que actúe a modo de “coma “. Los codones se hallan dispuestos de manera lineal y continua. Una base o puede pertenecer a la vez a dos tripletes consecutivos. CÓDIGO GENÉTICO 12 6.- TRADUCCIÓN 6.1.-­‐ INTRODUCCIÓN Proceso mediante el cual se sintetizan proteínas a partir del ARNm. En eucariotas tiene lugar en los ribosomas (formados por ARNr y proteínas ). Para ello se une el ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y los ARNt llevan al ribosoma los aminoácidos que se van a unir en la subunidad grande del ribosoma para formar la cadena polipeptídica. El ARNt tiene forma de trébol, disponiéndose en cuatro brazos formados por dobles cadenas de ARN enfrentadas y unidas a nivel de sus bases por puentes de hidrógeno, y tres asas o bucles en los extremos de los brazos que no aparean sus bases. El brazo que no tiene asa presenta en el extremo 3` el triplete CCA, al cual se va a unir el aminoácido; El asa del brazo opuesto posee un “triplete de anclaje” que es complementario de alguno de los codones del ARNm, es el denominado anticodón. Como hemos visto cada codón del aDNm codifica para un aminoácido. Ej: codón AGC y anticodón UCG, así no puede colocarse más que el aminoácido que diga el ARNm (no puede unirse otro ARNt con un anticodón distinto). El ARNt es el responsable de trasladar los aminoácidos sobre el ARNm, colocándolos según el orden que este último lleva en su mensaje. Cada molécula de ARNt es específica para cada aminoácido, de tal manera que según el anticodón que tenga, lleva en el extremo 3` ( triplete CCA) a uno u otro aminoácido. Los ribosomas contienen un sitio de unión para el ARNm y 3 sitios de unión para los ARNt: el sitio P (peptidil) que une el ARNt que lleva la cadena polipeptídica en formación, el sitio A (aminoacil) que une el ARNt que lleva el aminoácido que va a unirse y el sitio E de salida de los ARNt vacios. La subunidad pequeña del ribosoma es responsable del apareamiento de los ARNt con los codones del ARNm y la subunidad grande cataliza la formación de los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos entre sí. Además de estos 3 tipos de ARN (ARNt, ARNr y ARNm), la traducción requiere enzimas, proteínas (factores de iniciación, elongación y terminación) y nucleótidos trifosfato (ATP y GTP) como fuente de energía. 6.2.-­‐ LA TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS 1º Activación del aminoácido mediante una enzima, Aminoacil-­‐ARNt-­‐Sintetasa, con gasto de energía, ATP-­‐-­‐-­‐-­‐AMP + PP . Posteriormente el aminoácido se une al ARNt liberándose la enzima y el AMP. A. sintetasa aa` + ATP -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à aa`-­‐AMP + PPi ARNt -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐à aa´-­‐ARNt + AMP A.sintetasa 13 2º Fase de iniciación: comienza con la formación del complejo de iniciación formado por: -­‐ La subunidad 30s del ribosoma, al cual se le une el ARNm, en un lugar cerca del codón iniciador (AUG) que marca el comienzo (por eso siempre el primer aminoácido es metionina y el primer ARNt que se une al ribosoma es el que lleva el anticodón UAC), -­‐ Se une el aminoácido-­‐ARNt . -­‐ Luego se une la subunidad 50s, que presenta dos centros: Centro P (peptidil) y centro A (aminoacil). -­‐ Para la iniciación se necesitan tres factores de iniciación (proteínas): FI-­‐1, FI-­‐2 y FI-­‐3. El aminoácido inicial en las células procariotas es la N-­‐formil metionina (en eucariotas es la metionina), que se une con su ARNt al Centro P, anclando su anticodón con el codón de iniciación AUG. 3º Fase de elongación de la cadena: La segunda molécula de ARNt, cargada con su respectivo aminoácido (aminoacil-­‐ARNt) entra en el Centro A del ribosoma y ancla su anticodón con el correspondiente codón, posteriormente se establece un enlace peptídico entre el aminoácido que acaba de entrar y el primero que entró, catalizado por la enzima peptidil-­‐ transferasa. El primer ARNt se separa del aminoácido y se desprende del ARNm para ir a buscar otro aminoácido. Entonces el ARNm junto con las dos subunidades del ribosoma se desplaza un triplete ( siempre en la dirección 5’-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐ à3’ ), proceso llamado translocación del ribosoma, el ARNt con los dos aminoácidos pasa a ocupar el Centro P, entonces el Centro A queda libre para que se una el siguiente amioacil-­‐ARNt ( que será el que lleve el anticodón 14 complementario del siguiente codón del ARNm). En este proceso de alargamiento intervienen factores de elongación (FE) y energía que aporta el GTP. 4º Fase de terminación de la síntesis: Para que la cadena polipeptídica alcance su longitud definitiva se necesita, la presencia de un “codón sin sentido” (UAA, UAG, UGA) se une a él un factor de liberación que provoca la liberación de la cadena polipeptídica unida al último ARNt y la disociación del ARNt, de los factores de liberación y de las subunidades del ribosoma . La velocidad de síntesis proteica es alta (se pueden unir 1400 aminoácidos/minuto) lo que da idea de la eficacia del sistema. Además las cadenas de ARNm, suelen ser leídas por más de un ribosoma simultáneamente (polisomas), lo cual aumenta la efectividad y un ahorro de tiempo considerable en la síntesis de muchas copias de la misma proteína 6.3.