Análisis de la ubiquitinación de proteínas en la diferenciación de

Análisis de la ubiquitinación de proteínas en la
diferenciación de Giardia intestinalis
Carlos Alberto Niño Suárez M.Sc
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2011
Análisis de la ubiquitinación de proteínas en la
diferenciación de Giardia intestinalis
Carlos Alberto Niño Suárez M.Sc
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optarl al título de:
Doctor en Ciencias – Química (Dr.Sc.)
Director:
Moisés Wasserman PhD
Línea de Investigación:
Bioquímica
Grupo de Investigación:
Laboratorio de Investigaciones Básicas en Bioquímica – LIBBIQ
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2011
2
Resumen
Estudiamos la ubiquitinación de proteínas en el eucariota tempranamente divergente Giardia
intestinalis con el propósito de hacer inferencias sobre los papeles tempranos o primitivos de la
Ub y la ubiquitinación en el linaje eucariota. Encontramos que el gen de la enzima activadora de
Ub – E1 es esencial y es regulado durante la enquistación, además interesantemente la
proteína se localiza en la pared de los quistes. En cuanto a la expresión de la Ub y los patrones
de proteínas ubiquitinadas determinamos que hay diferencias entre los patrones de proteínas
ubiquitinadas citoplasmáticas y nucleares. Durante la enquistación la ubiquitinación se ve
drásticamente afectada, observándose una disminución considerable en la cantidad de
proteínas ubiquitinadas. La localización de especies de Ub mostró presencia de proteínas mono
y poli-ubiquitinadas en el citoplasma, y una fuerte señal de proteínas mono-ubiquitinadas en los
núcleos, además señales en la periferia sugieren asociación de ubiquitinación con vacuolas
periféricas similares a lisosomas (PVs), y localización en la pared del quiste sugiere una
asociación con esta matriza. Identificamos como posibles proteínas efectoras (proteínas de
unión a Ub - UBPs) a la enzima E1, dos proteínas de la subunidad reguladora del proteosoma
(Rpn2 y Rpn6), dos enzimas DUBs (Ubp14 y Doa4) y dos chaperonas (Bip y Hsp90-NT).
Identificamos proteínas ubiquitinadas en trofozoítos y durante la enquistación. De acuerdo con
las proteínas identificadas proponemos que la ubiquitinación en G.intestinalis participa en una
amplia gama de procesos celulares entre ellos: transcripción y traducción, regulación de la
expresión génica a través de la modificación de histonas, endocitosis y tráfico intracelular de
proteínas, control del ciclo celular, dinámica del citoesqueleto, plegamiento de proteínas y
ERAD, y en la biosíntesis de la pared del quiste entre otros. Nuestros resultados sugieren que la
ubiquitinación es indispensable en el desarrollo y diferenciación de G.intestinalis. Además que
más que en procesos asociados con degradación proteosomal la ubiquitinación tiene un papel
en procesos no degradativos indispensables en el desarrollo de este eucariota primitivo.
Palabras clave: Ubiquitinación, Ubiquitina, Giardia intestinales, enquistación, enzima activadora
de ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina, proteínas ubiquitinadas.
3
Abstract
Here we study the protein Ubiquitination in the early-branching eukaryote Giardia intestinalis as
a model to do inferences about the primitive or early roles of Ubiquitin and ubiquitination in the
eukaryote linage. We found that ubiquitin activating enzyme (E1) gene is esential and is
regulated during encystation, besides the protein localize in the cyst wall. About ubiquitina
expresión and ubiquitinated proteins pattern we found that are diferences in the citiplasmatic and
nuclear patterns. Ubiquitination is regulated during encystation, we observed a drastically
decrease in ubiquitinated proteins when this diferentation process is induced. Localization of
ubiquitin species show presence of mono- and poli-ubiquitinated proteins in citoplasm, and
strong signal of mono-ubiquitinated proteins in nucleus, a peipheral localization suggets
asociation between poli-ubiquitinated proteins and lysosoma-like peripheral vacuoles (PVs),
morover a relationship with the cyst wall. We identify ubiquitin binding proteins: the E1 enzyme,
the proteasome subunits Rpn2 and Rpn6, the DUBs Ubp14 and Doa4, and the chaperons Bip
and Hsp90-NT. We identify ubiquitinated proteins in trophozoites and during encystation, these
proteins suggest that ubiquitination is involven in several cellular processes in G.intestinalis:
transcription and translation, gene expression regulation, endocytosis, cell cycle control,
cytoskeleton dynamics, folding of proteins and ERAD, and the cyst wall bioshyntesis.
Our
results suggest that ubiquitination is important in G.intestinalis’s development and diferentiation.
Moreover, the ubiquitination roles in non-degradative process are the indispensable roles in
G.intestinalis’s biology.
Keywords: Ubiquitination, ubiquitina, Giardia intestinales, encystation, ubiquiting activating
enzyme, ubiquitina binding proteins, ubiquitinated proteins.
4
Contenido
Pág.
Resumen .................................................................................................................................... 3
Abstract ..................................................................................................................................... 4
Abreviaturas .............................................................................................................................. 8
Índice de Figuras ....................................................................................................................... 9
Capítulo 1 Motivación, hipótesis y objetivo .......................................................................... 11
Capítulo 2 Ubiquitinación ....................................................................................................... 14
2.1. Mecanismo de conjugación de ubiquitina. ................................................................. 15
2.1.1. Enzima activadora de ubiquitina (E1) ....................................................................... 16
2.1.2. Enzima conjugadora de ubiquitina (E2) ................................................................... 18
2.1.3. Enzima ligadora de ubiquitina (E3-Ligasas) ............................................................. 19
2.1.4. Enzimas desubiquitinadoras (DUBs)........................................................................ 21
2.1.5. El Proteosoma 26S .................................................................................................. 21
2.1.6. Mecanismos de selección y reconocimiento del sustrato a ubiquitinar ..................... 23
2.2. Complejidad y diversidad de la señal. ........................................................................ 24
2.3. Efectores de la señal – Dominios de unión a ubiquitina (UBDs) ............................... 27
2.4. Papeles de la ubiquitinación ........................................................................................ 30
2.4.1. Ubiquitinación en el control del ciclo celular ............................................................. 30
2.4.2. Ubiquitinación en regulación de la transcripción – modificación de Histonas ........... 33
2.4.3. Ubiquitinación en endocitosis................................................................................... 34
2.4.4. Ubiquitinación y degradación en el retículo endoplasmático (ERAD) ....................... 38
Capítulo 3 Giardia Intestinalis – modelo celular ................................................................... 42
3.1. Ciclo de vida de Giardia intestinalis ............................................................................ 43
3.1.1. El quiste ................................................................................................................... 45
3.1.2. El trofozoíto ............................................................................................................. 46
3.2. Procesos de diferenciación ......................................................................................... 48
3.2.1. Exquistación ............................................................................................................ 49
3.2.2. Enquistación ............................................................................................................ 50
3.3. Ubiquitinación en Giardia intestinalis ......................................................................... 53
Capítulo 4 Estrategia experimental y métodos ..................................................................... 55
4.1. Obtención de células y extractos de trofozoítos, células enquistantes y quistes .57
4.1.1. Cultivo y diferenciación de G.intestinalis. ................................................................. 57
4.1.2. Preparación de extractos proteicos. ......................................................................... 58
4.2. Caracterización bioquímica y funcional de la enzima activadora de ubiquitina (E1)
de G.intestinalis. .................................................................................................................. 58
4.2.1. Expresión del RNA mensajero: extracción de RNA, síntesis de cDNA y PCR en
tiempo real......................................................................................................................... 58
5
4.2.2. Análisis de la expresión de la proteína E1. .............................................................. 60
4.2.2.1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes rgNTE1 y rgCTE1. .......... 61
4.2.2.2. Producción de los anticuerpos policlonales en ratón anti-gNTE1 y antigCTE1..63
4.2.2.3. Inmunodetección e inmunofluorescencia. ............................................................ 64
4.2.3. Sobre-expresión de la proteína E1........................................................................... 65
4.2.4. Inhibición de la expresión del gen e1 por silenciamiento antisentido........................ 67
4.3. Análisis de la expresión y localización de la Ub y diferentes especies de Ub en
trofozoítos y durante la enquistación de G.intestinalis. ................................................... 68
4.3.1. Inmunoblot para detectar la Ub (Ub-inmunoblot)...................................................... 68
4.3.2. Inmunoprecipitación de especies de Ub................................................................... 69
4.3.3. Inmunolocalización de especies de Ub. ................................................................... 69
4.4. Identificación de proteínas de unión a ubiquitina en Giardia intestinalis. ............... 70
4.4.1. Producción y purificación de proteínas recombinantes GST, GST-Ub y GST-Ub3. .. 70
4.4.2. “Pull down” y SDS-PAGE......................................................................................... 70
4.4.3. Identificación de proteínas por LC-MS/MS ............................................................... 71
4.5. Identificación de proteínas ubiquitinadas................................................................... 72
4.5.1. Desarrollo del sistema de ubiquitinación in vitro ....................................................... 72
4.5.2. Purificación e identificación de proteínas His6Ub-ubiquitinadas. .............................. 73
Capítulo 5 Resultados y Discusión ........................................................................................ 74
5.1. Una E1 con modificaciones inusuales – el análisis de la enzima activadora de Ub
(E1) de G.intestinalis muestra a la ubiquitinación como un proceso fundamental para
su supervivencia y diferenciación...................................................................................... 74
5.1.1. La secuencia de la proteína E1 de G.intestinalis presenta todos los dominios
característicos de esta familia de proteínas. ...................................................................... 74
5.1.2. Desarrollo de anticuerpos policlonales anti-gE1....................................................... 76
5.1.3. La proteína E1 de G.intestinalis sufre un procesamiento proteolítico posttraduccional. ...................................................................................................................... 79
5.1.4. La expresión de E1 es regulada durante la enquistación. ........................................ 81
5.1.5. Modelo de los eventos proteolíticos que sufre la proteína E1. ................................. 84
5.1.6. Localización de la proteína E1 durante la enquistación............................................ 86
5.1.7. La proteína E1 es esencial en los trofozoítos y esta implicada en la enquistación. .. 88
5.2. Los patrones de proteínas ubiquitinadas y la localización de especies de ubiquitina
sugieren una asociación entre la ubiquitinación y la biología de G.intestinalis. ............ 91
5.2.1. El conjunto de proteínas ubiquitinadas es regulado durante la enquistación de
G.intestinalis. ..................................................................................................................... 91
5.2.2. Diferentes especies de ubiquitina presentan diferentes patrones de localización
celular tanto en trofozoítos como durante la enquistación. ................................................ 95
5.2.2.1. Distribución del conjunto completo de especies de Ub ....................................... 95
5.2.2.2. Distribución de proteínas poli-ubiquitinadas......................................................... 96
5.2.2.3. Distribución del conjunto de proteínas mono- y multi-mono-ubiquitinadas. ........ 98
5.2.2.5. Distribución de proteínas Lys63-poly-ubiquitinadas. ......................................... 102
6
5.3. Identificación de proteínas efectoras de la señal de ubiquitinación: proteínas del
sistema Ub-proteosoma y dos chaperonas candidatas a proteínas de unión a Ub en
G.intestinalis. ..................................................................................................................... 105
5.3.1. Producción de proteínas GST, GST-Ub y GST-Ub3. .............................................. 105
5.3.2. El establecimiento del ensayo de “pull down” revela uan fuerte actividad cisteína
proteasa en G.intestinalis. ............................................................................................... 106
5.3.3. Proteínas del sistema Ub-proteosoma y dos chaperonas candidatas a proteínas de
unión a Ub en G.intestinalis. ............................................................................................ 109
5.3.3.1. Enzima activadora de Ub (E1). ........................................................................... 111
5.3.3.2. Subunidades de la partícula regulatoria del proteosoma: Rpn2 y Rpn6. .......... 112
5.3.3.3. Enzimas desubiquitinadoras Ubp14 y Doa4. ..................................................... 115
5.3.3.4. Las chaperonas moleculares Bip y Hsp90 parecen tener relación con el sistema
de ubiquitinación en G.intestinalis. .................................................................................. 118
5.4. La identificación de proteínas ubiquitinadas en G.intestinalis sugiere participación
de la ubiquitinación en diversos procesos celulares de este organismo. .................... 122
5.4.1. Desarrollo de un sistema de ubiquitinación in vitro derivado de G.intestinalis. ....... 122
5.4.2. La implementación del sistema de ubiquitinación in vitro revela de nuevo que el
conjunto de proteínas ubiquitinadas es regulado durante la enquistación de
G.intestinalis………………………………………………………………………………………124
5.4.3. Purificación de las proteínas His6Ub-ubiquitinadas generadas en la reacción in
vitro…………………………………………………………………………………………………126
5.4.4. La identidad de las proteínas ubiquitinadas relaciona la ubiquitinación con una
amplia gama de proceso celulares involucrados en el desarrollo y la diferenciación de
G.intestinalis. ................................................................................................................... 129
5.4.4.1. Ubiquitinación en transcripción y traducción. ..................................................... 132
5.4.4.2. Histonas – Ubiquitinación en la regulación de la estructura de la cromatina. ... 133
5.4.4.3. Kinasas – Ubiquitinación en la regulación del ciclo celular. .............................. 134
5.4.4.4. Proteínas relacionadas con endocitosis y transporte – Ubiquitinación en la
regulación de la internalización y tráfico de proteínas. ................................................... 136
5.4.4.5. Proteínas de membrana y citoesqueleto – Ubiquitinación en dinámica del
citoesqueleto y posible participación en variación antigénica. ........................................ 137
5.4.4.6. Ubiquitinación en la biosíntesis de la matriz de la pared del quiste. ................. 138
5.4.4.7. Ubiquitinación en plegamiento de proteínas y ERAD ........................................ 139
Conclusiones ......................................................................................................................... 140
Referencias ............................................................................................................................ 143
ANEXOS ................................................................................................................................. 153
7
Abreviaturas
____________________________________________________
Las siguientes son las abreviaturas mas utilizadas en el texto
AP: Complejo de proteínas adaptadoras
APC/C: Complejo promotor de la anafase
C-terminal: Carboxilo-terminal
CDK: Kinasa dependiente de ciclina
CWP: Proteína de la pared del quiste – cyst wall protein
DUB: Enzimas desubiquitinadoras
ESCP: Cisteína-proteasa específica de la enquistación – enquistation -specific cysteine
protease
ER: Retículo endoplasmático
ERAD: Degradación asociada al retículo endoplasmático - endoplasmic-reticulum-associated
degradation
ESCRT: Complejo de clasificación endosomal requerido para transporte – endosomal sorting
complex required for transport
ESG: Genes específicos de la enquistación – encystation-specific genes
ESV: Vesículas específicas de La enquistación – enquistation-specific vesicles
GalNAc: Polisacárido de N-acetilgalactosamina
HECT-E3-ligasa: Enzima E3 ligasa com domínio HECT
Lys: Lisina
Lys6-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 6
Lys11-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 11
Lys27-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 27
Lys29-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 29
Lys33-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 33
Lys48-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 48
Lys63-poliUb: Cadenas de poli-ubiquitina enlazadas a través de lisina 63
monoUb: Mono-ubiquitina
MVB: Cuerpo multivesicular
N-terminal: Amino-terminal
poliUb: Poli-ubiquitina
PV: Vacuolas periféricas similares a lisosomas – lysosome-like peripheral vacuoles
RING-E3-ligasa: Enzima E3 ligasa com domínio RING
SCF: Complejo proteico Skp1/cullin/F-box
Ub: Ubiquitina
Ub-P: Sistema ubiquitina-proteosoma
UBD: Domínio de unión a ubiquitina – ubiquitin-binding domain
Ubl: Proteínas similares a ubiquitina – ubiquitin-like proteins
U-box: Homólogos de las proteínas UFD2
UBP: Proteína de unión a ubiquitina – ubiquitin-binding protein
UFD: Domínio de plegamiento de ubiquitina – ubiquitin-folding domain
VSP: Proteína variante de superficie – variant-specific surface protein
8
Índice de Figuras
Figura 1
Estructura de la ubiquitina.
15
Figura 2
Esquema del proceso de Ubiquitinación.
16
Figura 3
Reacción catalizada por E1.
17
Figura 4
Esquema de los dominios presentes en la familia de proteínas E1.
18
Figura 5
Representación del Proteosoma 26S.
22
Figura 6
Tipos de modificación por ubiquitina.
25
Figura 7
Estructuras de cadenas de ubiquitina.
27
Figura 8
Características de las E3-ligasas APC/C y SCF.
31
Figura 9
Endocitosis de proteínas de membrana mediada por ubiquitinación.
37
Figura 10
Ilustración de la degradación asociada al retículo endoplasmático – ERAD.
39
Figura 11
Giardia intestinalis.
44
Figura 12
Ruta biosintética del polisacárido GalNAc.
