redireccionamiento de anticuerpos.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : C07K 16/46
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
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A61K 39/395
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 94926336.2
kFecha de presentación : 16.09.94
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 720 624
kFecha de publicación de la solicitud: 10.07.96
T3
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54 Tı́tulo: Redireccionamiento de anticuerpos.
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30 Prioridad: 22.09.93 GB 9319969
03.12.93 WO GB93/02492
17.06.94 GB 9412166
20 Park Crescent
London W1N 4AL, GB
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72 Inventor/es: Winter, Gregory Paul y
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74 Agente: Ponti Sales, Adelaida
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.03.99
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.03.99
ES 2 126 145 T3
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73 Titular/es: MEDICAL RESEARCH COUNCIL
Aviso:
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Holliger, Kaspar Philippe
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 126 145 T3
DESCRIPCION
Redireccionamiento de anticuerpos.
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Descripción de la invención
La presente invención se refiere al redireccionamiento de anticuerpos hacia un sitio o antı́geno para
el cual no tienen especificidad funcional en condiciones normales. Se describe un procedimiento que
emplea una sustancia que se une a un antı́geno de forma especı́fica, la cual posee, al menos, dos especificidades: una especificidad por el sitio diana, y otra especificidad capaz de unirse a una parte de una
molécula de anticuerpo. De esta forma, anticuerpos que no tienen especificidad por el antı́geno diana
pueden ser conducidos a la proximidad del antı́geno mediante la sustancia unidora especı́fica para el
antı́geno. Este principio es ventajoso para redirigir anticuerpos en el sistema circulatorio hacia sitios
enfermos en el interior del cuerpo, por ejemplo, tumores o lugares de infección viral, bacteriana o por
parásitos, o combinaciones de los mismos. Este principio también puede aplicarse para bloquear respuestas inmunes inadecuadas, ejemplificadas por enfermedades autoinmunes o reacciones de hipersensibilidad.
El redireccionamiento puede conseguirse mediante anticuerpos biespecı́ficos convencionales, por ejemplo,
preparados quı́micamente o a partir de hibridomas hı́bridos, o usando los nuevos fragmentos biespecı́ficos
de anticuerpo, diacuerpos (diabodies, P. Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448,
y PCT/GB93/02492).
Los anticuerpos son proteı́nas elaboradas por los linfocitos B, para desempeñar un papel esencial en el
arma especı́fica del sistema inmune de los vertebrados. Esto se debe a su capacidad colectiva de unirse a
una enorme diversidad de estructuras antigénicas, con moléculas individuales de anticuerpos capaces de
una especificidad precisa hacia sus antı́genos afines. El grueso de la población de anticuerpos se encuentra en abundancia en la sangre y fluidos intersticiales, con tipos menores localizados en las superficies
mucosas tales como el lumen intestinal. Un anticuerpo que se una a un organismo extraño o a una
célula tumoral lo identifica para su destrucción por las funciones efectoras del sistema inmune codificadas
por el anticuerpo. La destrucción puede ser efectuada bien por la cascada de complemento o mediante
citotoxicidad a través de células y dirigida por el anticuerpo (antibody directe cell-mediated cytotoxicity,
ADCC). La ADCC se lleva a cabo mediante la unión de las regiones Fc del anticuerpo a sus receptores
Fc en, por ejemplo, macrófagos, eosinófilos, células K, y también basófilos y mastocitos. La interacción
con los receptores Fc interviene no sólo en la citólisis sino también en la fagocitosis y limpieza inmune.
Los isotipos Ig difieren de forma marcada en el espectro de funciones efectoras que captan.
El sistema inmune dispone de controles naturales y equilibrios para prevenir la producción de anticuerpos con especificidad por el huésped, los denominados “auto-antı́genos”. Ocasionalmente, el sistema
se estropea causando enfermedades autoinmunes. La auto-tolerancia es una razón por la cual el sistema
inmune podrı́a no destruir tumores y otros tipos de patologı́as, ya que estas derivan de células del huésped
que crecen anormalmente.
Se ha probado que es posible emplear anticuerpos en intervenciones médicas, empleando anticuerpos
manufacturados fuera del cuerpo. Las técnicas para la inmortalización de los linfocitos B han permitido
la fabricación de anticuerpos monoclonales para un rango de aplicaciones comerciales en ciencia y salud
humana (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies, E. S. Lennox, Ed. British Medical Bulletin
1984. Churchill-Livingstone). Es más, la comprensión de la estructura genética y fı́sica de los anticuerpos ha permitido su manipulación fuera del sistema inmune, a través del uso de técnicas de biologı́a
molecular, especialmente mediante el uso de tecnologı́a de exposición en fagos (phage display technique)
(WO 92/012047, WO92/20791, WO 93/06213, WO/93/11236, WO 93/19172, WO 94/13804).
Estructuralmente, el anticuerpo más simple (IgG) incluye cuatro cadenas polipeptı́dicas interconectadas por enlaces disulfuro. Las cadenas ligeras existen en dos formas diferentes llamadas kappa (κ) y
lambda (λ). Cada cadena tiene una región constante (C) y una región variable (V). Cada cadena está
organizada en una serie de dominios. Las cadenas ligeras tienen dos dominios, uno correspondiente a la
región C (CL) y otro a la región V (VL). Las cadenas pesadas tienen cuatro dominios, un dominio de
región V (VH) y tres dominios de región C, CH1, CH2 y CH3. El anticuerpo elemental IgG tiene forma
de “Y”; los dos brazos (extremo superior de la “Y”, cada uno de ellos es una región “Fab”) contienen un
dominio VH y VL asociados entre ellos. Son este par de regiones V las que difieren de un anticuerpo a
otro (debido a variaciones en la cadena de aminoácidos), y las que juntas son responsables de reconocer
el antı́geno y proporcionar un sitio de unión del antı́geno (antigen binding site, ABS). En mayor detalle,
cada región V (no importa que sea una cadena pesada o ligera) consiste en tres regiones de determinación
complementarias (complementary determining regions, CDRs) separadas por cuatro regiones de armazón
(FR). Las CDRs son la parte más variable de las regiones variables, y llevan a cabo la crı́tica función
de unión. Las regiones CDR derivan de muchas secuencias potenciales germen de lı́neas, a través de un
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proceso complejo que implica la recombinación, mutación y selección.
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Se ha mostrado que la función de unir antı́genos pueden realizarla fragmentos de un anticuerpo completo. Son ejemplos de fragmentos unidores (i) los fragmentos Fab formados por dominios VL, VH, CL
y CH1; (ii) el fragmento Fd formado por los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv formado por
los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E. S. et al., 1989, Nature
341: 544-546) el cual consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab’)2,
un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; (vii) dı́meros biespecı́ficos de cadenas
Fv sencillas (PCT/US92/09965), y (viii) diacuerpos, fragmentos bivalentes o biespecı́ficos construidos
mediante fusión de genes (P. Holliger et al. supra; WO94/13804). Los diacuerpos se discuten más abajo.
Los fragmentos biespecı́ficos están especialmente bien adaptados para la presente invención.
Mientras que los dominios V (y los fragmentos conteniendo dominios V) son mayoritariamente responsables de interaccionar con el antı́geno, los dominios C captan las funciones efectoras. El tipo de función
efectora captado está gobernado en su mayor parte por la clase de dominio C (el isotipo; M. Bruggermann
et al., 1987, J. Exp. Med. 166: 1351; L. Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323; J. Greenwood et al.,
1993, Eur. J. Immunol. 23: 1098-1104). De esta forma, los anticuerpos, que han evolucionado para combatir patógenos, se unen a antı́genos en el patógeno y, al hacer esto, inician la respuesta inmune apropiada
destinada a destruir el invasor. Por ejemplo, los dominios C del isotipo IgG1 (γ1) pueden matar células
disparando la cascada de complemento en la superficie de la célula, resultando en su lisis, o a través de
la unión de receptores del dominio C (receptores Fc) en células fagocı́ticas o asesinas especializadas, a
través de la ADCC. Por otra parte, los anticuerpos del isotipo IgG4 (γ4) aparecen activamente para bloquear una respuesta. En el contexto de la presente invención este bloqueo se considera como una función
efectora, la cual puede ser captada para una diana escogida. Los sitios de unión para el complemento y
receptores Fc se corresponden con el dominio CH2, la variación en la secuencia de dominios CH2 de los
diferentes isotipos resulta en diferentes fuerzas de interacción con el complemento y receptores Fc. Todos
los isotipos, excepto IgE, precisan que el dominio C esté correctamente glicosilado.
Mediante asociación de la región V con una determinada región C del isotipo, puede dispararse una
respuesta inmune apropiada cuando el anticuerpo se une al antı́geno. Debido a que el tipo de la respuesta
inmune está gobernado por el isotipo, los anticuerpos fabricados artificialmente pueden ser dotados de
las regiones constantes apropiadas para su uso terapéutico, por ejemplo, para destruir células tumorales
(Hale, G. et al., 1988, Lancet II: 1349-1399).