-­‐ DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS EN LA TRADUCCIÓN. En eucariotas la transcripción (en el núcleo) y la traducción (en el citoplasma) van separadas en el tiempo y en el espacio, mientras que en procariotas, al carecer de membrana nuclear, antes de terminar la transcripción en el citoplasma, ya se está produciendo la traducción (el ribosoma se une al ARNm y comienza a formar proteínas antes de acabar la síntesis del ARNm). Los ribosomas de eucariotas son de mayor tamaño (80S) que los de las células procariotas (70S) y tienen ARNr diferentes (en eucariotas la subunidad grande contiene 3 tipos de ARNr: 28S, 5,8S y 5S y la subunidad pequeña solo ARNr 18S, mientras en procariotas la subunidad grande contiene 2 tipos de ARNr: 23S y 5S y la subunidad pequeña solo ARNr 16S). Además la subunidad mayor de eucariotas posee una molécula más de ARNr. Las moléculas de ARNm de eucariotas solo poseen un punto de iniciación (porque son monocistrónicos ,es decir, llevan información para una sola proteína), mientras que los ARNm de procariotas poseen varios, ya que portan información para varias proteínas (los ARNm de procariotas son policistrónicos). En eucariotas, la “caperuza” (formada por un nucleótido de guanina metilado) del extremo 5´ del ARNm es la señal reconocida por la subunidad pequeña del ribosoma para asociarse al ARNm e iniciar la traducción (recuerda que en procariotas no existe la caperuza). En eucariotas el primer aminoácido que se incorpora a la proteína es metionina sin ninguna modificación (procariotas llevan formil metionina en su primer ARNt). Hay factores de iniciación y elongación diferentes en procariotas y eucariotas 15 7.- ALTERACIONES DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA (MUTACIONES) 7.1.- INTRODUCCIÓN Las mutaciones son cambios o variaciones del material genético de una célula que aparecen espontáneamente o bien son inducidas por agentes mutagénicos (pueden se químicos, como el gas mostaza, pesticidas,... o físicos, como las radiaciones de onda corta). Las mutaciones sólo son heredables cuando afectan a las células germinales ( gónadas) o a los gametos. Si atañen a las células somáticas, no se heredan pero pueden afectar al individuo ( cáncer). Según el efecto que tengan en el individuo, pueden ser beneficiosas, perjudiciales o neutras. 7.2.-LAS MUTACIONES COMO FUENTE PRIMARIA DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA: ALELOS. IMPLICACIONES DE LAS MUTACIONES EN LA EVOLUCIÓN Y APARICIÓN DE NUEVAS ESPECIES. Las mutaciones provocan cambios (aumentan la variabilidad genética), que si son beneficiosas en un determinado medio ambiente, jugarán un papel importante en la evolución de las especies al aumentar estas variaciones beneficiosas en la población generación tras generación, produciendo la adaptación de la especie a dicho medio. Si una población de una zona determinada acumula un número importante de estas variaciones beneficiosas nuevas (obtenidas por mutación) y no se reproducen con otras poblaciones de la misma especie de otras zonas (no pasan estas mutaciones a otras poblaciones de su especie), pueden acabar originando una nueva especie, al acumular tantos cambios que no comparte con otras poblaciones. La evolución biológica es el proceso de transformación de unas especies en otras mediante una serie de variaciones que se han ido sucediendo, generación tras generación, a lo largo del tiempo. Recordemos que la Teoría de la Evolución de Darwin se basa en tres premisas: el excesivo número de descendientes que hay en las poblaciones, la variabilidad fenotípica de la descendencia y la selección natural. El excesivo número de descendientes. Darwin observó que las especies tienen un potencial reproductivo muy alto, y que si su número no crece indefinidamente es porque los recursos alimenticios son limitados. La variabilidad de la descendencia. En los organismos que se reproducen sexualmente se observa que, pese a tener los mismos padres , todos los hermanos son diferentes entre sí (excepto los gemelos homocigotos). Darwin (1809-­‐1882) murió sin saber cuál era el origen de esta variabilidad. Los trabajos de Mendel, en los que se inicia el camino hacia su explicación, pese a estar publicados en 1866, tuvieron muy poca difusión y no fueron conocidos por Darwin. La selección natural. Darwin la explica diciendo que como nacen más individuos que los que pueden sobrevivir, se establece una lucha por la existencia, de un individuo con otros de su misma especie, con individuos de otras especies y con las condiciones físico químicas del 16 entorno. Si el ambiente es muy hostil, los individuos menos aptos mueren y solo los más aptos llegan a reproducirse, y por ello sólo éstos transmiten sus características a la generación siguiente. La selección natural se puede definir, pues, como la supervivencia del más apto. Tras el descubrimiento de las leyes de Mendel en 1900 y los grandes avances posteriores, a partir del genetista Dobzhansky, el zoólogo Mary, el paleontólogo Simpson y el biólogo Huxley, surgió entre 1938 y 1940 la Teoría Sintética o Neodarwinismo. En esta teoría se aceptan los principios Darwinistas de la variabilidad de la descendencia y de la selección natural, y se aporta la explicación de dicha variabilidad, el concepto de población genética como unidad de evolución y el concepto genético de especie, que sustituyó al basado simplemente en las simples diferencias morfológicas. La variabilidad de la descendencia en los organismos con reproducción asexual se debe exclusivamente a las mutaciones, y en los organismos con reproducción sexual a las mutaciones y, a la recombinación genética que se produce en la meiosis. La mutación es, sin embargo, desde el punto de vista cualitativo, mucho más importante que la recombinación, ya que puede dar lugar a nuevos genes, mientras que la recombinación origina agrupaciones diferentes de genes. La mutación, es pues la base de la variabilidad y la aparición de nuevas especies. Sin mutaciones las poblaciones no evolucionarían y serían iguales. Las mutaciones permiten que a partir de un gen original responsable de un carácter surjan alelos distintos. Al haber varios alelos para cada carácter y debido a los numerosos caracteres que tienen los individuos, es prácticamente imposible que dos individuos tengan exactamente la misma constitución genética, habiendo una gran variabilidad genética en las poblaciones, lo que permite que unos individuos presenten genotipos y por lo tanto fenotipos más favorables que otros frente a unas determinadas condiciones ambientales. Es decir si un alelo que surge por mutación confiere a los individuos que lo portan una ventaja adaptativa, la selección natural actuará aumentando su frecuencia en la población, ya que los individuos que presenten este alelo tendrán más probabilidad de sobrevivir y por lo tanto de reproducirse y dejar descendientes. Sin embargo, los individuos que porten alelos no ventajosos, tienen menos probabilidades de sobrevivir y como consecuencia de reproducirse; su frecuencia en la población entonces disminuirá De esta manera sólo los alelos ventajosos persisten en las poblaciones. (repasar ejemplo de la mariposas del abedul) 7.3.