HemosIL - Instrumentation Laboratory

HemosIL®
ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503
FRANÇAIS - Révision de la notice 04/2016
Utilisation
Procédures de test/Instrument
Recueil des spécimens et préparation
Pour la détermination chromogénique de l’activité du facteur VIII dans les plasmas humains citratés.1 Ceci inclut,
l’identification d’une déficience en facteur VIII, la surveillance des patients sous thérapie supplétive ainsi que l’estimation
des potentialités des concentrés de facteur VIII.2
I. Méthode en microplaque et Méthode en tube
a. Dilution des échantillons et des contrôles
Echantillons/contrôles
25 µl
Tampon de travail
2000 µl
Bien mélanger
b. Méthode en microplaque
Ajouter dans les puits de la microplaque
Zone de dosage
0-1,5 UI/mL0-0,05 UI/mL
Echantillons/contrôles/standards dilués
50 µl
50 µl
Mélanger et incuber à 37°C pendant
3-4 minutes
3-4 minutes
Réactif facteur (préincuber à 37°C)
50 µl
50 µl
Mélanger et incuber à 37°C pendant
2 minutes
4 minutes
Substrat chromogène (préincuber à 37°C)
50 µl
50 µl
A. Méthode cinétique: lire la densité optique
à 405 nm entre 30 et 120 secondes
B. Méthode en point final: procéder comme décrit ci-dessous.
Mélanger et incuber à 37°C pendant
2 minutes
10 minutes
Acide acétique à 20% ou acide citrique à 2%
50 µl
50 µl
Mélanger
Lire l’absorbance à 405 nm par rapport au tampon de travail. Si possible, lire et soustraire l’absorbance à 490 nm afin de
compenser les interférences dues à la microplaque.
c. Méthode en tube
Utiliser 200 µl au lieu de 50 µl pour toutes les étapes de pipetage.
d. Nombre de dosages par trousse
Méthode en microplaque: 120Méthode en tube: 30
e.Calcul
Soustraire l’absorbance du blanc échantillon de l’absorbance (A) à 405 nm pour chacun des standards. Sur une feuille
de papier millimétré, reporter en ordonnée la valeur de l’absorbance par minute (ΔA/mn) ou de l’absorbance (A) pour
chacun des standards et en abscisse la valeur de la concentration en facteur VIII correspondante (ΔA/mn ou A en
ordonnée et UI/mL de facteur VIII en abscisse) Relier les points en traçant la droite la mieux ajustée. Les échantillons
sont évalués sur la base de cette courbe de calibrage.
Droite d’étalonnage
Un exemple de droite d’étalonnage type (méthode sur microplaque) est présenté
ci-dessous:
Au moment du prélèvement, le patient doit être au repos et non stressé.
9 parts de sang fraîchement prélevé sont collectées avec 1 part de citrate trisodique.9 Le plasma doit être séparé des
cellules le plus tôt possible et testé dans les 30 minutes. Si la réalisation du test n’intervient pas tout de suite, conserver le
plasma à -20°C durant une semaine au maximum ou à -70°C durant un an au maximum. Les échantillons ne doivent pas
être stockés dans un congélateur à dégivrage automatique, ni être décongelés et recongelés avant le dosage. Durant le
transport les échantillons congelés doivent être conservés dans la glace.
Se référer au document NCCLS H21-A3 ou au document GEHT (STV, numéro spécial, 1-40, 1998) pour plus
d’informations sur le prélèvement des échantillons, leur manipulation et leur stockage.9
NOTE: Des pertes d’activité en facteur VIII de près de 20% peuvent se produire lors de la congélation et de la
décongélation, surtout si le plasma est congelé lentement.
Facteur IXa, Ca2+, Phospholipide
1. Facteur X −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Facteur Xa
Facteur VIII
Facteur Xa
2. Substrat −−−−−−−−−−−−−−−−−> Peptide + pNA
Composition
Le coffret ELECTRACHROME Factor VIII (Facteur VIII) contient:
S Chromogenic substrate (Réf. 4973050310): 1 flacon de 6 ou 7 ml de S-2765, N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA•2HCl
(7,7 mg/ flacon), d’inhibiteur synthétique de la thrombine I-2581 (0,2 mg/flacon) et de mannitol comme stabilisant.
E
Factor reagent (Réf. 4973050320): 2 flacons de 3 ou 3,5 ml d’une préparation contenant du facteur IXa bovin (0,3
U/flacon), du facteur X (2,7 UI/flacon) et de la thrombine (1 NIH-U/flacon) colyophilisés avec du CaCl2 (40 µmol/
flacon) et des phospholipides (0,2 µmol/flacon).
B Buffer (Réf. 4973050330): 2 flacons de 24 ml de tampon Tris 0,025 mol/l (solution mère), pH 7,9, force ionique 0,08
contenant du polybrène, du NaCl et de la sérum albumine bovine.
PRECAUTIONS:
Contient des produits d’origine bovine. Les animaux sources ont été déterminés comme indemnes d’ESB. Les animaux
sources ont été l’objet d’une inspection des services sanitaires vétérinaires ante et post mortem et déterminés comme
indemnes de tout agent infectieux ou contagieux. Cependant, ce matériel doit être manipulé et considéré comme
potentiellement infectieux.
Factor Reagent
Danger
Classe de danger: Resp. Sens. 1, H334
Indications de danger: H334: Peut provoquer des symptômes allergiques ou d’asthme ou des difficultés
respiratoires par inhalation.
Conseils de prudence: P261: Éviter de respirer les poussières/fumées. P284: [Lorsque la ventilation du local
est insuffisante] porter un équipement de protection respiratoire. P304 + P340: EN CAS D’INHALATION: transporter
la personne à l’extérieur et la maintenir dans une position où elle peut confortablement respirer. P342 + P311: En cas
de symptômes respiratoires: Appeler un CENTRE ANTIPOISON/un médecin. P501: Éliminer le contenu/récipient
conformément à la réglementation locale/régionale/nationale/internationale.
Informations additionnelles sur les dangers: Contient Factor IXa et Factor X. Jusqu’à 63.1% de ce mélange est
constitué de composants dont la toxicité aiguë (par voie orale, cutanée, par inhalation) pour la santé humaine et
l’écotoxicité pour le milieu aquatique sont inconnues.
Chromogenic Substrate, Buffer:
Classe de danger: Aucune
Indications de danger: Aucune
Conseils de prudence: Aucune
Informations additionnelles sur les dangers: EUH210: Fiche de données de sécurité disponible sur demande.
Chromogenic Substrate: Jusqu’à 6.5% de ce mélange est constitué de composants dont la toxicité aiguë (par voie
orale, cutanée, par inhalation) pour la santé humaine et l’écotoxicité pour le milieu aquatique sont inconnues.
Buffer: Jusqu’à 13% de ce mélange est constitué de composants dont la toxicité aiguë (par voie orale, cutanée, par
inhalation) pour la santé humaine et l’écotoxicité pour le milieu aquatique sont inconnues
Ce produit est à usage diagnostique in vitro.
Préparation
Chromogenic Substrate: Dissoudre le contenu du flacon avec 6 ml (Méthode en microplaque et Méthode en tube, ACL
8000/9000/10000 et ACL Futura/ACL Advance) ou 7 ml (Méthode d’analyse ELECTRA) d’eau déminéralisée de type
II selon les normes NCCLS ou équivalent.8 Replacer le capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète
reconstitution du produit. Conserver le réactif à 15-25°C pendant 10-30 minutes et retourner le flacon pour mélanger
doucement le contenu avant utilisation.
Factor reagent: Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 3 ml (Méthode en microplaque et Méthode en tube, ACL
8000/9000/10000 et ACL Futura/ACL Advance) ou 3,5 ml (Méthode d’analyse ELECTRA) d’eau déminéralisée de type II
selon les normes NCCLS ou équivalent.8 Replacer le capuchon et agiter doucement.
Assurez-vous de la complète reconstitution du produit. Conserver le réactif à 15-25°C pendant 10-30 minutes et
retourner le flacon pour mélanger doucement le contenu avant utilisation.
Buffer: Tampon de travail - diluer la solution mère en mélangeant 1 volume de solution mère avec 9 volumes (Méthode
en microplaque et Méthode en tube,
ACL 8000/9000/10000 et ACL Futura/ACL Advance) ou 7 volumes (Méthode d’analyse ELECTRA) d’eau déminéralisée
de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.8
Le flacon contenant cette solution de travail doit être clairement identifié.
NOTE: Les réactifs ne sont pas interchangeables entre lots.
Conservation et stabilité du réactif
Conservés à 2-8°C, les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur les flacons.
Substrat chromogène - Stabilité après reconstitution, 1 mois à 2-8°C dans le flacon d’origine.