Si un anticuerpo va a ser usado de tal forma que precise captar funciones efectoras naturales, entonces dicho anticuerpo (excepción hecha de los isotipos IgE) debe ser fabricado en células eucariotas para
que la proteı́na sea glicosilada. Desafortunadamente, el tipo y extensión de la glicosilación varı́a con el
tipo de célula eucariótica y condiciones de cultivo (Borys, M.C. et al., 1993, Biotechnology 11: 720-725),
y esto puede reducir dramáticamente su longevidad en el sistema circulatorio, ası́ como influenciar de
forma adversa la captación de funciones efectoras. Además, hay el riesgo añadido de que un anticuerpo
incorrectamente glicosilado sea inmunogénico, limitando la duración de la terapia.
Una forma de obviar la necesidad de regiones constantes correctamente glicosiladas es fabricar anticuerpos que incluyan, al menos, dos sitios diferentes de unión de antı́genos. Estos se conocen como
anticuerpos biespecı́ficos y pueden ser fabricados de diferentes formas (Holliger, P. and Winter, G., 1993,
Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449). Usando otra vez el ejemplo de matar un tumor, un sitio de
unión de antı́geno se dirige contra un marcador tumoral, mientras que el otro puede ser dirigido contra
un antı́geno presente en una célula de tipo efectora. Se ha comprobado que anticuerpos biespecı́ficos que
incorporaban una especificidad para el correceptor CD3 de las células T inhibı́an el crecimiento tumoral
(Titus, J.A. et al., 1987, J. Immunol. 138: 4018-4022) y curaban linfomas (Brissinck J. et al., 1991,
J. Immunol. 174, 4019-4026). De esta forma, la interacción entre la región Fc y la célula efectora es
remplazada por la interacción directa entre uno de los sitios de unión de antı́genos y el efector. Se ha
probado que los diacuerpos dirigidos contra el antı́geno carcinoembriónico (CEA, un marcador de célula
tumoral humana) y CD16 (en linfocitos T humanos) median en la lisis de células tumorales humanas
después de añadir linfocitos de sangre periférica (WO 94/13804).
Los presentes inventores se han dado cuenta de que la interacción directa entre la región C de la
molécula anticuerpo y el efector resulta en una activación limitada del sistema inmune, y que serı́a ventajoso activar a un mayor grado (o incluso apagar) las respuestas inmunes contra una determinada diana.
Los inventores también se han dado cuenta de que tal modulación puede conseguirse redirigiendo los
anticuerpos presentes de forma natural contra un sitio o diana para el cual no necesariamente poseen
especificidad. Los presentes inventores se han dado cuenta además que este principio podrı́a llevarse
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a cabo a través del uso de sustancias unidoras que posean una o más especificidades. Uno de tantos
ejemplos es un anticuerpo biespecı́fico que incorpora especificidad para otros anticuerpos. Un anticuerpo
con especificidad por una célula tumoral y, por ejemplo, las regiones constantes IgG1 se unirá al tumor
in situ y acumulará anticuerpos IgG1 presentes en el sistema circulatorio, de tal forma que se atraerán
hacia el tumor funciones efectoras especı́ficas de IgG1. Los anticuerpos en el suero de un individuo son
nativos a esa persona y, por tanto, serán funcionales a la hora de activar la cascada de complemento o la
ADCC. El principio de captación indirecto es más beneficioso que la interacción directa con las células
efectoras por diversas razones.
En primer lugar, hay evidencia de la existencia de redes de anticuerpos en el sistema inmune, en las
cuales especificidades anti-anticuerpos que se dan de forma natural construyen una masa de anticuerpos
a partir y alrededor de anticuerpos complejados en un sitio diana (A. S. Perelson, 1989, Immunol. Rev.
110:5-36; las redes de anticuerpos son revisadas por N.J. Calvanico, 1993, Dermatol. Clin. 11: 379-389).
Se cree que esto sirve para amplificar el efecto de unión de unas pocas moléculas de anticuerpo a una
diana, de forma que un pequeño grado de unión especı́fica puede disparar una respuesta efectora desproporcionadamente grande. Esto contrasta con la unión directa a células efectoras o con el disparo del
complemento, ya que este caso la unión es estequiométrica (un anticuerpo por antı́geno como mucho) en
vez de multiplicativa.
Una segunda razón por la cual esta disposición es beneficiosa, se refiere al control de la vida media en
suero. Los anticuerpos correctamente glicosilados tienen velocidades de desaparición del suero bastante
fiables, siendo la velocidad de recambio diferente para isotipos diferentes. Por ejemplo, IgG1 tiene una
vida media en suero del orden de 21 dı́as, mientras que, por otra parte, IgG3 e IgE son remplazadas en
cuestión de 1 a 2 dı́as. La duración del efecto terapéutico puede ser controlado por la vida media de los
anticuerpos biespecı́ficos administrados, por ejemplo, diacuerpo. La vida media es probable que dependa
de su afinidad (y cinética) unidora por el anticuerpo y antı́geno diana, y de la concentración en suero del
anticuerpo diana.
En tercer lugar, esta aproximación puede ser utilizada en inmunosupresión especı́fica contra un sitio. Algunos anticuerpos, tales como IgG4, previenen activamente la respuesta inmune bloqueando los
epı́topos. Es más, se sabe que algunos parásitos explotan esta propiedad para escapar a la respuesta
inmune (A. Capron et al., 1992, Mem. Inst. Oswaldo Cruz 85(Suppl. 5): 1-9), y que sus antı́genos
inducen la producción de anticuerpos con la especificidad correcta pero con isotipos de la región C incapaces de inducir la muerte celular. Este principio puede ser extendido, dentro del campo de la presente
invención, a usos tales como la mitigación de desórdenes autoinmunes como la artritis reumatoide y la
miastenia gravis. En este caso, los anticuerpos biespecı́ficos tiene especificidad por el epı́topo diana y, por
ejemplo, IgG4. No obstante, podrı́a ser necesario revisar los pacientes y comprobar la capacidad de su
inmunoglobulina IgG4 de captar funciones efectoras, ya que la capacidad de realizar esta función parece
variar entre individuos (Greenwood et al., supra).
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En cuarto lugar, in vivo, los alotipos naturales de los individuos son captados, por tanto, se elimina
la necesidad de emparejar los alotipos de los anticuerpos terapéuticos y de los individuos.
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Para aquellos que sean expertos en la técnica será patente que hay diferentes formas de poner este
principio en funcionamiento. Por ejemplo, podrı́an incorporarse sustancias unidoras presentes en la naturaleza o modificadas genéticamente y distintas de anticuerpos a una sustancia multiespecı́fica aquı́
descrita. Los ejemplos incluyen las lectinas, las proteı́nas que unen Fc tales como las proteı́nas A o G,
receptores tales como los receptores del Fc y componentes del sistema de complemento. También podrı́an
utilizarse pequeñas moléculas tales como los péptidos, ácidos nucleicos, o productos quı́micos presentes
en la naturaleza, o parcialmente sintéticos o sintéticos. Los compuestos antes mencionados pueden ser
utilizados en cualquier orden, número y combinación para crear las sustancias multiespecı́ficas aquı́ descritas para su uso en terapia, diagnóstico e investigación cientı́fica. No obstante, se prefiere el uso de
anticuerpos o de un fragmento de los mismos. Especialmente, se prefieren los fragmentos de anticuerpo
tales como (Fab)2 y diacuerpos que no tengan las regiones Fc, por las razones detalladas más abajo.
Deberı́amos destacar que, a menos que el contexto indique otra cosa, el término anticuerpo se usa aquı́
(y, habitualmente en el tema) para incluir fragmentos de anticuerpos, tanto sintéticos como naturales,
por ejemplo, moléculas que incluyan un dominio de unión de inmunoglobulinas.
En la realización preferida, la sustancia multiespecı́fica aquı́ descrita, es un anticuerpo biespecı́fico
capaz de unirse a un isotipo apropiado de un anticuerpo. Los “diacuerpos” pueden ser especialmente
ventajosos para este propósito, ya que pueden ser fácilmente construidos y expresados en E. coli. Los
diacuerpos con especificidades de unión apropiadas pueden ser fácilmente seleccionados utilizando iden4
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tificación con fagos (phage display) (WO 94/13804) en bibliotecas. Supongamos que uno de los brazos
del diacuerpo ha de mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra una cadena
ligera de inmunoglobulina, en tal caso, se puede fabricar una biblioteca en la cual el otro brazo es diverso
y seleccionar un anticuerpo con la especificidad apropiada.
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Aunque cualquier tipo de molécula de anticuerpo biespecı́fico podrı́a ser utilizada para redirigir anticuerpos, es preferible usar (Fab)2 , dı́meros de scFv, o diacuerpos en vez de anticuerpos completo. La
presencia de Fc en un anticuerpo completo podrı́a causar complicaciones in vivo que se originarı́an de
la dirección hacia sitios no especı́ficos, especialmente receptores de Fc. Los diacuerpos pueden ser construidos sin Fc, empleando tan sólo dominios variables, evitándose éste problema potencial. In vitro, la
simplicidad de fabricar diacuerpos biespecı́ficos en lugar de anticuerpos completos biespecı́ficos, hace de
éstos la forma de anticuerpo de elección.