Inmunolocalización de algunas estructuras en trofozoítos de G.intestinalis
del clon WB/1267.
Estructura de dominios presentes en la enzima E1 de G.intestinalis.
45
76
Figura 17
Inducción de proteínas recombinantes grNTE1 y grCTE1.
Purificación de las proteínas recombinantes grNTE1 y grCTE1 y
evaluación de los anticuerpos anti-gE1 producidos.
Análisis de trofozoítos que sobre-expresan la proteína E1.
Figura 18
La expresión de E1 es regulada durante la enquistación.
82
Figura 19
Modelo del procesamiento proteolítico de la proteína E1 de G.intestinalis.
86
Figura 20
Inmunolocalización de la proteína E1 durante la enquistación.
87
Figura 21
Efecto de la sobre-expresión del gen e1 sobre la enquistación in vitro.
89
Figura 22
Detección de Ub y proteínas ubiquitinadas durante la enquistación.
Inmunoprecipitación de Ub y proteínas ubiquitinadas en extractos de
trofozoítos y etapas de la enquistación.
Inmunolocalización del conjunto completo de especies de Ub durante la
enquistación.
Inmunolocalización de proteínas poli-ubiquitinadas durante la
enquistación.
Inmunolocalización de proteínas ubiquitinadas durante la enquistación con
el anticuerpo FK2.
92
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
47
75
78
80
94
96
97
99
9
Figura 27
Figura 30
Inmunolocalización de proteínas ubiquitinadas en trofozoítos con el
anticuerpo FK2.
Inmunolocalización de proteínas ubiquitinadas con cadenas de Lys48poliUb durante la enquistación.
Inmunolocalización de proteínas ubiquitinadas con cadenas de Lys63poliUb durante la enquistación.
Proteínas de fusión GST, GST-Ub y GST-Ub3.
Figura 31
Implementación del “pull down” para aislar proteínas de unión a ubiquitina.
107
Figura 32
“Pull down” de proteínas de unión a ubiquitina (UBPs).
Alineamiento de las secuencias de ubiquitina de Giardia intestinalis y
homo sapiens.
Alineamiento múltiple de las secuencias de las proteínas Rpn2 de
humano, levadura y G.intestinalis.
Dominios y características presentes en las proteínas Ubp14.
Alineamiento múltiple de proteínas Hsp90 de levadura, humano y
G.intestinalis.
Establecimiento de las condiciones óptimas de la reacción de
ubiquitinación in vitro.
Reacción de ubiquitinación in vitro.
Purificación de proteínas His6Ub-Ubiquitinadas generadas por la reacción
de ubiquitinación in vitro.
Purificación de proteínas His6Ub-ubiquitinadas bajo condiciones
denaturantes (Urea 8M).
Purificación e identificación de proteínas His6Ub-ubiquitinadas generadas
por el ensayo de ubiquitinación in vitro utilizando extractos de diferentes
etapas de la enquistación de G.intestinalis.
Proteínas ubiquitinadas agrupadas con base en su función y proceso
biológico en el que participan.
109
Figura 28
Figura 29
Figura 33
Figura 34
Figura 35
Figura 36
Figura 37
Figura 38
Figura 39
Figura 40
Figura 41
Figura 42
100
101
103
105
111
114
116
119
123
125
127
128
130
131
10
Capítulo 1
Motivación, hipótesis y objetivo
____________________________________________________
La marcación selectiva de proteínas blanco o sustrato con moléculas de ubiquitina (Ub) se
conoce como ubiquitinación y fue descrito a inicios de la década de los 80’s por los premios
Nobel en Química Aaron Ciechanover, Abraham Hershko e Irwin Rose [1-5]. Ciechanover,
Hershko y Rose demostraron que la degradación específica y selectiva de proteínas era
mediada por un sistema de marcación dependiente de ATP, y que dicha marca se daba por la
unión covalente de polímeros de la proteína APF1 (ATP dependent proteolysis factor 1),
conocida actualmente como Ub [2,3]. Además identificaron la maquinaria enzimática que realiza
esta marcación selectiva, la cual involucra la acción secuencial de la enzima activadora de Ub
(E1), enzimas conjugaduras de Ub (E2) y enzimas ligadoras de Ub (E3-ligasas) [4,5]. Estos
trabajos pioneros permitieron traer a la luz al sistema Ubiquitina-proteosoma (Ub-P) encargado
de la degradación específica de proteínas en eucariotas (Ub-P), en el cual la proteína
ubiquitinada es degradada por el complejo enzimático proteosoma 26S [6]. Desde entonces la
ubiquitinación se asoció íntima y principalmente con papeles degradativos, lo cual ha sido
reevaluado recientemente por investigaciones que muestran a la Ub como una molécula de
señalización de amplio espectro que participa en la regulación de diversos procesos celulares
[7,8].
La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que regula e interviene en múltiples
eventos celulares alterando la localización, actividad, estructura e interacción de las proteínas
sustrato [6-8]. La Ub se reconoce como un señalizador celular con papeles importantes en el
control del ciclo celular, endocitosis y clasificación (“sorting”) de proteínas, transducción de
señales, reparación del DNA, activación de kinasas y en la regulación de la transcripción entre
otros [7-10]. La ubiquitinación es regulada por los sistemas E3-ligasas/DUBs (enzimas
desubiquitinadoras – DUBs), en este las E3-ligasas ubiquitinan al sustrato mientras que las
proteasas DUBs remueven la Ub o regulan la extensión de las cadenas de Ub; haciendo así a la
ubiquitinación un proceso dinámico y reversible análogo a lo que sucede en el sistema de
11
regulación de kinasas/fosfatasas en la fosforilación. La Ub puede ser conjugada a la proteína
sustrato de diferentes formas dependiendo del número de Ub adicionadas o del tipo de cadena
de Ub formada, esto aumenta la complejidad de la modificación y a la vez genera una amplia
diversidad en la señalización mediada por Ub. Como todo sistema de señalización están
presentes proteínas efectoras de la señal, las cuales poseen dominios de unión a Ub (UBDs –
Ubiquitin binding domains) [11]. Los UBDs se unen de forma no covalente a la Ub y discriminan
entre los diferentes tipos de modificaciones por Ub. Estas interpretan y transmiten la
información conferida por la ubiquitinación en un evento celular específico.
Se han realizado grandes aportes al conocimiento de la Ub y de la ubiquitinación en si,
demostrando como se mencionó anteriormente que participa en la regulación de un amplio
espectro de eventos celulares. Sin embargo, no se ha establecido desde el punto de vista
evolutivo como la Ub adquirió este papel protagónico involucrándose en casi todo evento celular
en los eucariotas. Especialmente no se han realizado estudios que respondan a la pregunta:
Cuál o cuales son los papeles tempranos o primitivos de la Ub y la ubiquitinación en el
linaje eucariota? Como primer acercamiento para responder a esta pregunta nosotros
planteamos estudiar la ubiquitinación en una célula eucariota primitiva o tempranamente
divergente, partiendo de la hipótesis que estudiar el proceso de ubiquitinación en células
eucariotas primitivas puede dar luces sobre los papeles que la Ub y la Ubiquitinación
presentaban tempranamente en la evolución del linaje eucariota. Nuestra modelo para
llevar a cabo el estudio es la célula eucariota tempranamente divergente Giardia intestinalis.
Este parásito protozoario está ubicado en la base del linaje eucariota [12], y el análisis de su
genoma mostró una alta divergencia en cuanto a los componentes de importantes maquinarias
moleculares eucariotas [13], sugiriendo que G.intestinalis presenta los componentes más
básicos y sencillos de estos. Adicionalmente en Giardia están ausentes importantes organelos
eucariotas como las mitocondrias, los peroxisomas y el aparato de Golgi [14]. G.intestinalis
presenta un ciclo de vida que le permite alternar entre sus dos estadios, el trofozoítos
(vegetativo/replicativo) y el quiste (infectivo/latente), a través de dos procesos de diferenciación
celular denominados enquistación y exquistación [14]. La enquistación es el proceso de
diferenciación de trofozoíto a quiste, este proceso es sumamente atractivo ya que parece ser un
proceso de adaptación primitivo en el cual se llevan a cabo importantes y variados procesos
celulares (división nuclear, replicación del DNA, recambio de proteínas, transporte y
clasificación – sorting de proteínas entre otros) [14-16]. Todo lo anterior hace de G.intestinalis
12
un modelo muy atractivo para el estudio de la evolución de procesos fundamentales en las
células eucariotas.
Con base en lo anterior planteamos como Objetivo general de nuestro estudio: Analizar el
proceso de ubiquitinación de proteínas y su relevancia en la diferenciación de Giardia
intestinales. Para abordar y desarrollar nuestro objetivo general planteamos tres Objetivos
específicos:
Determinar la medida en que es necesaria la ubiquitinación de proteínas para que se
lleve a cabo normalmente la diferenciación de Giardia intestinalis.
Analizar el proceso de ubiquitinación durante la diferenciación de Giardia intestinales.
Desarrollar un sistema de ubiquitinación in vitro derivado de Giardia intestinales.
De esta forma esperamos contribuir al conociendo básico del proceso de ubiquitinación.
13
Capítulo 2
Ubiquitinación
____________________________________________________
Las modificaciones post-transduccionales regulan una amplia gama de eventos celulares y
están directamente involucradas en la regulación de la actividad y el recambio de las proteínas.
La ubiquitinación es una de las más versátiles modificaciones post-transduccionales y consiste
en la unión covalente de una o varias moléculas de ubiquitina (Ub) a una proteína blanco o
sustrato [6,17]. La Ub es una proteína altamente conservada de 76 aminoácidos, está presente
en eucariotas y ausente en procariotas, su función conjugadora a proteínas intracelulares fue
identificada en extractos de reticulocitos y se le denominó inicialmente proteína APF1 (ATP
dependent proteolysis factor 1) [2]. La Ub es una proteína extremadamente estable que
permanece correctamente plegada a temperaturas superiores a 85°C y un amplio rango de pH
(6-13), esta estabilidad se debe en gran medida a su plegamiento, conocido como “plegamiento
comprimido beta”, en donde cuatro hojas beta se empacan alrededor de una alpha hélice
central [18-20] (Figura 1). La unión covalente y selectiva de Ub a proteínas (ubiquitinación)
altera la función, estabilidad, localización o desencadena la degradación de estas. La
ubiquitinación se describió inicialmente como una señal de degradación de proteínas y este fue
considerado su principal función celular por mucho tiempo [6]. Sin embargo, recientemente se
han descrito papeles reguladores de otro tipo de procesos no degradativos, presentando a la Ub
como un señalizador celular fundamental [7,8]. La ubiquitinación participa en diferentes
procesos celulares tales como: regulación del ciclo celular, internalización de proteínas de
membrana, replicación del DNA, entre otros [6-8,21]. En este capítulo presentamos las
principales características del sistema de ubiquitinación, el mecanismo de conjugación de la Ub
a la proteína sustrato, y las proteínas que participan en dicho mecanismo; en cuanto a la señal
generada realizamos una descripción del por qué de su complejidad y de cómo esta señal
puede ser detectada por proteínas efectoras con dominios de unión a Ub (UBDs – “Ubiquitin
binding domains”). Finalmente describimos brevemente la participación de la ubiquitinación en
algunos procesos celulares.
14
Figura 1. Estructura de la ubiquitina. Se muestra un
diagrama de cintas de la molécula de Ub. La Ub
contiene 5 hojas (gris), una -hélice central (negro).
La Ub tiene siete residuos de lisina (Lys-azul), los
cuales pueden servir como aceptores de moléculas
de Ub. Se indican los tres residuos hidrofóbicos
Leucina 8 (Leu8-verde), Isoleucina 44 (Ile44-rojo) y
Valina 70 (Val70-amarillo), los cuales están
involucrados en el mecanismo de reconocimiento
empleado por varios dominios de unión a Ub (UBDs).
Tomado de la referencia [11]
2.1. Mecanismo de conjugación de ubiquitina.
El proceso de conjugación de la Ub a proteínas blanco involucra una cascada ordenada y
secuencial de tres pasos (Figura 2). La conjugación se inicia con la activación, dependiente de
ATP, de la Ub por parte de la enzima conjugadora de Ub (E1) generándose un intermediario
tiol-éster de alta energía entre la E1 y el grupo carboxilo G76 de la Ub (E1-S-Ub). La Ub es
posteriormente transferida a una de las varias proteínas portadoras o conjugadoras de Ub (E2),
la reacción de transtiolación resulta en la formación de otro intermediario de alta energía tioléster, esta vez E2-S-Ub. E2 transfiere la Ub al sustrato que está unido específicamente a un
miembro de la familia de proteínas ligadoras de Ub (E3 o E3-ligasas). Existen diferentes clases
de enzimas E3s, las de dominio HECT (homólogo al C-Terminal de E6-AP) y las que poseen
dominio RING (“Really Interesting New Gene”). En el caso de las E3s con dominio HECT la Ub
es transferida primero al residuo de cisteína del sitio activo de la E3, para generar un tercer
intermediario tiol-éster de alta energía, Ub-S-E3, antes de que ésta sea transferida al sustrato
unido a la E3-ligasa. Las E3s que poseen un dominio RING transfieren directamente la Ub
activada, al sustrato unido a E3 (Figura 2). De esta forma la Ub es finalmente transferida al
sustrato, generalmente a un grupo -NH2 de un residuo interno de lisina (Lys) en el sustrato
para generar un enlace covalente isopeptídico. En algunos casos la Ub es conjugada al -NH2
del grupo amino terminal de la proteína sustrato y se conoce como la regla del N-terminal. En el
caso de la poli-ubiquitinación se realizan adiciones sucesivas de Ub activada a residuos
15
internos de Lys sobre la molécula de Ub previamente conjugada formando así cadenas de poliubiquitina (poliUb). En cada paso del proceso de ubiquitinación la complejidad del sistema
aumenta y son las E2s en conjunto con las múltiples E3s las que determinan la especificidad del
reconocimiento del sustrato [6,17]. Una regulación adicional del sistema es llevada a cabo por
las enzimas desubiquitinadoras (DUBs) (también conocidas como ubiquitina hidrolasas), las
cuales regulan la longitud de cadenas de poliUb y liberan las moléculas de Ub unidas a las
proteínas sustrato haciendo de la ubiquitinación un proceso dinámico y reversible [22].
Figura 2. Esquema del proceso de Ubiquitinación. La ubiquitina es activada por la enzima
activadora E1 en un paso dependiente de ATP. Se genera un intermediario tiol-éster E1-S-Ub.
Posteriormente la Ub es transferida a la enzima conjugadora E2 (E2-S-Ub) y finalmente al sustrato
que esta enlazado específicamente a una E3-ligasa. En las E3-ligasas de dominio HECT la Ub se
transfiere primero de la E2 a la E3 y posteriormente al sustrato, en las E3-ligasas de dominio RING
la Ub se transfiere de la E2 directamente al sustrato. (Así como esta las figuras en las que no se anota
referencia bibliográfica fueron diseñadas por los autores de este manuscrito)
2.1.1. Enzima activadora de ubiquitina (E1)
Se ha identificado una única enzima activadora de Ub (E1) en cada uno de los organismos en
los que se ha descrito, estas proteínas presentan tamaños de 115-125 kDa. La enzima
activadora E1 fue identificada y purificada en 1982 empleando un sistema de afinidad Ubsefarosa, la unión de la enzima a la columna requería ATP y Mg 2+ y era resistente a cambios en
la concentración de sal; la enzima era eluida por cambios en pH e incrementando la
concentración de compuestos tiol. Las características de la elución indicaban la formación de
una unión covalente, posiblemente tiol-éster, entre la enzima y la columna [4]. La unión
covalente de E1 con la Ub inicia con la unión de Mg-ATP y luego de Ub (Figura 3). Inicialmente
se forma un intermediario adenilato de Ub que sirve como donador de Ub a una cisteína en el
16
sitio activo de E1. Cada molécula de E1 carga dos moléculas de Ub activada, una como
adenilato (enlace no-covalente) y la otra como tiol-éster (enlace covalente). La Ub enlazada a
E1 como tiol-éster es transferida a la enzima conjugadora E2. La enzima E1 es altamente
eficiente y le permite la producción de suficiente Ub activada para las reacciones de
conjugación posteriores, a pesar que la concentración de E1 es mucho más baja que la de
concentración de E2 [17].
Figura 3. Reacción catalizada por E1. Paso 1: Formación de adenilato de ubiquitina. Paso 2 y 3:
transferencia de la Ubiquitina del adenilato a la Cisteína de E1 y segunda ronda de formación de adenilato
de Ubiquitina quedando E1 completamente cargada.
