Evolución de la actividad de la Bilirrubina

Anales de Biología 24: 155-160, 2002
Evolución de la actividad de la Bilirrubina-UDP GlucuronosilTransferasa (bUDP-GT) durante el desarrollo en rata
María Helena Cantarino1, Rosa María Arahuetes1, Elvira Arza1, Francisco J. Cubero1, María del Socorro GarcíaBarrutia2 & Agustín Ortiz1
1 Departamento de Biología Animal II, Facultad de CC. Biológicas, Universidad Complutense de Madrid (UCM), España.
2 Departamento de Biología Celular, Facultad de CC. Biológicas, UCM, España.
Resumen
Correspondencia
A. Ortiz
E-mail: [email protected]
Tel.: 91.3.94.48.92
Fax: 91.3.94.49.35
Recibido: 4 Febrero 2002
Aceptado: 13 Abril 2002
La enzima microsomal bUDP-GT (bilirrubina uridindifosfo-glucuronosil
transferasa) es responsable de la conjugación de la bilirrubina para
ser eliminada por la bilis. Es un hecho establecido que durante la gestación la madre conjuga y elimina la bilirrubina producida por el feto, si
bien hemos demostrado en nuestro laboratorio que el gen responsable de dicha enzima comienza a expresarse a partir del día 13 de
gestación y por ello, nos planteamos: 1º) la puesta a punto de la técnica para determinar la actividad de la bUDP-GT en tejido hepático, y
2º) aportar nuevos datos sobre la variación de la actividad de la enzima durante el desarrollo perinatal. En cuanto al primer apartado, se
han analizado el tiempo de activación de la fracción microsomal, que
se estabiliza a los 30 minutos de incubación y la variación de la actividad enzimática cuyo máximo aparece a los 5 minutos de incubación
de la mezcla de reacción. En cuanto a la evolución de la actividad de
la bUDP-GT con la edad, hemos visto que sólo al final del periodo de
gestación comienzan a aparecer valores detectables y durante el primer mes de vida ya alcanzan valores próximos al adulto.
Palabras clave: bUDP-GT, Actividad enzimática, Bilirrubina, Fracción
microsomal, Perinatal.
Abstract
Evolution of bilirubin-UDP-glocuronosyltransferase during development
in the rat.
Conjugation of bilirubin and excretion by the liver is catalysed by the
microsomal enzyme bilirubin-UDP-glucuronosyltransferase (bUDP-GT).
It is well known that during gestation, the fetal liver in utero is incapable for capture, conjugation and clearance of bilirubin. However, we have
previously demonstrated that the gene responsible for the enzyme starts
to express by day 13 of gestation. Therefore, the aims of the present
work are first, to carry out a procedure so as to determine the activity
of the bUDP-GT in the hepatic tissue, and, second, to obtain new data
about the changes during the perinatal development in the activity levels of the mentioned enzyme. On the one hand, we have analyzed
both, the activation time of the microsomal fraction, which stabilizes after 30 minutes of incubation, and the changes in the enzyme activity
which reach a maximum peak after 5 minutes of incubation. On the other
hand, we only detect activity of the bUDP-GT at the final period of gestation, reaching adult levels during the first month of extrauterine life.
Key words: bUDP-GT, Enzime activity, Bilirubin, Microsome fraction, Perinatal.
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M. H. Cantarino et al.
Anales de Biología 24, 2002
Introducción
Animales
La bUDP-GT (bilirrubina uridin-difosfatoglucuronosiltransferasa) es una enzima unida a la membrana microsomal responsable de la conjugación de la bilirrubina para su posterior eliminación por bilis. Su regulación depende de la composición
lipídica de la membrana, por lo que, durante el desarrollo fetal, los cambios en la actividad de las enzimas hepáticas implicadas en la síntesis de fosfolípidos provoca cambios en la
composición lipídica microsomal, modulando la actividad
catalítica de la bUDP-GT.
Para este trabajo se han utilizado ratas adultas, tanto machos
como hembras de la especie Rattus norvegicus, variedad albina, raza Wistar, con un peso entre 200 y 300g, así como fetos
de la misma raza de rata de 21 días de gestación y neonatos
de cuatro días y de un mes.