Réactif facteur - Stabilité après reconstitution, 12 heures à 2-8°C, 2 semaines à -30°C ou 1 mois à -70°C dans le flacon
d’origine. Eviter le stockage à -20°C.
Tampon (Tampon de travail) - Stabilité après dilution, 1 mois à 2-8°C.
Pour une stabilité optimale, conserver les réactifs à 2-8°C dans le flacon d’origine entre chaque utilisation.
ATTENTION: Eliminer la solution de substrat si elle présente une coloration jaune.
Etalonnage
Générer une courbe d’étalonnage à chaque changement de lot de réactif ELECTRACHROME Facteur VIII. Utiliser
le Plasma normal de référence titré pour préparer les étalons. Ce dernier doit être dilué avec le tampon de travail afin
d’obtenir les ratios correspondants. Certains standards devront être dilués deux fois avec le tampon de travail. Mélanger
doucement dans un tube en plastique entre et après chaque dilution.
Pour les taux de facteur VIII en dessous de 0,05 UI/mL (patients atteints d’hémophilie A), utiliser la courbe basse.
NOTE: Le test doit être réalisé dans les 30 minutes qui suivent le prélèvement ou la décongélation des échantillons de
plasma.
Préparation des étalons
Prédilution
Facteur VIII
Plasma
Tampon de travail
UI/mL
(µl)(µl)
Courbe normale
1,42
25 0
1,00
25 0
0,50
100100
0,25
50150
0
00
Courbe basse
0,050
1001900
0,024
502000
0,012
252000
0,006
254000
0
00
Dilution finale
Facteur VIII
Plasma prédilué
Tampon de travail
UI/mL
(µl)(µl)
Courbe normale
1,42
01400
1,00
02000
0,50
252000
0,25
252000
0
02000
Courbe basse
0,050
252000
0,024
252000
0,012
252000
0,006
252000
0
02000
Normal range.
End-point method in microplate
0.8
0.6
0.4
0.1
0
0.5
1
Résultats
0
1.5
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
FVIII, IU/mL
FVIII, IU/mL
f.Résultats
Les valeurs d’absorbances des points de la droite d’étalonnage doivent se trouver dans les limites suivantes:
Méthode en microplaque
Méthode en tube
StandardAbsorbance
Absorbance
Courbe normale
Méthode
Méthode
Méthode Méthode
0-1,5 UI/mL
cinétique
en point final
cinétique
en point final
0,0 UI/mL
<0,06<0,12
<0,14<0,21
1,0 UI/mL
0,16-0,32
0,33-0,63
0,38-0,74 0,58-1,11
Courbe basse
0-0,05 UI/mL
0 UI/mL
<0,02<0,18
<0,04<0,32
0,05 UI/mL
0,02-0,050,17-0,44
0,04-0,110,29-0,76
II. Méthode d’analyse ELECTRA®
Préparation des étalons et des réactifs
1. Préparer le plasma de référence et les contrôles comme indiqué dans les notices correspondantes. L’analyseur
diluera automatiquement les points de la courbe d’étalonnage.
2. Placer les réactifs et le plasma de référence comme indiqué ci-dessous.
a. ELECTRA paramétrage instrument
Instrument
Protocole
E1600C
4
Nombre
de
canaux
4
Substrat
1
5
4
Réactif
facteur
Substrat
Réactif
facteur
E1800C
E1400C
4
Type de
réactif
Pompe Position
n°
pompe
B
Couleur
éch.
therm
Transp.
Volume
de réactif
(µl)
75
F
Transp.
75
1
B
Transp.
75
4
F
Transp.
75
Type
d’échantillon
Tampon de
travail
Plasma
de réf.
Tampon de
travail
Plasma
de réf.
Position
réactif
princ.
A
Vol.
d’échantillon
(µl)
50
B
50
A
50
B
50
NOTE: Se reférer au mode d’emploi spécifique de l’instrument ELECTRA pour des informations complémentaires.
Calculs: les valeurs des patients sont calculées automatiquement à partir de la droite d’étalonnage et les résultats du
facteur VIII sont indiqués en activité (UI/mL).
b. Droite d’étalonnage ELECTRA
Un exemple de droite d’étalonnage type (méthode d’analyse ELECTRA) est présenté
ci-dessous.
Type de graphique: linéaire/linéaire
Type de courbe: linéaire
Dilution de l’échantillon: 1/62
0.60
1:52
0.50
A
B
S
/
M
I
N
1:62
0.40
0.30
1:124
0.20
Les résultats de facteur VIII sont reportés en UI/mL. 1,0 UI/mL de FVIII est équivalent à 100% de FVIII. Se référer au
mode d’emploi de l’instrument pour des informations complémentaires.
Limites de la méthode et substances interférant avec celle-ci
Les résultats du test Facteur VIII ne sont pas affectés par l’héparine jusqu’à 1 UI/mL.
Aucune interférence médicamenteuse n’a été rapportée.
Aucune interférence sur les analyseurs ACL Futura et ACL Advance jusqu’à:
HémoglobineTriglycérides Bilirubine
Valeurs normales et valeurs hautes
275 mg/dl
923 mg/dl 30 mg/dl
(9,23 g/l)
(300 mg/l)
Valeurs basses
27 mg/dl
400 mg/dl 8 mg/dl
(4 g/l)
(80 mg/l)
Valeurs attendues
Les valeurs normales de cette étude ont été obtenues en utilisant le coffret ELECTRACHROME Facteur VIII.
Méthode
N
Valeurs (unités)
Méthode en microplaque
61
50 - 200 (% activité (M=28, F=33; âgés de 21 à 55 ans)
Du fait qu’un grand nombre de variables peuvent affecter les résultats, nous recommandons à chaque laboratoire
d’établir ses propres valeurs normales.
Caractéristiques et performances
Précision:
Les résultats suivants donnent le coefficient de variation (CV %) obtenu pour trois activités en facteur VIII différentes,
déterminées par la méthode en microplaques. Chaque laboratoire doit établir ses propres données relatives à la
précision de la méthode.
Moyenne FVIII
Intra-séries
Inter-séries
Concentration
CV % n=42
CV % n=6 N=7
1,0 UI/mL2,4% 2,1%
0,25 UI/mL2,6% 5,9%
0,03 UI/mL3,0% 3,9%
Lors d’études complémentaires, la précision intra-séries a été évaluée au cours d’essais multiples en utilisant le réactif
ELECTRACHROME Facteur VIII.
Les résultats obtenus sont les suivants:
ACL 8000/9000/10000
Facteur VIII Moyenne (UI/mL) 0,900,390,07
CV (%)
5,15
6,06
4,57
ACL Futura/ACL Advance
Moyenne (UI/mL)
CV % (Intra-séries)
CV % (Total)
Valeur haute
1,97
1,70
1,90
Valeur haute
3,67
1,73
3,97
Valeur normale
0,99
1,62
3,52
Valeur normale
0,42
3,59
5,41
Valeur basse
0,05
2,51
2,86
Valeur basse
0,01
2,84
4,55
ELECTRA
Moyenne (UI/mL)
CV % (Intra-séries)
CV % (Total)
Plasma normal de référence, titré
0,80
2,72
2,68
Plasma anormal de référence, titré
0,25
2,15
2,43
Corrélation:
Les dosages font apparaître une corrélation significative avec le Coatest Facteur VIII.
ELECTRACHROME FVIII (Méthode en tube)
r=0,97
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = 0,07 + 0,94 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (microplaques)
r=0,96
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,11 + 1,09 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (ACL)
r=0,97
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,13 + 1,16 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (ELECTRA MLA 900)
r=0,98
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,06 + 1,03 x UI/mL FVIII (Coatest)
Dans une étude complémentaire, comparant les résultats obtenus avec le coffret ELECTRACHROME Facteur VIII utilisé
sur un analyseur ACL 9000 à ceux obtenus avec le même coffret sur un analyseur ELECTRA 1400C, le coefficient de
corrélation était de 0,98.
UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 2,36 + 1,14 x UI/mL FVIII (ELECTRA 1400C)
Dans une étude complémentaire, comparant les résultats obtenus avec le coffret ELECTRACHROME Facteur VIII utilisé
sur un analyseur ACL Futura à ceux obtenus avec le coffret IL Test Facteur VIII et le réactif TCA-SP, le coefficient de
corrélation était de 0,99.
UI/mL FVIII (ACL Futura) = - 0,26 + 1,08 x UI/mL FVIII (IL Test FVIII et TCA-SP)
1:245
0.10
Non fournis avec la trousse, ils doivent faire l’objet d’une commande séparée.
1. Plasma normal de référence titré (ELECTRA) ou équivalent. Utiliser des numéros de lots différents pour la courbe
d’étalonnage et le contrôle.