Todas las proteínas E1 conocidas son monoméricas, sin embargo las E1s que activan las
proteínas similares a Ub SUMO y NEDD8 (Ubl por sus siglas en ingles “Ub-like proteins”) son
complejos heterodiméricos [23]. Las E1s presentan tres dominios típicos de esta familia de
proteínas (Figura 4). En el N-terminal se encuentra un dominio con dos motivos homólogos
MoeB o ThiF, en el caso de las E1 de SUMO y NEDD8 estos motivos se encuentran separados
(uno en cada subunidad). El primer motivo MoeB o ThiF proporciona estabilidad estructural
mientras que el segundo une ATP y una molécula de Ub (como adenilato) [24-27]. En el
segundo motivo MoeB o ThiF se encuentra presente la secuencia consenso de unión a ATP
GXGXXGCE [27]. El segundo es el dominio catalítico en donde se encuentra la cisteína (Cys)
involucrada en el enlace covalente tioester con la Ub, y se encuentra presente la secuencia
consenso PXCTXXXXP (C es la Cys catalítica) [27,29]. El tercer dominio es conocido como
“ubiquitin folding domain” (UFD) localizado en la región C-terminal de la proteína y esta
involucrado en la unión entre las enzimas E1 y E2 [23,27]. La enzima E1 es considerada la
cúspide o ápice de la cascada enzimática de ubiquitinación y por tanto de los procesos de
señalización mediados por Ub [6]. La manipulación de E1 ha permitido hacer inferencias sobre
el papel de la ubiquitinación en diferentes células. En levaduras una cepa deficiente en E1 no
solo reduce la conjugación de Ub sino que produce arresto en el ciclo celular [30]. Empleando
17
un mutante sensible a temperatura del gen e1 de Caenorabditis elegans (uba-1) se logró
determinar su participación en diferentes estados del desarrollo del nemátodo, la progresión
meiótica y el tamaño del cuerpo [31]. En Drosophila melanogaster se determinó que la enzima
E1 parece tener papeles importantes en la regulación de la apoptosis [32].
Figura 4. Esquema de los dominios presentes en la familia de proteínas E1. Se muestran esquemas para
enzimas E1 de homo sapiens: la enzima activadora de Ub (UBA1), el heterodímero de la enzima activadora
de SUMO (SAE1/UBA2) y el heterodímero de la enzima activadora de NEDD8 (NAE1/UBA3). Los números
indican las posiciones de los aminoácidos. El dominio MoeB o ThiF esta representado por cajas azules, el
dominio catalítico por cajas naranjas y el “ubiquitin-folding domain” (UFD) por cajas verdes. Se indica la
posición de la Cisteína (Cys) involucrada en la unión covalente con la molécula de Ub.
2.1.2. Enzima conjugadora de ubiquitina (E2)
La enzima E2 fue aislada por primera vez de un extracto crudo de reticulocitos por
cromatografía de afinidad sobre Ub-sefarosa. E2 se enlazaba a la columna en presencia de la
enzima E1 y de ATP, y era eluida con compuestos tiol a alta concentración [5]. Las enzimas E2
catalizan la trasferencia y unión covalente de la Ub a la proteína blanco, o cuando actúan junto
con una E3-ligasa con dominio HECT transfieren la Ub a la E3-ligasa para formar el
intermediario E3-S-Ub (Figura 2). La cisteína del sitio activo de E2 se encuentra en una región
altamente conservada. Todas las E2s presentan un dominio conservado de 150 aminoácidos
(dominio UBC) requerido para la unión a las distintas E3s. Algunas E2s presentan extensiones
N-terminal o C-Terminal, las cuales pueden regular asociación con E3-ligasas, actividad
intrínseca E2, o reconocimiento del sustrato ya que en algunos casos pueden interactuar
directamente con el sustrato. Se han identificado 11 enzimas E2 en Saccharomyces cerevisiae
18
(Ubc 1-8, 10,11 y 13), y el número y variedad en mamíferos es mucho mayor (aproximadamente
60 en humanos), reflejando evolución de nuevas E2s. A pesar de la similaridad entre ellas,
diferentes E2s tienen funciones biológicas diferentes, cada una actúa con diferentes E3-ligasas
y así sobre sustratos específicos [6,17]. El por qué de la existencia de la enzima conjugadora
E2 es una pregunta interesante, es decir por qué se requiere? Por qué no se transfiere la Ub a
la ligasa E3 directamente de la enzima E1?. Hay dos hipótesis, las dos relacionadas con su
papel en la regulación del sistema. La primera hipótesis dice que si una E3 funciona con una
E2 específica, el paso adicional de conjugación a E2 provee un punto adicional para regular el
marcaje de los sustratos en la E3, por ejemplo por cambios en la concentración o actividad
(ejemplo fosforilación) de la E2. La segunda hipótesis plantea que la existencia de varias E2s le
da más diversidad y especificidad a la ubiquitinación; y así E2 puede modular la selección de la
proteína sustrato o la estructura de la modificación por la ubiquitina [33].
2.1.3. Enzima ligadora de ubiquitina (E3-Ligasas)
Las enzimas E3-ligasas son proteínas o complejos de proteínas que llevan a cabo
el
reconocimiento específico de los sustratos a ser ubiquitinados, estas se unen tanto a las
enzimas E2s como al sustrato (Figura 2). El gran numero de E3-ligasas esta directamente
relacionado con la extraordinaria diversidad de sustratos que son ubiquitinados. La reacción de
E3 involucra al menos dos pasos, la unión de E3 al sustrato vía la señal de ubiquitinación y la
unión covalente de una o más moléculas de Ub al sustrato; y la ubiquitinación exitosa depende,
en gran medida, de la interacción de las E3-ligasas con dichos elementos [17,33]. En Homo
sapiens el número de E3-ligasas es de alrededor 1000, aproximadamente 50 con dominio
HECT y de 600 a 1000 con dominio RING. A pesar del amplio número de E3-ligasas
identificadas estas pueden ser clasificadas dentro de tres grupos: E3-ligasas con domino HECT
(“Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus”), las que poseen dominio RING finger (“Really
Interesting New Gene”) y homólogos de las proteínas UFD2 (U-box). Las familias HECT y Ubox son mucho más pequeñas que las familia RING, y se calcula que el número total de E3ligasas en organismos complejos puede estar en rangos de cientos [33].
Las E3-ligasas con dominio HECT (HECT-E3-ligasas) interactúan con la Ub formando un
intermediario tiol-éster con esta antes que la Ub sea transferida al grupo -NH2 de la proteína
sustrato (Figura 2). Presentan una secuencia de 350 aminoácidos homóloga al carboxiloterminal de miembros de la familia E6-AP (proteína asociada a E6). El dominio contiene un
19
residuo de cisteína conservado al cual la Ub es transferida de E2. El dominio N-terminal, el cual
varía en tamaño entre las HECT-E3-ligasas, esta involucrado en el reconocimiento específico
del sustrato [33]. Las E3-ligasas que poseen un dominio RING (RING-E3-ligasa) transfieren
directamente la Ub activada al sustrato unido a E3 (Figura 2). Las RING-E3-ligasas son
proteínas cuyo dominio consiste de un motivo corto rico en cisteínas e histidinas (CX2CX(939)CX(1-3)HX(2-3)C/HX2CX(4-48)CX2C) el cual coordina dos iones zinc. Los dominios RING
se clasifican como RING-HC y RING-H2, dependiendo si la posición 5 del sitio de coordinación
(subrayado en el dominio) es ocupada por una Cys o una His. Por muchos años se pensaba
que este dominio estaba relacionado con dimerización de proteínas y solo hasta hace pocos
años las proteínas con dominio RING se asociaron como E3-ligasas. Estas enzimas transfieren
Ub tanto a sustratos heterólogos así como a las mismas proteínas RING. Se ha mostrado que
muchos dominios RING se unen directamente a residuos hidrofóbicos en E2. Se cree que las
RING-E3-ligasas actúan por “catálisis por proximidad”, es decir que su papel es incrementar la
probabilidad de reacción posicionando la Lys del sustrato y el intermediario E2-S-Ub [17,33].
Algunas RING-E3-ligasas son importantes reguladores del ciclo celular, entre ellas se
encuentran la subunidad APC11 del complejo promotor de la anafase (APC/C) y el complejo
SCF (Skp1/cullin/F-box protein) involucrado en la regulación de kinasas dependientes de
ciclinas (CDKs), ciclinas e inhibidores de CDKs [34].
Un dominio de unión a enzimas E2 conocido como U-box define a una familia pequeña de
proteínas E3-ligasas, este dominio (70 aminoácidos) fue identificado en la proteína Ufd2 de
levadura. Ufd2 se comporta de forma inusual ya que no tiene un sustrato propio sino que
promueve la poli-ubiquitinación de sustratos de otras E3-ligasas, y por esta razón fue clasificada
inicialmente como una E4 (factor de elongación de Ub). Otra proteína con dominio U-box es la
proteína CHIP (“C-terminus of Hsc70 interacting protein”) y aunque presenta un comportamiento
parecido a una E4 también actúa como una E3 convencional. Las proteínas U-box adoptan una
conformación parecida al dominio RING, experimentalmente se encontró que proteínas U-box
interactúan directamente con enzimas E2 y podrían facilitar la conjugación de la Ub, e incluso
son sujetas a auto-ubiquitinación; además algunas proteínas U-box elongan cadenas de Ub
dependiente de E1 y E2 pero independientes de E3-ligasa. Estas tres características muestran
que las U-box constituyen una nueva familia de enzimas E3-ligasas y que la actividad E4 puede
reflejar un tipo de actividad especializada para estas E3-ligasas [33,35].
20
2.1.4. Enzimas desubiquitinadoras (DUBs)
Las enzimas desubiquitinadoras (DUBs) o ubiquitina hidrolasas (UCHs) regulan la longitud de
cadenas de poliUb y liberan las moléculas de Ub unidas a las proteínas sustrato. Las DUBs
regulan negativamente la ubiquitinación haciendo de esta un proceso dinámico y reversible [22],
generándose
una
regulación
E3-ligasas/DUBs
similar
al
sistema
de
regulación
de
kinasas/fosfatasas en la fosforilación. Estas enzimas son cisteína proteasas y se dividen en
cinco grupos, ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasas (UCHs), proteasas específicas de Ub
(UBPs), familia JAMM, familia otubaina y familia ataxina; siendo las dos primeras las más
estudiadas y abundantes [22,36,37]. Se han identificado y caracterizado principalmente en
levaduras y en humano, el genoma humano codifica cerca de 100 DUBs [38]. Entre las DUBs
más estudiadas se encuentran Ubp6, Rpn11, Doa4 y Ubp14. Ubp6 es una proteína que se ha
encontrado asociada al proteosoma y esta asociación aumenta su actividad, se ha planteado su
papel dual en regular los niveles de Ub y la actividad del proteosoma [39]. Estando Ubp6
asociada al proteosoma se evidencia su participación en la liberación de las cadenas de poliUb
de las proteínas sustrato ya en el proteosoma; sin embargo no es la única DUB allí, Rpn11 una
subunidad del proteosoma tiene actividad DUB, e incluso Doa4 se ha encontrado asociada al
proteosoma. Si bien todas liberan cadenas de poliUb de proteínas sustrato es su especificidad
por algún tipo de sustrato o de un momento celular específico lo que puede diferenciarlas,
ampliando así el rango de regulación. Aunque Doa4 se ha encontrado asociada al proteosoma
su papel más relevante es en el tráfico de proteínas de membrana y su enrutamiento hacia
cuerpos multivesiculares. Este papel al parecer es único de esta enzima, haciéndola especial
entre las múltiples DUBs [40]. Una de las enzimas claves en la homeostasis de Ub libre es
Ubp14, ya que esta se encarga de liberar esta Ub de las cadenas de poliUb libres; de esta
forma se tiene un “pool” de Ub que puede ser nuevamente enlazada a una proteína blanco [41].
2.1.5. El Proteosoma 26S
El proteosoma 26S es un complejo enzimático directamente relacionado con los papeles
degradativos de la ubiquitinación ya que es el encargado de degradar las proteínas marcadas
con cadenas de poliUb enlazadas a través de Lys48 (Lys48-poliUb) o Lys11 (Lys11-poliUb). El
Proteosoma es un complejo multiproteíco de 2,5 MDa compuesto de al menos 33 subunidades
en Saccharomyces cerevisiae, y estas son altamente conservadas en todos los eucariotas en
los que el proteosoma 26S ha sido caracterizado. El proteosoma 26S se divide en dos
complejos: la partícula central (CP) de 670 kDa conocida como partícula 20S o proteosoma
21
20S, y la partícula regulatoria (PR) de cerca de 1MDa y conocida como partícula 19S (Figura 5)
[42]. La actividad proteolítica del proteosoma se encuentra en la partícula central CP, ésta es un
complejo en forma de barril compuesto de cuatro anillos heptagonales cada uno compuesto de
7 proteínas. Los dos anillos externos (subunidades ) son idénticos, igual ocurre para los dos
anillos internos (subunidades ), dando una configuración vertical
. Los sitios de actividad
proteolítica están dentro de la CP en tres de las subunidades internas
activos de serina proteasas, como hay dos anillos
las cuales tienen sitios
cada proteosoma tienen 6 sitios catalíticos.
Las tres actividades proteolíticas presentes son: actividad tríptica en 2 (similar a tripsina TL,
ruptura después de residuos básicos), actividad quimotríptica en
5 (similar a quimiotripsina
ChL, ruptura después de residuos hidrofóbicos) y una actividad acídica en
1 (post-glutamil
peptidil hidrolítica PGPH, ruptura después de residuos ácidos). Los poros que permiten la
entrada de los sustratos están cerrados en el estado basal y requieren un mecanismo de
apertura para que el sustrato entre y sea degradado. El control de la apertura del poro es
llevada a cabo por la partícula regulatoria 19S que al parecer forma interacciones con la región
amino-terminal de la subunidad
[6, 42, 43].
TAPA
Poro de entrada
Partícula central
CP 20S
Figura
5.
Representación
del
Proteosoma 26S. El proteosoma está
compuesto por una subunidad central 20S
y una o dos partículas regulatorias 19S.
La partícula regulatoria a su vez en
compuesta por dos unidades, la base y la
tapa, conectada por Rpn10. Adaptado de
la referencia [43].
Sitios activos
Partícula regulatoria
RP 19S
La partícula regulatoria (RP) está compuesta de al menos 19 proteínas, una o dos RP se
asocian con la subunidad CP para formar el proteosoma 26S. La RP se divide en dos subcomplejos, la base y la tapa (Figura 5). La base está situada cerca de la subunidad CP y
contiene 6 ATPasas tipo AAA (ATPases Associated with various cellular Activities) (Rpt1-6) y
22
cuatro no ATPasas (Rpn1, 2, 10 y 13). Las subunidades ATPasas forman un anillo y están
involucradas en la apertura del poro y translocación de
los sustratos a la CP. Estas
subunidades no presentan funciones equivalentes a pesar de su alta similaridad, Rpt2 tiene un
papel importante en la apertura del poro y entrada del sustrato mientras que Rpt5 parece estar
involucrada en el reconocimiento del sustrato ubiquitinado. Entre las no ATPasas la Rpn10
reconoce conjugados de Ub y participa en el correcto ensamblaje de la RP estabilizando la
unión entre la tapa y la base vía su N-terminal. El sub-complejo tapa está compuesto de nueve
subunidades, siete de ellas son esenciales para la viabilidad en levaduras y aunque se ha
demostrado que la tapa es necesaria para la degradación de conjugados de Ub hay poca
información sobre sus mecanismos de acción [42,43]. La subunidad Rpn11 de la tapa es una
enzima DUB que participa en la liberación de cadenas de Ub del sustrato antes de su
degradación [44].
2.1.6. Mecanismos de selección y reconocimiento del sustrato a ubiquitinar
Gran parte del reconocimiento específico, y no azaroso, de un sustrato para que sea modificado
por ubiquitinación radica en el sustrato en si y en la unión de este a la E3-ligasa adecuada.
Como se mencionó anteriormente se han identificado cientos de estas E3-ligasas y así se
pueden reconocer cientos de sustratos a ubiquitinar. La interacción entre las E3-ligasas y los
sustratos es entonces el determinante en la selección específica del sustrato. Se han descrito
varios modos de reconocimiento del sustrato por parte del sistema [6,17]. Algunos mecanismos
se describen a continuación:
En el reconocimiento vía la regla del N-terminal los sustratos se unen directamente a la E3ligasa vía su residuo N-terminal. La E3-ligasa tiene dos sitios para reconocer el N-terminal,
uno para el reconocimiento de sustratos con N-terminal básico y otro para N-terminal
hidrofóbico.
Algunas enzimas E3-ligasas tienen un tercer sitio que les permite reconocer sustratos no
necesariamente por el N-terminal, este reconocimiento es mediado por activación alostérica
por la unión de un péptido a uno de los otros dos sitios.
Otra vía de reconocimiento involucra procesos de fosforilación, en los cuales el sustrato debe
estar fosforilado para que sea reconocido por la E3-ligasa adecuada (caso de algunas
ciclinas), o incluso la fosforilación de algunas E3-ligasas regula su unión al sustrato (por
ejemplo la APC/C).