Un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para captar una función efectora
mediada por anticuerpo hacı́a una diana, el procedimiento emplea una sustancia unidora multiespecı́fica
que tiene especificidad de unión anti-anticuerpo y especificidad de unión por la diana. Esto se ilustra en la
Figura 1. La unión de la sustancia unidora multiespecı́fica a la diana y al anticuerpo permite la captación
hacı́a la diana de la función efectora mediada por el anticuerpo. La sustancia unidora se une al anticuerpo
y a la diana, en donde media la función efectora del anticuerpo, generalmente, la función efectora es la
que corresponde al anticuerpo unido (por ejemplo, ADCC, fijación del complemento, o bloqueo, tal y
como se ha discutido). El anticuerpo empleado para la captación de las funciones efectoras asociadas
podrı́a ser cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE. Preferiblemente,
la especificidad anti-anticuerpo de la sustancia unidora, es por la región constante de los anticuerpos de
uno o más isotipos. El uso de especificidad anti-anticuerpo especı́fica para un isotipo permite la selección
de la función efectora captada.
Las IgG1, IgG3 e IgM humanas son especialmente valiosas para la fijación del complemento, y la IgG1
e IgG3 son particularmente valiosas para la ADCC. De este modo, la sustancia unidora multiespecı́fica
tendrá especificidad de unión para una región constante del isotipo. Las moléculas de IgM son especialmente útiles en ensayos de aglutinación. La IgG4 es el isotipo más apropiado para bloquear anticuerpos,
ya que, en general, no capta citotoxicidad celular dirigida por anticuerpos o complemento. En algunos
casos, podrı́a ser útil el uso de un isotipo que no activara el complemento a niveles muy elevados, para
prevenir una respuesta tóxica. IgG1 podrı́a ser particularmente apropiada para la captación de la fagocitosis. Los mastocitos podrı́an ser captados vı́a anticuerpos IgE. Esto podrı́a hacerlos de interés en la
destrucción de células cancerosas, pero podrı́a limitar su uso en otras aplicaciones (WO 92/11031).
La especificidad dirigida contra las cadenas ligeras permite la captación de un espectro de isotipos de
anticuerpos, incluyendo aquellos que activan el complemento o ADCC.
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La especificidad anti-idiotipo podrı́a ser utilizada. Las especificidades para idiotipos ampliamente
distribuidos, tales como las que podrı́an ser proporcionadas por la comúnmente utilizada secuencia del
gen del germen de lı́nea DP-47 V, podrı́an ser utilizadas para captar cualquier anticuerpo en el que este
idiotipo fuera todavı́a reconocible en el anticuerpo maduro. La especificidad para idiotipos de anticuerpos
especı́ficos es útil para usar el anticuerpo que presenta dicho idiotipo en un ensayo de aglutinación. En
un ejemplo de como usar diacuerpos, una primera molécula de diacuerpo, dirigida contra un marcador
celular de superficie y el idiotipo del anticuerpo, unirı́a una célula al anticuerpo. Una segunda molécula
de diacuerpo serı́a capaz de unirse a otro sitio de unión de antı́genos en el anticuerpo y a una segunda
célula, uniéndolas por tanto. Las moléculas de IgM serı́an particularmente convenientes para esto, porque
tienen 10 sitios de unión de antı́genos por molécula.
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La sustancia unidora multiespecı́fica podrı́a ser biespecı́fica. Podrı́a ser un anticuerpo o fragmento
de anticuerpo biespecı́fico (tal y como se ha expuesto). Preferentemente, es un diacuerpo, es decir, un
multı́mero (por ejemplo, dı́mero) de polipéptidos cada uno de los cuales tiene un primer dominio que
incluye una región de unión de una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, estando los dos dominios unidos pero sin que puedan asociarse para formar un sitio de unión de antı́genos.
La unión podrı́a ser a través de un péptido de conexión de 1 a 10 aminoácidos (por ejemplo, 5). Los
polipéptidos se asocian en multı́meros, en los que el primer dominio de un polipéptido se asocia con el
segundo dominio de otro polipéptido para formar un sitio de unión de antı́genos. Para más información
y posibles formatos de “diacuerpo” para la presente invención, ver WO 94/13804. También se prefieren
los dı́meros de scFv, en los cuales cada polipéptido incluye regiones de unión de regiones variables de
cadenas pesadas y ligeras, las cuales pueden asociarse intra-molecularmente para formar sitios de unión de
antı́genos (en contraste con los diacuerpos), porque el péptido enlace que une los dos dominios existentes
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en cada polipéptido es suficientemente largo, y (Fab)2 .
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Un procedimiento según la presente invención podrı́a ser realizado in vitro o in vivo, podrı́a ser un
protocolo de tratamiento de un individuo para una condición en la cual la captación de funciones efectoras mediadas por anticuerpos es, o es posible que sea, beneficioso. La administración a un individuo
podrı́a realizarse empleando cualquier técnica estándar, siendo los criterios de selección de una técnica,
y selección de dosificaciones, frecuencia de administración, etc., bien conocidos por los especialistas en el
tema. La administración de anticuerpos está descrita, por ejemplo, en Hale et al., 1988, Lancet II: 13941399; Simmons et al., 1994, Circulation 89: 596-603; y Riethmuller et al., 1994, Lancet 343: 1177-1183.
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In vitro, podrı́a hacerse uso de una sustancia unidora multiespecı́fica, tal como un anticuerpo biespecı́fico, tal como un diacuerpo, para redirigir anticuerpos hacia la captación funciones efectoras de
anticuerpos para tratar células o tejidos diana extraı́dos del paciente. Por ejemplo, podrı́a tomarse la
médula ósea extraı́da de un paciente con leucemia y las células podrı́an ser tratadas, ex vivo, con una sustancia unidora tal como un diacuerpo biespecı́fico dirigido contra un marcador especı́fico para las células
tumorales y una región constante de la inmunoglobulina IgG1, junto con anticuerpo IgG1 y complemento.
Las células tumorales serı́an entonces especı́ficamente lisadas y las células enteras que quedaran serı́an
tomadas y devueltas al paciente. Alternativamente, podrı́a emplearse la ADCC, la sustancia unidora (por
ejemplo, un diacuerpo) junto con IgG1 y una preparación de células asesinas se añadirı́a a las células de
la médula ósea para lisar las células tumorales antes de devolver las células restantes al paciente.
De forma similar, por ejemplo usando la lisis por complemento, la captación de la función efectora
podrı́a utilizarse en ensayos diagnósticos para obtener el número de células que expresan un determinado
marcador, por ejemplo, un antı́geno especı́fico para tumores, presente en una muestra de, por ejemplo,
sangre. El grado de lisis reflejarı́a el número de células presentes. Si se empleara una sustancia unidora
anti-IgM (por ejemplo, un diacuerpo) más IgM, el incremento en la lisis por complemento incrementarı́a
la sensibilidad para detectar un muy pequeño número de células tumorales que expresaran los marcadores
de superficie celular.
La mediación de una función efectora puede ser causada o permitida de acuerdo con las condiciones
bajo las cuales se opera la invención. Por ejemplo, in vitro la mediación podrı́a ser causada por la adición
en el medio de los componentes necesarios del sistema efector (por ejemplo, complemento). De todas
formas, en el suero, por ejemplo, todos los componentes necesarios para la función efectora podrı́an estar
presentes ab initio tanto in vitro como in vivo, permitiendo que la función efectora sea llamada una vez
que la sustancia unidora se ha unido a la diana y al anticuerpo.
Aún otro aspecto de la invención, proporciona el uso de una sustancia unidora multiespecı́fica en la
captación hacia una diana de una función efectora mediada por anticuerpo, teniendo la sustancia unidora
una especificidad de unión anti-anticuerpo y una especificidad de unión por la diana. Podrı́a hacerse
uso de la sustancia unidora multiespecı́fica en cualquier procedimiento proporcionado por la presente invención. Podrı́a hacerse uso en la fabricación de un medicamento para la captación de funciones efectoras
mediadas por anticuerpo, por ejemplo, para el tratamiento de una condición en la cual hay, o posiblemente haya, un beneficio (ver más arriba).
También se proporcionan en la presente invención, composiciones farmacéuticas que incluyen sustancias unidoras multiespecı́ficas como las descritas, y el uso de tales composiciones. Tales composiciones
farmacéuticas podrı́an incluir cualquier excipiente apropiado y farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención proporciona una sustancia unidora multiespecı́fica, por ejemplo
un “diacuerpo” (tal y como se ha expuesto) que tenga una especificidad de unión anti-anticuerpo (y una
especificidad de unión por la diana). Tal sustancia unidora multiespecı́fica tiene un sitio de unión con una
especificidad de unión anti-anticuerpo y un sitio de unión con una especificidad por la diana, e incluye
un multı́mero de polipéptidos, teniendo cada polipéptido un primer dominio que incluye una región de
unión de una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina, y un segundo dominio que
incluye una región de unión de una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, estando
formados los sitios de unión por la asociación de un primer dominio de un polipéptido en el multı́mero con
un segundo dominio de otro polipéptido en el multı́mero. En un diacuerpo, el primer dominio de cada polipéptido es incapaz de asociarse con el segundo dominio de ese polipéptido para formar un sitio de unión
del antı́geno. También se proporcionan en la invención las composiciones que incluyan tal multı́mero,
por ejemplo composiciones farmacéuticas que incluyan un excipiente farmacéuticamente aceptable. El
diacuerpo podrı́a ser un dı́mero de polipéptido.