2. Plasma de calibration (systèmes de Coagulation IL).
3. Plasma anormal de référence titré (ELECTRA) ou équivalent.
4. Contrôle normal (systèmes de Coagulation IL), code produit 0020003120 / 0020003110.
5. Témoins appropriés étalonnés par référence à un Standard International pour le facteur VIII (systèmes de
Coagulation IL).
6. Acide acétique à 20 % ou acide citrique à 2 % (méthode en point final).
7. Solution de nettoyage (ACL 8000/9000/10000), code produit 0009831700.
8. Photomètre, 405 nm (et 490 nm pour la procédure sur microplaque).
9. Microplaques* ou semi microcuvettes (1 cm).
10. Centrifugeuse à 2000 x g.
11. Bain Marie à 37°C ± 0,2°C.
12. Pipettes calibrées avec une précision de 1 % (ou mieux).
13. Tubes à essai en plastique.
14. Agitateur.
15. Chronomètre.
16. Vortex.
17. Papier millimétré.
18. Eau déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.
*NOTE: Ne pas utiliser de microplaques pour « coating ».
Les contrôles normaux et anormaux sont recommandés pour un programme de contrôle de qualité complet.10 Le
laboratoire doit utiliser des plasmas de contrôle appropriés, dont la concentration en facteur VIII a été évaluée et se situe
dans les limites de la droite d’étalonnage. Le plasma de contrôle normal (systèmes de Coagulation IL) et les plasmas
normal et anormal de référence, titrés (ELECTRA) sont spécifiques à ce programme. Chaque laboratoire doit établir sa
propre moyenne et déviation standard et son programme de contrôle de qualité afin de vérifier l’état de fonctionnement
de son système analytique. Les contrôles doivent être analysés au minimum toutes les 8 heures en concordance avec
une bonne pratique de laboratoire. Se référer au mode d’emploi de l’instrument pour des informations complémentaires.
Se reporter à Westgard et al pour l’identification et la résolution des contrôles hors limites.11
0.2
0
Matériel requis mais non fourni
Contrôle de qualité
0.3
0.2
0
Low range.
End-point method in microplate
0.4
A 405 nm
Le facteur VIII est une protéine plasmatique de haut poids moléculaire, cofacteur du facteur IXa lors de l’activation du
facteur X en Xa.3 La déficience en facteur VIII est responsable d’un grave trouble hémorragique, l’hémophilie A. Il existe
un rapport inverse entre la gravité de cette pathologie et la concentration en facteur VIII. Les patients atteints d’hémophilie
A sont généralement classés en trois catégories sur la base de leur activité en facteur VIII, à savoir:
< 0,01 UI/mL = hémophilie sévère
0,01 à 0,04 UI/ ml = hémophilie modérée
0,05 à 0,25 UI/mL = hémophilie mineure.4
En présence d’ions calcium et de phospholipides, le facteur X est activé en facteur Xa par le facteur IXa. Cette activation
est fortement stimulée par le facteur VIII, qui joue ici un rôle de cofacteur. La mise en oeuvre de quantités optimales
de Ca2+, de phospholipides et de facteur IXa, plus un excès de facteur X, se traduira par une relation linéaire entre la
vitesse d’activation du facteur X et la quantité de facteur VIII. Le facteur Xa hydrolyse le substrat chromogène, libérant
le groupe chromophore pNA. La coloration est ensuite mesurée à 405 nm. La quantité de facteur Xa générée, et donc
l’intensité de la coloration, est proportionnelle à l’activité du facteur VIII dans l’échantillon. Afin d’éviter l’hydrolyse du
substrat chromogène par la thrombine formée, on ajoute en même temps que le substrat l’inhibiteur synthétique de la
thrombine.5-7
A 405 nm
Principe
(Dil)
La précision et la corrélation de ces résultats sont obtenues en utilisant un lot spécifique de réactifs et de contrôles.
0.00
0
20
40
60
80
100
Linéarité:
120
%
c. Nombre de dosages par trousse sur analyseur ELECTRA
Facteur VIII
jusqu’à 60
III. Méthode d’analyse sur les analyseurs de coagulation IL
Prendre contact avec le représentant local I.L. pour des informations relatives à chacune des applications disponibles.
a. Nombre de dosages par trousse sur les analyseurs ACL 8000/9000/10000
Facteur VIII
110 tests (approx.)
b. Nombre de dosages par trousse sur les analyseurs ACL Futura/ACL Advance
Facteur VIII
120 tests (approx.)
ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503
La courbe normale donne une linéarité de la méthode de 0,05-1,5 UI/mL et la courbe basse de 0,005-0,05 UI/mL
(Méthode en microplaque et tube).
La courbe normale donne une linéarité de la méthode de 0,10-1,2 UI/mL et la courbe basse de 0,00-0,10 UI/mL (ACL
8000/9000/10000).
La courbe haute donne une linéarité de la méthode de 0,38-3,82 UI/mL, la courbe normale de 0,09-1,5 UI/mL et la
courbe basse de 0,011-0,135 UI/mL
(ACL Futura/ACL Advance).
La linéarité est de 0,00-1,2 UI/mL sur l’analyseur ELECTRA.
Sensibilité:
Analyseur
Valeur haute
Valeur normale
Valeur basse
Méthode en microplaque
N/A
0,36
2,4
(mAbs/min pour 1 UI/dl d’activité FVIII)
ACL Futura/ACL Advance
0,035
0,035
0,306
(mAbs/min pour 1 UI/dl d’activité FVIII)
Limite de détection:
Analyseur
Valeur haute
Valeur normale
Valeur basse
Méthode en microplaque et tube UI/mLN/A
0,05
0,005
ACL Futura/ACL Advance UI/mL0,09 0,09 0,005
ITALIANO - Revisione dell’inserto 04/2016
Utilizzo
Preparazione
Metodo
Kit con substrato cromogenico per la determinazione fotometrica dell’attività del Fattore VIII nel plasma umano citratato.1
Permette il rilevamento delle carenze di Fattore VIII, il controllo dei pazienti in terapia sostitutiva e la valutazione
dell’attività dei concentrati di Fattore VIII.2
Chromogenic Substrate: Sciogliere il contenuto del flacone con 6 mL (tecniche in micropiastra e provetta e sistemi ACL
8000/9000/10000 e ACL Futura/ACL Advance) o 7 mL (sistemi ELECTRA) di acqua distillata.8 Chiudere con il tappo
e miscelare delicatamente. Assicurarsi della completa ricostituzione del prodotto. Mantenere il reagente a 15-25°C per
10-30 minuti e miscelare nuovamente prima dell’uso.
Factor reagent: Sciogliere il contenuto di ciascun flacone con 3 mL (tecniche in micropiastra e provetta e sistemi ACL
8000/9000/10000 e ACL Futura/ACL Advance) o 3,5 mL (sistemi ELECTRA) di acqua distillata.8 Chiudere con il tappo
e miscelare delicatamente. Assicurarsi della completa ricostituzione del prodotto. Mantenere il reagente a 15-25°C per
10-30 minuti e miscelare nuovamente prima dell’uso.
Buffer: Diluire con acqua distillata8 la quantità necessaria di tampone concentrato 1:10 (1+9) (tecniche in micropiastra e
provetta e sistemi ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACL Advance) o 1:8 (1+7) (sistemi ELECTRA). Identificare come
tampone di lavoro.
NOTA: Lotti diversi di reagenti non sono tra loro intercambiabili.
I. Tecniche in micropiastra e provetta
a. Diluizione dei campioni e dei controlli
Campioni/controlli
25 µL
Tampone di lavoro
2000 µL
Miscelare bene
b. Metodo in micropiastra
Aggiungere nei pozzetti della micropiastra:
Intervallo di misura
0-1,5 UI/mL
0-0,05 UI/mL
Campioni/controlli/standard diluiti
50 µL
50 µL
Miscelare e incubare a 37°C per
3-4 minuti
3-4 minuti
Reagente fattori (pre-riscaldato a 37°C)
50 µL
50 µL
Miscelare e incubare a 37°C per
2 minuti
4 minuti
Substrato cromogenico (pre-riscaldato a 37°C)
50 µL
50 µL
A. Metodo cinetico: leggere il ΔA/min a 405 nm
per 30 - 120 secondi.