Por otra parte, ha quedado demostrado que la bilirrubina
producida en el feto es transferida por la placenta al plasma
materno, conjugada en el hígado materno, y excretada en bilis materna. Cuando esta ruta excretora se interrumpe en el
nacimiento, la eliminación del pigmento llega a ser dependiente del hígado del recién nacido, cuya capacidad excretora está
desarrollada de manera incompleta durante los primeros días
de vida. Esta hiperbilirrubinemia fisiológica, también llamada ictericia del recién nacido, aparece no sólo en humanos sino
también en otros muchos mamíferos (Thaler 1972, Odell 1976,
Valaes 1976, Fevery et al. 1979, Lee et al. 1986).
Además de la rápida normalización en la conjugación de
la bilirrubina en el hígado postnatal, la evidencia experimental sugiere que la defectuosa captura hepática inicial, el transporte intracelular y la excreción biliar del pigmento, también
alcanzan, progresivamente, los valores del adulto durante el
periodo neonatal acompañados por las modificaciones estructurales y ultraestructurales del hígado, lo que representa la
adaptación del hígado fetal a la vida extrauterina.
Los objetivos de este estudio han sido: 1) la puesta a punto de la técnica para la determinación de la actividad de la
bUDP-GT en tejido hepático ya que se requería un método de
gran sensibilidad, dadas las características particulares de las
muestras fetales y de neonatos, y 2) aportar nuevos datos sobre la variación de la actividad de la bUDP-GT durante el
desarrollo perinatal, dado que son factores diferentes los que
modulan dicha actividad.
Los animales permanecieron en el animalario de la Facultad de Ciencias Biológicas en módulos con Tª constante
de 18 a 20ºC y con fotoperiodo controlado (12 horas luz/oscuridad). En su momento, fueron anestesiados con éter dietílico con la finalidad de obtener una relajación completa y así
evitar una vasoconstricción periférica. Una vez anestesiada la
rata, se somete a una laparotomía media hasta el diafragma
retirando la capa muscular y se aparta toda la masa visceral,
con el fin de que el hígado y los vasos sanguíneos conectados a él queden bien visibles. A continuación se extrae el hígado, se pesa, se trocea y se coloca en un tubo de cristal al
que previamente se le ha añadido el tampón I: KH2PO4 20mM,
K2HPO4 80mM, DTT 1mM, EDTA 1mM y glicerol 20% con
un pH de 7,4 y en una relación del 10-15% peso/volumen.
Preparación de la fracción microsomal
Se sometió a homogeneización (en un homogeneizador Heidolph) y a continuación a tres centrifugaciones sucesivas. La
primera, en una centrífuga Eppendorf 5403, a 30 g a 4ºC durante 15 min y las dos siguientes se llevan a cabo en una ultracentrífuga Beckman XL-90 ultracentrifuge. La primera, con
el sobrenadante de la centrífugación anterior, es a 41.000 g a
4ºC durante 15 minutos, mientras que la segunda es a 80.000
g a 4ºC durante una hora. El sedimento, en el que se encuentra la fracción microsomal, se resuspende en un volumen conocido de tampón. A partir de esta muestra se determinó la
concentración de proteínas microsomales por el método de
Bradford y la determinación de la actividad de la enzima microsomal.
Determinación de la actividad de la bUDP-GT
Material y métodos
Productos químicos
KH2PO4, K2HPO4, Glicerol, UDPGA (ácido glucurónico), bilirrubina, Brij-56 (polyoxyethylene 10 cetyl ether), NO2Na,
sulfamato amónico, ácido ascórbico, butilacetato y reactivo
de Bradford son productos de Sigma-Aldrich (St Louis, MO,
USA).
DTT (1,4-Dithiothreitol) y EDTA son productos de
Boehringer Mannheim GMBH (Alemania). Solución de tampón pH 2,8 según Soerensen (glicina/HCl), etil antranilato y
2-pentanona son productos de Fluka Chemie (Stenheim, Suiza).
Para la determinación de la actividad de la bUDP-GT se activaron alícuotas microsomales (4 mg/ml de proteína microsomal) con Brij-56 (0,08%) mediante incubación a 37ºC durante 15, 30, 45 y 60 minutos. En la medida de la actividad, los
componentes y sus concentraciones en el volumen o mezcla
de reacción fueron: microsomas activados 1 mg/ml, tampón
tris-maleato 0,1mM, UDP- GA 5mM, bilirrubina 0,125 mM.