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Además de la utilidad en los procedimientos y composiciones descritos supra, tales sustancias unidoras
multiespecı́ficas encuentran una utilidad en otro aspecto de la presente invención, a saber, un procedimiento general de apuntar o captar un anticuerpo hacia una diana para la cual el anticuerpo no tiene
especificidad de unión, tanto con o sin funciones efectoras asociadas. Por ejemplo, podrı́a emplearse un
diacuerpo multiespecı́fico (por ejemplo, biespecı́fico) en ensayos de aglutinación.
Las sustancias unidoras multiespecı́ficas tales como los diacuerpos preferidos (por ejemplo, biespecı́ficos) podrı́an emplearse en la coagulación de células, bacterias o virus, haciendo múltiples interacciones, ası́ como en ensayos de aglutinación de hematı́es, para determinar, por ejemplo, tipos de células
de la sangre. Los diacuerpos con un brazo dirigido contra una molécula de anticuerpo podrı́an usarse en
diferentes formatos para unir células entre ellas, tal y como se ilustra en la Figura 2.
Por ejemplo, podrı́a emplearse un diacuerpo, u otras sustancias unidoras multiespecı́ficas, que tuvieran
un brazo dirigido contra un antı́geno de superficie en una célula y otro dirigido contra IgM. La naturaleza
multivalente de IgM implica que dos o más moléculas de diacuerpo podrı́an unirse a la molécula de IgM
y ası́ unir diferentes células de la sangre entre ellas. Esta IgM podrı́a ser añadida como un reactivo
extra, o podrı́a ser posible utilizar la IgM presente en las muestras de sangre ensayadas, para promover
la aglutinación.
Un brazo podrı́a estar dirigido contra un antı́geno de superficie de una célula y el otro dirigido contra
un idiotipo comúnmente presente en moléculas de anticuerpo, tal como anticuerpos dirigidos contra elementos del gen DP-47 VH, un segmento de gen habitualmente usado en anticuerpos humanos (Tomlinson
et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 776-798). Las moléculas de IgM con este idiotipo serı́an particularmente
útiles.
25
Un brazo podrı́a estar dirigido contra isotipos, que no fueran la IgM, para su uso en ensayos de
aglutinación, aunque como estos otros anticuerpos son más pequeños, podrı́an ser menos efectivos en la
aglutinación de células.
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35
En cualquier realización de la presente invención, la diana puede ser cualquier antı́geno, por ejemplo,
de origen bacteriano, viral, fúngico, protozoico, o antı́geno en la superficie de la célula (por ejemplo,
células cancerosas), permitiendo la captación de las funciones efectoras naturales codificadas por anticuerpos hacia las dianas que presenten dichos antı́genos (por ejemplo, bacterias, virus, parásitos o células
tumorales) mediante una sustancia unidora multiespecı́fica la cual tiene especificidad de unión por el
antı́geno, y especificidad de unión anti-anticuerpo.
Otros aspectos de la invención serán obvios a personas especializadas en la técnica.
40
Los siguientes ejemplos ilustran como se pueden poner en práctica los principios aquı́ desvelados.
Aquellos que sean especialistas en el campo, fácilmente apreciarán modificaciones y variaciones que
podrı́an hacerse sin alejarse de la invención descrita aquı́.
Todos los documentos mencionados en el texto se incorporan aquı́ por referencia.
45
La Figura 1 ilustra el uso de un diacuerpo biespecı́fico para redirigir un anticuerpo tal como IgG1 o
IgM hacı́a el marcador en la superficie de la célula, disparando el complemento.
50
La Figura 2 ilustra la aglutinación de hematı́es usando un diacuerpo biespecı́fico dirigido contra un
antı́geno de hematı́e y un anticuerpo, tal como IgM con dos o más epı́topos idénticos. Una molécula de
diacuerpo se une al antı́geno del hematı́es y a la molécula de IgM. Una segunda molécula de diacuerpo
se une a la misma molécula de IgM y entonces se une a un antı́geno en un segundo hematı́e, por tanto,
uniéndolos entre ellos y agregando los hematı́es.
Ejemplo 1
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Preparación y caracterización de un diacuerpo biespecı́fico anti-2-feniloxazol-5-ona, anti-cadena ligera
lamdba de ratón.
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Se preparó un clon que codificaba un diacuerpo biespecı́fico dirigido contra la 2-fenil-5-oxazolona y
la cadena ligera 1 de ratón, con un eslabón de cero aminoácidos, a partir de DNA que codificaba un
anticuerpo contra la 2-fenil-5-oxazolona derivado del hibridoma NQ11 (anti-2-feniloxazol-5-ona; C. Brees
et al., 1985, Nature 316: 412-418; P. Holliger et al. supra) y a partir de DNA derivado de un hibridoma
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LS136 dirigido contra la cadena ligera lamdba del ratón, usando la metodologı́a esencialmente descrita en
el ejemplo 1 de WO 94/13804. El diacuerpo bivalente dirigido contra la cadena ligera lambda del ratón
se preparó como paso intermedio.
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LS136 es un hibridoma múrido dirigido contra las cadenas ligeras del anticuerpo 1 de ratón. Ha sido
clonado en un formato diacuerpo usando un eslabón de 5 residuos en la orientación VH-GGGGS-VL en el
vector de fago pUC119SfiNotmyc. La secuencia del eslabón se incorporó en el primer VkCbaLink5BstEII
y primer 4 (Tabla 1) usado para amplificar el extremo 5’ de VK. El primer 4 también introduce un
sitio de restricción SacI en el extremo 5’ de VK. Un sitio de restricción para BstEII se incorporó en el
extremo 5’ de la secuencia eslabón del primer VkCbaLink5BstEII y primer 4, y también en el extremo
3’ de VH1FOR-2 (E. S. Ward, D. Gussow, A. D. Griffiths, P. D. Jones and G. Winter, 1989, Nature 341:
544-546). Esto podrı́a permitir clonar los fragmentos VH y eslabón-VL en el vector pUC119SfiNotmyc
con una reacción de ligación de 3 pasos.
El RNA se extrajo de células de hibridoma LS136 y usado para preparar cDNA. Se amplificó el DNA
del dominio VH y VL de LS136 mediante PCR a partir de cDNA usando respectivamente los pares de
primers VH3Aba y VH1FOR-2, y VkCbaLink5BstEII y VK4FOR (T. Clackson, H. R. Hoogenboom, A.
D. Griffiths y G. Winter, 1991, Nature 352: 624-628), utilizando condiciones estándar, y se reamplificó
usando VH3AbaSfi y VH1for-2 (para VH) y el primer 4 (P. Holliger et al. supra) y Vk4foNot (para VK).
El producto de la reacción CH PCR fue digerido con los enzimas NotI y BstEII. El DNA de los dominios
VH y VL se ligó simultáneamente en pUC119SfiNotmyc digerido con SfiI/NotI en una relación molar
3:3:1 (VH:VL:pUC119SfiNotmyc o pCantab6) y la mezcla de ligación resultante se usó para transformar
células TG1 de E. coli. El DNA de los dominios VH y VL también se ligó con el vector pCANTAB6
digerido con Sfi/Not de la misma forma, y se transformó en células HB2151 de E. coli. Los recombinantes
fueron revisados en busca de insertos del tamaño correcto usando los primers LMB2 y LMB3 para los
recombinantes con vector pUC119SfiNotmyc, o LMB3 y fdSeq para los recombinantes con el pCANTAB6.
Expresión del diacuerpo LS136.
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El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento del clon pUC119SfiNotmyc a 37◦ C. Se indujeron
células en fase de crecimiento exponencial en 2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina mediante
la adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM IPTG y cultivadas durante 3 horas a 22◦ C.
Las células se centrifugaron (1000 g, 10 minutos) y se resuspendió el precipitado de células en 100 µl de
PBS/1 mM EDTA enfriado en hielo, dejándose en hielo durante 60 minutos. Se centrifugó la suspensión
de células (1000 g durante 10 minutos) y se usó el sobrenadante conteniendo el diacuerpo en un ELISA
como se detalla más abajo.
Se añadieron 50 µl de sobrenadante periplasmático y 50 µl de 3 % BSA/PBS a pocillos de ELISA
recubiertos con IgMλ de ratón o IgG2aλ de ratón (ambas de Sigma) (10 µg ml−1 en PBS), bloqueados
con 3 % BSA/PBS. Se siguió un protocolo de ELISA estándar (H. R. Hoogenboom et al., 1991, Nucl.
Acid Res. 19: 4133-4137) utilizando detección del myc-tag con el anticuerpo monoclonal 9E10, e IgG
anti-ratón (para IgMλ) conjugada con peroxidasa de rábano silvestre, y cadena κ anti-ratón y complejo
peroxidasa-biotina-streptavidina (ambos de Amersham) (para IgG2aλ1). Las lecturas de ELISA después
de 10 minutos fueron mayores que 1,0.
45
Construcción de un diacuerpo biespecı́fico Ls136/NQ11/5 y diacuerpo biespecı́fico LS136/NQ11/0.
