Tecnología de cultivos celulares en investigación - BVS-INS

CULTIVO DE
CÉLULAS EN LA
PRODUCCION
DE
BIOLOGICOS
M.V. ROQUE FERNANDEZ VERA
Introducción histórica.
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Hooke, Robert (1635-1703), 1º descubrimientos de las células vegetales.
El cultivo de tejidos se desarrolló a finales del siglo XIX aplicado a técnicas de embriología.
Roux : 1885 mantuvo células de embrión de pollo en solución salina durante unos días.
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Burrows y Carrel Utilizaron células de mamífero, perros, gatos , cobayos, y tumores sólidos.
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Rous y Jones (1916) emplearon extractos con tripsina disociar células y embriones , estableciendo el 1º
cultivo celular
Grey y col.(1952) establecen la 1ª línea celular continua, bien conocidas las células HeLa .
Eagle (1955) 1ª investigación sistemática requerimientos nutritivos de las células en cultivo
Hayflick y Moorhead (1961)1ª vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de
fibroblastos
Sato y col.(76-82) publicaron trabajos donde líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y
factores de crecimiento en medios libres de suero.
Los últimos años la aplicación de tecnologías en cultivo celular hay grandes avances para comprender
los mecanismos intracelulares e intercelulares estableciendo co-cultivos,...
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Actualmente ha revolucionado el manejo de cultivos celulares a través de la clonación, y los trabajos con
células madre:
Introducción histórica PERU.
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En Perú se realiza trabajos con tejidos de animales desde la década de los 50 donde se inocula
animales con virus como para la producción de vacuna antivariólica .
Igualmente se trabaja vacuna antirrabica tipo FERMI inoculando corderos y tipo SEMPLE donde se
inocula conejos posteriormente se inocula ratones lactante vacuna antirrábica tipo FUENZALIDA Y
PALACIOS
Entre los años 70 y 80 se trabaja con cultivos primarios la vacuna ANTIAFTOSA donde se usa epitelios
linguales de bovinos y adyuvada con Hidróxido de Aluminio.
A finales de los 70 se construye el laboratorio de vacunas virales y un equipo de profesionales medicos
veterinarios se especializan en el centro de referencia de PANAFTOSA – BRASIL en la producción de
vacuna aftosa en cultivos celulares células BHK21
En 1983 se inagura el LVV y se comienza con la producción de vacuna anti aftosa trivalente ( virus
O,A,C ) oleosa
En1984 se propone la producción de vacuna antirrábica en CC (cel BHK) uso veterinario a partir 1986
se produce el primer lote de vacuna, y hasta la fecha se viene produciendo tratando de cubrir la
demanda nacional.
En 1998 se trabaja lotes piloto de vacuna antirrábica en células VERO para humanos
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
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Aplicaciones del cultivo celular.
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Los estudios Abarcan muchas disciplinas .
Actividad intracelular. trascripción de DNA, síntesis de proteínas,
metabolismo energético.
Flujo intracelular. ej. ensamblaje y desensamblaje de los
diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA :
núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas,...
Ecología celular. estudia necesidades nutricionales, infecciones,
transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos),
cinética de población celular,...
Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria,
cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión,
interacciones célula-célula.
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Cultivo de Células en Producción de Biológicos
CULTIVOS CELULARES
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Áreas de Investigación
Virología :condiciones de cultivo, virus animales y plantas, producción vacunas
antivirales.
Investigación del Cáncer
Inmunología. introducción de técnicas de fusión celular en producción de
anticuerpos monoclonales, y el análisis genético de la célula somática.
Ingeniería de proteínas. producción de proteínas en líneas celulares : interferón,
insulina, hormona de crecimiento,...
Estudios de interacción y señalización celular,. Comprende el estudio de los
receptores y de las vias de translocación de la señal.
Aplicaciones diagnósticas. En medicina y farmacología destacan el análisis
cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis,
detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,...
Aplicaciones médicas : mantenimiento y producción de tejidos para transplante.
Aplicaciones industriales y agronómicas : producción por reproducción "in vitro" de
clones de plantas de interés comercial,...
y otras muchas.
Equipos en el laborataorio de CC
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Cabinas de flujo laminar (áreas de trabajo y de contención estéril).
Incubadores : baños termostatizados, incubadores de CO2,
Incubadores 'roller', ...
Instrumentos ópticos de observación del cultivo : microscopio
invertido de contraste de fases, de fluorescencia,...
Instalación de criogenia (tanques de N2 líquido) y congeladores
Equipo de esterilización : autoclave, equipos de filtración,...
Otros instrumentos : centrífugas, contadores electrónicos (Cell
Counters), equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro,
pipeteadores...
NORMAS DE SEGURIDAD