Con esta mezcla de reacción se procedió al ensayo «in vitro»
a diferentes tiempos (5, 15 y 30 minutos) y siempre en baño
metabólico a 37ºC. A continuación, para analizar la actividad
de la enzima recurrimos al procedimiento basado en la diazotización selectiva de los glucurónidos de bilirrubina en presencia de bilirrubina a pH 2,7. Esto se realizó deteniendo la
reacción de incubación con tampón glicina/HCl en hielo, agi-
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Actividad de la bUDP-GT en rata
Tiempo de activación
Activación (nmol/mn/mg)
157
15 minutos
30 minutos
45 minutos
60 minutos
0,165 ± 0,011
0,188 ± 0,001
0,181 ± 0,003
0,189 ± 0,025
Tabla 1. Variación en el valor de la actividad de la bUDP-GT a diferentes tiempos de activación de la fracción microsomal con Brij-56. El
número de muestras utilizadas en cada uno de los tiempos de incubación ha sido de 15.
Table 1. Changes in the activity of the bUDP-GT at different times after activation of the microsomal fraction with Brij-56. (n=15 per
time).
A
Formación de azopigmentos
nmol/mg
6
4,62
5
4
2,88
3
2
1,53
1
0
5'
15'
30'
nm
B
nmol/mn/mg
0,35
Variación de la actividad enzimática
0,307
0,3
0,25
0,197
0,2
0,154
0,15
0,1
0,05
0
5'
15'
30'
mn
Figura 1. El gráfico A muestra la cantidad de azopigmentos (expresada en nmol/mg de proteína microsomal) que se han formado en función del tiempo de incubación. En el gráfico B se observa la actividad (expresada en nmol/mn/mg de proteína microsomal) de la bUDPGT a diferentes tiempos de incubación con la mezcla de reacción. El número de muestras empleadas en cada uno de los tiempos ha sido
de 10.
Figure 1. A shows the azopigments quantified as nmol/mg of microsomal protein. B represents the activity of the bUDP-GT (expressed as
nmol/mn/mg) at several times of incubation with the reaction mixture. (n=10 per time).
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M. H. Cantarino et al.
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Evolución de la actividad con la edad
pmol/mn/mg
300
251
250
214,5
200
150
72,6
100
50
6,87
0
21 fetal
4 días
1 mes
1 año
edad
Figura 2. El gráfico representa los valores de actividad de la bUDP-GT y su evolución con la edad. El número de muestras empleadas en
cada uno de los tiempos ha sido de 8.
Figure 2. Activity of the bUDP-GT versus evolution during development (n=8 per time).
tando bien y dejando la muestra a temperatura ambiente. La
bilirrubina conjugada se convierte en azopigmentos coloreados que son extraíbles en solventes orgánicos y medidos espectrofotométricamente. Por lo tanto, a la bilirrubina conjugada se le añadió el reactivo de diazotización (HCl 0,15M,
NO2Na al 5%, sulfamato amónico 17g/l y etil antranilato), se
agitó y se incubaron las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Se detuvo la reacción con
ácido ascórbico y se extrajo el azopigmento al añadir 1,5 ml
de 2-pentanona/butilacetato (17/3 v:v), agitando intensamente y congelando las muestras a –20ºC durante dos horas. Se
descongelaron y centrífugaron a 2500 rpm durante 10 mn a
temperatura ambiente. Se recogió la fase superior y se leyó la
densidad óptica a 530 nm en un espectrofotómetro Hitachi U2000 contra un blanco de 2-pentanona/butilacetato (17:3 v/v).
Las modificaciones llevadas a cabo en esta metodología
están basadas en el método descrito por Roy & Heirwegh
(1968), modificado «a posteriori» por Heirwegh et al. (1972),
Viollon-Abadie et al. (1999).
hepáticas que por su grado de maduración no presentan valores relevantes de la misma, como es el caso del hígado en el
periodo perinatal. Por esta razón, uno de los objetivos de este
trabajo ha sido el desarrollo de una técnica, con las modificaciones más apropiadas, que permita valorar con gran fiabilidad dicha actividad enzimática durante el desarrollo.
Variación de los tiempos de activación de la fracción
microsomal
Se ha valorado el tiempo de activación de la fracción microsomal con Brij-56 en función del tiempo de incubación. Los
resultados aparecen en la Tabla 1. A partir de los 30 minutos
de activación, los valores obtenidos fueron prácticamente iguales por lo que se fijó ese tiempo como preestablecido para la
metodología.