- TIPOS DE MUTACIONES Existen 3 tipos según la extensión del ADN afectado: -­‐ Las mutaciones génicas -­‐ Las mutaciones cromosómicas estructurales -­‐ Las mutaciones que afectan al número de cromosomas (o mutaciones genómicas) a) Mutaciones puntuales o génicas: Son mutaciones que afectan a la composición de uno o varios de los nucleótidos que componen un gen. La mayoría de estas mutaciones son perjudiciales para el organismo, y debido a la selección natural se mantienen en frecuencia baja dentro de la población. Causa: fallos en el proceso de autoduplicación del ADN. La unidad mínima de mutación es el “mutón” ( un par de nucleótidos complementarios de la molécula de ADN). 17 Dentro de este tipo puede ocurrir que se sustituya alguna base del ADN por otra. La sustitución de bases se llama transición si se sustituye por una base del mismo tipo (púrica por otra púrica, es decir, A↔G o bien pirimidínica por pirimidínica, es decir, C↔T) o se llama transversión si se sustituye por una base de distinto tipo ejemplo A↔C. O bien puede haber un corrimiento de la pauta de lectura al añadirse (inserción o adición) o perderse (deleción) algún nucleótido en el gen. CONSECUENCIAS: las inserciones y delecciones al producir corrimiento de la pauta de lectura producen proteínas totalmente distintas, es decir, inservibles. En las sustituciones de bases puede tener consecuencias muy distintas, si con la sustitución el nuevo triplete del ARNm (codón) que origine este ADN mutado, sigue dando el mismo aminoácido, no sucede nada (mutación silenciosa), si cambia el aminoácido puede que no sea importante si dicho aminoácido no se encuentra en el sitio activo de la proteína codificada, o puede hacer una proteína inservible si afecta al sitio activo. También puede codificar una proteína más larga o corta de lo normal (si afecta a un codón de terminación o si origina un codón de terminación respectivamente). Ejemplos de enfermedades importantes sería la anemia falciforme que se debe al cambio de un aminoácido por otro (ac. glutámico por valina) en una de las cadenas beta. Esto hace que los glóbulos rojos adopten una forma de hoz, obstruyendo los capilares sanguíneos. Otra enfermedad es el albinismo , que se caracteriza por falta de pigmentación, en este caso no se forma melanina, ya que la enzima tirosinasa está inactiva. Algunos tipos de cánceres también están relacionados con mutaciones génicas. b) Mutaciones cromosómicas (estructurales) Son mutaciones que provocan cambios en la estructura interna de los cromosomas. Es decir, afectan a la secuencia de los genes dentro de los cromosomas. Hay varios tipos: delección, se produce la pérdida de un fragmento del cromosoma A( la cantidad de material genético disminuye), duplicación, se forma por la repetición de un fragmento del cromosoma ( la cantidad de material genético aumenta), inversión, un fragmento cambia de sentido en el cromosoma, si se produce en el mismo cromosoma el segmento se separa, gira 180º y se ensambla de nuevo (se invierte la posición pero no se desplaza a otro lugar del cromosoma), las inversiones que incluyen el centrómero se llaman pericéntricas; y las que no lo incluyen 18 se llaman paracéntricas. Si el intercambio de segmentos tiene lugar entre dos cromosomas no homólogos, se denomina translocación recíproca. Cuando sólo hay traslación de un segmento a otro lugar del mismo cromosoma o de otro cromosomas, sin reciprocidad se denomina transposición. CONSECUENCIAS: pueden afectar a la meiosis ya que al cambiar la estructura del cromosoma entorpece el emparejamiento de los cromosomas homólogos (recombinación de la profase I). Si ocurre en la meiosis, los gametos pueden transmitir cromosomas defectuosos a los descendientes, como sucede con el síndrome de Down familiar ya que por una translocación de un fragmento del cromosoma 21 los descendientes pueden tener un fragmento más del cromosoma 21 (Recuerda que el síndrome de Down normal es por tener un cromosoma 21 de más). Las delecciones y duplicaciones pueden tener consecuencias graves, ya que no basta con tener todos los genes de la especie, sino que han de estar en el número adecuado para que no se produzcan desequilibrios en su expresión. Así por ejemplo el síndrome “cri du chaat” que se caracteriza por microcefalia, retraso mental profundo y detención del crecimiento, es un ejemplo de delección en el cromosoma 5. Las translocaciones e inversiones no suelen tener efecto fenotípico marcado , ya que tienen el número adecuado de genes. Sin embargo, son importantes también desde el punto de vista evolutivo. La duplicación posee una importancia evolutiva grande, por ejemplo, distintos genes de la hemofilia se han adquirido por duplicaciones en el transcurso de la evolución. 