23
En varios casos las proteínas sustrato no son reconocidas por la E3-ligasa directamente sino
que se requiere de una proteína de anclaje o proteína puente; el complejo ternario conlleva a
la ubiquitinación y degradación de la proteína sustrato.
La degradación de las ciclinas mitóticas presenta un caso especial en que la ubiquitinación
de estas es mediada por el reconocimiento de una secuencia específica.
El motivo se
encuentra en el N-terminal y se conoce como “caja de destrucción”, presenta la secuencia
consenso RXXLXXXXN. El motivo no es ubiquitinado ni fosforilado y no es intercambiable
entre ciclinas, esto muestra que es necesario para la ubiquitinación pero no es suficiente.
2.2. Complejidad y diversidad de la señal.
La conjugación de proteínas con moléculas de Ub se describió inicialmente como una señal
para que estas fueran degradadas por el proteosoma 26S [6]. Sin embargo, recientemente se
ha descrito su participación en procesos no degradativos, involucrando a la ubiquitinación en
señalización celular presentando una regulación por los sistemas E3-ligasas/DUBs análogo a lo
que sucede en el sistema de regulación de kinasas/fosfatasas de la fosforilación [7,8]. A
diferencia de la fosforilación la modificación por Ub presenta una mayor complejidad ya que la
Ub puede ser conjugada a la proteína sustrato de diferentes formas dependiendo del número de
Ub adicionadas o del tipo de cadena de Ub formada (Figura 6). Además de la complejidad se
genera una amplia diversidad en la señalización dependiente de Ub [45-47]. Cada tipo de
modificación influye de forma diferente en el destino de la proteína ubiquitinada. Cuando se
adiciona una única molécula de Ub se denomina mono-ubiquitinación, y si se dan adiciones de
varias moléculas sencillas de Ub se conoce como mono-multi-ubiquitinación. La mono- y multimono-ubiquitinación presenta importantes papeles en procesos de endocitosis de proteínas de
membrana, regulando su internalización, degradación en lisosomas o su reciclaje a la
membrana, también participan en el mecanismo de reparación del DNA, regulación de la
expresión genética, modificación de la estructura de la cromatina por modificación de histonas,
entre otros [48]. La poli-ubiquitinación ocurre cuando sucesivas moléculas de Ub son
adicionadas a residuos internos de Lys de la Ub unida al sustrato formando cadenas,
generalmente de cuatro moléculas de Ub [45].
24
Figura 6. Tipos de modificación por ubiquitina. Mono-ubiquitinación es la conjugación
de una única molécula de Ub a una Lys del sustrato. Multi-mono-ubiquitinación es la
conjugación de varias moléculas sencillas de Ub a Lys del sustrato. Poli-ubiquitinación es
la conjugación de cadenas de poli-Ub en una o varias Lys del sustrato.
La molécula de Ub tiene 7 residuos de Lys en su secuencia (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33,
Lys48 y Lys63) (Figura 1) y todos ellos pueden servir como aceptores de moléculas de Ub
generando así los polímeros. En la levadura se han determinado las proporciones de cada
cadena, siendo las cadenas de poliUb formadas a través de Lys48, Lys11 y Lys63 las mas
abundantes (29, 28 y 17% respectivamente) seguidas por Lys6, Lys27, Lys29 y Lys33 (11, 9, 3
y 3% respectivamente) [49]. Proteínas ubiquitinadas con cadenas formadas a través de Lys48
(Lys48-poliUb) son reconocidas y degradadas por el proteosoma 26S regulando así diversos
procesos celulares, este proceso por mucho tiempo se consideró como el papel primordial o
único de la ubiquitinación [6]. Modificación de proteínas con cadenas de Lys63-poliUb
intervienen en mecanismos de respuesta al daño del DNA, señalización y endocitosis [46,47].
Las cadenas de Lys63-poliUb presentan un papel fundamental en el proceso de internalización
de proteínas de membrana y transporte a cuerpos multivesiculares, proceso mediado por la
maquinaria del “endosomal sorting complex for transport” (ESCRT) [50]. Modificaciones con
cadenas de Lys11-poliUb sirven como señales de degradación proteosomal similar a las
cadenas de Lys48-poliUb. Estas cadenas participan en regulación del ciclo celular siendo
Lys11-poli-ubiquitinados varios de los sustratos de la E3-ligasa APC/C. Recientemente se
describió su participación en la degradación proteosomal de proteínas detectadas como
defectuosas en el retículo endoplasmático (ER) (proceso denominado ERAD – “endoplasmicreticulum-associated degradation”) especialmente en respuesta a estrés en el ER [49], vale la
pena señalar que la señal primordial de degradación proteosomal por ERAD son las cadenas de
Lys48-poliUb. El conocimiento sobre los otros tipos de cadenas es bastante limitado, estas
cadenas se identificaron inicialmente en experimentos de ubiquitinación in vitro y
solo
recientemente se han identificado en estudios in vivo los cuales sugieren que participan en
procesos de reparación del DNA (Lys6-poliUb), degradación por Ub fusionada (una molécula de
25
Ub se fusiona al N-terminal de una proteína permitiendo la formación de cadenas de Lys29poliUb o Lys48-poliUb y degradación por el proteosoma 26S), degradación lisosomal (Lys29poliUb) y modificación de kinasas (Lys29-poliUb y Lys33-poliUb) [47,51-53]. Recientemente se
demostró la formación y funcionalidad in vivo de cadenas de poliUb lineales, la unión tipo
cabeza-cola implica el enlace peptídico entre la Metionina del N-terminal de una Ub y la Glicina
del C-terminal de otra Ub. Las cadenas lineales de poliUb intervienen en la regulación del
sistema de señalización por NF-kβ, el sustrato es el modificador esencial NEMO (“NF-kβ
esential modifier”) el cual forma un complejo con IKK (compuesto de IKK
y IKK ); la
ubiquitinación de NEMO es esencial para el reclutamiento de otros factores y la posterior
translocación de NF-kβ al núcleo para iniciar la respuesta genética [54].
Cada tipo de cadena de poliUb puede ser reconocida de forma selectiva por las DUBs (en el
caso del desensamblaje) o por proteínas de unión a Ub (UBPs – “ubiquitin-binding proteins”)
que contienen dominios de unión a Ub (UBDs – “ubiquitin-binding domains”) [11]. Independiente
de la Lys empleada para formar las cadenas de poliUb dichas cadenas presentan la misma
masa y carga, de tal manera que el mecanismo por el cual se pueden distinguir una u otra
cadena parece depender de la estructura de las cadenas [47]. Estudios estructurales revelaron
que las cadenas de Lys48-poliUb (tetrámero) adoptan un plegamiento compacto formando una
estructura seudo-tetragonal presentándose interacciones entre las moléculas de Ub (Figura 7).
Las cadenas no son totalmente rígidas y pueden ser parcialmente desplegadas cuando
interactúan con DUBs o UBPs [55-57]. Las cadenas de Lys63-poliUb son extendidas y
presentan una conformación abierta donde las moléculas de Ub no interactúan una con otra
(Figura 7), esta organización permite que las moléculas de Ub estén más accesibles [57]. Este
tipo de estructura sugiere que las cadenas de Lys63-poliUb pueden ser reconocidas de forma
similar a las moléculas de mono-Ub y como se menciono antes ambas modificaciones
participan en procesos similares como por ejemplo procesos endocíticos. Las diferencias
estructurales de las cadenas de Lys48-poliUb y Lys63-poliUb ha permitido la generación de
anticuerpos monoclonales que distinguen cada tipo de cadena [58]. Las cadenas lineales de
poliUb presentan una conformación abierta muy similar a las cadenas Lys63-poliUb (Figura 7),
sin embargo se diferencia en que las uniones peptídicas a través de Met-Gly son menos
flexibles que las uniones Lys-Lys [59]. En cuanto a los otros tipos de cadenas hasta el momento
no se conocen sus estructuras pero se sugiere que pueden presentar plegamientos distintivos
para cada tipo de forma que cada cadena puede ser reconocida de forma diferente.
26
Figura 7. Estructuras de cadenas de ubiquitina. (A) Estructura de la cadena Lys48-poliUb. (B)
Estructura de la cadena Lys63-poliUb. (C) Estructura de cadena lineal de poliUb. El sustrato en azul.
La flecha muestra la posición de la Isoleucina 44 (Ile 44) la cual es importante para la unión de las
proteínas con dominios de unión a ubiquitina (UBDs). Proximal indica a la molécula de Ub más
cercana al sustrato, y distal la más lejana al sustrato. Adaptado de la referencia [47].
2.3. Efectores de la señal – Dominios de unión a ubiquitina (UBDs)
Los dominios de unión a Ub (UBDs) son un grupo de dominios modulares que reconocen y se
unen de forma no covalente a la Ub, estos dominios interpretan y transmiten la información
conferida por la ubiquitinación generando una respuesta celular específica [11,60,61]. Los UBDs
son entonces receptores o proteínas efectoras de la señalización mediada por Ub, relacionan a
la ubiquitinación con diversos procesos celulares y contribuyen a la diversidad y versatilidad de
la señalización por Ub (Tabla 1). Se han identificado alrededor de 24 UBDs y su número parece
estar en ascenso; estos varían en estructura, tamaño (20-150 aminoácidos) y en el tipo de
reconocimiento [11]. Los UBDs se han identificado en proteínas que catalizan la ubiquitinación,
DUBs, o en receptores de Ub con diversas funciones biológicas. Cada UBD interactúa de forma
especial con uno u otro tipo de modificación, de tal forma que un UBD puede presentar afinidad
27
preferencialmente por monoUb o por algún tipo de cadena de poliUb. La mayoría de UBDs
interactúan con Ub a través de una zona hidrofóbica de ésta la cual incluye los aminoácidos
Leu8, Ile44 y Val70. La constante de disociación (Kd) de la unión UBD-Ub (Ub libre) es de 10500 μM, lo cual indica una baja afinidad [60]. Esta baja afinidad crea una red fluida que se
puede ensamblar y desensamblar fácilmente. La afinidad de un UBD por Ub parece
incrementarse por la presencia del sustrato, y también por proteínas accesorias o
modificaciones post-traduccionales como la fosforilación. La baja afinidad por Ub libre puede ser
bastante relevante si se tiene en cuenta que la concentración de Ub libre en la célula es
bastante alta (aprox. 10 μM en células de mamífero), por lo tanto permite que la Ub libre no
influya secuestrando los UBDs ya que estos presentan mayor afinidad por la Ub unida al
sustrato [60]. Múltiples proteínas con UBDs que participan en endocitosis son sustratos de
mono-ubiquitinación y esta modificación regula la capacidad de unión de su UBD a las proteínas
ubiquitinadas. Este tipo de modificación se conoce como mono-ubiquitinación acoplada y
requiere que la proteína a ser mono-ubiquitinada tenga un UBD funcional [62].
Como se mencionó antes cada UBD presenta afinidades diferentes por cada tipo de
modificación por Ub. Varios UBDs (UIM, UBZ, CUE, GLUE y PRU) presentan mayor afinidad
por monoUb que por poliUb, mostrando un papel importante en mecanismos mediados por
mono-ubiquitinación. Estos dominios presentan un mecanismo común de reconocimiento de la
mono-Ub por medio de la Ile44 lo cual sugiere una mutua exclusión ya que solo se puede unir
un único UBD a la vez [11]. Interesantemente el dominio UIM esta presente en varias proteínas
endocíticas como Eps15 (“epidermal growth factor receptor substrate 15”), Eps15R, Hrs/Vps21
(“hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase”, en este caso como doble dominio DUIM),
epsin1 y epsin2 entre otras, relacionando la ubiquitinación con endocitosis [61,62]. El dominio
CUE esta presente en proteínas de la maquinaria endocítica como Vps9 (“guanine nucleotide
exchange factor”) y proteínas involucradas en señalización como Tollip y TAB2 (señalización
por el receptor de interleukina-1) [63,64]. Otros dominios presentan mayor afinidad por poliUb
que por monoUb siendo este el caso del dominio UBA, además proteínas con dominio UBA
pueden presentar mayor afinidad por uno u otro tipo de cadena de poliUb. Un ejemplo es el
dominio UBA de la proteína Rad23 (“radiation sensitive abnormal 23”) el cual tiene una afinidad
3.6 veces mayor por Lys48-poliUb que por Lys63-poliUb, y 70 veces menor por monoUb que
por Lys48-poliUb [62]. Por otra parte otros dominios como el dominio UBAN en la proteína
NEMO se unen específicamente a cadenas lineales de poliUb. La afinidad de NEMO por
cadenas lineales es 100 veces mayor que cadenas de Lys63-poliUb, mutaciones en el dominio
28
UBAN de NEMO bloquea la interacción con cadenas lineales de poliUb afectando la activación
de la kinasa y NF- k en respuesta al estímulo por TNFα (“tumour necrosis factor-α”) [66].
UBD
α-Hélice
UIM
MIU
DUIM
UBM
UBAN
UBA
GAT
CUE
VHS
Zinc finger (Znf)
UBZ
NZF
Proteína Representativa
S5a (humano) / Rpn10 (levadura) , Vps27,
STAM, epsin y RAP80 (UIMC1)
RABEX5
HRS
Polimerasa iota y revesionless 1
NEMO, ABIN1-ABIN3 y optineurina
Rad23 (levadura) y R23A (humano), Dsk2
y NBR1
CGA3 y TOM1
Vps9, TAB2 y TAB3
STAM y CGA3
Polimerasa-h, polimerasa-k yTax1BP1
NPL4, Vps36, TAB2, (MAP3K7IP2) y
TAB3 (MAP3K7IP3)
RABEX5 (RABGEF1) y A20 (TNFAIP3)
Isopeptidasa T (USP5) y HADC6
ZnF A20
ZnF UBP (PAZ)
Dominio con homología a plesktrin (PH)
Rpn13
PRU
EAP45 (VPS36)
GLUE
Dominio similar a conjugadora de Ubiquitina (Ubc)
Función
Degradación proteosomal, endocitosis,
biogénesis de cuerpos multivesiculares (MVB) y
reparación del DNA
Endocitosis
Biogénesis de MVB
Tolerancia al daño del DNA
Señalización por factor nuclear k (NF- k )
Direccionamiento al proteosoma, regulación de
kinasas y autofagia
Biogénesis de MVB
Endocitosis y regulación de kinasas
Biogénesis de MVB
Tolerancia al daño del DNA y señalización por
NF- k
ERAD, Biogénesis de MVB y regulación de
kinasas
Endocitosis y regulación de kinasas
Función del proteosoma y autofagia
Función del proteosoma
Biogénesis de MVB
UEV
UEV y MMS2
UBC
UBCH5C
Reparación del DNA, biogénesis de MVB y
regulación de kinasas.
Transferencia de ubiquitina
Sla1 y CLN85 (SH3KBP1)
Ufd3 (Doa4)
Prp8
Endocitosis
ERAD
Splicing de RNA
Otros
SH3
PFU
Jab1/MPN
Tabla 1. Dominios de unión a ubiquitina (UBDs). La tabla muestra varios UBDs, proteínas que contienen estos
dominios y la función de estas. A continuación los nombres de los UBDs. UIM – motivo que interactúa con Ub (Ub
“interacting motif”); MIU – UIM invertido (“invertid UIM”); DUIM – doble dominio UIM (“doubled sided UIM”); UBM –
motivo de unión a Ub (Ub “binding motif”); UBAN – dominio de unión a Ub en ABIN y NEMO (“Ub binding in ABIN and
NEMO”); UBA – Ub asociado (“Ub-associated”); GAT – dominio de unión a Ub en GAA y Tom1 (“GAA and Tom1 Ub
binding domain”); CUE – conjugación de Ub acoplada a degradación en retículo endoplasmático (“coupling of Ub
conjugation to ERAD”); VHS – dominio presente en VPS-27, Hrs y STAM (“domain present in VPS-27, Hrs and
STAM”); UBZ – unión a Ub ZnF (“Ub-binding ZnF”); NFZ – localización nuclear 4 ZnF (“nuclear localization 4 ZnF”);
ZnF A20 – inhibidor del factor NF-k A20 (“A20 binding inhibitor of NF-k ”); ZnF – dedo de zinc (“zinc finger”); UBP –
proteína de unión a Ub (“Ub-binding protein”); PRU – receptor de Ub con homología a plekstrin (“plekstrin homology
receptor for Ub”); GLUE – unión a Ub en EAP25 (“GRAM-like Ub-binding in EAP45”); UEV – variante de la enzima E2
(“Ub-conjugating enzyme E2 variant”); UBC – conjugadora de Ub (“Ub conjugating”); SH3 – homologo a Src 3 (“Src
homology 3”); PFU – familia PLAA de unión a Ub (“PLAA family ubiquitin binding”) y dominio Jab1/MPN. Adaptada de
la referencia [10]
29
2.4. Papeles de la ubiquitinación
Como se menciono anteriormente la Ub se reconoce como un señalizador celular con papeles
en un amplio espectro de procesos celulares [7-10]. Si bien este texto no pretende examinar
uno por uno los papeles celulares de la ubiquitinación hacemos a continuación una breve
descripción de algunos de ellos a manera de ejemplo, que permitan a su vez observar la
versatilidad y complejidad de la señal. Abordamos entonces el papel de la ubiquitinación en: el
control del ciclo celular, la regulación de la transcripción con énfasis en la modificación de
histonas, la endocitosis de proteínas de membrana, y la degradación proteosomal de proteínas
detectadas como defectuosas en el retículo endoplasmático (ERAD – “endoplasmic-reticulumassociated degradation”).