B: Metodo end-point: procedere come segue:
Miscelare e incubare a 37°C per
2 minuti
10 minuti
Acido acetico al 20% o acido citrico al 2%
50 µL
50 µL
Miscelare
Leggere l’assorbanza contro il tampone di lavoro a 405 nm. Se possibile, leggere e sottrarre l’assorbanza a 490 nm per
compensare le differenze esistenti nel materiale dei pozzetti delle micropiastra.
c. Metodo in provetta
Usare 200 µL invece di 50 µL in tutte le fasi di pipettamento.
d. Determinazioni per kit
Tecniche in micropiastra: 120 Tecniche in provetta: 30
e.Calcoli
Sottrarre i valori di assorbanza (A) dei bianchi a quelli degli standard. Riportare su carta millimetrata la variazione
nell’assorbanza per minuto (ΔA/min) o l’assorbanza (A) degli standard rispetto alla loro concentrazione di fattore VIII.
Riportare ΔA/min o A sull’asse Y e le UI/mL di fattore VIII sull’asse X. Tracciare una linea retta con i punti ottenuti. I
campioni vanno determinati sulla base di questa curva standard.
Curva standard
Un esempio di una tipica curva standard secondo il metodo della micropiastra è mostrato qui sotto.
Fattore IXa, Ca2+, Fosfolipidi
1. Fattore X −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Fattore Xa
Fattore VIII
I reagenti sigillati sono stabili a 2-8°C fino alla data di scadenza stampata sull’etichetta del flacone.
Substrato cromogenico- Stabilità dopo la ricostituzione: 1 mese a 2-8°C nel flacone originale.
Reagente fattori - Stabilità dopo la ricostituzione: 12 ore a 2-8°C, 2 settimane a -30°C o 1 mese a -70°C nel flacone
originale. Non conservare a -20°C.
Tampone (tampone di lavoro) - Stabilità dopo la preparazione: 1 mese a 2-8°C.
Al termine dei cicli lavorativi si consiglia di conservare i reagenti a 2-8°C nel flacone originale per una migliore stabilità.
NOTA: Non utilizzare il substrato se la soluzione presenta un colore giallo.
Calibrazione
Fattore Xa
2. Substrato −−−−−−−−−−−−−−−−−> Peptide + pNA
Composizione
Il kit ELECTRACHROME Factor VIII è composto da:
S Chromogenic substrate (Nr. Cat. 4973050310): 1 flacone da 6 o 7 mL di substrato cromogenico liofilizzato
S-2765, N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl (7,7 mg/flacone) con aggiunta di un inibitore sintetico della trombina
I-2581 (0,2 mg/flacone) e di mannitolo.
E
Conservazione e stabilità dei reagenti
Factor reagent (Nr. Cat. 4973050320): 2 flaconi da 3 o 3,5 mL di reattivo Fattore IXa bovino (0,3 U/flacone) con
aggiunta di Fattore X (2,7 UI/flacone) e di trombina (1 UNIH/flacone) co-liofilizzati con CaCl2 (40 µmol/flacone) e
fosfolipidi (0,2 µmol/flacone).
B Buffer (Nr. Cat. 4973050330): 2 flaconi da 24 mL di tampone concentrato Tris 0,025 mol/L, pH 7,9, forza ionica
0,08 con aggiunta di Polibrene, NaCl e di albumina bovina serica.
ATTENZIONE:
Factor Reagent
Pericolo
Classe di pericolo: Resp. Sens. 1, H334
Indicazioni di pericolo: H334: Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato.
Consigli di prudenza: P261: Evitare di respirare la polvere/i fumi. P284: [Quando la ventilazione del locale è
insufficiente] indossare un apparecchio di protezione respiratoria. P304 + P340: IN CASO DI INALAZIONE:
trasportare l’infortunato all’aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. P342 + P311:
In caso di sintomi respiratori: contattare un CENTRO ANTIVELENI/un medico. P501: Smaltire il prodotto/recipiente in
conformità alla regolamentazione locale/regionale/ nazionale/ internazionale.
Informazioni supplementari sui pericoli: Contiene Factor IXa e Factor X. Fino al 63.1% di questa miscela è costituita
da ingredienti la cui tossicità acuta (orale, dermale, inalatoria) per la salute umana e la tossicità per l’ambiente acquatico
non è nota.
Chromogenic Substrate, Buffer:
Classe di pericolo: Nessuno
Indicazioni di pericolo: Nessuno
Consigli di prudenza: Nessuno
Informazioni supplementari sui pericoli: EUH210: Scheda dati di sicurezza disponibile su richiesta.
Chromogenic Substrate: Fino al 6.5% di questa miscela è costituita da ingredienti la cui tossicità acuta (orale, dermale,
inalatoria) per la salute umana e la tossicità per l’ambiente acquatico non è nota.
Buffer: Fino al 13% di questa miscela è costituita da ingredienti la cui tossicità acuta (orale, dermale, inalatoria) per la
salute umana e la tossicità per l’ambiente acquatico non è nota.
Contiene materiale di origine bovina, ottenuto da animali che non hanno mostrato sintomi di BSE né in vita né dopo la
morte. Ciò nonostante il materiale dovrebbe essere trattato come potenzialmente infetto.
Per uso diagnostico in vitro.
Per ogni nuovo numero di lotto di ELECTRACHROME Fattore VIII è necessaria una curva standard. Per la preparazione
degli standard, utilizzare il Plasma di Riferimento Normale e diluirlo con il tampone di lavoro come riportato in tabella.
Alcuni standard devono essere diluiti due volte. Miscelare delicatamente per inversione le provette di plastica durante le
varie fasi di preparazione e di diluizione degli standard di calibrazione.
Per valori di Fattore VIII inferiori a 0,05 UI/mL (pazienti con emofilia A), utilizzare l’intervallo basso.
NOTA: Il test dovrebbe essere effettuato entro 30 minuti dalla preparazione o dallo scongelamento dei campioni.
a. Preparazione degli standard
Pre-diluizione
Fattore VIII
Plasma
Tampone di lavoro
UI/mL
(µL)(µL)
Intervallo normale
1,42
25 0
1,00
25 0
0,50
100100
0,25
50150
0
00
Intervallo basso
0,050
1001900
0,024
502000
0,012
252000
0,006
254000
0
00
Diluizione finale
Fattore VIII
Plasma pre-diluito
Tampone di lavoro
UI/mL
(µL)(µL)
Intervallo normale
1,42
01400
1,00
02000
0,50
252000
0,25
252000
0
02000
Intervallo basso
0,050
252000
0,024
252000
0,012
252000
0,006
252000
0
02000
Normal range.
End-point method in microplate
0.8
Low range.
End-point method in microplate
0.4
0.6
A 405 nm
Il Fattore VIII è una proteina plasmatica ad alto peso molecolare che agisce come
co-fattore del Fattore IXa nell’attivazione da Fattore X a Fattore Xa.3 Una carenza di Fattore VIII causa una grave malattia
della coagulazione: l’emofilia A. La gravità di questo disturbo emorragico è inversamente correlata alla concentrazione del
Fattore VIII. Pazienti affetti da emofilia A sono in genere classificati, sulla base dell’attività del Fattore VIII, in tre categorie:
<0,01 UI/mL (emofila grave);
0,01-0,04 UI/mL (emofilia moderata);
0,05-0,25 UI/mL (emofilia leggera).4
In presenza di ioni calcio e di fosfolipidi, il Fattore X viene attivato a Fattore Xa dal Fattore IXa. Questa attivazione è
fortemente stimolata dal Fattore VIII che agisce come co-fattore. Usando quantità ottimali di Ca2+, fosfolipidi, Fattore IXa,
ed un eccesso di fattore X, la velocità di attivazione del Fattore X risulta correlata linearmente alla quantità di Fattore VIII
presente. Il Fattore Xa idrolizza il substrato cromogenico facendo così liberare il gruppo cromoforo pNA. Si misura quindi
il colore sviluppato a 405 nm. Il Fattore Xa così generato, e quindi l’intensità del colore, sono proporzionali all’attività del
fattore VIII presente nel campione. L’idrolisi del substrato cromogenico ad opera della trombina formatasi può essere
evitata aggiungendo al substrato un inibitore sintetico della trombina.5-7
A 405 nm
Principio del metodo
0.4
0.3
0.2
0.1
0.2
0
0
0
0.5
1
1.5
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
FVIII, IU/mL
FVIII, IU/mL
f.Risultati
I valori di assorbanza della curva standard dovrebbero rientrare nei seguenti limiti:
Metodo in micropiastra
Metodo in provetta
StandardAssorbanza
Assorbanza
Intervallo normale
Metodo
Metodo
Metodo Metodo
0-1,5 UI/mL
cinetico
end-point
cinetico
end-point
0,0 UI/mL
<0,06
<0,12
<0,14
<0,21
1,0 UI/mL
0,16-0,32
0,33-0,63
0,38-0,74 0,58-1,11
Intervallo basso
0-0,05 UI/mL
0 UI/mL
<0,02
<0,18
<0,04
<0,32
0,05 UI/mL
0,02-0,05
0,17-0,44
0,04-0,11
0,29-0,76
Symbols used / Verwendete Symbole / Símbolos utilizados / Symboles utilisés / Simboli impiegati / Símbolos utilizados
In Vitro Diagnostic Medical Device
In Vitro Diagnostikum
Dispositif medical de diagnostique in vitro
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Dispositivo médico para utilização em diagnóstico in vitro
Batch code
Chargenbezeichnung
Codigo de lote
Code du lot
Codice del lotto
Número de lote
Use by
Verwendbar bis
Fecha de caducidad
Utiliser jusque
Utilizzare entro
Data límite de utilização
Temperature limitation
Zulässiger Temperaturbereich
Limite de temperatura
Limites de température
Limite di temperatura
Límite de temperatura
Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA)
Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy)
Tel. + 1 800 678 0710
Consult instructions for use
Gebrauchsanweisung beachten
Consulte las instrucciones de uso
Consulter les instructions d’utilisation
Consultare le istruzioni per l’uso
Consultar as instruções de utilização
Control
Kontrollen
Control
Contrôle
Controllo
Controlo
Biological risks
Biologisches Risiko
Riesgo biológico
Risque biologique
Rischio biologico
Risco biológico
Manufacturer
Hersteller
Fabricante
Fabricant
Fabbricante
Fabricado por
Authorised Representative in the European Community
Bevollmächtigter in der Europäischen Union
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Mandataire dans la Communauté européenne
Mandatario nella Comunità Europea
Representante autorizado
303358 R3 04/2016
HemosIL®
ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503
ITALIANO - Revisione dell’inserto 04/2016
II. Metodo ELECTRA®
Preparazione dei Reagenti e degli Standard
1. Preparare il plasma di riferimento e i controlli come indicato nei rispettivi inserti. Lo strumento prepara
automaticamente i diversi standard di calibrazione.