19 c) Mutaciones cromosómicas ( numéricas) o genómicas: Son variaciones en el número normal de cromosomas de una especie. Las causas parecen estar relacionadas con una segregación anormal de los cromosomas o de las cromátidas durante la división meiótica, o bien por fusión o fisión de cromosomas. Si afectan al número normal de la dotación cromosómica completa se llaman euploidías como por ejemplo la monoploidía (n) que es condición habitual en algunas fases de los ciclos vitales de los seres vivos , por ejemplo los gametos en la especie humana, en estos casos no se considera mutación , y las poliploidías como la triploidía (3n), tetrapolidía (4n),... pero si afectan solo a algún cromosoma se llaman aneuploidías como por ejemplo las monosomías (2n-­‐1) , las trisomias (2n+1) o las tetrasomías ( 2n+2) o doble trisomías ( 2n+1+1) . CONSECUENCIAS: la mayoría de estas mutaciones ocasionan individuos no viables (no llegan a nacer) o enfermedades importantes, En la especie humana aparecen espontáneamente alteraciones de tipo aneuploide que pueden afectar: - a los autosomas, como el síndrome de Down (trisomía par 21) , en este caso el individuo presenta un grado variable de retraso mental y un rostro con cierto aspecto oriental. Otro ejemplo es el síndrome de Edwards (trisomía par 18). En este caso los afectados muestran retraso mental y de desarrollo, hipertensión. - a los cromosomas sexuales o heterocromosomas, como el síndrome de Klinefelter (44+XXY), en este caso son hombres con retraso mental, estériles, con genitales poco desarrollados, se asocia con ser más alto de lo normal, no suelen tener complicaciones, aunque podrían presentar posibles problemas de comportamiento (se ha visto que una alta proporción de criminales encarcelados presentan esta mutación) . Aparece en uno de cada 2000 niños. El síndrome de Turner, es una monosomía del cromosoma X (44+X), las mujeres tienen retraso en el crecimiento (aspecto infantil) falta de desarrollo de los órganos sexuales y esterilidad. Aparece en una de cada 2500 niñas. El síndrome triple X (XXX) o superhembra por lo general no suelen presentar complicaciones, pueden ser más altas pero en algunos casos presentan problemas de aprendizaje (ligero retraso mental). Aparece en una de cada 1500 niñas. Las aneuploidías se pueden producir por varios mecanismos , uno es la fusión céntrica, que es la unión de dos cromosomas no homólogos, con pérdida del centrómero de uno de ellos. Un ejemplo es el origen del cromosoma 2 humano ( originado por la fusión de dos cromosomas acrocéntricos , dando uno metacéntrico). Por eso en la especie humana hay 23 parejas y en orangutanes y chimpancés hay 24 parejas de cromosomas. El otro mecanismo es la segregación errónea durante la meiosis. 7.4.-AGENTES MUTAGÉNICOS Las mutaciones pueden ser debidas a causas naturales o no (mutaciones inducidas), las inducidas son mutaciones provocadas por agentes externos llamados agentes mutágenos o mutagénicos, como pueden ser los rayos X, ultravioleta, gamma y sustancias químicas (benzopireno, gas mostaza, ácido nitroso,…). Las naturales pueden ser debidas a errores en la replicación del ADN o en la meiosis o por cambios químicos espontáneos en el ADN. Los agentes mutagénicos se pueden clasificar de la siguiente manera: 20 a) MUTÁGENOS ENDÓGENOS: producen mutaciones espontáneas Metabolitos reactivos: radicales libres, productos finales de la glucosilación avanzada (AGE) Fluctuaciones térmicas: despurinación (pérdida de bases púricas) y desaminación (transformación del grupo amino de una base, en grupo ceto) Transposiciones: “genes saltarines” los transposones que son segmentos móviles de ADN que pueden cambiar de lugar, variando su posición dentro del cromosoma e incluso pueden trasladarse a otro cromosoma. Los transposones se han encontrado en todo tipo de organismos (virus, maíz, insectos…) se piensa incluso que los virus mutagénicos (oncovirus) podrían realizar esta acción al llevar en su genoma transposones tomados previamente de una célula infectada que incorporarían a la nueva célula infectada. Errores de apareamiento: frecuencia baja, un error por cada 1010 pares de bases b) MUTÁGENOS EXÓGENOS: producen mutaciones inducidas BIOLÓGICOS: Algunos agentes biológicos aumentan la frecuencia de mutaciones, como algunos tipos de virus animales, denominados oncovirus, que son capaces de desarrollar cáncer, por ejemplo el virus del herpes genital está implicado en la aparición del cáncer de cuello de útero. También se ha visto que la bacteria Helicobacter pilori causante de úlceras gástricas, puede estar implicada en la aparición de cáncer de estómago. El virus de Epstein-­‐Barr (causante de la mononucleosis infecciosa) predispone al linfoma de Burkitt y carcinomas nasofaríngeos. FÍSICOS: Son principalmente las radiaciones, que se dividen en radiaciones ionizantes y no ionizantes: – Las radiaciones ionizantes son de longitud de onda muy corta y, por tanto, muy energéticas, que provocan la ionización de los átomos de las sustancias que atraviesan. Entre estas radiaciones se encuentran los rayos X y γ (gamma), así como las partículas α y β y los neutrones emitidos en procesos radiactivos. Pueden romper los anillos de las bases nitrogenadas, e incluso los enlaces fosfodiéster, con la ruptura del ADN, y por lo tanto de los cromosomas. – Las radiaciones no ionizantes se trata, fundamentalmente de las radiaciones ultravioleta (UV). Son radiaciones más energéticas que la luz. No producen ionizaciones, sino que su acción consiste en provocar el paso de electrones a niveles energéticos más altos , esto induce el establecimiento de enlaces covalentes entre dos pirimidinas, formándose dímeros de timina. También promueve la aparición de formas tautoméricas ( son formas de las bases nitrogenadas que no poseen los grupos funcionales correspondientes a las bases) que dan lugar a mutaciones génicas del tipo de las transiciones. QUÍMICOS: 21 Son sustancias químicas muy variadas como el ácido nitroso, gas mostaza, drogas, pesticidas, benzopireno, cromo, cadmio, arsénico, dioxinas, alcaloides como la nicotina …que reaccionan con el ADN. Provocan básicamente, tres tipos de alteraciones: –Modificaciones de las bases nitrogenadas: como el ácido nitroso (HNO2) que produce la desaminación ( pérdida del grupo amino), el gas mostaza que añade grupos alquilo (metilo, etilo…) o la hidroxilamina, que añade grupos hidroxilo. –Sustitución de una base por otra ( análogos): son sustancias similares a las bases nitrogenadas como el 5–bromouracilo que sustituye a una timina o la 2–amino purina que se coloca en lugar de adenina. –Intercalación de moléculas, sustancias que se pueden intercalar entre 2 bases nitrogenadas o entre las 2 cadenas de ADN. Los colorantes proflavina y el naranja de acridina se pueden intercalar entre 2 bases nitrogenadas y el benzopireno que se encuentra el humo del tabaco es un potente cancerígeno que provoca mutaciones al intercalarse entre las dos cadenas de ADN y unirlas covalentemente. – Otros mutágenos conocidos son el dietilestilbestrol y otras sustancias usadas para el engorde fraudulento del ganado, el asbesto utilizado como aislante en algunas edificaciones, el cromo y el cadmio de pinturas y colorantes, las dioxinas generadas por la combustión de plasticos de PVC… 8.