2.4.1. Ubiquitinación en el control del ciclo celular
El ciclo celular se divide en cuatro etapas: las fases G1 (crecimiento), S (síntesis del material
genético), G2 (crecimiento) y M (mitosis); los controles para regular la correcta y temporalmente
adecuada entrada, transición y salida de estas fases son de gran importancia ya que evitan
eventos redundantes que perjudican la sobrevivencia de la célula o alteraciones en su
comportamiento (por ejemplo la proliferación descontrolada en las células de cáncer). Las
kinasas dependientes de ciclina (CDKs) son protagonistas importantes del control del ciclo
celular regulando los eventos que deben ocurrir en cada una de las fases. Las CDKs son
activadas por las ciclinas y su actividad es inhibida por inhibidores específicos de CDKs, tanto
las ciclinas como los inhibidores de CDKs son regulados por degradación por el sistema Ub-P.
Las proteínas de la maquinaria de ubiquitinación están involucradas directamente con el control
del ciclo celular. La enzima E1 se localiza en “zonas calientes” importantes en la división celular
como lo es el uso mitótico, y como se mencionó anteriormente mutaciones en este gen causan
arresto en el ciclo celular de levadura [30,67]. Enzimas E2 como Ubc13, Cdc34 y UbcH10
tienen funciones centrales en el ciclo celular [68]. En cuanto a las E3-ligasas estas participan
activamente en el control del ciclo celular, por ejemplo la HECT-E3-ligasa E6AP participa en la
degradación del regulador p53, y las RING-E3-ligasas APC/C (“anaphase-promoting complex”)
y SCF (“Skp1/cullin/F-box protein”) participan en el control de la proliferación celular actuando
sobre diversos sustratos reguladores del ciclo (Figura 8) [34,68-71]. En cuanto al proteosoma
26S se ha demostrado que su inhibición bloquea la proliferación de células cancerosas e
incluso el inhibidor Bortezomib se ha evaluando en pacientes y a demostrado actividad
particularmente en mieloma múltiple [72].
30
Los diferentes tipos de modificaciones por Ub también tienen diferentes funciones en el control
del ciclo celular. La mono-ubiquitinación tiene papeles importantes en la regulación de histonas
y la progresión a la fase S del ciclo [73]. Las cadenas de Lys11-poliUb son ensambladas por la
ligasa APC/C a sus diversos sustratos y esta marcación conlleva a la degradación proteosomal
de estos [74]. Las cadenas de Lys63-poliUb participan en la endocitosis de receptores de
factores de crecimiento. Un gran número de reguladores del ciclo son conjugados a cadenas de
Lys48-poliUb y degradados por el proteosoma 26S, entre ellos los sustratos de la E3-ligasa
SCF [68].
A
B
Figura 8. Características de las E3-ligasas APC/C y SCF. (A). Estructura general de APC/C y SCF. APC/C
consiste de 13 subunidades, el dominio RING se encuentra en la subunidad APC11. APC/C necesita de sus dos
proteínas adaptadoras CDC20 y CDH1 para el reconocimiento de los sustratos. Los complejos SCF consisten de
tres subunidades: RBX1 que contiene el dominio RING, CUL1 y SKP1. SCF necesita de proteínas adaptadoras
conocidas como F-box las cuales median el reconocimiento por el sustrato. El amplio número de proteínas F-box
( 70 en humano) genera a su vez un diverso número de complejos SCF. Las proteínas F-box SKP2, FBW7 y TRCP son importantes reguladores del control del ciclo celular. Se listan sustratos para cada E3-ligasa. (B) Fases
reguladas por APC/C y SCF. APC/C participa en la ubiquitinación de sustratos en las fases M y G1 mientras que
SCF en la ubiquitinación de sustratos desde etapas tardías de la fase G1 hasta el inicio de M. Se muestran los
sustratos para cada E3-ligasa en orden de degradación. Para APC/C los sustratos están en rojo: rojo claro para
sustratos mediados por Cdc20 y rojo oscuro para sustratos mediados por Cdh1. Para SCF los sustratos están en
azul: azul claro, azul y azul oscuro para sustratos mediados por SKP2, FBW7 y -TRCP respectivamente.
Adaptado de la referencia [70].
31
El complejo APC/C es una RING-E3-ligasa compuesta por 13 subunidades y es regulador de la
mitosis y la fase G1, el dominio RING se encuentra en la subunidad APC11 (Figura 8) [70-71].
El reconocimiento de los sustratos por el APC/C es mediado por los adaptadores específicos
Cdc20 y Cdh1 los que se asocian transitoriamente con la E3-ligasa, la unión del sustrato y los
adaptadores se lleva a cabo por repetidos de motivos WD40 en los adaptadores. Cdc20 y Cdh1
reconocen proteínas que tienen la caja de destrucción (D-box) con la secuencia consenso
RXXLXXXXN, o la caja KEN (KEN-box) con el consenso KENXXXN. El complejo APC/C es
regulado durante el ciclo siendo activado en la mitosis por fosforilación y controlado
negativamente en G1 por degradación de su E2 UbcH10, degradación y fosforilación de los
adaptadores Cdc20 y Cdh1, y expresión de su inhibidor Emi1. Un ejemplo puntual de el papel
del APC/C es la regulación de la salida de la mitosis, el APC/C media la degradación
proteosomal de las ciclinas de tipo A y B las cuales activan la mayor kinasa mitótica CDK1, sin
las ciclinas la CDK1 es incapaz de fosforilar sustratos mitóticos y se promueve la salida de la
mitosis. Entre los sustratos que regula se encuentran: las ciclinas mitóticas, Polo-kinasas, la
securina (la degradación de securina libera la separasa resultando en el clivaje de la cohesina y
generando así la separación de las cromátides hermanas), proteínas requeridas para la
elongación del uso mitótico durante la mitosis como Ase1p, kinesinas Cin8 y Kip1 (importantes
en el establecimiento y mantenimiento del “bipolar spindle”), reguladoras de la citoquinesis, y a
su propia enzima E2 UbcH10 [70,71]. La desregulación de la degradación proteosomal mediada
por Cdc20 esta implicada en tumorogénesis, además Cdc20 se ha encontrado sobre-expresado
en algunos cánceres humanos. En cuanto a Cdh1 se ha descrito expresión reducida durante la
progresión maligna de líneas celulares de cáncer [70].
Los complejos SCF son RING-E3-ligasas compuestos de cuatro subunidades y son grandes
protagonistas del ciclo celular, estos complejos SCF regulan sustratos que participan en
diversas etapas del ciclo celular, especialmente en eventos tardíos de fase G1 hasta el inicio de
la fase M (Figura 8) [69-70]. Las tres subunidades primarias de los complejos SCF son Skp1,
Cullin y Rbx1 la cual contiene el dominio RING. La SCF modifica sustratos que han sido
marcados con alguna modificación post-traduccional como fosforilación o glicosilación. Al igual
que APC/C requiere de proteínas adaptadoras, en este caso las proteínas F-box de las cuales
se han identificado cerca de 70 en humano. La unión al sustrato se da por repetidos ricos en
leucina o WD40 en la proteína adaptadora. A pesar del amplio número de proteínas F-box tres
se destacan como importantes reguladores del ciclo celular: SKP2 (“S-phase kinase-associated
protein 2”), FBW7 (“F-box and WB40 domain protein 7”) y
-TRCP (“ -transducin repeat-
32
containing protein”) El grupo de sustratos de los complejos SCF es bastante amplio y diverso,
entre ellos podemos mencionar: I B / / , -catenina, Emi1 (“early mitotic inhibitor 1”, inhibidor
del APC/C), Cdc25A (fosfatasa requerida para la progresión de G1 a S), Wee1 (coordina el
crecimiento y la división celular), las ciclinas A, D y E, Inhibidores de CDKs (p27, p57 y p21), los
factores de transcripción MYC y B-MYB [69-70]. La desregulación de la proteólisis de sustratos
de SCF ha sido implicada en cáncer. La proteína SKP2 es considera un oncogén que regula los
supresores tumorales p27 y p57. Bajos niveles de p27 son comunes en muchos canceres
humanos, esta es causada por una sobre-expresión de SKP2. FBW7 es considerado un
supresor tumoral que regula la degradación de varias oncoproteínas como la Ciclina E, MYC,
JUN, entre otros; mutaciones en FBW7 han sido detectadas en cáncer de ovario, seno, linfoma
y colorrectal. Sobre-expresión de -TRCP se ha detectado en algunos tumores [70].
2.4.2. Ubiquitinación en regulación de la transcripción – modificación de Histonas
La transcripción en células eucariotas es regulada por la estructura de la cromatina y proteínas
con diferentes funciones (factores de transcripción, factores de elongación, activadores,
represores, etc). La modificación de histonas altera la estructura de la cromatina y se asocian
con la regulación de la expresión genética, por ejemplo la hiper-acetilación de histonas genera
una cromatina menos condensada y activación de la transcripción. Las histonas pueden ser
modificadas por fosforilación, acetilación, metilación, ADP-ribosilación, SUMOilación, y
ubiquitinación [75]. Hallazgos recientes han demostrado una asociación muy importante entre la
ubiquitinación de histonas, la estructura de la cromatina y el control transcripcional, la
información de los mecanismos de asociación aún es limitada. Se ha descrito que las cinco
histonas (H1, H2A, H2B, H3 y H4) pueden ser modificadas por mono-ubiquitinación y no por
poli-ubiquitinación, y se cuenta con más información sobre la mono-ubiquitinación de las
histonas H2A y H2B [76,77]. La histona H2B se ha detectado mono-ubiquitinada (ubH2B) en
mamíferos y levaduras. H2B es mono-ubiquitinada en levadura en la Lys123 por la acción
conjunta de la enzima conjugadora E2 Rad6 (HR6A y HR6B en mamíferos) y la RING-E3-ligasa
Bre1 (RNF20 en mamíferos) [78,79]. Otras proteínas pueden promover la ubiquitinación de
H2B, esto se ha detectado en la ubiquitinación co-transcripcional de H2B. Cuando inicia la
transcripción la E2 Rad6 y la E3-ligasa Bre1 son reclutados a promotores asociados a la RNApolimerasa II, la mono-ubiquitinación de H2B requiere la presencia del complejo de elongación
PAF, estos factores de elongación e incluso la elongación en sí promueven la ubiquitinación por
mecanismos aún desconocidos [77]. La mono-ubiquitinación de H2B es esencial para el inicio
de la transcripción y la elongación. ubH2B es requerida para la trimetilación de las Lys4 y Lys79
33
de la histona H3 (H3K4me y H3K79me), siendo así ubH2B importante en establecer patrones
apropiados de H3 trimetilada sobre genes durante la transcripción [80]. Se propone que ubH2B
regula la actividad metiltransferasa del complejo COMPASS encargado de metilar H3 [81]. La
mono-ubiquitinación de H2B se asocia con activación transcripcional, niveles mas altos de
ubH2B
se
encuentra
en
cromatina
transcripcionalmente
activa
que
en
cromatina
transcripcionalmente silenciada (como regiones teloméricas). Sin embargo el panorama es más
complejo ya que algunos resultados sugieren que ubH2B puede tener papeles en activación y
silenciamiento simultáneamente [76,77]. Por ejemplo cuando se impide genéticamente la monoubiquitinación de H2B se disminuye el silenciamiento de genes asociados al telómero, este
papel en silenciamiento parece estar directamente relacionado con los niveles de metilación de
H3 [76]. Se ha descrito otra función de ubH2B en meiosis, ubH2B es requerida para el
reclutamiento de la maquinaria que controla la ruptura de la doble hebra del DNA durante la
recombinación meiótica [82].
La mono-ubiquitinación de H2A (ubH2A) ha sido descrita en mamíferos pero no en levadura.
H2A es mono-ubiquitinada en la Lys199 por una enzima E2 aún no identificada y al menos dos
diferentes RING-E3-ligasas, Ring1B y 2A-HUB, ambos asociados con silenciamiento
transcripcional [77,83]. La E3-ligasa Ring1B se asocia con tres complejos represivos: el
complejo represivo Polycomb 1(PRC1), E2F-6.com-1, y el complejo FBXL10-BcoR, asociando
ubH2A con silenciamiento. La pérdida de ubH2A no afecta otras modificaciones involucradas
con silenciamiento como la metilación de las Lys27 o Lys9 de H3. Por otra parte ubH2A inhibe
la di- y tri-metilación de la Lys4 de H3 reprimiendo así la iniciación de la transcripción [77]. En
general ubH2A es considerada una marca epigenética asociada con silenciamiento
transcripcional. En cuanto a la ubiquitinación de las otras histonas es muy poco lo que se sabe.
H1 es mono-ubiquitinada en Drosophila por la acción de TAFII250 (E2) (subunidad del complejo
TBP-TAFII), las consecuencias de esta modificación son desconocidas. H3 es monoubiquitinada en ratón por la E3-ligasa de dominio RING Np95 que tiene funciones en el control
del ciclo celular. H4 es mono-ubiquitinada en las Lys31 y Lys91 por la E2 EEUC que regula la
terminación eficiente de la transcripción [76].
2.4.3. Ubiquitinación en endocitosis
Las células eucariotas internalizan proteínas de membrana, receptores, virus y varias moléculas
extracelulares por endocitosis. La endocitosis puede verse también como un proceso de
señalización involucrada en la activación de receptores de membrana y en la internalización de
34
las señales generadas hasta el efector final [84]. El proceso endocítico de proteínas de
membrana puede dividirse en tres grandes etapas: inicialmente se da una reacción de
internalización de la proteína a ser internalizada, la proteína es internalizada por medio de
vesículas y endosomas, y finalmente se dirige a los lisosomas para su degradación o puede ser
reciclada a la membrana celular [85]. Todos estos pasos deben ser regulados para que la
proteína internalizada llegue a su adecuado destino, motivos dentro de la proteína internalizada
o modificaciones post-traduccionales de esta participan en dicha regulación. La ubiquitinación
participa activamente en el proceso y en la regulación de endocitosis de proteínas de
membrana (Figura 9). La primera función no proteosomal descrita para la ubiquitinación en
tráfico intracelular e internalización de proteínas de membrana fue descrito para las proteínas
de levadura Ste6 (miembro de la familia de transportadores ABC) y Ste2p (receptor de
membrana plasmática acoplado a proteína G) [86,87]. Proteínas de membrana con diferentes
funciones pueden ser internalizadas por ubiquitinación: proteínas involucradas en transducción
de señales (Ste2, Ste3 y Ste6), transportadores de iones y nutrientes (permeasas, canales de
Na+ y Cl-), reguladores de crecimiento, diferenciación y/o metabolismo (GHR – “growth hormone
receptor”, EGFR – “epidermal growth factor receptor”, c-Met – “hepatocyte growth factor
receptor”, TGF R – “transforming growth factor β receptor”, entre otros), proteínas involucradas
en respuesta inmune (“inteleukin-2 receptor”, “T cell receptor”, “IgG receptor”, entre otros),
neurotransmisores (“AMPA glutamate receptor”, “glycine receptors”), proteínas involucradas en
contactos célula-célula y desarrollo (E-cadherine, occludin, Notch, Delta) por nombrar algunas
[88].