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Se combinaron las dos especificidades de anticuerpos, LS136 (cadena ligera λ del anticuerpo antiratón) y NQ11 (anti-phOx), en un formato diacuerpo biespecı́fico fusionando VH y VL con un eslabón
de 5 aminoácidos VH-GGGGS-VL o directamente con un enlace 0 en la orientación VH-VL en el vector
fagémido pUC119SfiNotmyc. Se incorporó la secuencia eslabón en los primers 4 y 3 (Tabla 1) usados
para amplificar el extremo 5’ de Vk, y en los primers 7 y 6 (Tabla 1) usados para amplificar el extremo
3’ de VH. Se incorporó un sitio de restricción para BstEII en posición 5’ respecto la secuencia eslabón
del primer 3, y se incorporó un sitio de restricción para SacI en posición 5’ respecto la secuencia eslabón
del primer 6. Esto permitirı́a que los fragmentos ensamblados VH-eslabón y eslabón-VL fueran clonados
en una reacción de ligación de 3 pasos dentro del vector de expresión pUC19LS136/5 BstEII/SacI.
Construcción del diacuerpo biespecı́fico LS136/NQ11/5 (eslabón de 5 aminoácidos).
60
Se amplificó VHNQ11 con los primers 2 y 7 (Tabla 1), VkNQ11 fue amplificado con los primers 1 y
4 usando scFvNQ11 clonado en fdDOG-1 como plantilla. El producto de la reacción de PCR de VH se
digerió con los enzimas de restricción AscI y SacI, y el producto de la reacción de PCR de VL se digerió
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con los enzimas de restricción AscI y BstEII. Se cortó un fragmento del diacuerpo LS136/5 (ver más
arriba) con BstEII/SacI, y el DNA de los dominios VH y VL fue simultáneamente ligado con éste en una
relación molar 3:3:1 (VH:VL:pUC119-LS136/5). La mezcla de ligación resultante se usó para transformar
células E. coli TG1. Los recombinantes fueron revisados en busca de insertos del tamaño correcto usando
los primers LMB2 y LMB3 para amplificación con PCR de las colonias recombinantes.
Construcción del diacuerpo biespecı́fico LS136/NQ11/0 (eslabón de cero aminoácidos).
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VHNQ11 fue amplificado con los primers 2 y 6 (Tabla 1), VkNQ11 fue amplificado con los primers
1 y 3 usando como plantilla scFvNQ11 clonado en fdDOG-1. El producto de la reacción de PCR de
VH se digerió con los enzimas de restricción AscI y SacI, y el producto de la reacción de PCR de VL
se digerió con los enzimas de restricción AscI y BstEII. Se cortó un fragmento del diacuerpo LS136/5
(ver más arriba) con BstEII/SacI, y el DNA de los dominios VH y VL fue simultáneamente ligado con
éste en una relación molar 3:3:1 (VH:VL:pUC119-LS136/5). La mezcla de ligación resultante se usó para
transformar células E. coli TG1. Los recombinantes fueron revisados en busca de insertos del tamaño
correcto usando los primers LMB2 y LMB3 para amplificación con PCR de las colonias recombinantes.
Expresión del diacuerpo biespecı́fico LS136/NQ11/5 y diacuerpo biespecı́fico LS136/NQ11/0.
20
25
El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento a 37◦ C. Se indujeron células en fase exponencial
en 2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina mediante la adición de IPTG hasta una concentración
final de 1 mM IPTG y se cultivaron durante 3 horas a 22◦ C. Las células se centrifugaron (1000 g, 10
minutos) y se resuspendió el precipitado de células en 100 µl de PBS/1 mM EDTA enfriado en hielo, y
se dejó en hielo durante 60 minutos. Se centrifugó la suspensión de células (1000 g durante 10 minutos)
y se usó el sobrenadante conteniendo el diacuerpo en un ELISA para cadena ligera λ como más arriba, o
para phOx como en el ejemplo 1 de WO 94/13804. Las lecturas de ELISA después de 10 minutos fueron
mayores que 1,0.
Ejemplo 2
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Preparación y caracterización de un diacuerpo biespecı́fico anti-lisozima de huevo de gallina y anti-cadena
ligera lambda de ratón, y demostración de lisis por complemento.
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Se preparó un clon codificante de un diacuerpo biespecı́fico dirigido contra lisozima de huevo de gallina
(HEL) y la cadena ligera λ de ratón, con un eslabón de cinco y cero aminoácidos, a partir de DNA codificante de un fragmento de anticuerpo de cadena simple Fv contra el lisozima de huevo de gallina (HEL)
derivado de los genes V del anticuerpo anti-HEL HyHEL10 (T. B. Lavoie, W. B. Drohan y S. J. SmithGill, 1992, J. Immunol. 148: 503-513; obsequio de Sandra Smith-Gill) y a partir de DNA derivado de un
hibridoma LS136 dirigido contra una cadena ligera lambda de ratón usando la metodologı́a esencialmente
descrita en el ejemplo 1 y en P. Holliger et al. (1993, supra). Se usó un diacuerpo bivalente dirigido contra
la cadena ligera lambda de ratón, descrito esencialmente en el ejemplo 1, como paso intermedio.
Se preparó DNA codificante de los dominios VH y VL del diacuerpo y se digerió exactamente tal
y como se describe en el ejemplo 1 de Wo 94/13804. El DNA de los dominios VH y VL se ligó simultáneamente en pCANTAB5-E (Pharmacia) digerido con SfiI/NotI, en una relación molar 3:3:1, y la
mezcla de ligación resultante se usó para transformar células E. coli HB2151. Los recombinantes fueron
revisados en busca de insertos del tamaño correcto usando los primers fdSeq y LMB3.
Expresión del diacuerpo LS136.
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60
El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento a 37◦ C. Se indujeron células en fase de crecimiento exponencial en 2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina mediante la adición de IPTG
hasta una concentración final de 1 mM IPTG y se cultivaron durante 3 horas a 22◦ C. Las células se
centrifugaron (1000 g, 10 minutos) y se resuspendió el precipitado de células en 100 µl de PBS/1 mM
EDTA enfriado en hielo, y se dejó en hielo durante 60 minutos. Se centrifugó la suspensión de células
(1000 g durante 10 minutos) y se usó el sobrenadante conteniendo el diacuerpo en un ELISA como se
detalla más abajo.
Se añadieron 50 µl de sobrenadante periplasmático y 50 µl de 3 % BSA/PBS a pocillos de ELISA
recubiertos con IgMλ de ratón o IgG2aλ de ratón (ambas de Sigma) (10 µg ml−1 en PBS), bloqueados con
3 % BSA/PBS. Se siguió un protocolo de ELISA estándar (H. R. Hoogenboom et al., 1991, Nucl. Acid
Res. 19: 4133-4137) utilizando detección del E-tag con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag conjugado
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con HRP (Ray Mernaugh, Pharmacia). Las lecturas de ELISA después de 10 minutos fueron mayores
que 1,0.
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Construcción del diacuerpo
LS136/HyHEL10/0.
biespecı́fico
LS136/HyHEL10/5
y
del
diacuerpo
biespecı́fico
Se combinaron las dos especificidades de anticuerpos, LS136 (anti-cadena ligera λ de ratón) y HyHEL10NQ11 (anti-lisozima), en el formato diacuerpo biespecı́fico fusionando los dominios VH y VL con
un eslabón de 5 aminoácidos VH-GGGGS-VL o directamente con un enlace 0 en la orientación VH-VL
en el vector fagémido pCANTAB5-E (Pharmacia). La secuencia eslabón se incorporó en los primers 3
y 4 (Tabla 1) usados para amplificar el extremo 5’ de Vk, y en los primers 6 y 7 (Tabla 1) usados para
amplificar el extremo 3’ de VH. Se incorporó un sitio de restricción para BstEII en posición 5’ respecto
la secuencia eslabón de los primers 3 y 4, y se incorporó un sitio de restricción para SacI en posición 5’
respecto la secuencia eslabón de los primers 6 y 7. Esto permitirá que los fragmentos ensamblados VHeslabón y eslabón-VL sean clonados dentro del vector de expresión pCANTAB5-E LS136/ 5 BstEII/SacI
con una reacción de ligación de 3 pasos.
Construcción del diacuerpo biespecı́fico LS136/HyHEL10/5 (eslabón de 5 aminoácidos).
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Se amplificó VHHyHEL10 con los primers 2 y 7 (Tabla 1), y VkHyHEL10 fue amplificado con los
primers 1 y 4 para el diacuerpo con eslabón de 5 aminoácidos LS136/HyHEL10/5 usando scFvHyHEL10
clonado en pUC119 como plantilla. El producto de la reacción de PCR de VH se digerió con los enzimas
de restricción AscI y SacI, y el producto de la reacción de PCR de VL se digerió con los enzimas de restricción AscI y BstEII. Se cortó un fragmento del diacuerpo LS136/5 (ver más arriba) con BstEII/SacI,
y el DNA de los dominios VH y VL fue simultáneamente ligado con éste en una relación molar 3:3:1
(VH:VL:pCANTAB5-E LS136/5). La mezcla de ligación resultante se usó para transformar células E.
coli HB2151. Los recombinantes fueron revisados en busca de insertos del tamaño correcto usando los
primers fdSeq y LMB3 para amplificación con PCR de las colonias recombinantes.
30
Construcción del diacuerpo biespecı́fico LS136/NHyHEL10/0 (eslabón de cero aminoácidos).