Formación de azopigmentos
Resultados y Discusión
El color de los extractos de azopigmentos obtenidos en la
mezcla de reacción, se debe a los párametros siguientes:
La valoración de la actividad de la enzima microsomal bUDPGT requiere atención especial cuando se parte de muestras
a) bilirrubina conjugada sintetizada durante la incubación
de la mezcla de reacción.
Anales de Biología 24, 2002
Actividad de la bUDP-GT en rata
b) material diazopositivo presente en la muestra.
c) compuestos diazonegativos que absorben a la longitud de onda utilizada.
d) turbidez de la mezcla (Heirwegh et al. 1972).
En la Figura 1: A, se muestran los resultados obtenidos
en la cuantificación de la formación de azopigmentos durante
el tiempo comprendido entre 5 y 30 minutos de incubación
de la mezcla de reacción. Éstos están expresados en nmol/mg
de proteína microsomal y se han obtenido restanto de los valores finales los correspondientes a los cuatro factores expresados anteriormente.
159
existe expresión del gen de la bUDP-GT, cuatro días antes de
lo detectado por Huang et al. (1992) utilizando la misma sonda. Por otra parte, la bibliografía existente sobre la actividad
de dicha enzima en el periodo perinatal esescasa, y en contraposición a nuestros resultados, Fevery et al. (1977), detectó
algo de actividad a partir del día 19 de gestación.
Estos datos coinciden con los señalados por Bruni &
Chang (1999) donde trabajaban con concentraciones de bilirrubina/albúmina de 0,85 mM y UDPGA de 83,5 mM mientras que en nuestro caso se ha trabajado con bilirrubina/albúmina de 0,125 mM y UDPGA de 5 mM (Viollon-Abadie et
al. 1999).
Finalmente, los resultados están en concordancia con la
hipótesis de que la actividad de esta enzima hepática permanece suprimida por, al menos dos factores: las hormonas gestacionales circulantes y las bajas concentraciones de bilirrubina circulante ya que la placenta la elimina rápidamente (Lee
et al. 1986). Al nacer, los neonatos excretan hormonas gestacionales una vez que son separados de la circulación placentaria, y, la bilirrubina endógena sirve para inducir la actividad
de bUDP-GT. Esto nos hace pensar que cuando la ruta placentaria se pierde, se induce rápidamente la traducción del
mRNA de la bUDP-GT ya que la expresión del gen es anterior al nacimiento.
Variación de la actividad enzimática de la bUDP-GT
Agradecimientos
En la Figura 1: B, se señala los resultados obtenidos. Según
éstos, el pico de actividad aparece a los 5 minutos de incubación (0,307 nmol/ mn/mg) disminuyendo, de forma no lineal,
hasta 0,154 nmol/mn/mg a los 30 minutos de incubación. Este
hecho podría explicarse por la falta de sustrato. Nosotros hemos trabajado con concentraciones de albúmina y de UDPGA
mucho más bajas que Bruni & Chang (1999) que han señalado un aumento continuo de actividad en función del tiempo.
Sin embargo, Heirwegh et al. (1972), trabajando con concentraciones muy superiores a las nuestras, manifestaron una caída
de la actividad enzimática en función del tiempo muy similar
a la nuestra.
Queremos agradecer a la Comunidad Autónoma de Madrid y
a la Universidad Complutense la ayuda prestada para la realización de este trabajo con la concesión de los proyectos:
C.A.M. 08.6/0027.1/98 y U.C.M. PR/52/008901.
Entre nuestros objetivos destacaba la puesta a punto de
una técnica eficaz, sensible y fiable, minimizando costes para
poder llevarla a cabo, y por tanto, creemos que los parámetros a utilizar serían de 30 minutos de incubación para la activación de la fracción microsomal seguida de 5 minutos de
incubación para la mezcla de reacción con las concentraciones señaladas con anterioridad en el apartado de material y
métodos.
Evolución de la actividad de la bUDP-GT con la edad
Se ha analizado la actividad de la bUDP-GT en función de
los parámetros ya establecidos, excepto del tiempo de activación que en este caso fue de 30 minutos para poder comparar
con otros trabajos. Los resultados que hemos obtenido se
muestran en la Figura 2. En ellos se pone de manifiesto que
sólo a partir del día 21 hay trazas de actividad que aumenta
significativamente en el 4º día postnatal y a partir del primer
mes de vida se alcanzan valores próximos al adulto.
Estudios realizados en nuestro laboratorio (Cubero et al.
2001) han puesto de manifiesto que el día 13 de gestación ya
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