2. Disporre i reagenti e il plasma di riferimento come indicato di seguito.
a. Impostazione degli strumenti ELECTRA
Strumento Protocollo n. canali
test
E1600C
4
4
Substrato
1
B
Chiaro
Volume
reagente
(µl)
75
5
F
Chiaro
75
4
Reagente
fattori
Substrato
1
B
Chiaro
75
Reagente
fattori
4
F
Chiaro
75
E1800C
E1400C
4
Tipo
reagente
Pompa Fessura
n.
Radiatore
Tipo reagente Posizione Vol. campione
campione
PRR
(µl)
Tampone di
lavoro
Standard FVIII
A
50
B
50
Tampone di
lavoro
Standard FVIII
A
50
B
50
NOTA: Fare riferimento alle istruzioni del manuale per il Modello ELECTRA utilizzato.
Calcoli: i valori dei pazienti vengono calcolati automaticamente dal confronto con la curva standard. I risultati di Fattore
VIII sono espressi in UI/mL.
b. Curva standard ELECTRA
Un esempio di una tipica curva standard su ELECTRA è mostrato qui sotto.
Tipo di grafico: lineare/lineare
Tipo di curva: lineare
Diluizione campione: 1:62
0.60
1:52
0.50
A
B
S
/
M
I
N
1:62
Precisione:
Qui di seguito sono riportati i valori dei coefficienti di variazione (CV %) di tre plasmi con livelli diversi di concentrazione
di fattore VIII determinati con il metodo della micropiastra. Ogni laboratorio dovrebbe determinare i propri valori dei
coefficienti di variazione.
Media FVIII
Nella serie
Tra giorni
Concentrazione
CV % n=42
CV % n=6 N=7
1,0 UI/mL
2,4%
2,1%
0,25 UI/mL
2,6%
5,9%
0,03 UI/mL
3,0%
3,9%
In ulteriori studi la precisione del kit ELECTRACHROME Fattore VIII è stata verificata eseguendo numerosi test.
Qui di seguito sono riportati i valori ottenuti:
ACL 8000/9000/10000
Media Fattore VIII (UI/mL)
0,90
0,39
0,07
CV (%)
5,15
6,06
4,57
ACL Futura/ACL Advance
Media (UI/mL)
CV % (nella serie)
CV % (Totale)
Intervallo alto
1,97
1,70
1,90
Intervallo alto
3,67
1,73
3,97
Intervallo normale
0,99
1,62
3,52
Intervallo normale
0,42
3,59
5,41
Intervallo basso
0,05
2,51
2,86
Intervallo basso
0,01
2,84
4,55
ELECTRA
Media (UI/mL)
CV % (nella serie)
CV % (Totale)
Plasma di Riferimento Normale
0,80
2,72
2,68
Plasma di Riferimento Anormale
0,25
2,15
2,43
Correlazione:
I test qui di seguito riportati mostrano una buona correlazione con Coatest Fattore VIII:
ELECTRACHROME FVIII (Metodo Manuale)
r=0,97
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = 0,07 + 0,94 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (Metodo in micropiastra)
r=0,96
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,11 + 1,09 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (ACL 100-7000)
r=0,97
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,13 + 1,16 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (ELECTRA MLA 900)
r=0,98
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,06 + 1,03 x UI/mL FVIII (Coatest)
In un ulteriore studio clinico sono state comparate le prestazioni del test ELECTRACHROME Fattore VIII su ACL 9000
con quelle di ELECTRA 1400C ottenendo un coefficiente di correlazione di 0,98.
UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 2,36 + 1,14 x UI/mL FVIII (ELECTRA 1400C)
In un ulteriore studio clinico sono state comparate, su ACL Futura, le prestazioni del test ELECTRACHROME Fattore VIII
con quelle del kit IL Test Fattore VIII (con l’impiego del reattivo APTT-SP) ottenendo un coefficiente di correlazione di 0,99.
UI/mL FVIII (ACL Futura) = = - 0,26 + 1,08 x UI/mL FVIII (kit IL Test Fattore VIII con reattivo APTT-SP)
I risultati dei test di precisione e di correlazione sono stati ottenuti usando uno specifico lotto di reagenti e controlli.
Materiali necessari ma non forniti
I seguenti prodotti non sono forniti insieme al kit e devono essere ordinati separatamente.
1. Plasma di Riferimento Normale (sistemi ELECTRA) o equivalente. Utilizzare lotti di numeri distinti per il controllo e la
curva standard.
2. Plasma Calibrante (sistemi ACL).
3. Plasma di Riferimento, Anormale (sistemi ELECTRA) o equivalente.
4. Controllo normale (sistemi ACL), codice prodotto 0020003110.
5. Controlli titolati rispetto a uno Standard Internazionale per il FVIII (sistemi ACL).
6. Acido acetico al 20% o acido citrico al 2% (solo per il metodo end-point).
7. Soluzione detergente (ACL 8000/9000/10000), codice prodotto 0009831700.
8. Spettrofotometro 405 nm (e 490 nm per procedimento su micropiastra).
9. Micropiastra* o cuvette semi-micro (1 cm).
10. Centrifuga, 2000 x g.
11. Dispositivo di riscaldamento, 37 ± 0,2°C.
12. Pipette graduate con una precisione pari almeno all’1%.
13. Provette in plastica.
14. Agitatore.
15. Cronometro.
16. Miscelatore Vortex.
17. Carta millimetrata.
18. Acqua distillata.8
*NOTA: Non utilizzare micropiastre per coating.
Per un completo programma di controllo di qualità si raccomanda l’uso di plasmi normali e patologici.10 Utilizzare
plasma di controllo appropriati con valori accertati di fattore VIII nell’intervallo della curva standard. Il Controllo normale
(sistemi di coagulazione ACL) e i Plasmi di Riferimento Normale e Anormale (sistemi ELECTRA) sono indicati per
questo programma. Ogni laboratorio dovrà stabilire i propri valori medi e le deviazioni standard per ogni controllo ed
individuare le corrette procedure di analisi. I controlli dovranno essere analizzati almeno una volta ogni 8 ore in accordo
con le esigenze del laboratorio. Consultare il Manuale dell’Operatore dello strumento per ulteriori informazioni. Per
l’identificazione e la risoluzione di situazioni particolari, fare riferimento all’articolo di Westgard et al.11
0.30
1:124
1:245
0.10
Prestazioni
I campioni vanno raccolti da paziente mantenuto a riposo prima del prelievo.
Aggiungere a nove parti di sangue fresco venoso una parte di trisodio citrato.9 Il plasma deve essere separato
immediatamente dalle cellule e analizzato entro 30 minuti. In alternativa il plasma puó essere conservato a -20°C per una
settimana o a -70°C per un anno. I campioni non devono essere conservati in frigoriferi a sbrinamento automatico e non
vanno scongelati e ricongelati prima dell’analisi. I campioni congelati devono essere trasportati in ghiaccio secco.