35
VHNQ11 fue amplificado con los primers 2 y 6 (Tabla 1), VkNQ11 fue amplificado con los primers
1 y 3 usando como plantilla scFvHyHEL10 clonado en pUC119. El producto de la reacción de PCR de
VH se digerió con los enzimas de restricción AscI y SacI, y el producto de la reacción de PCR de VL se
digerió con los enzimas de restricción AscI y BstEII. Se cortó un fragmento del diacuerpo LS136/5 (ver
más arriba) con BstEII/SacI, y el DNA de los dominios VH y VL fue simultáneamente ligado con éste en
una relación molar 3:3:1 (VH:VL:pCANTABL5-E LS136/5). La mezcla de ligación resultante se usó para
transformar células E. coli HB2151. Los recombinantes fueron revisados en busca de insertos del tamaño
correcto usando los primers fdSeq y LMB3 para amplificación con PCR de las colonias recombinantes.
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Expresión del diacuerpo biespecı́fico LS136/HyHEL10/5 y del diacuerpo biespecı́fico LS136/HyHEL10/0.
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El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento a 37◦ C. Células en fase log de crecimiento en
2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina fueron inducidas mediante la adición de IPTG hasta
una concentración final de 1 mM IPTG y cultivadas durante 3 horas a 22◦C. Las células se centrifugaron
(1000 g, 10 minutos) y se resuspendió el precipitado de células en 100 µl de PBS/1 mM EDTA enfriado
en hielo, y se dejó en hielo durante 60 minutos. Se centrifugó la suspensión de células (1000 g durante 10
minutos) y el sobrenadante conteniendo el diacuerpo se usó en un ELISA para la cadena ligera λ como se
detalla más arriba o para lisozima de huevo de gallina como en P. Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 6444-6448). Después de 10 minutos se obtuvieron lecturas de ELISA mayores que 1,0.
Expresión del diacuerpo LS136/HyHEL10/5 para purificación y ensayo de lisis por complemento.
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El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento a 37◦ C. Se indujeron células en fase de crecimiento exponencial en 2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina mediante la adición de IPTG
hasta una concentración final de 1 mM IPTG y se cultivaron durante 24 horas a 22◦ C. Las células se
centrifugaron (1000 g durante 10 minutos), el precipitado de células se resuspendió, y el sobrenadante
se filtró a través de un filtro de 0,16 µm y concentrado mediante filtración de flujo-cruzado (cross-flow
filtration) (filtro con punto de corte de 10 kD). El concentrado se purificó en un columna de afinidad
HEL-Sepharosa. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS, 5 volúmenes de columna de
0,5 M NaCl/0,1 mM Tris, pH 8,5 y la proteı́na fue eluida con trietilamina 100 mM diluida en Tris 1 M
enfriado con hielo, pH 7,5, y dializada extensivamente frente a PBS/0,2 mM EDTA.
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Ensayo de lisis por complemento.
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Se determinó la capacidad del diacuerpo LS136/HyHEL10/5 para redirigir anticuerpos y utilizar sus
funciones efectoras usando un ensayo de lisis por complemento.
Preparación de hematı́es recubiertos de lisozimas.
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Para esta técnica se emplearon hematı́es humanos (RBCs, red blood cells). Una vez que se hubo
retirado y descartado el recubrimiento pulido de los hematı́es, estos fueron lavados, centrifugados y resuspendidos en PBS cuatro veces, descartándose cada vez el sobrenadante. Fue importante no mezclar
células de diferentes grupos sanguı́neos antes de este paso de lavado. Después del lavado y centrifugado
final, las RBCs precipitadas se recubrieron con proteı́na mezclando las RBCs, la solución de recubrimiento
con proteı́na (10 mg/ml de lisozima en PBS), y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC, 100
mg/ml en PBS) en la relación 1:4:1 (v/v). Esta mezcla se agitó en una plataforma rotatoria a 4◦ C durante
1,5 horas, transcurridas las cuales se centrifugaron las RBCs, se retiró el sobrenadante y se descartó. A
continuación, las células fueron lavadas 5 veces en aproximadamente 10 ml de PBS (hasta que ya no hubo
más hemólisis) y, entonces, fueron resuspendidas en un volumen final de 10 ml PBS listas para su uso.
Ensayo de lisis por complemento.
Los hematı́es recubiertos con 10 mg/ml HEL se lavaron tres veces en solvente de fijación del complemento (Oxoid, Basingstoke), y se añadieron 50 µl de una suspensión al 1 % a pocillos de una placa
de microtitración con 96 pocillos. Las diluciones del diacuerpo LS136/HyHEL10/5 purificado (desde 1
mg/ml hasta 10 ng/ml, 50 µl) se añadieron e incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las
células fueron precipitadas mediante centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5 minutos, y el sobrenadante se
descartó. La células se resuspendieron en diluciones de una inmunoglobulina IgM con una cadena ligera
lambda (IgMλ) que no es especı́fica para un antı́geno presente en el ensayo (Mieloma MOPC 104E), y
se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron precipitadas una vez más
mediante centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. En este punto,
el precipitado de células se lavó una vez con el disolvente de fijación del complemento, y las células se
precipitaron otra vez, se resuspendieron en una dilución 1 en 20 de complemento de conejillo de indias
(preparado a partir de suero de conejillos de indias, después de aglutinar los hematı́es), y se incubaron
durante 30 minutos a 37◦C. Los restos celulares se precipitaron mediante centrifugación a 4000 r.p.m.
durante 5 minutos, el sobrenadante se transfirió a otra placa de microtitración, y se leyeron las absorbancias a 405 nm.
Se encontró que el grado de lisis titulaba con ambas diluciones, la del diacuerpo LS136/HyHEL10/5
y la de IgMλ Mieloma MOPC 104E. Se encontró que una combinación de 50 µg/ml de IgMλ y 10 ng/ml
de diacuerpo causaba un 50 % del máximo de lisis de hematı́es recubiertos de HEL. No se observó lisis
(aparte de los niveles de lisis de fondo) al usar hematı́es no recubiertos o recubiertos con phOx-BSA, o
al no incluir el diacuerpo o la IgMλ.
Se obtuvieron resultados similares cuando se determinó la capacidad del diacuerpo para redirigir
IgG2aλ y anticuerpos de suero completo empleando el ensayo de lisis por complemento. Se realizó
el mismo ensayo estándar usando 50 ng/ml del diacuerpo LS136/HyHEL10/5 y una inmunoglobulina
IgG2a con una cadena ligera lambda (IgG2aλ) que no es especı́fica para el antı́geno presente en el ensayo
(Mieloma HOPC-1, 100 µg/ml). En este caso, se encontró que el diacuerpo dirigı́a eficientemente la
hemólisis inducida por complemento.
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El ensayo de complemento también se realizó mezclando simplemente hematı́es recubiertos de antı́geno,
diacuerpo, y IgMλ en un volumen de 150 µl de complemento de conejillo de indias, diluida 1/5 en disolvente de fijación de complemento. Una vez más, se observó hemólisis eficiente después de una incubación
a 37◦ C durante 30 minutos. En ausencia del diacuerpo, este ensayo resultó en cierto nivel de fondo de
hemólisis.
Por tanto, concluimos que el diacuerpo es efectivo para redirigir funciones efectoras de anticuerpos
correspondientes a anticuerpos no especı́ficos para el antı́geno hacia células que tienen el antı́geno en su
superficie.
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Ejemplo 3
Preparación y caracterización de un diacuerpo anti-CEA, anti-cadena ligera lambda de ratón, y demostración de la lisis mediada por complemento de una célula tumoral.
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Se preparó un clon codificante para un diacuerpo biespecı́fico dirigido contra antı́geno carcinoembriónico (CEA) y la cadena ligera λ de ratón, y con un eslabón de cinco aminoácidos, a partir de DNA
que codificaba las regiones variables derivadas del anticuerpo múrido anti-CEA MFE23, el cual se une
al antı́geno carcinoembriónico (CEA), antı́geno especı́fico de tumor, y a partir del DNA derivado del
hibridoma LS136, dirigido contra la cadena ligera lambda de ratón, usando la metodologı́a esencialmente
descrita en el ejemplo 1 y en P. Holliger et al. (1993, supra). El diacuerpo bivalente dirigido contra la
cadena ligera lambda de ratón descrito en los ejemplos 1 y 2 se usó como paso intermedio en la construcción.
Construcción de un diacuerpo biespecı́fico LS136/MFE23/5.
Se combinaron las dos especificidades de anticuerpos, LS136 (anti-cadena ligera λ de ratón) y MFE23
(anti-CEA), en el formato diacuerpo biespecı́fico fusionando los dominios VH y VL con un eslabón de 5
aminoácidos VH-GGGGS-VL en el vector pCANTAB5-E (Pharmacia). La secuencia eslabón se incorporó
en el primer 4, usado para amplificar el extremo 5’ de Vk, y en el primers 7, usado para amplificar el
extremo 3’ de VH. Se incorporó un sitio de restricción para BstEII en posición 5’ respecto la secuencia
eslabón del primer 4, y se incorporó un sitio de restricción para SacI en posición 5’ respecto la secuencia
eslabón del primer 7. Esto permitirá que los fragmentos ensamblados VH-eslabón y eslabón-VL sean clonados dentro del vector de expresión pCANTAB5-E LS136/5 BstEII/SacI con una reacción de ligación
de 3 pasos.