En levadura y mamíferos se han identificado las E3-ligasas que dirigen la ubiquitinación de
proteínas de membrana, en levadura una única HECT-E3-ligasa denominada Rsp5 y en
mamíferos dos HECT-E3-ligasas conocidas como Cbl y Nedd4 [88]. En levadura se ha descrito
que
la
mono-ubiquitinación
de
proteínas
de
membrana
(permeasas,
receptores
y
transportadores) es suficiente para generar su internalización, y que la modificación con
cadenas de Lys63-poliUb acelera el proceso [89]. En mamíferos el panorama es diferente, no
sólo el receptor es ubiquitinado sino que también las proteínas endocíticas adaptadoras ( arrestina, CIN85, Epsin, Eps15, entre otras) son ubiquitinadas en respuesta al estímulo
extracelular, incluso se ha determinado que en algunos casos la ubiquitinación parece no ser
indispensable para la internalización de la proteína pero si en la regulación de procesos
endocíticos mas tardíos [10,88]. Esto complica aun más el panorama e indica que el
reconocimiento de las moléculas de Ub conjugadas en las proteínas transportadas es vital para
35
el proceso endocítico, este reconocimiento lo llevan a cabo proteínas efectoras con dominios de
unión a Ub (UBDs, descritos en la sección 2.3). En mamíferos también se ha observado que
cadenas de Lys63-poliUb aceleran la internalización, esto sugiere dos cosas: 1) que la
internalización se vea favorecida ya que en las cadenas hay mas moléculas de Ub que pueden
ser reconocidas por proteínas con UBDs, o 2) que la modificación con monoUb y cadenas de
Lys63-polyUb sean señales diferentes de rutas de internalización diferentes [10]. También se ha
determinado que algunas proteínas pueden ser internalizadas por rutas diferentes y que estas
dependen de la ubiquitinación; por ejemplo el EGFR (“epidermal growth factor receptor”) es
internalizado a través de endocitosis dependiente de clatrina cuando no está ubiquitinado, y es
internalizado a través de endocitosis independiente de clatrina cuando está ubiquitinado, ambas
rutas de internalización parecen estar activas simultáneamente y depende de la concentración
de ligando EGF. El destino del EGFR parece estar favorecido hacia su reciclaje a membrana
plasmática cuando este es internalizado por endocitosis dependiente de clatrina (no
ubiquitinado), y favorecida hacia la degradación lisosomal cuando es internalizado por
endocitosis independiente de clatrina (EGFR ubiquitinado) [90]. La internalización dependiente
de Ub requiere la acción de proteínas con UBDs, como se discutió anteriormente la afinidad de
UBDs por Ub es baja sin embargo las proteínas endocíticas adaptadoras son un buen ejemplo
de cómo esta puede favorecerse. Las proteínas adaptadoras Epsin y Eps15 contiene varios
UBDs (permite la unión a varias monoUb en proteínas multi-mono-ubiquitinadas) así como
módulos que reconocen otras proteínas endocíticas lo cual incrementa y favorece la asociación
Ub-UBD [90].
Una vez la proteína ubiquitinada es internalizada y se encuentra en endosomas tempranos ésta
puede tomar dos caminos: si la Ub es liberada la proteína es reciclada a la membrana
plasmática, pero si sigue ubiquitinada esta es dirigida dentro de vesículas intraluminales
generándose los llamados cuerpos multivesiculares (MVBs) y su destino final serán los
lisosomas donde será degradada (Figura 9) [10]. La liberación temprana de la Ub de la proteína
internalizada se lleva a cabo antes de formarse el MVB y la cataliza la enzima DUB AMSH en
mamíferos. AMSH es una enzima DUB que hidroliza cadenas de Lys63-poliUb y no de Lys48poliUb lo cual indica que tiene papeles en degradación de proteínas por lisosoma y no por
proteosoma 26S [91]. El direccionamiento de las proteínas ubiquitinadas internalizadas a los
MVBs es mediado por los complejos de clasificación endosomal requeridos para el transporte –
ESCRTs (“endosomal sorting complex required for transport”) [92].
36
Figura 9. Endocitosis de proteínas de membrana mediada por ubiquitinación. La ubiquitinación regula la
endocitosis de algunas proteínas de membrana, el esquema muestra la ruta general empleando la internalización de
un receptor de membrana a manera de ejemplo. (a) El receptor se asocia con su ligando lo cual conduce al
reclutamiento de las proteínas adaptadoras endocíticas, la HECT-E3-ligasa (Rps5 en levadura / Cbl y NEDD4 en
mamíferos) realiza la ubiquitinación del receptor. Algunos receptores pueden ser mono-ubiquitinados o poliubiquitinados con cadenas de Lys63-poliUb. (b) La proteína ubiquitinada es internalizada en vesículas que
posteriormente (c) se fusionan con endosomas formando los endosomas tempranos. Generalmente la endocitosis
mediada por ubiquitinación genera la degradación del receptor, (d) sin embargo en algunos casos la acción de
enzimas DUBs puede hidrolizar el enlace con Ub y (e) el receptor es reciclado a la membrana. En levadura la DUB
involucrada es Doa4, en células de mamíferos es AMSH. (f) La proteína ubiquitinada es dirigida a los cuerpos
multivesiculares (MVBs) por un proceso mediado por ESCRTs. Inicialmente las moléculas de Ub son reconocidas
por las proteínas Hrs y STAM del ESCTR-0. (g) La formación de MVBs se da por la acción coordinada y secuencial
de los complejos ESCRT-I, II y III. El ESCRT-III recluta una enzima DUB (Doa4 en levadura y UNPY en mamíferos)
que libera las cadenas de Ub del receptor internalizado y finalmente el MVBs se fusionan con los lisosomas y la
proteína internalizada es degradada. (a’) Algunos receptores pueden ser internalizados por endocitosis dependiente
de clatrina y no por ubiquitinación, el que se de la internalización por una vía u otra parece depender de la
concentración del ligando. Este proceso involucra el reclutamiento de las proteínas dinamina y el complejo de
proteínas adaptadoras 2 (AP2). (b’) La proteína es internalizada en vesículas de clatrina. (c’) La clatrina es eliminada
y la vesícula se fusiona con endosomas formando los endosomas tempranos. (d’) Finalmente el receptor es reciclado
a la membrana.
37
Se han identificado cuatro ESCRTs 0, I, II y III. Los ESCRT- 0, I y II están comprometidos en
el proceso de direccionamiento temprano y todos contienen proteínas capaces de unir Ub,
es decir con UBDs. El ESCRT-III interviene
en la incorporación final de las proteínas
ubiquitinadas en los MVBs. El reconocimiento inicial de las proteínas ubiquitinadas lo realiza el
ESCRT-0 el cual esta compuesto de las proteínas Hrs (Vps27 levadura), STAM y eps15b, todas
con UBDs funcionales. Hrs media el reclutamiento de ESCRT-I al unirse con el receptor
TSG101 el cual junto con Vps28 y Vps37 forma el complejo ESCRT-I. La transición a ESCRT-II
requiere el contacto directo entre componentes de ESCRT-I y II así como el reconocimiento de
la proteína ubiquitinada por UBDs, la proteína Vps36 de ESCRT-II por medio de su dominio
GLUE reconoce la Ub de la proteína internalizada [92]. El complejo ESCRT-III no contiene
UBDs, y es el encargado de reclutar la enzima DUB que retira la Ub de la proteína internalizada
antes de su inmersión total en los MVBs, en levadura es Doa4, en el caso de células mamíferas
la enzima DUB involucrada es UBPY [40,91,92]. Finalmente los MVBs se fusionan con los
lisosomas y la proteína internalizada es degradada por las hidrolasas lisosomales (Figura 9)
[10].
2.4.4. Ubiquitinación y degradación en el retículo endoplasmático (ERAD)
La síntesis de proteínas se lleva a cabo en el retículo endoplasmático (ER), este organelo
también se responsabiliza de realizar un control de los péptidos sintetizados y soportar su
maduración. Las proteínas que adquieren sus conformaciones adecuadas son liberadas del ER
para su transporte a su destino final. Aquellas proteínas que no maduran correctamente
permanecen en el ER, son marcadas, translocadas al citoplasma y ubiquitinadas para su
posterior degradación por el proteosoma 26S, este proceso se denomina degradación ERasociada o ERAD (“ER-associated degradation”) (Figura 10) [93]. Las proteínas mal plegadas
no son los únicos sustratos del sistema ERAD, este también degrada las enzimas limitantes de
la ruta de biosíntesis de esteroles cuando la cantidad de esteroles es abundante [94]. Para
comprender mejor el sistema ERAD vale la pena describir brevemente algunos procesos
durante la maduración de las proteínas en el ER. Durante la síntesis de las proteínas en el ER
éstas son marcadas de formas diferentes regulando así su maduración y en éstos procesos
intervienen diferentes proteínas. Muchos polipéptidos son marcados co-traduccionalmente por
oligosacariltransferasas con glucosa3-manosa9-N-acetilglucosamina en motivos de asparigina
Asn-X-Ser/Thr haciendo la proteína más hidrofílica, esta modificación dirige el plegamiento cotraduccional [95]. Ya en el interior del ER las -Glicosidasas remueven dos residuos de glucosa
y marcan así a las proteínas para el proceso de plegamiento, se asocian chaperonas
38
dependientes de glicanos como la calnexina y la calreticulina las cuales pueden actuar
sinérgicamente con Bip. Las chaperonas de la familia Hsp70 (Bip y Hsp70) y chaperonas
dependientes de glicanos (calnexina y calreticulina) se unen a los polipéptidos previniendo su
salida a golgi, y actúan junto con oxidoreductadas (PDI-1 – “protein disulfide isomerase 1”) para
realizar el plegamiento de las proteínas y corregir aquellas con conformaciones incorrectas
[93,96]. Una vez la proteína ha sido plegada correctamente las chaperonas se disocian y la Glicosidasa II retira las glucosas presentes dejando un motivo manosa9-N-acetilglucosamina,
estas proteínas pueden salir del ER y ser transportadas a su destino. Un modelo propone que la
remoción de los residuos de manosa define el tiempo que tiene una proteína para adquirir su
conformación, de tal forma que el número y posición de los azucares determina la salida o
permanencia en el ER [94].
e. Direccionamiento
al proteosoma
y degradación
a. Reconocimiento
b. Direccionamiento a ERAD
c. Translocación
temprana
d. Ubiquitinación
y Translocación
Figura 10. Ilustración de la degradación asociada al retículo endoplasmático – ERAD. (a) Las proteínas
mal plegadas son reconocidas por chaperonas luminales y factores asociados (chaperonas de la familia Hsp70,
calexina, calreticulina, y proteína disulfuro isomerasa), aquellas proteínas que sean plegadas correctamente
salen del retículo endoplasmático (ER) y las que no se direccional al ERAD. (b) Las proteínas mal plegadas
son reconocidas por glicosilhidrolasas, marcadas y direccionadas al ERAD (E3-ligasa y translocon). (c) Antes
de ser ubiquitinada la proteína es exportada al citosol por la acción del translocon, posiblemente Sec61 o
proteínas de la familia Derlin. El proceso es mediado por la ATPasa Cdc48 y otros componentes aún no
identificados. (d) Tan pronto la proteína sale del translocón esta es poli-ubiquitinada por la E3-ligasa. (e) La
proteína poli-ubiquitinada es direccionada al por la acción de Rad23 y Dsk2 (proteínas que contienen dominios
UBA), se da el reconocimiento por parte de las subunidades del proteosoma Rpn10 y Rpn13 dirigiendo así el
sustrato al proteosoma 26S para su degradación. Tomado de la referencia [93].
39
Las Glicosilhidrolasas de la familia GH47 Mns1 ( 1,2-manosidasa) y Htm1 (“manosidasa-like 1”)
de levadura están involucradas con la selección de proteínas para ser degradadas por el
sistema ERAD, su acción secuencial genera un motivo manosa7-N-acletilglucosamina que
marca la proteína para el ERAD [97,98]. En mamíferos la acción la llevan a cabo las enzimas
ERManI (acción homologa a Mns1) y EDEM1/EDEM2/EDEM3 (acción homologa a Htm1) [99].
Tanto en levadura como en mamíferos no se conoce el mecanismo de selección de sustratos
por parte de estas manosidasas. Las proteínas procesadas por Mns1 y Htm1 son dirigidas a la
E3-ligasa para su ubiquitinación, otros sustratos que no son glicosilados también tienen el
mismo destino sin embargo los eventos de marcación que generan su degradación no son
conocidos. Se ha descrito un papel importante de las chaperonas en la selección y
ubiquitinación de sustratos por ERAD en una ruta independiente de glicosilación, la interacción
prolongada de una proteína con Hsp70 parece ser suficiente para reclutar la E3-ligasa, además
en levadura se ha detectado a Bip en membrana del ER haciendo parte de un complejo
multiproteíco con la E3-ligasa HRD [100]. Las proteínas a ser degradadas por ERAD son
dirigidas a las E3-ligasas (Figura 10). En levadura se han identificado dos E3-ligasas del
sistema ERAD: la RING-E3-ligasa HRD (“HMG-CoA reductase degradation”) que actúa sobre
sustratos con defectos en sus dominios transmembrana o luminal, y la RING-E3-ligasa Doa10
(“degradation of Mat- 2-10”) que actúa preferiblemente sobre sustratos con defectos en sus
dominios citoplasmáticos [94]. La E3-ligasa HRD es un complejo anclado a la membrana
compuesto de cinco subunidades: Hrd1/Der3, Usa1, Der1, Hrd3 y Yos9 [91]. Hrd1/Der3 tiene
seis dominios transmembrana y contiene el dominio de ligasa RING [101]. El dominio luminal de
HRD esta compuesto por Hrd3 y Yos9. Yos9 tiene un dominio homólogo a receptor-manosa-6fosfato que reconoce glicanos con manosa unida
1,6 y parece actuar como un escáner de
proteínas mal plegadas. Hrd3 se une a proteína mal plegadas lo que sugiere que el dominio
luminal de HRD media el reconocimiento de los sustratos [100,102]. Hrd1/Der3 actúa junto con
las enzimas E2s Ubc1 y Ubc7. La E3-ligasa Doa10 presenta el dominio ligasa RING en el Nterminal y tiene 14 dominios transmembrana, y también actúa con las enzimas E2 Ubc1 y Ubc7
[93]. En ambos casos la E2 Ubc7 debe ser reclutada por Cue1 (“coupling of Ub conjugation to
ER degradation”) [94]. En mamíferos se han caracterizado más E3-ligasas. Dos E3-ligasas
homologas a HRD, las enzimas HRD1 (synoviolin) y gp78 (AMF3) [105,106]. Las subunidades
de la E3-ligasa mamífera HRD1 son todas ortólogas de contrapartes en levadura, Sel1l (Hrd3),
Herp (Usa1), Derlin 1-3 (Der 1) y OS-9 (Yos9). HRD1 actúa junto con las enzimas E2s UBE2G1,
UB2G2 (homologas de Ubc7) y UBE2K (homologa a Ubc1), e igual que en levadura UBE2G2
debe ser reclutada por Cue1. La E3-ligasa gp78 tiene un dominio G2BR (“UBE2G2-binding
40
region”) que recluta directamente a la E2 UBE2G2 sin necesidad de Cue1. La E3-ligasa TEB4
es posiblemente el ortólogo mamífero de Doa10 ya que tienen la misma topología
transmembrana y su dominio ligasa RING también esta en el N-terminal. Otras E3-ligasas
mamíferas que actúan en ERAD son: RMA1, Parkin (asociada con párkinson juvenil) y
complejos SFC (donde las proteínas F-box son Fbs2 y Fbs2 que reconocen cadenas de
azúcares) [94].
Las proteínas a ser degradadas deben cruzar la membrana del ER antes de ser ubiquitinadas,
los candidatos a mediar esta salida son el translocón Sec61 y las proteínas de la familia Derlin
(componente de las E3-ligasa HRD) (Figura 10) [94]. La exportación de la proteína es un
proceso dependiente de energía y es mediada por Cdc48 (p97 en mamíferos) la cual es una
AAA-ATPasa, sin embrago el mecanismo molecular aún no es claro [107]. Una vez las
proteínas son exportadas al citoplasma y ubiquitinadas estas son direccionadas al proteosoma
26S. La principal modificación de estas proteínas es la poli-ubiquitinación con cadenas de
Lys48-poliUb, sin embrago recientemente también se ha descrito que algunos sustratos pueden
ser marcados con cadenas de Lys11-poliUb [94,49]. El direccionamiento al proteosoma lo
median Rad23 y Dsk2, estas proteínas contienen dominios UBA (UBA son dominios de unión a
Ub) que reconocen cadenas de Lys48-poliUb. Rad23 y Dsk2 contienen un dominio N-terminal
UBL (Ub-like domain) el cual interactúa con las subunidades del proteosoma Rpn10 y Rpn13
dirigiendo así el sustrato al proteosoma 26S para su degradación (Figura 10) [108,109].
41
Capítulo 3
Giardia Intestinalis – modelo celular
___________________________________________________
Giardia intestinalis (G.intestinalis) es un protozoario y parásito intestinal considerado un
eucariote tempranamente divergente [14]. El análisis y comparación de la secuencia de su
rRNA 16S ubicó a
G.intestinalis en la base del linaje eucariota [12]. El genoma de este
protozoario ha sido completamente secuenciado y al analizarlo se encontró que presenta
maquinarias moleculares menos complejas que otras células eucariotas como la levadura [13].
Al parecer en este organismo se llevan a cabo los procesos eucariotas con un número menor
de componentes, quizás los mínimos indispensables para tal fin, lo cual esta de acuerdo con su
carácter de eucariota primitivo. Adicionalmente en Giardia están ausentes importantes
organelos eucariotas como la mitocondrias, los peroxisomas y el aparato de Golgi [14,110].