Per informazioni aggiuntive sulla preparazione, il trattamento e la conservazione dei campioni fare riferimento al
documento NCCLS H21-A3.9
ATTENZIONE: durante il congelamento e lo scongelamento dei campioni l’attività di Fattore VIII può diminuire del 20%, in
particolare se il plasma viene congelato lentamente.
Controllo di qualità
0.40
0.20
Preparazione dei campioni
Risultati
I risultati dei pazienti sono riportati in UI/mL e 1,0 UI/mL di FVIII è equivalente ad un’attività di FVIII del 100%. Riferirsi al
Manuale dell’Operatore per ulteriori informazioni.
(Dil)
Limitazioni/sostanze interferenti
0.00
0
20
40
60
80
100
I risultati del fattore VIII non sono influenzati da livelli di eparina fino a 1 UI/mL.
Non è stata riscontrata alcuna interferenza da altri farmaci.
Non si sono rilevate interferenze su ACL Futura/ACL Advance per valori fino a:
EmoglobinaTrigliceridi Bilirubina
Intervallo normale e intervallo alto
275 mg/dL
923 mg/dL
30 mg/dL
Intervallo basso
27 mg/dL
400 mg/dL
8 mg/dL
120
%
c. Determinazioni per kit su sistemi ELECTRA
Fattore VIII
fino a 60
III. Metodo per sistemi di coagulazione ACL
Per le metodiche e le procedure di lavoro contattare il personale IL.
a. Determinazioni per kit su sistemi ACL 8000/9000/10000
Fattore VIII
110 determinazioni (ca.)
b. Determinazioni per kit su sistemi ACL Futura/ACL Advance
Fattore VIII
120 determinazioni (ca.)
Valori attesi
Utilizzando il kit ELECTRACHROME Fattore VIII è stato determinato il seguente intervallo di riferimento:
Metodo
N
Intervallo (unità di misura)
Metodo in micropiastra
61
50 - 200 Attività %
(M=28, F=33; età compresa tra 21 e 55 anni)
A causa delle numerose variabili che possono influenzare i risultati, ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo
di riferimento.
ELECTRACHROME™ Factor VIII - 49730503
Linearità:
La curva standard è lineare nei seguenti intervalli:
- metodo manuale e in micropiastra: 0,05-1,5 UI/mL (intervallo normale) e 0,005-0,05 UI/mL (intervallo basso)
- ACL 8000/9000/10000: 0,10-1,2 UI/mL (intervallo normale) e 0,00-0,10 UI/mL (intervallo basso)
- ACL Futura/ACL Advance: 0,38-3,82 UI/mL (intervallo alto), 0,09-1,5 UI/mL (intervallo normale) e 0,011-0,135 UI/mL
(intervallo basso)
- ELECTRA: 0,00-1,2 UI/mL.
Sensibilità:
Sistema
Intervallo alto
Intervallo normale
Intervallo basso
Metodo in micropiastra
N/A
0,36
2,4
(mAbs/min per 1 UI/dl
di attività FVIII)
ACL Futura/ACL Advance
0,035
0,035
0,306
(mAbs/min per 1 UI/dl
di attività FVIII)
Limite di rilevabilità:
Sistema
Intervallo alto
Intervallo normale
Intervallo basso
Metodo in micropiastra N/A
0,05
0,005
e provetta UI/mL
ACL Futura/ACL Advance UI/mL
0,09
0,09
0,005
PORTUGUÊS - Revisão do folheto 04/2016
Aplicação Prevista
Método de ensaio
Materiais necessários mas não fornecidos
Para a determinação fotométrica da actividade do factor VIII em plasma humano citratado.1
Inclui a detecção da deficiência no factor VIII, monitorização de doentes em terapêutica de substituição e para estimar a
potência dos concentrados do factor VIII.2
I. Métodos de Microplaca e de tubo de Teste
a. Diluição das Amostras teste e Controlos
Amostra/controlo
25 µL
Tampão de trabalho
2000 µL
Misture bem
b. Método da Microplaca
Adicionar aos poços da Microplaca:
Intervalo do ensaio
0-1,5 UI/mL0-0,05 UI/mL
Amostras diluídas/controlos/padrões
50 µL
50 µL
Misturar e incubar a 37°C durante
3-4 minutos
3-4 minutos
Reagente factor (pré- aquecimento a 37°C)
50 µL
50 µL
Misturar e incubar a 37°C durante
2 minutos
4 minutos
Substrato cormogénico (pré- aquecimento a 37°C)
50 µL
50 µL
A. Método cinético: Ler ΔA/min a 405 nm
durante 30 - 120 segundos.
B: Método End-point: Proceder como descrito a seguir:
Misturar e incubar a 37°C durante
2 minutos
10 minutos
Ácido acético 20% ou ácido citríco 2%
50 µL
50 µL
Misturar
Leia a absorvância contra um branco de tampão de trabalho a 405 nm. Se possível leia e subtraia a absorvância a 490
nm, para compensar as diferenças causadas pelo material, dos poços das Microplacas.
c. Método do Tubo de Teste
Use 200 µL em vez de 50 µL para todas as etapas de pipetagem.
d.Determinações/kit
Método de Microplaca: 120 Método de tubo de Teste: 30
e.Cálculos
Subtraia as respectivas actividades do branco nos padrões, a partir das suas absorvâncias (A) a 405 nm.
Faça um gráfico das alterações na absorvância por minuto (ΔA/min) ou absorvância (A) para os padrões em relação à
sua concentração em factor VIII em papel de gráfico linear. Trace o gráfico ΔA/min ou A no eixo Y e o factor VIII UI/mL no
eixo X. Ligue os pontos padrão com a linha direita, que melhor se ajuste.
A avaliação das amostras baseia-se na curva padrão.
Curva Padrão
Em baixo está um exemplo de uma curva padrão típica (Método da Microplaca):
Este kit não inclui os produtos abaixo mencionados, pelo que deverão ser pedidos em separado:
1. Plasma de Referência Analisado-Normal (ELECTRA) ou equivalente.
Utilize diferentes n° de lote para a curva padrão e controlo.
2. Plasma de Calibração (Sistemas de Coagulação da IL).
3. Plasma de Referência Analisado-Anormal (ELECTRA) ou equivalente.
4. Controlo Normal (Sistemas de Coagulação da IL), Núm. Cat. 0020003120 / 0020003110.
5. Plasmas de controlo adequados, com valores titulados de acordo com os Padrões Internacionais de Factor VIII
(Sistemas de Coagulação da IL).
6. Ácido acético 20% ou ácido cítrico 2% (Método end-point).
7. Solução de limpeza (ACL 8000/9000/10000), Núm. Cat. 0009831700.
8. Fotómetro, 405 nm (490 nm para o procedimento com Microplaca).
9. Microplaca* ou cuvetes semi-micro (1 cm).
10. Centrífuga, 2000 x g.
11. Dispositivo de aquecimento, 37°C ± 0,2°C.
12. Pipetas calibradas com uma exactidão de 1% ou melhor.
13. Tubos de teste plásticos.
14. Misturador.
15. Cronómetro.
16. Misturador Vortex.
17. Papel de gráfico linear.
18. Água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS).
*NOTA: não utilize microplacas que se destinam a revestimento.
O factor VIII é uma proteína plasmática de elevado peso molecular que serve como cofactor do factor IXa na sua
activação de factor X a factor Xa.3
A deficiência de factor VIII causa um problema hemorrágico grave, hemofilia A.
A gravidade desta patologia hremorrágica é inversamente relacionada com a concentração do factor VIII. Os doentes
com hemofilia A são geralmente classificados de acordo com a sua actividade em factor VIII, em 3 categorias:
<0,01 UI/mL = grave,
0,01-0,04 UI/mL = moderada e
0,05-0,25 UI/mL = hemofilia ligeira.4
Na presença de iões cálcio e de fosfolípidos, o factor X é activado a factor Xa pelo factor IXa. Esta activação é
grandemente estimulada pelo factor VIII que actua como cofactor nesta reacção. Ao utilizar quantidades óptimas de
Ca2+, fosfolípidos, factor IXa e excesso de factor X, a velocidade de activação do factor X é linearmente relacionada com
a quantidade de factor VIII.
O factor Xa hidrolisa o substrato cromogénico, e liberta o grupo cromóforo,
para-Nitroanilina (pNA). A cor é lida fotometricamente a 405 nm. O factor Xa gerado,
e portanto a intensidade da cor, é proporcional à actividade do factor VIII na amostra.