El clon MFE23 anti-CEA scFV descrito en PCT/GB93/02492 se mutó primero para retirar un sitio
interno para BstEII en el dominio VL mediante mutagénesis in vivo usando el oligonucleótido CEA23BstE (Tabla 1) y el Sculptor Kit (Amersham International). Se amplificó VHMFE23 con los primers
2 y 7 (Tabla 1) y VkMFE23 con los primers 1 y 4 para el diacuerpo con eslabón de 5 aminoácidos
LS136/MFE23/5, usando como plantilla el MFE23 anti-CEA scFv mutado. El producto de la reacción
de la PCR del VH fue digerido con los enzimas de restricción AscI y SacI, y el producto de la reacción de
la PCR de VL se digerió con los enzimas AscI y BstEII. El vector de DNA pCANTAB-5E, que codificaba
el diacuerpo LS136/5 (ver más arriba) se cortó con BstEII/SacI, y el DNA de los dominios VH y VL fue
simultáneamente ligado con éste en una relación molar 3:3:1 (VH:VL:pCANTAB5-E LS136/5). La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células E. coli HB2151. Los recombinantes fueron
revisados en busca de insertos del tamaño correcto usando los primers fdSeq y LMB3 para amplificación
con PCR de las colonias recombinantes. A continuación, los fragmentos SfiI-NotI que codificaban el
diacuerpo fueron subclonados en el vector pUC119 SfiNot-hismyc para su expresión.
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Expresión del diacuerpo biespecı́fico LS136/MFE23/5.
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El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento a 37◦ C. Células en fase log de crecimiento en
2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina fueron inducidas mediante la adición de IPTG hasta
una concentración final de 1 mM IPTG y cultivadas durante 3 horas a 22◦C. Las células se centrifugaron
(1000 g durante 10 minutos) y se resuspendió el precipitado de células en 100 µl de PBS/1 mM EDTA
enfriado en hielo, y se dejó en hielo durante 60 minutos. Se centrifugó la suspensión de células (1000
g durante 10 minutos) y el sobrenadante conteniendo el diacuerpo se usó en un ELISA para la cadena
ligera λ, como en los ejemplos 1 y 2, o para CEA tal y como se describe en A. D. Griffiths et al., 1993,
EMBO J. 12: 725-734. Después de 10 minutos se obtuvieron lecturas de ELISA mayores que 1,0.
Expresión del diacuerpo LS136/MFE23/5 para su purificación y ensayo de lisis por complemento.
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El diacuerpo soluble se expresó mediante crecimiento a 37◦ C. Se indujeron células en fase de crecimiento exponencial en 2 ml 2YT/0,1 % glucosa/100 µg ml−1 ampicilina mediante la adición de IPTG
hasta una concentración final de 1 mM IPTG y cultivadas durante 24 horas a 22◦C. Las células se centrifugaron (1000 g durante 10 minutos), el precipitado de células se resuspendió, y el sobrenadante se filtró
a través de un filtro de 0,16 µm y concentrado mediante filtración de flujo-cruzado (cross-flow filtration)
(filtro con punto de corte de 10 kD). El concentrado se purificó usando cromatografı́a de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) usando agarosa-NTA-niquel (Qiagen, número de catálogo 30210) siguiendo
las instrucciones del fabricante, y dializado extensivamente frente a PBS/EDTA.
12
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Ensayo de lisis por complemento.
La capacidad del diacuerpo LS136/MFE23/5 para redirigir anticuerpos y utilizar sus funciones efectoras se determinó mediante un ensayo de lisis por complemento usando la liberación de cromo (51 Cr).
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Se recolectaron 2x106 células diana LS 174T (ATCC CL 188, patente US-4288236) después de desprenderlas, y se lavaron con medio RPMI 1640 conteniendo un 10 % de suero fetal bovino. Después de
centrifugarlas, se marcó el precipitado de células con 51 Cr (200 µCi) durante 1 hora a 37◦C. Después de
2 lavados con medio RPMI 1640, las células diana (5000 células por ensayo) fueron repartidas en pocillos
de cultivo.
Las diluciones del diacuerpo LS136/HyHEL10/5 purificado (desde 1 mg/ml hasta 10 ng/ml, 50 µl)
se añadieron e incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron precipitadas
mediante centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5 minutos, y el sobrenadante se descartó. La células se
resuspendieron en diluciones de una inmunoglobulina IgM con una cadena ligera lambda (IgMλ) que no
es especı́fica para un antı́geno presente en el ensayo (Mieloma MOPC 104E), y se incubaron durante 20
minutos a temperatura ambiente. Las células fueron precipitadas una vez más mediante centrifugación
a 2000 r.p.m. durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. En este punto, el precipitado de células
se lavó una vez con el disolvente de fijación del complemento, y las células se precipitaron otra vez, y
se resuspendieron en una dilución 1 en 20 de complemento de conejillo de indias (preparado a partir de
suero de conejillos de indias, después de aglutinar los hematı́es), y se incubaron durante 30 minutos a
37◦C. Los restos celulares se precipitaron mediante centrifugación a 4000 r.p.m. durante 5 minutos, el
sobrenadante se transfirió a otra placa de microtitración. Las células se centrifugaron y la mitad del
sobrenadante (100 µl) se recogió, determinándose la liberación de cromo en un contador gamma. Cada
punto de la muestra se procesó por triplicado y el porcentaje de lisis especı́fica se calculó como,
100 x
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(media de liberación en la muestra - liberación espontánea)
(liberación máxima - liberación espontánea)
La liberación espontánea se midió en células diana en medio de ensayo tan sólo, y la liberación máxima
se midió después de la lisis de un número equivalente de células diana en 1 M HCl.
Se encontró que el nivel de lisis titraba con ambas diluciones, de diacuerpo LS136/MFE23/5 y de
IgMλ de Mieloma MOPC104E. No se observó lisis (aparte de niveles de fondo de lisis) cuando no se
incluyó bien el diacuerpo o la IgMλ, o usando un control de hematı́es recubiertos con phOx-BSA en lugar
de las células tumorales.
Ejemplo 4
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Lisis de una célula tumoral por citotoxicidad mediada por células y dirigida por anticuerpos, dirigida por
un diacuerpo dirigido contra CEA y con una cadena ligera lambda de ratón.
La ADCC es una función efectora natural codificada por antibióticos, que se lleva a cabo a través de
la unión de regiones Fc de un anticuerpo a receptores de Fc. Las células envueltas por los anticuerpos
son destruidas a través de la lisis por un cierto número de células mononucleares.
Las células mononucleares se aislaron a partir de bazo de ratones Balb/c en un gradiente de Ficoll,
y se cultivaron durante 3 dı́as en medio RPMI (Russel Park Memorial Institute)/10 % suero fetal bovino
(FCS) a 37◦ C en frascos de cultivo pretratados con el anticuerpo mitogénico anti-CD3 (por ejemplo,
2C11 a 50µg/ml en PBS durante 24 horas, y lavado 4 veces con PBS para retirar los anticuerpos no
unidos). A continuación, se transfirieron a frascos no tratados durante 3-7 dı́as para que se expandieran,
en RPMI/5 % FCS y 10 unidades/ml de interleucina 2 (IL-2) recombinante, a 37◦ C.
Se recolectaron 2x106 células diana LS 174T (ATCC CL 188, patente US-4288236) después de desprenderlas, y se lavaron con medio RPMI 1640 conteniendo un 10 % de suero fetal bovino. Después de
centrifugarlas, se marcó el precipitado de células con 51 Cr (200 µCi) durante 1 hora a 37◦C. Después de
2 lavados con medio RPMI 1640, las células diana (5000 células por ensayo) fueron repartidas en pocillos
de cultivo.
Las diluciones del diacuerpo LS136/HyHEL10/5 purificado (desde 1 mg/ml hasta 10 ng/ml, 50 µl)
se añadieron e incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron precipitadas
mediante centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5 minutos, y el sobrenadante se descartó. La células se
resuspendieron en diluciones de una inmunoglobulina IgG1 con una cadena ligera lambda (IgG1λ) que no
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es especı́fica para un antı́geno presente en el ensayo (Mieloma 3C52’CL anti-4-hidroxi-3-fenilacetil (NIP)),
y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron precipitadas una vez más
mediante centrifugación a 2000 r.p.m. durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante.
5
Las células K se lavaron para retirar la IL-2 y se añadieron para obtener relaciones efector:diana
(células K:LS174T) entre 50:1 y 10:1, y se incubaron durante 4 h a 37◦ C. Las células se centrifugaron y la
mitad del sobrenadante (100 µl) se recogió, determinándose la liberación de cromo (51 Cr) en un contador
gamma. Cada punto de la muestra se procesó por triplicado y el porcentaje de lisis especı́fica se calculó
como,
10
100 x
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(media de liberación en la muestra - liberación espontánea)
(liberación máxima - liberación espontánea)
La liberación espontánea se midió en células diana en medio de ensayo tan sólo, y la liberación máxima
se midio después de la lisis de un número equivalente de células diana en 1 M HCl. Se encontró que el nivel
de lisis titraba con ambas diluciones, de diacuerpo LS136/MFE23/5 y de IgG1λ de Mieloma 3C52’CL.
No se observó lisis (aparte de niveles de fondo de lisis) cuando no se incluyó bien el diacuerpo o la IgG1λ,
o usando un control de hematı́es recubiertos con phOx-BSA en lugar de las células tumorales.