Otros ejemplos de su carácter primitivo es su sistema de transporte de proteínas, un ejemplo
interesante son las vacuolas periféricas similares a lisosomas (PVs – “lysosome-like peripherals
vacuoles”) que al parecer hacen labores tanto de endosomas como de lisosomas [111,112].
Todo lo anterior hace de G.intestinalis un modelo muy atractivo para el estudio de la evolución
de procesos fundamentales en las células eucariotas. Como se mencionó anteriormente
G.intestinalis es un parásito intestinal e infecta una gran variedad de mamíferos entre ellos al
humano, causando una enfermedad conocida como Giardiosis. El parásito invade la mucosa
intestinal generando así la sintomatología de la enfermedad, la Giardiosis es muy común en
niños menores de 10 años y comunidades con deficiencias en sus sistemas sanitarios; se
caracteriza principalmente por pérdida de peso, malnutrición, retardo en el crecimiento, diarrea,
nausea, anorexia, fiebre y fatiga, entre otros síntomas [14]. El género Giardia se ha dividido en
cinco especies: Giardia agilis (infecta anfibios), Giardia muris (infecta roedores, aves y reptiles),
Giardia psitacci (infecta aves), Giardia ardeae (infecta garzas), Giardia microti (infecta ratones) y
Giardia intestinalis [14]. En este capítulo presentamos las principales características de la
biología de G.intestinalis, describimos su ciclo de vida y sus procesos de diferenciación,
además lo que se conoce hasta el momento sobre la Ub y la ubiquitinación en este eucariota.
42
3.1. Ciclo de vida de Giardia intestinalis
G.intestinalis presenta dos estadios diferenciados estructural, funcional y morfológicamente: el
quiste (infectivo/latente) y el trofozoíto (vegetativo/replicativo). Su ciclo de vida se basa en la
diferenciación de un estadio al otro influenciado por los estímulos que encuentra en su entorno
(Figura 11). El ciclo inicia con la infección cuando el quiste es ingerido por el hospedero en agua
o alimentos contaminados, la exposición al ácido gástrico durante su paso por el estómago
dispara el proceso de exquistación. Al poco tiempo de su llegada al intestino emergen los
trofozoítos que se adhieren a la superficie del duodeno y yeyuno por medio de su disco ventral,
una estructura única de esta célula. Rápidamente se multiplican por fisión binaria, algunos
viajan con el flujo intestinal y son inducidos a enquistar (enquistación); el pH ligeramente
alcalino, la presencia de sales biliares y la baja concentración de colesterol parecen ser los
inductores del proceso. Estos quistes son desalojados en las heces y pueden ser ingeridos por
otro hospedero completando el ciclo [14,16,113]
Durante la enquistación se dan dos eventos de replicación del DNA y una división nuclear de tal
forma que un trofozoíto binucleado con ploidía de 4N (2N por núcleo) genera un quiste
cuadrinucleado de ploidía 16N (4N por núcleo). Durante la exquistación ocurren dos divisiones
celulares (citoquinesis) y solo una división nuclear sin replicación del DNA, esto debido a que el
quiste contiene suficiente material genético para originar cuatro trofozoítos sin necesidad de
replicar su genoma. Los quistes tienen una ploidía de 16N (4N por núcleo) la cual permanece
en el exquizoíto, el exquizoíto se divide por citoquinesis (primera división celular) generando dos
trofozoítos binucleados con ploidía de 8N (4N por núcleo). En estos trofozoítos se da un evento
de división nuclear generando cuatro núcleos y una ploidía de 8N (2N por cada núcleo) En
seguida ocurre una citoquinesis (segunda división celular) y se generan cuatro trofozoítos cada
uno con dos núcleos y ploidía de 4N (2N por núcleo) [114]. Durante la replicación vegetativa de
los trofozoítos no se han observado estados sexuales y se propone que está es completamente
asexual, además la envoltura nuclear parece permanecer intacta impidiendo así el intercambio
del material genético [115]. Sin embargo, durante los procesos de diferenciación se dan eventos
similares a procesos meióticos. En la exquistación, el exquizoíto se divide dos veces sin
replicación de DNA, produciendo cuatro trofozoitos tetraploides lo que se asemeja a un proceso
meiótico donde el genoma es replicado seguido de dos rondas de segregación de los
cromosomas. Genes homólogos de proteínas que participan en procesos meióticos (Hop1,
Spo11, DMC1A y DMC1B) están presentes en Giardia [116,117]. Y en el estadio de quiste se
43
identificó fusión de núcleos o kariogamia que permitiría el intercambio de material genético, y se
ha propuesto que los genes homólogos de la meiosis podrían participar en eventos de
recombinación homóloga en este estadio [118]. Lo anterior sugiere que los procesos de división
celular que se dan durante los eventos de diferenciación de Giardia podrían mezclar eventos
mitóticos y meióticos primitivos, haciendo de este organismo un excelente modelo para estudios
sobre la evolución de la división celular de eucariotas.
Figura 11. Giardia intestinalis. (A) Ciclo de vida. Una vez los quistes son ingeridos por el hospedero y alcanzan
el estómago se inicia el proceso de exquistación, este culmina en la parte alta del intestino donde emerge el
exquizoíto que rápidamente se divide en dos trofozoítos y estos nuevamente se dividen, de tal forma que un quiste
genera cuatro trofozoítos. Durante la exquistación se dan dos divisiones nucleares sin replicación del DNA. Los
trofozoítos colonizan la mucosa intestinal. Algunos trofozoítos viajan con el flujo intestinal y enquistan. Durante la
enquistación ocurren dos eventos de replicación del DNA y una división nuclear. Los quistes son desalojados en
las heces. (B) Microscopía de luz de un quiste. (C) Microscopía de luz de un trofozoíto La barra indica 10 μM. (DV)
Disco ventral, (ESV) vesículas específicas de enquistación, (F) flagelo y (N), núcleo.
44
3.1.1. El quiste
El quiste (Figura 11) es de forma ovoide, cuadrinucleado de aproximadamente 5 por 8 m y es
el responsable de la transmisión de la Giardiosis. Resiste a las condiciones ambientales
externas, sobrevive a bajas temperaturas (dos meses a 4ºC y cuatro días a 37ºC) y al ácido
gástrico del estómago del hospedero, esa capacidad de alta tolerancia es debida a una pared
protectora de 0.3-0.6 m de espesor la cual está compuesta de una red filamentosa y una capa
membranosa interna que incluye dos membranas. En el cuerpo del quiste se encuentran cuatro
núcleos, el disco ventral desensamblado, los flagelos contraídos, axonemas y vacuolas
periféricas (PVs). La pared del quiste es altamente insoluble y está constituida de polisacárido
(63%) y proteínas (37%) [14,119]. En cuanto al polisacárido se ha determinado que está
compuesto de galactosamina formando un polímero N-acetilgalactosamina (GalNAc) de [DGalNAc( 1,3)-D-GalNAc]n donde n es al menos 23 [119]. El polímero GalNAc es sintetizado a
partir de fructosa-6-fosfato (generada a partir de Glucosa) y se han identificado 5 enzimas que
participan en este proceso las cuales se inducen durante el proceso de enquistación (Figura 12)
[120]. Se ha caracterizado la actividad enzimática que cataliza la reacción de polimerización y
formación final del polímero de GalNAc denominada actividad “cyst-wall synthase” (CWS), sin
embargo la identidad de la enzima no se ha determinado (121).
Figura 12. Ruta biosintética del polisacárido GalNAc. El
polisacárido GalNAc constituye el 63% de la pared del
quiste de G.intestinalis. GalNAc es biosintetizado a partir de
fructosa-6-fosfato por la acción secuencial de seis enzimas,
las enzimas que participan en las cinco primeras reacciones
han sido completamente identificadas, mientras que la
enzima que cataliza la reacción de polimerización final no se
conoce y solo se ha caracterizado la actividad. Las enzimas
en
orden
de
acción
son:
glucosamina-6-fosfato
isomerasa/deaminasa
(GNA),
fosfoacetilglucosamina
mutasa (AMG), UDP-N-acetilglucosamina (UAP), UDP-Nacetilglucosamina 4-epimerasa (UAE) y cyst wall synthase
(CWS). n es al menos 23.
45
El componente proteico de la pared se fundamenta en tres proteínas denominadas CWP1,
CWP2, y CWP3 de 26, 39 y 27 kDa respectivamente (“cyst wall poteins” 1, 2 y 3); estas son
proteínas ricas en leucina, contienen una región N-terminal hidrofóbica, un dominio rico en
cisteína y cinco copias de una repetición rica en leucina implicada en interacciones proteínaproteína [122,123]. CWP2 sufre un procesamiento post-traduccional que consiste en una
proteólisis en su C-terminal por la proteasa ESCP (“enquistation-specific cysteine protease”),
generándose así dos polipéptidos de 26 kDa (N-terminal) y 13 kDa (C-terminal). La proteína de
26 kDa (CWP2-26) es la que se incorpora a la pared del quiste, sin embargo ambas regiones
son indispensable para la formación de las ESVs (vesículas específicas de enquistación o
“enquistation specific vesicles”) [122,124,125]. La expresión de las CWPs es inducida durante la
enquistación y son transportadas a la pared del quiste por las vesículas específicas de la
enquistación (ESVs). Recientemente se demostró que CWP1, a través de su región rica en
leucina, se une al polímero de GalNAc actuando como una lectina [126]. La proteína HCNCp
(“High Cystein Non-variant Cyst protein”) junto con un grupo de proteínas denominadas
EGFCPs (“EGF-like cyst proteins”) localizan en la pared del quiste y parecen ser transportadas
a ésta a través de las ESVs como ocurre con las CWPs. Sin embargo, a diferencia de lo que
ocurre con las CWPs que se localizan exclusivamente en la pared del quiste estas proteínas se
localizan en la pared y en el cuerpo del quiste simultáneamente [127,128]. Hasta el momento no
se conoce que papel desempeñan estas proteínas en la pared del quiste.
3.1.2. El trofozoíto
El trofozoíto (Figura 11) necesita condiciones anaeróbicas para sobrevivir y multiplicarse. Se
localiza y coloniza en el intestino del hospedero, mide entre 10-12 m de largo y 5-7 m de
ancho; su estructura consiste de una membrana celular, y citoesqueleto entre los que se
destacan estructuras como el cuerpo basal, cuerpo medio, disco ventral y cuatro pares de
flagelos (anterior, posterior, caudal, y ventral). Los trofozoítos de Giardia carecen de organelos
típicos eucariotas como los peroxisomas y las mitocondrias, sin embargo se han descrito y
caracterizado unos organelos denominados mitosomas los cuales parecen ser remanentes
mitocondriales [129]. El aparato de Golgi también parece estar ausente, vesículas secretorias
(ESVs) que sugieren transporte similar al mediado por Golgi se han identificado solo en
trofozoítos enquistantes [14,110]. Los trofozoítos son binucleados, los dos núcleos poseen la
misma cantidad de DNA, se replican casi al mismo tiempo y ambos son transcripcionalmente
activos [14]. Cada núcleo tiene dos copias de cada uno de los cinco cromosomas de un tamaño
aproximado de 1,6 Mb (cromosomas 1 y 2), 2,3 Mb (cromosoma 3), 3,0 Mb (cromosoma 4) y 3,8
46
Mb (cromosoma 5), dando lugar a un genoma haploide de 12 MB (Bernarder et al. 2001). En
cuanto al nucleolo este se ha considerado ausenta, sin embargo recientemente en un estudio
empleando marcadores nucleolares (fibrilarina y rRNA-seudoridina sintasa, CBF5) se
identificaron unas zonas fibro-granulares en la parte anterior de los núcleos los cuales parecen
ser regiones de organización nucleolar [130].
A. RETICULO
ENDOPLASMÁTICO
B. VACUOLAS
PERIFÉRICAS
C. MEMBRANA PLASMÁTICA
Y FLAGELOS
Figura 13. Inmunolocalización de algunas estructuras en trofozoítos de G.intestinalis del
clon WB/1267. (A) Retículo endoplasmático inmunolocalizado empleando un
anticuerpo
monoclonal anti-Bip. (B) Vacuolas periféricas similares a lisosomas (PVs) inmunolocalizadas con
anticuerpo monoclonal anti-PV. (C) Inmunolocalización de la proteína VSP-1267 con el anticuerpo
monoclonal 7D2. VSP1267 se localiza en membrana y flagelo lo que permite observar estas
estructuras. El clon WB/1267 solo expresa la VSP-1267. Tomado de la referencia [110]
Giardia tiene un retículo endoplasmático (ER) que ocupa gran parte de la célula presentado una
organización característica, zonas densas alrededor del núcleo y mas discretas en el resto de la
célula (Figura 13). En el ER se localizan la chaperona Bip y las tres proteínas disulfuro isomeras
(PDIs) identificadas en Giardia [112]. Giardia tiene numerosas vacuolas periféricas similares a
lisosomas (PVs – “lysosome-like peripherals vacuoles”), las cuales actúan como endosomas y
lisosomas [111-112] (Figura 13). En las PVs se han localizado la fosfatasa ácida (AcP) y la
catepsina B [111-112], también están presentes importantes proteínas involucradas en
transporte y endocitosis como dinamina [131], clatrina [131,132] y las subunidades AP1-μa
[133] y AP2-μ2 [132] de los complejos de proteínas adaptadores AP1 y AP2 respectivamente.
Las membranas de los trofozoítos están cubiertas completamente de una familia de proteínas
llamadas proteinas variantes de superficie (VSPs – “variant-specific surface proteins”) (Figura
13). Estas proteínas son ricas en cisteína y contienen muchos motivos CXXC, uno o dos
motivos GGCY, un motivo dedo de Zn, un dominio transmembrana conservado y un extremo Cterminal citoplasmático invariable conteniendo los 5 aminoácidos GRGKA. El genoma del
parásito tiene cerca de 190 genes que codifican VSPs, sin embargo solo expresa en la
47
superficie una a la vez. Las VSP en la superficie cambia espontáneamente cada 6 o 13
generaciones en cultivos in vitro o bajo presión inmunológica. Estas proteínas esta involucradas
en la variación antigénica, la cual le permite al parásito evadir la respuesta inmune del
hospedero mediante un continuo cambio de la proteína VSP expuesta en su superficie [134]. El
proceso molecular por el cual se regula que solo una VSP se traduzca a proteína es mediado
por un mecanismo similar al RNA de interferencia [135].
Giardia presenta un citoesqueleto bastante complejo, el cual incluye al disco ventral, cuatro
pares de flagelos, entre otros [14]. El disco ventral es una estructura propia de G.intestinales, es
una estructura cóncava compuesto de microtúbulos que ocupa las dos terceras partes de la
superficie ventral del trofozoíto y presenta una profundidad de aproximadamente 0,4 m; por
medio del disco ventral los trofozoítos se adhieren a las células epiteliales del intestino. Las
proteínas mayoritarias identificadas en el disco son las tubulinas y un grupo de proteínas
acídicas llamadas giardinas que comprenden aproximadamente el 20% de las proteínas del
citoesqueleto. El disco también contiene las proteínas motoras actina, actinina, que actuarían
como la base bioquímica de la contracción del disco [14]. La proteína de unión a calcio centrina
está presente en todo el sistema microtubular de Giardia y se ha propuesto que puede estar
involucrada, junto con los microtúbulos, en movilidad y adhesión [136]. La adherencia es
inhibida por oxígeno, bajas temperaturas, bajas concentraciones de cisteína y agentes
farmacológicos como metronidazol, furazolidina y benzimidazoles, estos últimos actúan sobre la
-tubulina. Giardia tiene cuatro pares de flagelos: anterior, caudal, posterior y ventral, y
emergen del cuerpo basal. Estos tienen importantes papeles en la locomoción de la célula y
también participan en el proceso de fijación a las células epiteliales del intestino [14].
3.2. Procesos de diferenciación
G.intestinalis presenta dos procesos de diferenciación que le permiten adaptarse a su entorno y
alternar entre el hospedero y el medio ambiente externo, ambos procesos se llevan a cabo en el
hospedero (Figura 11). La diferenciación de quiste inerte a trofozoíto vegetativo se conoce
como exquistación, y en dicho proceso se presenta un estadio intermedio conocido como
exquizoíto. La enquistación es la diferenciación de trofozoíto a quiste y es quizás uno de los
procesos de adaptación más primitivos y exitosos de un eucariota.
48
3.2.1. Exquistación
El proceso de exquistación (Figura 11) es un paso esencial en la transmisión de la Giardiosis,
es inducido por los cambios extremos de pH (ácido del estómago a alcalino del intestino),
osmolaridad, cambios de temperatura, y exposición a proteasas como tripsina y quimotripsina.