A hidrólise do substrato cromogénico pela trombina é prevenida pela adição de um inibidor sintético da trombina,
juntamente com o substrato.5-7
Factor IXa, Ca2+, Fosfolípidos
1. Factor X −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Factor Xa
Factor VIII
Factor Xa
2. Substrato −−−−−−−−−−−−−−−−−> Peptido + pNA
Composição
O kit ELECTRACHROME Factor VIII é composto por:
S Chromogenic substrate (Núm. Cat. 4973050310): recipiente 1 x 6 ou 7 mL de substrato cromogénico liofilizado
S-2765, N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA.2HCl (7,7 mg/recipiente), Inibidor da Trombina sintético I-2581 (0,2 mg/
recipiente) e manitol como estabilizador.
E
Factor reagent (Núm. Cat. 4973050320): recipientes 2 x 3 ou 3,5 mL de uma preparação que contém Factor
bovino IXa (0,3 U/recipiente), Factor X
(2,7 UI/ recipiente) e Trombina (1 NIH-U/recipiente) coliofilizada com CaCl2 (40 µmol/recipiente) e fosfolípidos (0,2
µmol/recipiente).
B
Preparação
Chromogenic Substrate: Dissolver o conteúdo do recipiente em 6 mL (Métodos de Microplaca e de tubo de Teste, ACL
8000/9000/10000 e ACL Futura/ACLAdvance) ou
7 mL (Método ELECTRA) de água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS).8 Fechar o recipiente e homogeneizar
suavemente. Verificar se o produto fica completamente dissolvido. Conservar o reagente entre 15 e 25°C durante 10-30
minutos. Misturar suavemente invertendo o recipiente, antes de utilizar.
Factor reagent: Dissolver o conteúdo de cada recipiente em 3 mL (Métodos de Microplaca e de tubo de Teste, ACL
8000/9000/10000 e ACL Futura/ACLAdvance) ou 3,5 mL (Método ELECTRA) de água destilada (tipo II de acordo com
a NCCLS).8 Fechar o recipiente e homogeneizar suavemente. Verificar se o produto fica completamente dissolvido.
Conservar o reagente entre 15 e 25°C durante
10-30 minutos. Misturar suavemente invertendo o recipiente, antes de utilizar.
Buffer: (Solução concentrada) - diluída pela mistura de 1 volume de solução concentrada com 9 volumes (Métodos de
Microplaca e de tubo de Teste,
ACL 8000/9000/10000 e ACL Futura/ACLAdvance) ou 7 volumes de água destilada (tipo II de acordo com a NCCLS).8
Identifique como tampão de trabalho.
NOTA: Os reagentes não são inter-comutáveis entre lotes.
Conservação e estabilidade do reagente
Os reagentes fechados, que ainda não foram utilizados, são estáveis até ao final do prazo de validade, que consta no
rótulo, desde que conservados entre 2-8°C.
Substrato cromogénico - Estabilidade depois da reconstituição: 1 mês a 2-8°C dentro do recipiente original.
Reagente factor - Estabilidade depois da reconstituição: 12 horas a 2-8°C, 2 semanas a -30°C ou 1 mês a -70°C dentro
do recipiente original. Evite a conservação a -20°C.
Tampão de trabalho - Estabilidade depois da sua preparação: 1 mês a 2-8°C.
Para obter uma estabilidade óptima retire os reagentes do aparelho e conserve-os entre 2-8°C, nos recipientes originais.
NOTA: Rejeite se a solução de substrato, surgir amarela.
A 405 nm
Buffer (Núm. Cat. 4973050330): recipientes 2 x 24 mL de Tampão Tris 0,025 mol/L (solução concentrada), pH 7,9,
força iónica 0,08 com polibrene, NaCl e albumina de soro bovino.
AVISOS E PRECAUÇÕES:
Factor Reagent
Perigo
Classe de perigo: Resp. Sens. 1, H334
Advertências de perigo: H334: Quando inalado, pode provocar sintomas de alergia ou de asma ou
dificuldades respiratórias.
Recomendações de prudência: P261: Evitar respirar as poeiras/fumos. P284: [Em caso de ventilação
inadequada] usar proteção respiratória. P304 + P340: EM CASO DE INALAÇÃO: retirar a pessoa para uma zona ao ar
livre e mantê-la numa posição que não dificulte a respiração. P342 + P311: Em caso de sintomas respiratórios: contacte
um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS/medico. P501: Eliminar o conteúdo/recipiente em conformidade com
os regulamentos locais/ regionais/ nacionais/internacionais.
Informações perigo suplementar: Contém Factor IXa e Factor X. Até 63.1% da mistura é constituído por ingredientes
cuja toxicidade aguda (oral, dérmica, por inalação) para a saúde humana e cujo risco para o ambiente aquático não são
conhecidos.
Chromogenic Substrate, Buffer:
Classe de perigo: nenhuma
Advertências de perigo: nenhuma
Recomendações de prudência: nenhuma
Informações perigo suplementar: EUH210: Ficha de segurança fornecida a pedido.
Chromogenic Substrate: Até 6.5% da mistura é constituído por ingredientes cuja toxicidade aguda (oral, dérmica, por
inalação) para a saúde humana e cujo risco para o ambiente aquático não são conhecidos.
Buffer: Até 13% da mistura é constituído por ingredientes cuja toxicidade aguda (oral, dérmica, por inalação) para a
saúde humana e cujo risco para o ambiente aquático não são conhecidos.
Contém material de origem bovina. Todos os animais dadores eram oriundos de manadas isentas de BSE. Todo o gado
foi inspeccionado ante e post-mortem por um veterinário e aparentemente não estavam infectados nem continham
material contagioso. No entanto, o material deve ser tratado como potencialmente infeccioso.
Para uso em diagnóstico in vitro.
Low range.
End-point method in microplate
0.4
0.6
0.4
0
0.5
1
0.2
Valores Esperados
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
FVIII, IU/mL
FVIII, IU/mL
f.Resultados
Os valores de absorvância para a curva padrão devem estar dentro dos seguintes limites:
II. Método ELECTRA®
Preparação dos Reagentes e dos Padrões
1. Prepare o plasma de referência e os controlos como indicado nas respectivas circulares de instruções. O aparelho
prepara automaticamente os pontos das curvas padrões individuais
2. Coloque os reagentes, e o plasma de referência, conforme indicado abaixo.
a. Programação do Utilizador do aparelho ELECTRA
E1600C
4
4
Substrato
5
F
Claro
4
Reagente
fator
Substrato
1
B
Claro
75
Reagente
fator
4
F
Claro
75
4
Núm de Ranhura
bomba
de
bomba
1
B
Bomba
D.T.C.
Volume Tipo de reagente Posição Volume amostra
reagente de amostragem
PPR
(µl)
(µl)
75
Tampão de
A
50
trabalho
75
Plasma de Ref.
B
50
Núm de
canais
E1800C
E1400C
Tipo de
reagente
Protocolo
de teste
Claro
Tampão de
trabalho
Plasma de Ref.
A
50
B
50
NOTA: Consulte o Manual de referência para o modelo específico do aparelho ELECTRA, para obter instruções.
Cálculos: Os valores dos doentes são normalmente automaticamente calculados, por comparação com a curva padrão
e resultados do factor VIII são expressos em UI/mL.
b. Curva Padrão ELECTRA
A seguir está um exemplo de uma curva padrão típica (Método ELECTRA):
Tipo de gráfico: Linear/Linear
Tipo de curva: Linear
Diluição da Amostra: 1:62
0.60
1:52
0.50
A
B
S
/
M
I
N
Efectuou-se um estudo de intervalo normal de valores com o kit ELECTRACHROME Factor VIII.
Método
N
Intervalo (unidades)
Método da Microplaca
61
50 - 200 actividade %
(M=28, F=33; com idades entre 21 a 55 anos)
Devido a várias variáveis que podem afectar os resultados, cada laboratório deve estabelecer os seus intervalos de
valores normais.
Características técnicas
Método da Microplaca
Método do Tubo de Teste
PadrãoAbsorvância
Absorvância
Gama normal
Método
Método
Método
Método
0-1,5 UI/mL
cinético
End-point
cinético
End-point
0,0 UI/mL
<0,06<0,12
<0,14<0,21
1,0 UI/mL
0,16-0,320,33-0,63
0,38-0,740,58-1,11
Limite baixo
0-0,05 UI/mL
0 UI/mL
<0,02<0,18
<0,04<0,32
0,05 UI/mL
0,02-0,050,17-0,44
0,04-0,110,29-0,76
Aparelho
Resultados
Não existe interferência nos resultados do factor VIII causada por níveis de heparina até 1 UI/mL.
Não foi notificada nenhuma interferência causada por fármacos.