Por tanto, el diacuerpo puede redirigir la actividad ADCC, disparada por el anticuerpo IgG1λ, hacia
células tumorales que codifiquen un antı́geno hacia el cual se dirige uno de los brazos del diacuerpo.
Ejemplo 5
25
Redireccionamiento in vivo de anticuerpos para intervenir en la velocidad de recambio de la lisis.
El diacuerpo biespecı́fico LS136/MFE23/5 es útil para el tratamiento de un adenocarcinoma LS174T
xenografiado con CEA+ , e implantado en un ratón “desprotegido” (nude mice).
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El ratón “desprotegido” carece de células T, y permite el crecimiento de tumores humanos xenografiados. No obstante, sı́ que tiene células B normales y niveles normales de Ig en suero, y muestran respuestas
inmunes independientes de T normales, por ejemplo, algunas respuestas de ciertos anticuerpos.
Se expresó y purificó un diacuerpo para su aplicación in vivo tal y como se ha descrito en el ejemplo
3, que fue adicionalmente purificado en una columna de exclusión SuperdexT M 16/60 de Pharmacia para
retirar endotoxinas (LPS).
Los ratones “desprotegidos” Balb/c se inyectaron (por ejemplo vı́a i.v.) con un número significativo
de células tumorales LS147T (por ejemplo, 5000) en un dı́a, y se trataron con una o varias inyecciones
i.v. conteniendo la cantidad deseada de diacuerpo (por ejemplo, 100 µg) en tampón fosfato (PBS) algún
momento posterior en el tiempo. En esta diseño experimental, la Ig en suero está en exceso respecto el
diacuerpo y, en consecuencia, la mayor parte de las Ig tan sólo complejará con un diacuerpo.
En un protocolo alternativo, más de un diacuerpo se compleja con cualquier especie de Ig presente en
el suero, con objeto de sacar partido de la elevada avidez de unión por el antı́geno diana. Esto podrı́a
realizarse mediante incubación con Ig de suero antes de la inyección. La retirada de una cantidad conveniente de suero del ratón (por ejemplo, 100 µl, la concentración total de Igλ en ratón Balb/c intacto
es menor que 1 mg/ml) es seguida por la adición de la cantidad deseada de diacuerpo (por ejemplo, 100
µg) en tampón fosfato (PBS), por la mezcla e incubación in vitro del suero y diacuerpo, para permitir
que el diacuerpo una Ig de suero antes de su reinfusión en el ratón.
El diacuerpo biespecı́fico LS136/MFE23/5 apunta a las Ig que llevan una cadena ligera λ, y que
suponen menos de un 5 % de las Ig totales en suero. No obstante, el nivel de Igλ en suero pueden ser
aumentado enormemente por inmunización con ciertos antı́genos que elicitan respuestas independientes
de las células T, por ejemplo, dextrano. La eficiencia de los regı́menes de tratamiento (tal y como se
describen más arriba) podrı́a ser incrementada si los niveles de Igλ se inflaran de esta forma antes de la
administración del diacuerpo.
Vale la pena destacar que, también en este caso, las especificidades de los anticuerpos no están dirigidas
contra el antı́geno diana ya que la inmunización se realiza con antı́genos irrelevantes.
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TABLA 1
Oligonucleótidos utilizados
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VH3AbaSfi
5’--CAT GCC ATG ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC
CSA GGT GAA GCT GGT GGA RTC TGG--3’
VKCbaLink5BStE
5’--GAG CCA TCA ATC GAT CTG GTC ACC GTC TCC TCA
GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GTG CTR ACC CAG TCT
CCA--3’
Primer 1
5’--GAC TCA TTC TCG ACT GAG CTC ACT TGG CGC GCC
TTA TTA CCG TTT GAT CTC GAG CTT GGT CCC--3’
Primer 2
5’--GTC CTC GCA ACT GGC GCG CCA CAA TTT CAC AGT
AAG GAG GTT TAA CTT GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA
ATT--3’
25
Primer 3
5’--GAG CCA TCA ATC GAT CTG GTC ACC GTC TCC TCA
GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA--3’
30
Primer 4
5’--GAG CCA TCA ATC GAT CTG GTC ACC GTC TCC TCA
GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT
CCA--3’
Primer 6
5’--GAG CCA TCA ATC TCG GAG CTC GAT GTC TGA GGA
GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC--3’
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Primer 7
5’--GAG CCA TCA ATC TCG GAG CTC GAT GTC CGA TCC
GCC ACC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG
GCC CC--3’
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fdSEQ
5’--GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT--3’
LMB 2
5’--GTA AAA CGA CGG CCA GT--3’
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LMB 3
5’--CAG GAA ACA GCT ATG AC--3’
CEA3-BstE
5’--GGT TAT GGT GAC TTT CTC CCC--3’
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REIVINDICACIONES
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1. Procedimiento para captar una función efectora mediada por un anticuerpo hacia una diana antigénica, incluyendo el procedimiento, in vitro, la unión de una sustancia unidora multiespecı́fica, la cual
tiene una especificidad de unión por el anticuerpo y una especificidad de unión no covalente por la diana,
a un anticuerpo y a la diana, y ocasionando o permitiendo que el anticuerpo unido medie su función
efectora.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la especificidad de unión anti-anticuerpo es
isotipo-especı́fica.
3. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que la especificidad de unión anti-anticuerpo lo es
por la región constante de uno o más isotipos.
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4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia de
unión incluye un dominio de unión de inmunoglobulina.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la sustancia de unión incluye un multı́mero de
polipéptidos, teniendo cada polipéptido un primer dominio que incluye una región de unión de una región
variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina, y un segundo dominio que incluye una región
de unión de una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, formando la asociación de un
primer dominio y un segundo dominio dentro del multı́mero un sitio de unión de antı́geno.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el primer dominio de cada polipéptido es incapaz
de asociarse con el segundo dominio de dicho polipéptido para formar un sitio de unión de antı́geno.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la diana es una
célula humana.
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8. Utilización de una sustancia unidora multiespecı́fica in vitro para la captación de una función
efectora mediada por anticuerpo hacia un antı́geno diana, teniendo la sustancia de unión especificidad
anti -anticuerpo y especificidad de unión no covalente por la diana.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la que la especificidad de unión anti-anticuerpo es isotipoespecı́fica.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la que la especificidad de unión anti-anticuerpo lo es por
la región constante de uno o más isotipos.
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11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la sustancia de unión incluye
un dominio de unión de inmunoglobulina.
12. Utilización según la reivindicación 11, en la que la sustancia de unión incluye un multı́mero de
polipéptidos, teniendo cada polipéptido un primer dominio que incluye una región de unión de una región
variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina, y un segundo dominio que incluye una región
de unión de una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, formando la asociación de un
primer dominio y un segundo dominio dentro del multı́mero un sitio de unión de antı́geno.
13. Utilización según la reivindicación 12, en la que el primer dominio de cada polipéptido es incapaz
de asociarse con el segundo dominio de dicho polipéptido para formar un sitio de unión de antı́geno.
14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la que la diana es una célula humana.
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15. Sustancia de unión multiespecı́fica que tiene un sitio de unión con especificidad anti-anticuerpo
y un sitio de unión con especificidad de unión no covalente por una diana antigénica, y que incluye un
multı́mero de polipéptidos, teniendo cada polipéptido un primer dominio que incluye una región de unión
de una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina, y un segundo dominio que incluye
una región de unión de una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, formándose los
sitios de unión por la asociación de un primer dominio de un polipéptido presente en el multı́mero con
un segundo dominio de otro polipéptido presente en el multı́mero.
16. Sustancia de unión según la reivindicación 15, en la que el primer dominio de cada polipéptido
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es incapaz de asociarse con el segundo dominio de dicho polipéptido para formar un sitio de unión de
antı́geno.
5
17. Sustancia de unión según la reivindicación 15 ó 16, para su utilización en un procedimiento de
tratamiento de un individuo.
18. Procedimiento para unir un anticuerpo a una diana por la cual el anticuerpo no tiene especificidad
de unión, que incluye la unión in vitro de una sustancia multiespecı́fica según la reivindicación 15 o la
reivindicación 16 a un anticuerpo y a la diana.
10
19. Utilización de una sustancia multiespecı́fica, la cual tiene especificidad de unión anti-anticuerpo y
especificidad de unión no especı́fica por la diana antigénica, para la fabricación de un medicamento para
la captación de una función efectora mediada por anticuerpos hacia la diana.
15
20. Utilización según la reivindicación 19, en la que la especificidad de unión anti-anticuerpo es
isotipo-especı́fica.
21. Utilización según la reivindicación 20, en la que la especificidad de unión anti-anticuerpo lo es por
la región constante de uno o más isotipos.
20
22. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que la sustancia de unión
incluye un dominio de unión de inmunoglobulina.
25
30
23. Utilización según la reivindicación 22, en la que la sustancia de unión incluye un multı́mero de
polipéptidos, teniendo cada polipéptido un primer dominio que incluye una región de unión de una región
variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, y un segundo dominio que incluye una región de
unión de una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, formándose los sitios de unión
por la asociación de un primer dominio con un segundo dominio dentro del multı́mero.
24. Utilización según la reivindicación 23, en la que el primer dominio de cada polipéptido es incapaz
de asociarse con el segundo dominio de dicho polipéptido para formar un sitio de unión de antı́genos.
25. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en la que la diana es una célula
humana.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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