- ¿QUÉ ES LA BIOTECNOLOGÍA? Es un conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (por ejemplo, enzimas), para la obtención de productos, bienes y servicios. Esta definición abarca desde la biotecnología tradicional, utilizada desde hace cientos de años, por ejemplo el empleo de procesos de fermentación microbiana para producir bebidas alcohólicas, yogurt, pan, queso,… hasta la biotecnología contemporánea como la reprogramación nuclear, , la clonación celular, la nanotecnología,… Los colores de la biotecnología : 22 9.- EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA 9.1.-INTRODUCCIÓN ¿Qué relación hay entre los conceptos: organismo transgénico, transgén y ADN recombinante? La ingeniería genética, es un conjunto de técnicas que permiten la manipulación y la transferencia de genes de un organismo a otro. De este modo obtenemos organismo genéticamente modificados. Los organismos transgénicos son aquellos a los que se ha insertado algún gen, conocido como transgén, procedente de otro organismo. El ADN formado por la unión de fragmentos de ADN procedentes de organismos diferentes se denomina ADN recombinante. Por eso, el conjunto de técnicas que utiliza la ingeniería genética se denomina tecnología de ADN recombinante. En 1973 los investigadores Stanley Cohen y Herbert Boyer presentaron una bacteria Escherichia coli que llevaba genes de la rana africana Xenoporus laevis. La llamaron Quimera, como el ser mitológico combinación de león, cabra y serpiente. 9.2.-CONSTRUCCIÓN DE UN ADN RECOMBINANTE Las herramientas básicas para la construcción de moléculas de ADN recombinante son las endonucleasas de restricción y las ADN ligasas. Podemos decir que son las tijeras y el pegamento moleculares. Las endonucleasas de restricción son, enzimas sintetizadas por bacterias, capaces de cortar en fragmentos el ADN de cualquier organismo. Estas enzimas-­‐tijera reconocen secuencias específicas y cortan entre determinados pares de bases, dando lugar a fragmentos con extremos de una sola cadena, llamados extremos cohesivos, porque pueden asociarse con otros fragmentos de extremos complementarios de una sola cadena. La mayoría de los sitios de restricción son simétricos, lo que significa que la secuencia de nucleótidos es la misma en ambas cadenas cuando se leen en dirección 5´ 3´. Este tipo de secuencias de nucleótidos, que se leen de la misma manera en las dos hebras se denominan palindrómicas. Actualmente se conocen más de 1200 endonucleasas de restricción que reconocen y cortan distintas secuencias de nucleótidos de ADN. Las ADN ligasas son enzimas-­‐ pegamento que unen los extremos cohesivos de fragmentos de ADN generados por las endonucleasas de restricción mediante la formación de enlaces covalentes . Observa en el dibujo como se obtiene un ADN recombinante: 23 -­‐ Primero, las moléculas de ADN de dos organismos diferentes se cortan con la mism enzima de restricción ( en este caso EcoRI). Esta enzima reconoce la secuencia GAATTC y corta entre los nucleótidos G y A de cada una de las cadenas de las moléculas de ADN. -­‐ Segundo, se generan fragmentos de ADN con extremos cohesivos complementarios en cada una de las moléculas. -­‐ Tercero, se ponen en contacto los fragmentos de ADN obtenidos y se someten a la acción de la enzima ADN ligasa, formándose una moléculas de ADN recombinante, que contiene ADN de los dos organismos. 9.3.- TÉCNICA DE LA HIBRIDADCIÓN Se basa en la propiedad del ADN de desnaturalizarse a Tº o pH elevados, debido a que los puentes de hidrógeno de las dos cadenas se rompen, quedando las dos hélices desenrolladlas y separadas. Como sabemos este proceso es reversible y una bajada de temperatura o una disminución de pH, hace que las hebras vuelvan a enrollarse, recuperando su actividad. A este proceso se le conoce como renaturalización. En el laboratorio se puede conseguir que dos moléculas diferentes se desnaturalicen y después al renaturalizarse se formen moléculas híbridas que tengan hebras de diferentes ADN. Cuanto más relacionados estén los ADN, mayor será el grado de hibridación. Esta técnica se utiliza no sólo para ver el grado de parentesco entre especies sino también para detectar secuencias complementarias, localizar genes relacionados con enfermedades genéticas,… 24 9.4.