Não existe interferência nos Sistemas ACL Futura/ACL Advance, até aos seguintes valores:
HemoglobinaTriglicéridos Bilirrubina
Intervalo normal e intervalo alto
275 mg/dL
923 mg/dL
30 mg/dL
Intervalo baixo
27 mg/dL
400 mg/dL
8 mg/dL
0
1.5
Para realizar um programa completo de Controlo de Qualidade, recomenda-se a utilização dos controlos normais
e anormais.10 Devem ser utilizados, os plasmas de controlo adequados, com valores titulados para o Factor VIII
no intervalo da curva padrão. Os controlos da IL adequados para este programa são o Controlo Normal (Sistemas
de Coagulação da IL) e o Plasma de Referência Analisado- Normal e Anormal (ELECTRA). Cada laboratório deve
estabelecer a sua própria média e desvio padrão e deve efectuar um programa de controlo de qualidade para
monitorizar os seus resultados. Os controlos devem ser analisados uma vez em cada turno de 8 horas, de acordo com
a norma vigente no Laboratório. Ver Manual do Operador para mais informações. Consultar a publicação de Westgard e
col. para identificar e solucionar situações anormais do Controlo de Qualidade.11
Limitações/interferências
0.3
0
0
Controlo de Qualidade
Os resultados do factor VIII são expressos em UI/mL. 1,0 UI/mL de FVIII é equivalente a 100% FVIII. Para mais
informações consultar o Manual do Operador do Aparelho.
0.1
0.2
Calibração
É necessária uma curva padrão para cada novo n° de lote de ELECTRACHROME Factor VIII. Para preparação dos
lotes, use Plasma de Referência Analisado-Normal. Dilua com tampão de trabalho para atingir os seguintes rácios.
Alguns padrões serão diluídos 2 vezes, com tampão de trabalho. Misturar suavemente por inversão em tubos de teste
plásticos entre e depois das diluições.
Para níveis de factor VIII abaixo de 0,05 UI/mL (Hemofília A doentes), deve ser usado o intervalo baixo.
NOTA: O teste deve realizar-se no espaço de 30 minutos, após colheita da amostra e preparação ou descongelamento
das amostras de plasma.
Preparação dos Padrões
Diluição primária
Plasma de Referência
Analisado-Normal
Tampão de
Factor VIII
Amostra primária
trabalho
UI/mL
(µL)(µL)
Gama normal
1,42
25 0
1,00
25 0
0,50
100100
0,25
50150
0
00
Limite baixo
0,050
1001900
0,024
502000
0,012
252000
0,006
254000
0
00
Diluição secundária
Plasma da
Diluição
Tampão de
Factor VIII
Primária
trabalho
UI/mL
(µL)(µL)
Gama normal
1,42
01400
1,00
02000
0,50
252000
0,25
252000
0
02000
Limite baixo
0,050
252000
0,024
252000
0,012
252000
0,006
252000
0
02000
Normal range.
End-point method in microplate
0.8
A 405 nm
Resumo e Príncipio
1:62
Precisão:
Os dados seguintes mostram o coeficiente de variação (CV%) para 3 diferentes concentrações plasmáticas de factor
VIII, conforme determinado pelo Método da Microplaca. Cada laboratório deve estabelecer os seus dados de precisão.
Média Factor VIII
(Intra-série)
(Dia para dia)
Concentração
CV% n=42
CV% n=6 N=7
1,0 UI/mL2,4% 2,1%
0,25 UI/mL2,6% 5,9%
0,03 UI/mL3,0% 3,9%
Em estudos adicionais, a precisão foi avaliada, intra e na totalidade (de análise para análise e de dia para dia) do
ELECTRACHROME Factor VIII, ao longo de vários ensaios.
Obtiveram-se os seguintes dados:
ACL 8000/9000/10000
Média Factor VIII (UI/mL)
0,900,390,07
CV (%)
5,15
6,064,57
ACL Futura/ACL Advance
Média (UI/mL)
CV% (Intra-série)
CV% (Total)
Intervalo alto
1,97
1,70
1,90
Intervalo alto
3,67
1,73
3,97
Intervalo normal
0,99
1,62
3,52
Intervalo normal
0,42
3,59
5,41
Intervalo baixo
0,05
2,51
2,86
Intervalo baixo
0,01
2,84
4,55
ELECTRA
Média (UI/mL)
CV% (Intra-série)
CV% (Total)
Plasma de Referência
0,80
2,72
2,68
Analisado-Normal
Plasma de Referência
0,25
2,15
2,43
Analisado-Anormal
Correlação:
Os ensaios mostram uma forte correlação com o ensaio Coatest Factor VIII:
ELECTRACHROME FVIII (Método do Tubo de Teste)
r=0,97
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = 0,07 + 0,94 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (Método da Microplaca)
r=0,96
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,11 + 1,09 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (ACL 100-7000 ou ACL Classic)
r=0,97
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,13 + 1,16 x UI/mL FVIII (Coatest)
ELECTRACHROME FVIII (ELECTRA MLA 900)
r=0,98
n=25
UI/mL FVIII (ELECTRACHROME) = -0,06 + 1,03 x UI/mL FVIII (Coatest)
Em estudos adicionais comparando o desempenho do ensaio ELECTRACHROME Factor VIII num ACL 9000 versus o
ELECTRA 1400C, o ceficiente de correlação obtido foi de 0,98.
UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 2,36 + 1,14 x UI/mL FVIII (ELECTRA 1400C)
Em estudos adicionais comparando o desempenho do ensaio ELECTRACHROME Factor VIII num ACL Futura versus o
ensaio IL Test Factor VIII com o reagente APTT-SP, o coeficiente de correlação obtido foi de 0,99.
UI/mL FVIII (ACL 9000) = - 0,26 + 1,08 x UI/mL FVIII (ensaio IL Test FVIII com o reagente APTT-SP)
Estes resultados de precisão e de correlação foram obtidos utilizando lotes específicos, de reagente e de controlo.
Lineariedade:
0.40
0.30
1:124
0.20
1:245
0.10
(Dil)
0.00
0
20
40
60
80
100
120
%
c. Determinações/kit nos Sistemas ELECTRA
Factor VIII
até 60
III. Método nos Sistemas de Coagulação IL
Contacte o seu representante local IL para as instruções relativas à aplicação.
a. Determinações/kit nos Sistemas ACL 8000/9000/10000
Factor VIII
110 testes (aprox.)
b. Determinações/kit nos Sistemas ACL Futura/ACL Advance
Factor VIII
120 testes (aprox.)
A curva padrão é linear no intervalo normal a partir de 0,05-1,5 UI/mL e no intervalo baixo a partir de 0,005-0,05 UI/mL
(Métodos de Microplaca e de tubo de Teste).
A curva padrão é linear no intervalo normal a partir de 0,10-1,2 UI/mL e no intervalo baixo a partir de 0,00-0,10 U/mL
(ACL 8000/9000/10000).
A curva padrão é linear no intervalo alto a partir de 0,38-3,82 UI/mL, no intervalo normal a partir de 0,09-1,5 UI/mL e no
intervalo baixo a partir de 0,011-0,135 UI/mL (ACL Futura/ACL Advance).
A curva padrão é linear no intervalo a partir de 0,00-1,2 UI/mL (ELECTRA).
Sensibilidade:
Sistema
Intervalo alto
Intervalo normal
Intervalo baixo
Método da Microplaca
N/A
0,36
2,4
(mAbs/min por 1 UI/dL
de actividade FVIII)
ACL Futura/ACL Advance
0,035
0,035
0,306
(mAbs/min por 1 UI/dL
de actividade FVIII)
Limite de detecção:
Sistema
Intervalo alto
Intervalo normal
Intervalo baixo
Métodos de Microplaca
N/A
0,05
0,005
e de tubo de Teste UI/mL
ACL Futura/ACL Advance UI/mL0,09 0,09 0,005
Recolha e preparação da amostra
Os doentes devem estar em repouso e sem stress, antes da recolha.
Adicionar nove partes de sangue extraído recentemente por punção venosa a uma parte de citrato trissódico.9 O plasma
devem ser separado das céluas o mais cedo possível e o teste deve ser realizado no intervalo de 30 minutos. Se o
plasma não for analisado imediatamente, conserve a -20°C durante o máximo de uma semana ou
a -70°C, durante o máximo de 1 ano. Não conserve num frigorifico auto-descongelante. Não descongele ou recongele as
amostras antes de utilizar. No transporte, as amostras congeladas têm de ser mantidas em gelo seco.
Para efectuar a recolha, o manuseamento e a conservação da amostra devem
seguir-se as recomendações referidas no documento H21-A3 da NCCLS.9
NOTA: As perdas que atingem cerca de 20%de actividade do factor VIII podem ocorrer durante a congelação e a
descongelação, especialmente se o plasma for congelado lentamente.
Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA)
Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy)
Tel. + 1 800 678 0710
303358 R3 04/2016
ELECTRACHROME™ FVIII49730503
Printed Insert Sheet: 303358
Revision: R3
Issued:04/2016
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