TECNICAS DE LABORATORIO ESTANDAR Y NORMAS DE
HIGIENE PERSONAL:
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BPM, BPL, BPA, desarrollo procedimientos, minimizar riesgos
biológicos, químicos y físicos.
El lavado de manos inicio y fin jornada y el uso de indumentaria de
protección es obligatorio para el manejo de cultivos y agentes
biológicos.
Usar sustancias antimicrobianas, secar con toallas de papel o aire.
No comer, beber, fumar, aplicarse cosméticos ni guardar o almacenar
alimentos y bebidas en el área de trabajo del laboratorio.
No pipetear con la boca.
El ingreso a las zonas restringidas deben efectuarse únicamente a
través de las instalaciones de cambio de ropa y ducha.
Vacunarse..
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CULTIVOS CELULARES
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CLASES DE CULTIVOS CELULARES
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CULTIVOS PRIMARIOS
CULTIVOS EN MONOCAPA
CULTIVOS EN SUSPENSION
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CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados
directamente de un animal.
Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de
órganos o parte de órganos in vitro.
Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.
Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas.
Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos
sucesivos comenzando por un cultivo primario.
Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a
muchos subcultivos. Expectativa de
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado
CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico
MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel)
CHO: Epitelio de ovario de hamster chino
VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde
africano
HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano
MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto
HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana
FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino
Etc., etc., etc.
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
Sigla
Nombre u
organismo
Ciudad, país
ATCC
American Type Culture
Collection
Minassas, USA
800
DSMZ
Human and Animal Cell
Cultures
Braunschweig,
Alemania
500
ECACC
European Collection of
Cell Cultures
Salisbury,
Wiltshire, UK
1000
Genova, Italia
2300
GEIMM Istituto Giannina
Gaslini
Nº de
cultivos
CULTIVOS CELULARES INSTALACIONES
CULTIVOS CELULARES EQUIPOS
CRIOPRESERVACION
MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
COMPONENTES:
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Agua
Sales
Glucosa
Ácidos grasos
Vitaminas
Suero
Péptidos
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





Micro y oligoelementos
Aminoácidos esenciales
Factores de crecimiento
Otro regulador de pH
Indicador de pH
Antiespumante
¿Antibióticos?
MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
CONDICIONES DE UN MEDIO
CUALIDADES:
Específico para la célula a cultivar
Nutritivo
pH adecuado
Capacidad buffer
Isotónico
Estéril
MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
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Medio Basal de Eagle (BME). Medio con aminoácidos esenciales. Se
suplementa con suero bovino fetal al 10 %.
Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). aminoácidos en mayor
concentración que el BME. adición de suero (10 %).
R.P.M.I. 1640. crecimiento de linfoblasto y líneas celulares leucémicas
en suspensión.
Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). 4 V AA y vit. selección
de hibridomas .
Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy
completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina,
selenito, et... linfocitos libre de suero.
McCoy 5A. L.C diploides tanto de rata como humanas.
Medio L-15 de Leibovitz. cultivo de virus.
Medio F-10 de Ham. L.C. humanas, se suplementan con proteínas,
hormonas metales como Fe, Cu, Zn. Cé. amnióticas.
Medio F-12 de Ham. medio libre de suero.
Medio 199. usado para cultivo de células no diferenciadas y estudio de
cromosomopatías.
MEDIO ESENCIAL MINIMO MEM

Composición Química:

L-arginina. HCL
L-cistina. 2HCL
L-glutamina.
D- glucosa
L-histidina.
L-isoleusina.
L-leucina
L-lisina
L-metionina
L-fenilalanina.
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
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


126.00 mg/l
32.40 mg/l
294.00 mg/l
2000.00 mg/l
31.00 mg/l
52.00 mg/l
52.00 mg/l
58.00 mg/l
15.00 mg/l
32.00 mg/l





L-treonina
L-triptófano
L-tirosina 2Na.2H2O
L-valina
Rojo de fenol .
48.00
10.00
54.52
46.00
10.00
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l.
Colina cloruro
1.00
Acido fólico
1.00
Inositol
2.00
Niacinamida
1.00
Bicarbonato de sodio al 7.5% 30.00
Piridoxal. HCL
1.00
Riboflavina
0.10
Tiamina HCL
1.00
D- Calcio pantotenato
1.00
Glutamina al 3%
10.00
Sulfato de magnesio. 6H2O 200.00
Cloruro de potasio
400.00
Cloruro de sodio
6500.00
Fosfato dibasico de sodio
1327.00
Penicilina
1000.00
Estreptomicina
100.00
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
ml/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
ml/l
mg/l
mg/l
mg/l
mg/l
UI
mg/l
CULTIVOS CELULARES

SISTEMA DE CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS ESTACIONARIOS
CULTIVOS ROTATIVOS
CULTIVOS EN SUSPENSION


ESTACIONARIO
ROTATIVO
PRODUCCION DE BIOLOGICOS
ROTATIVO
ROTATIVO
ROTATIVO Y SUSPENCION
PRODUCCION DE BIOLOGICOS MICROPORTADORES
RECUENTOCELULAR
CULTIVO DE TEJIDOS
CELULAS MDCK
CELULAS BHK
RFV
CULTIVOS CELULARES

PRODUCCION DE BIOLOGICOS
VACUNA ANTIVARIOLICA
 VACUNA ENCEFALITIS EQUINA
 VACUNA ANTIAFTOSA (FRENKEL)
 VACUNA ANTIAFTOSA (OLEOSA)
 VACUNA HEPATITIS
 VACUNA INFLUENZA
 VACUNA ANTIRRABICA
 OTRAS VACUNAS

PRODUCCION DE VACUNA ANTIRRABICA
VACUNA EN CULTIVOS CELULARES
INACTIVACION DE ANTIGENO
CLARIFICACION DE ANTIGENO
ANTIGENO RABICO PARA FORMULACION
ENVASE DE LA VACUNA
TAPONADO Y PRECINTADO
CONTROL DE VACUNAS
Hay factores importantes en la fabricación de Vacunas Antirrábicas, para el
control se emplean ratones adultos de (11- 14 gr.) y lactantes los cuales deben
provenir de criaderos garantizados, debiendo tener buenas condiciones de
manejo, alimentación y salud.
Los controles son decisivos, para poder usar un biológico, entre ellos tenemos
ESTERILIDAD
SEGURIDAD GENERAL
INOCUIDAD
POTENCIA (NIH)
ESTABILIDAD
VACUNA DE USO VETERINARIO
Vacuna Antirrábica en CC
RFV
Vacunación Antirrábica
ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA
ANTIRRÁBICA 2004-2013
CANTIDAD EN FRASCOS
300.000
250.000
238.380
224.182
224.920
200.000
150.000 138.945
126.064 129.060
100.000
128.496
112.443
73.901
59.239
50.000
0.000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CANTIDAD
ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA
ANTIRRÁBICA 2004-2013
3,000,000
2,500,000
2,383,800
2,249,200
CANTIDAD EN DOSIS
2,241,820
2,000,000
1,500,000
1,389,450
1,290,600
1,260,640
CANTIDAD
1,284,960
1,123,260
1,000,000
739,010
592,390
500,000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
«EL TRABAJO INDIVIDUAL GANA UNOS PASOS
PERO EL TRABAJO EN EQUIPO LOGRA LAS METAS
PRODUCIMOS PARA PROTEGER LA SALUD »
LVV
GRACIAS…