- LA CLONACIÓN DEL ADN. VECTORES (PLÁSMIDOS) La obtención de varias copias de ADN es posible mediante dos métodos: - Introducir el fragmento de ADN que se quiere multiplicar en una bacteria, al multiplicarse la bacteria también multiplicará el ADN (clonación). Es decir, esta técnica consiste en producir múltiples copias de un gen específico o fragmento de ADN, en el interior de un organismo llamado hospedador (bacterias, levaduras,..) - Mediante la técnica PCR obtienes las copias de ADN que quieras de una manera rápida y sencilla. La técnica PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite hacer muchas copias de fragmentos de ADN en poco tiempo y partiendo de muy poca cantidad de ADN. Para ello introducimos el fragmento de ADN que queremos copiar en un líquido que contiene la enzima ADN polimerasa y muchos nucleótidos. Primero se calienta para separar las dos cadenas del ADN, una vez separadas, la ADN polimerasa (la ADN polimerasa no se desnaturaliza por el calor, porque ha sido obtenida de una bacteria termófila que vive en lugares con altas temperaturas) va colocando los nucleótidos complementarios haciendo la copia, se deja enfriar para que se vuelvan a unir las cadenas de ADN y se repite el proceso todas las veces que se quiera (en cada ciclo se multiplica exponencialmente las copias de ADN obtenidas). La potencialidad de esta técnica es impresionante, a partir de una sola molécula de ADN, la PCR puede generar 100000 millones de moléculas idénticas en una tarde. El ADN puede proceder de una muestra de tejido de un hospital, de una gota de sangre o semen en la escena de un delito, o de un cerebro momificado. Las aplicaciones de esta técnica son importantes en estudios evolutivos, para determinar huellas dactilares genéticas, en medicina forense o investigaciones policiales,… La clonación de un gen usando vectores consiste en introducirlo en una célula de manera que pueda ser copiado y mantenido. Para introducir el gen en una célula, se inserta el gen en una molécula de ADN, llamada vector de clonación, capaz de entrar y de replicarse de forma independiente en una célula huésped. Los vectores pueden ser bacteriófagos (virus que infectan bacterias), cósmidos y plásmidos bacterianos. Todos deben tener unas características comunes, llevar su propio origen de replicación y unos genes marcadores que sirvan para su rápida y fácil identificación. Estos genes marcadores pueden ser genes que proporcionen resistencia a determinados antibióticos, o genes que produzcan bioluminiscencia. Los más utilizados son los plásmidos bacterianos, que son pequeñas moléculas circulares de ADN de doble hélice que pueden replicarse independientemente (es decir, sin asociarse al ADN cromosómico) en bacterias. . En una bacteria puede haber entre 20 y 50 plásmidos. Los plásmidos que contienen un fragmento de ADN insertado por ingeniería genética se denominan plásmidos recombinantes. Muchos de estos plásmidos contienen genes que confieren resistencia a antibióticos (plásmidos R) . Si un plásmido recombinante se introduce en una bacteria se replicará con ella y obtendremos millones de copias de ese plásmido recombinante que pueden aislarse. El proceso de clonación de un gen en bacterias incluye las siguientes etapas: 25 1-­‐ Obtención del fragmento de ADN que contiene el gen que se quiere clonar. 2-­‐ Obtención del plásmido recombinante: Para insertar el gen que se quiere clonar en el vector de clonación (plásmido en este caso), se corta el plásmido y el ADN que se quiere clonar con la misma enzima de restricción y se une con la ADN ligasa el fragmento de ADN de interés al plásmido, obteniéndose el plásmido recombinante. Además del gen que queremos clonar, el plásmido elegido debe llevar un gen de fácil detección genotípica llamado marcador, necesario para el paso 4. 3-­‐ Transformación de las bacterias: Consiste en incorporar el plásmido recombinante en bacterias, para ello, los plásmidos recombinantes se incuban en un cultivo de bacterias capaces de captar ADN del exterior, proceso llamado transformación (recordar la parasexualidad en bacterias: conjugación, transformación y transducción). 4-­‐ Selección de las bacterias transformadas: Consiste en comprobar qué bacterias han incorporado el gen. Como el plásmido lleva un gen marcador fácil de detectar, por ejemplo resistencia a un antibiótico (otro puede ser producción de bioluminiscencia pero con bacterias casi siempre se usa la resistencia a un antibiótico), entonces se añade al medio de cultivo bacteriano ese antibiótico y las bacterias que sobrevivan serán las que han incorporado el plásmido recombinante (bacterias trasnformadas)y por tanto, el gen que queremos clonar, las otras bacterias ( no transformadas) no crecerán. 5-­‐ Crecimiento de las bacterias transformadas: Las bacterias transformadas se mantienen en medios de cultivo para su rápido crecimiento. Al mismo tiempo que las bacterias se duplican, se duplica también el número de plásmidos recombinantes y el gen que lleva insertado. 6-­‐ Aislamiento de los plásmidos recombinantes y de las copias del gen de interés. El conjunto de todos los fragmentos de ADN clonados a partir de un genoma se denomina librería genómica o genoteca de ADN. 26 10.- INGENIERÍA GENÉTICA: AGRICULTURA Y MEDIO AMBIENTE Vamos a ver el proceso más usado de obtención de plantas transgénicas y las aplicaciones de la ingeniería genética en agricultura y medio ambiente. 10.1.- AGRICULTURA: PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS Transformación (Agrobacterium) y Regeneración Los organismos eucariotas desarrollados a partir de una célula en la que se han introducido genes extraños se denominan organismos transgénicos u organismos modificados genéticamente (OMG). Actualmente es posible introducir en una planta, ADN procedente de otra especie; incluso procedente de animales o de bacterias y conseguir con ello plantas transgénicas con diferentes características (planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética, bien para introducir uno o más genes nuevos o para modificar la función de un gen propio). La finalidad en la agricultura es conseguir una mayor productividad de los cultivos, obteniendo plantas resistentes a los herbicidas, a los insectos; mejorando la resistencia a cambios ambientales (plantas que puedan resistir heladas, sequías), modificando las características de las plantas, mejorando las características nutritivas del producto,… Hay que tener en cuenta que el 10% de una cosecha se pierde debido a las “malas hierbas”. Este porcentaje se puede reducir utilizando plantas transgénicas resistentes a los herbicidas con los que se eliminan las malas hierbas. El método más común para introducir genes en plantas utiliza una bacteria del suelo llamada Agrobacterium, que en condiciones naturales es capaz de infectar células vegetales y transferirles genes (en condiciones naturales infecta vegetales produciendo la enfermedad “agalla de la corona”). Esta bacteria presenta un plásmido, llamado plásmido Ti, que se utiliza como vector de clonación en plantas. Durante la infección la bacteria transfiere un fragmento de su plásmido Ti a las células de la planta. Este fragmento se denomina ADN-­‐T y termina integrándose en algún lugar del cromosoma. 27 La producción de plantas transgénicas consta de 2 etapas denominadas transformación y regeneración. La transformación es el proceso de inserción en la célula vegetal del gen o genes que nos interesa y la regeneración consiste en la obtención de una planta completa a partir de una célula vegetal transformada. Transformación: Por ingeniería genética se puede insertar un gen de interés en la región T del plásmido Ti. Para ello, se aísla el plásmido Ti de Agrobacterium, se inserta en la región T del plásmido el gen que nos interesa, usando una enzima de restricción y ADN ligasa. Se vuelve a introducir el plásmido en la bacteria Agrobacterium y se deja que la bacteria infecte células vegetales Así, después de la infección, el nuevo gen será también transferido a la célula vegetal e insertado en el genoma de la planta. No todas las especies pueden ser transformadas usando Agrobacterium. Especialmente para las monocotiledóneas se ha desarrollado un método alternativo, denominado “bombardeo con micropartículas”. En este método, se recubren micropartículas de oro o de tungsteno con el ADN, las cuales son aceleradas en un “cañón génico” para adquirir suficiente velocidad y poder penetrar en la célula. Regeneración: Después de la transformación, las células vegetales que recibieron los genes de interés se seleccionan empleando herbicidas en el medio de cultivo (además de los genes de interés, se introducen otros genes, denominados “marcadores de selección” que le confieren resistencia a las células que los llevan, de modo que las que células que no llevan estos genes marcadores, mueren). Las células vegetales que han sobrevivido son las que han sufrido la transformación. Entonces se cultivan y de ellas se obtienen plantas completas (regeneración). Gran parte de las células vegetales son totipotentes, quiere decir que una célula de cualquier parte de la planta puede multiplicarse y generar la planta completa. Para eso las células deben crecer en el medio de cultivo adecuado y en presencia de determinadas hormonas y factores de crecimiento vegetales. El resultado es una planta que lleva el gen de interés en cada una de sus células. 28 Obtención de plantas resistentes al herbicida glifosato: En la imagen inferior se observa que el glifosato inhibe una enzima (epsps) vital para la supervivencia de las plantas, provocando su muerte. Las plantas tolerantes a glifosato tienen una variante del gen epsps de la cepa CP4 de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens, que produce una enzima epsps que no es inhibida por el glifosato. Como la enzima EPSPS producida en esta cepa bacteriana no es afectada por el glifosato, su introducción en el genoma de las plantas las vuelve tolerantes al herbicida. La introducción de este gen se ha realizado por la técnica anteriormente descrita: se introduce el gen epsps en la región T del plásmido de Agrobacterium, y se infecta células vegetales con la bacteria Agrobacterium que posee este plásmido recombinante con el gen epsps resistente al herbicida, algunas células vegetales se habrán transformado y poseerán el gen que le da resistencia al herbicida glifosato. Para seleccionar estas células vegetales se añade el herbicida glifosato y las células vegetales que sobrevivan son las transformadas. De estas células se obtendrán plantas completas (regeneración) transgénicas resistentes al glifosato. 29 10.2.- APLICACIONES GENÉTICA MEDIOAMBIENTALES DE LA INGENIERÍA Algunos microorganismos están siendo utilizados para limpiar el medio ambiente de ciertos contaminantes, ya que tienen la capacidad de transformarlos en sustancias no contaminantes o de adsorberlos. Hay especies que degradan el petróleo y los pesticidas. , otras que acumulan metales pesados y otras que descontaminan las aguas residuales. La utilización de la actividad biológica de los microorganismos para restaurar ambientes contaminados se llama Biorremedación. Fue inventada por George M. Robinson en la década de 1960 ( realizó experimentos con microbios en frascos contaminados de petróleo). Sabemos que la naturaleza tiene mecanismos de autorregulación. Cuando un ecosistema es dañado o perturbado por la presencia de un agente físico, químico o biológico, éste utiliza mecanismos de recuperación, como bacterias, hongos, plantas. o algas que pueden degradar a los agentes dañinos. En el proceso de la Biorremedación destacan especialmente las bacterias, los seres vivos con mayor capacidad metabólica del planeta. Las bacterias pueden degradar prácticamente cualquier sustancia orgánica, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Si la sustancia se degrada completamente se habla de mineralización; este es el proceso ideal, pero no siempre ocurre. Algunas sustancias no son degradadas sino transformadas en otras a esta se le llama biotransformación ( puede ser peligrosa, pues a veces la nueva sustancia puede ser igual o más nociva que la de partida). Finalmente hay sustancias que no son degradadas y se las denomina recalcitrantes, éstas pueden persistir durante mucho tiempo. La Biorremedación puede ser in situ, el material contaminado se trata en el lugar en el que se encuentra o ex situ, en este caso el material se traslada a otro lugar para completar su descontaminación en biorreactores. Entre los procesos más interesantes, la descomposición microbiana de hidrocarburos es de considerable importancia económica y ambiental. Una de las principales causas de contaminación del ambiente son los derrames de petróleo. Los vertidos de petróleo en el agua tienden a formar láminas en la superficie en donde el viento y el oleaje forman cicroscópicas emulsiones. Esto permite que bacterias (pseudomonas, micobacterias y corinebacterias), levaduras y hasta algas verdes tengan una mayor superficie de contacto con la partícula, facilitando su degradación. Algunos contaminantes, como los metales pesados (plomo, mercurio,…) no son fáciles de biorremediar por medio de microorganismo, además la incorporación de estos en la cadena alimentaria (bioacumulación) agrava el problema. Se puede usar entonces la remedación por medio de plantas (fitorremedación). Es útil en estos casos usar plantas transgénicas que concentre estas toxinas en sus partes aéreas, las cuales pueden ser cosechadas , eliminadas o recicladas para usos industriales. Otro tipo de compuesto susceptible de biorremedación son los plaguicidas ( insecticidas, herbicidas,…). Algunas de estas sustancias pueden actuar como dadores de electrones o como fuente de carbono para cierto microorganismos. Conocer los procesos bioquímicos que llevan a las reacciones de degradación, así como los genes que codifican las enzimas responsables de estos procesos ha servido y está sirviendo para desarrollar herramientas de interés biotecnológico, como el uso de las bacterias en procesos de biominería (extracción de metales de interés), de bioproducción de 30 sustancias de interés tales (bioplásticos o biopolímeros), energía (electricidad), sustancias de interés farmacológico, o enzimas que realizan procesos químicos de una forma más eficiente y más respetuosa con el medio ambiente que la industria química. 11.- APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA EN MEDICINA En este campo, destacamos : -­‐ La Obtención de productos farmacéuticos Muchas enfermedades están provocadas por la carencia de una proteína: La insulina, el interferón, la hormona del crecimiento o el factor VIII de la coagulación son proteínas que se producían en cantidades muy pequeñas mediante procesos muy costosos y que, en la actualidad, se fabrican mediante la ingeniería genética. También se puede introducir genes en bacterias para que fabriquen otros medicamentos como antibióticos, vacunas… Por ejemplo sacamos de un virus el gen que fabrica el antígeno del virus, se lo metemos a una bacteria y la bacteria fabrica antígenos del virus que son utilizados como vacuna. Actualmente, se está investigando introducir genes humanos en el cerdo para fabricar órganos que puedan ser trasplantados en humanos con el menor rechazo posible. -­‐ La terapia génica : consiste en bien eliminar el gen anómalo que produce alguna enfermedad, o bien, introduciendo el gen no anómalo (correcto) para evitar la enfermedad. . La manipulación genética de algunos virus puede permitir su utilización en la terapia génica frente a diferentes enfermedades, como la distrofia muscular o la fibrosis quística. Actualmente las investigaciones para buscar soluciones a las enfermedades genéticas se basan en este método. La insulina humana fue la primera proteína obtenida por ingeniería genética. Es una hormona que se produce en el páncreas y junto con el glucagón, regula los niveles de glucosa en sangre (glucemia).Las personas con deficiencia en esta hormona son diabéticas y deben inyectarse insulina una o más veces al día. Recordamos que esta proteína consta de dos cadenas polipeptídicas (insulina A e insulina B, de 20 y 31 aminoácidos respectivamente) unidas mediante puentes disulfuro. Las dos cadenas están codificadas por partes diferentes de un mismo gen. En realidad, el gen de la insulina codifica una sola cadena polipeptídica más larga que posteriormente dará lugar a insulina, para lo que se debe eliminar el fragmento central de la cadena, que une la insulina A y la B. Para conseguir que las bacterias produzcan insulina humana, se han seguido dos caminos: (1) producción de un precursor de la hormona, la proinsulina (cadena polipeptídica más larga), y conversión de ésta en insulina por métodos químicos; (2) producción de las cadenas A y B por separado (en distintas células bacterianas), y unión posterior de las cadenas A y B para formar insulina. En la figura inferior se ilustra el segundo de estos caminos. Puesto que las cadenas polipeptídicas de la insulina son cortas, resulta más rentable sintetizar en el laboratorio los 31 polinucleótidos que las codifican que aislar el gen de la insulina a partir de células humanas. Esto fue lo que se hizo: se fabricó un ADN sintético con 63 bases que codificaban la insulina A, otro con 90 bases que codificaban la insulina B, y a ambos se les añadió, al final de la secuencia codificadora, el triplete correspondiente a la metionina, y también se añadieron fragmentos adecuados para que las enzimas de restricción cortaran por ellos; así, cada uno de los polinucleótidos se insertaron por separado en un plásmido de Escherichia coli, junto al gen que expresa una proteína -­‐la β-­‐galactosidasa. Es decir, se utilizaron dos cultivos distintos de E. coli, de manera que de cultivo de bacterias se obtiene el polipéptido A junto con la β-­‐ galactosidasa y otro cultivo, el polipéptido B junto con la β-­‐galactosidasa . Cuando los genes sintéticos se expresaron, se obtuvieron dos cadenas polipeptídicas llamadas “proteínas de fusión”, ya que cada una contiene una cadena de insulina (A o B) unida a una cadena de β-­‐galactosidasa por un resto de metionina (codificado por el triplete que se introdujo). Tales proteínas de fusión tienen la ventaja de ser más estables en E. coli que la insulina sola. Posteriormente se procesan las proteínas con bromuro de cianógeno (BrCN), que destruye la metionina, y así quedan libres las cadenas A y B. Después de purificadas, se unieron químicamente, formándose entre ellas los puentes de disulfuro ( entre cisteínas) y obteniéndose así, la insulina activa. 32 33