Este proceso de diferenciación ocurre rápidamente, in vitro el tiempo es de 30 minutos. Una
vez los quistes han sido ingeridos y son expuestos al ácido gástrico del estómago se inicia el
proceso de exquistación. Sin embargo, la exquistación completa se lleva a cabo cuando el
quiste llega al intestino, ya que si los trofozoítos emergieran de éste en el estómago morirían de
inmediato debido al bajo pH. Una vez en el intestino delgado los quistes son expuestos a
enzimas proteolíticas y sales biliares, y finalmente la inducción completa por parte de su entorno
hace que emerja un exquizoíto cuadrinucleado que rápidamente se divide en dos trofozoítos
activos, estos a su vez se dividen de nuevo por fisión binaria para así generar en total cuatro
trofozoítos por quiste. Los trofozoítos colonizan el duodeno adhiriéndose a las células epiteliales
por medio de su disco ventral [14].
Para que se dé la emergencia del exquizoíto es necesario que se genere una puerta de salida
en la pared, se ha descrito que este emerge por una abertura en uno de los polos del quiste y
que las primeras estructuras en salir son los flagelos que posiblemente median el movimiento
de salida [137]. Inicialmente se planteaba que la ruptura de la pared era mediada por proteasas
del hospedero, sin embargo los experimentos de exquistación in vitro muestran que el
exquizoíto puede emerger sin necesidad de incorporar proteasas en la solución de enquistación
[138,139]. Lo anterior sugiere que proteasa propias de Giardia podrían actuar sobre la pared
para generar la abertura, efectivamente dos proteasas (catepsina B y la fosfatasa ácida AcP)
que se localizan en las PVs tiene un papel importante en la exquistación. El inhibidor de
cisteína-proteasas Mu-Tyr(Ome)hPhe-FMK inhibe el proceso de exquistación, y se identificó
como blanco de este inhibidor a la catepsina B [140]. Por otra parte se ha demostrado que la
de-fosforilación de las CWPs es un evento indispensable para que se de la exquistación y la
enzima responsable de este proceso es la fosfatasa ácida AcP [141]. Ambos estudios sugieren
que el contenido de las PVs y su liberación puede mediar la ruptura de la pared del quiste para
que emerja el exquizoíto.
Durante la exquistación se ha observado un aumento en la captación de oxígeno que comienza
inmediatamente inducido el proceso y se incrementa exponencialmente durante los 30 minutos
siguientes, estos cambios están ligados a un incremento en la velocidad metabólica [142].
49
Durante la exquistación están involucrados procesos de señalización. Antagonistas de
calmodulina (TFP y W7) inhiben la exquistación sugiriendo que esta proteína puede estar
involucrada en este proceso [143], además trabajos en nuestro grupo mostraron un papel
importante del ión calcio en la fase de inducción de la exquistación [144], sugiriendo un papel
importante del sistema Ca2+/Calmodulina en la exquistación. Estudios de inhibición han sugerido
que otras proteínas de señalización como la PKA (proteína kinasa A) y la PP2A (fosfatasa ácida
2A) participan en eventos tempranos de la exquistación [145,146]. Recientemente nuestro
grupo identificó a las proteínas 14-3-3 y Hsp70 como los sustratos fosforilados mas abundantes
en la exquistación, además su estado de fosforilación cambia durante el proceso. Hsp70 esta
fosforilada en los quistes y una vez inducido el proceso es defosforilada. Por otro lado 14-3-3
permanece fosforilada durante todo el proceso pero su movilidad electroforética cambia
sugiriendo modificaciones adicionales o diferentes grados de fosforilación. Lo anterior sugiere
que Hsp70 y 14-3-3 podrían intervenir en el proceso de exquistación. En este mismo trabajo se
demostró que la inhibición serina-treonina kinasa inhibe el proceso de citoquinesis del
exquizoíto [139]. Estos resultados sugieren que en la exquistación pueden presentarse
mecanismos moleculares dependientes de sistemas kinasa/fosfatasa. En cuanto a la síntesis de
RNA mensajeros un trabajo realizado por Hetsko y col. [147], utilizando el método de mRNA
“differential display” evidenció complejos cambios transcripcionales durante el proceso de
exquistación. Se observó cómo algunos transcritos aparecían, desaparecían o cambiaban en
abundancia durante la exquistación, sin embargo no identificaron los mRNAs. Nosotros
encontramos que durante la exquistación ocurren eventos de transcripción y síntesis de
proteínas, demostrando que la exquistación a pesar de su corta duración no es sólo un proceso
de re-arreglo mecánico de componentes, sino uno en el que se inicia un patrón de expresión
génica, muy bien regulado, dirigido a generar las condiciones metabólicas necesarias para el
desarrollo de los trofozoítos [138,148].
3.2.2. Enquistación
La enquistación es la diferenciación de trofozoíto a quiste y ocurre en el yeyuno. Este proceso
es inducido por la carencia de colesterol, y esta condición es necesaria y suficiente para que se
de el proceso [113]. La enquistación puede realizarse in vitro empleando altas concentraciones
de bilis, que secuestran el colesterol, y aumentando ligeramente el pH de 7.0 a 7.8. Este
proceso requiere más tiempo que la exquistación, in vitro puede oscilar entre 24 y 48 horas
dependiendo el método empleado. La enquistación puede dividirse en tres etapas: 1) recepción
del estímulo y transmisión de la señal al núcleo para activar la expresión de genes específicos
50
de la enquistación, 2) síntesis y transporte de los componentes de la pared del quiste,
biogénesis de los organelos transportadores (ESVs), y 3) liberación del contenido de las ESVs y
ensamblaje de la pared del quiste. Adicionalmente se dan procesos de replicación del material
genético, división nuclear, internalización de los flagelos, fragmentación del disco adhesivo,
entre otros [15].
Uno de los eventos más característicos e importantes que ocurre durante la enquistación es la
formación de la pared del quiste y los eventos que la preceden (síntesis y transporte de los sus
componentes) [15]. Se conoce muy poco sobre la activación de los genes específicos de la
enquistación (ESG – “encystation-specific genes”) y mucho menos de como la deprivación de
colesterol se transluce en una señal intracelular que genere la respuesta. Se ha propuesto que
alteraciones en la membrana de los trofozoítos debido al cambio en la concentración de
colesterol puede activar proteínas de membrana que inicien una cascada de señalización que
termina en la activación de la transcripción de los ESGs [15,16]. Hasta la fecha solo se ha
asociado una proteína de membrana con la enquistación, la inhibición de la DPP-IV (dipeptidil
peptidasa IV asosiada a la membrana) impide la formación de los quistes lo cual vincula un
proceso proteolítico mediado por esta aminopeptidasa de membrana con la enquistación [149].
En cuanto al control transcripcional durante la enquistación se han realizado estudios que
muestran una posible asociación de los factores de transcripción Myb2 (“Myb-related
transcription factors”), GARP (“golden arabidopsis response regulator protein”), ARID (“AT-rich
interaction domain”) y WRKY (“wrky transcription factor”) con la expresión de los ESGs [150153]. El de más amplio espectro parece ser Myb2, este se une específicamente a la secuencia
C(T/A)ACAG presente en la región 5’ flanqueante a los genes cwp1, cwp2, cwp3, gna y del
mismo myb2 [150]. Aunque los estudios muestran evidencias como la unión de los factores a
regiones promotoras de los genes y patrones de expresión similares entre el factor y el gen
regulado no son totalmente concluyentes. En dichos estudios no se realizaron estudios de
inhibición genética de dichos factores que muestren una asociación directa con la expresión de
los ESGs y/o con la enquistación, por el momento se pueden sugerir como candidatos.
Recientemente se demostró que la ESGs esta regulada por mecanismos epigenéticos, la hipoacetilación de histonas activa la expresión de estos genes, de tal manera que la actividad de las
acetilasas y deacetilasas de histonas es importante en la regulación genética durante la
enquistación [154]. El comportamiento contradice el comportamiento general de la hipoacetilación de histonas (genera una cromatina mas condensada) la cual reprime la transcripción
[75]. Los autores proponen un mecanismo indirecto en el cual la hipo-acetilación podría reprimir
51
la expresión de un gen de una proteína que este actuando como represora de la expresión de
los ESGs o de uno se sus activadores, y al no estar presente se activaría la expresión de los
ESGs [154] .
Una vez sintetizadas las CWP1-3 son transportadas a las ESVs, las ESVs son gránulos de
secreción que solo se forman cuando se induce la enquistación y participan en el tráfico y
maduración de los componentes proteicos de la pared del quiste [15]. La formación de enlaces
disulfuro intermoleculares entres las CWPs al parecer son mediados por tres disulfuro
isomerasas (PDI 1-3), las cuales se localizan en las ESVs [155]. Estas PDI tienen actividad
transglutaminasa que al parecer podrían realizar entrecruzados peptídicos haciendo un
complejo proteico más resistente, la inhibición de esta actividad disminuye la formación de
quistes [156]. La proteína CWP2 pierde una región de su C-terminal en su proceso de
maduración, la cisteína-proteasa ESCP que realiza la ruptura también está localizada en las
ESVs [124]. En las ESVs también se encuentra la proteína de unión a calcio gGSP (“granulespecific protein”) implicada en la descarga del contenido de las ESVs, está implica al calcio en
el proceso de exocitosis del material proteico de la pared del quiste [157]. En cuanto al
polisacárido GalNAc que forma el 63% de la pared no se conoce como es transportado a la
periferia de la célula ni como se forma incorpora en la pared. Un estudio reciente sugiere que la
proteína CWP1 se puede unir a GalNAc actuando como una lectina, mostrando una relación de
asociación entre el componente polisacárido y el proteico [121]. El mecanismo final de
liberación de los componentes de las ESVs y formación de la matriz de la pared es
desconocido.
La formación eficiente de quistes se afecta cuando se realiza inhibición genética de proteínas
involucradas en transporte vesicular como la dinamina [131], y las subunidades AP1-μa [133] y
AP2-μ2 [132] de los complejos de proteínas adaptadores AP1 y AP2 respectivamente. Las tres
proteínas se localizan en las PVs, sin embargo dinamina co-localiza con las ESVs durante la
enquistación. Ya que la inhibición genética de dinamina no interfirió con la formación de ESVs
se sugiere que su acción es en eventos tardíos en la enquistación posiblemente regulando la
liberación del contenido de las ESVs [131]. AP1-μa y AP2-μ2 al parecer permanecen en las
PVs, durante la enquistación se encuentran PVs rodeando ESVs lo que muestra una asociación
entre PVs y enquistación. Como se menciono antes en las PVs se encuentra la enzima ESCP
responsable de modificar a CWP2, evento indispensable en la enquistación. En conjunto se
sugiere que AP1-μa y AP2-μ2 podría mediar el tráfico de ESCP a las ESVs [132]. En cuanto a
52
vías de señalización asociadas al proceso algunas proteínas de señalización han sido
relacionadas con éste: la fosfatasa 2A (PP2A) y la proteína kinasa C (PKC) cuyas inhibiciones
afectan el proceso de enquistación [146,158]; y otras cuya actividad aumenta durante el
proceso como la proteína kinasa 2 (PKA) y las kinasas-1 y 2 reguladas por señal extracelular
(ERK1/2) [159,160].
3.3. Ubiquitinación en Giardia intestinalis
En G.intestinalis se describió en 1994 la presencia de un único gen que codifica para Ub [161].
En nuestro grupo se identifico por bioinformática un gen adicional de Ub que se encuentra
fusionado al gen de una subunidad ribosomal, similar a lo que se ha descrito en otros eucariotes
[162]. Posteriormente Catic y col. [163] reportaron de nuevo la presencia de este gen en
G.intestinalis señalando que se encuentra fusionado a la proteína ribosomal S27. Los genes de
Ub se expresan como tres precursores, una unidad idéntica concatenada (poliubiquitina), y dos
(UbL40 y UbS27) que están fusionados a polipéptidos ribosomales L40 y S27 [164]. En cuanto al
sistema de ubiquitinación se han identificado parcialmente algunos de los componentes en
G.intestinalis. En nuestro grupo se identificaron por bioinformática y analizaron la expresión de
genes homólogos a una enzima activadora de Ub (E1), una enzima conjugadora de Ub (E2),
una HECT-E3-ligasa y la ligasa E3-
(involucrada en la vía del N-terminal). Además
identificaron in silico otras tres enzimas E2, dos E3-ligasas (una de ellas con dominio RING) y
cuatro homólogos de proteínas desubiquitinadoras [162]. Estos resultados muestran que
G.intestinalis presenta las enzimas necesarias para la ubiquitinación de proteínas. Hasta la
fecha solo se ha identificado un sustrato ubiquitinado en Giardia, la glucosamina-6-fosfato
isomerasa - GNA (la enzima que cataliza el primer paso en la biosíntesis del polisacárido
GalNAc, componente de la pared del quiste (Figura12)), sin embargo en dicho trabajo sólo se
mostró que la proteína tenía Ub conjugada y no se analizó ni discutió su significado biológico
[165].
En cuanto al proteosoma 20S de G.intestinalis éste fue purificado por primera vez por
Emmerlich y col. [166] empleando gradientes de glicerol y separaciones cromatográficas. La
micrografía electrónica del proteosoma 20S de 700KDa mostró la forma típica de barril para la
53
partícula central 20S. El análisis SDS-PAGE bidimensional evidenció 14 subunidades proteicas
entre 23 y 33 kDa, es decir igual número de subunidades que otros proteosomas 20S (7
subunidades
y 7 subunidades ). El proteosoma 20S purificado no mostró actividad frente a
los péptidos fluorogénicos habitualmente empleados como sustratos del 20S, los autores
atribuyen esto a daño del 20S durante la purificación. Recientemente en nuestro grupo también
se purificó el Proteosoma 20S de G.intestinalis y se determinó que este presenta actividad
frente a los péptidos fluorogénicos Z-LLE-AMC y Suc-LLVY-AMC, lo cual indica actividad similar
a quimotripsina y similar a caspasa respectivamente [167]. En este trabajo también se
determinó que la inhibición específica del proteosoma de G.intestinalis no afecta la replicación
de los trofozoítos. Ninguno de los inhibidores del proteosoma (MG132, epoximicina, lactacistina)
afecto el porcentaje de enquistación, sin embargo se observó que el inhibidor MG132 afectaba
la viabilidad de los quiste formados, sugiriendo que el proteosoma 26S podría estar involucrado
en procesos tardíos de la enquistación relacionados con la formación de la matriz de la pared
del quiste [167].
54
Capítulo 4
Estrategia experimental y métodos
____________________________________________________
La investigación desarrollada en este trabajo de tesis partió de la siguiente hipótesis: estudiar
el proceso de ubiquitinación en células eucariotas primitivas puede dar luces sobre los
papeles que la Ub y la ubiquitinación presentaban tempranamente en la evolución del
linaje eucariota. A partir de esta hipótesis planteamos como Objetivo general: analizar el
proceso de ubiquitinación de proteínas y su relevancia en la diferenciación de Giardia
intestinales. Para cumplir con este objetivo desarrollamos la siguiente estrategia experimental:
1. Obtener células y extractos de trofozoítos, células enquistantes y quistes.
La mayor parte del trabajo involucró el uso de células completas (ej. inmunofluorescencias) o
extractos de células de trofozoítos, células enquistantes y quistes. Para tal fin se realizó un
trabajo constante de cultivo de trofozoítos y experimentos de enquistación in vitro. El método
empleado para realizar la diferenciación in vitro de trofozoíto a quiste (enquistación) se llevó a
cabo por 48 horas, se colectaron células a las 0, 6, 12, 24 y 48 (quistes) horas post-inducción.
2. Determinar en que medida es necesaria la ubiquitinación – análisis de la enzima
activadora de Ub (E1) de G.intestinalis.
La enzima E1 es considerada el ápice de la cascada y las vías de señalización mediadas por
ubiquitinación. Con base en esta premisa realizamos la caracterización bioquímica y funcional
de la enzima E1 de G.intestinalis como acercamiento experimental para hacer inferencias sobre
el papel de la ubiquitinación en esta célula. Analizamos los niveles de expresión del gen de e1 a
nivel de mRNA y proteína, desarrollamos anticuerpos policlonales en ratón con el fin de analizar
la expresión y localización de la enzima. Empleando técnicas de manipulación genética sobreexpresamos e inhibimos la expresión del gen e1 para determinar su funcionalidad en el
desarrollo y diferenciación de G.intestinalis.
55
3. Analizar la expresión y localización de la Ub y diferentes especies de Ub en trofozoítos
y durante la enquistación de G.intestinalis.
Empleamos técnicas de inmunoblot para evaluar la expresión de la Ub y los conjugados Ubproteína (proteínas ubiquitinadas) en trofozoítos, células enquistantes y quistes. Para evaluar el
conjunto completo de Ub y proteínas conjugadas a Ub, así como de diferentes especies de Ub
realizamos experimentos de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia. Utilizamos anticuerpos
que reconocen específicamente a la Ub y a diferentes especies de Ub:
-
pAb-gUb: Reconoce específicamente la Ub de G.intestinalis. Desarrollado en nuestro
laboratorio empleando como antígeno Ub purificada de G.intestinalis [167]. Policlonal en
conejo.
-
ZTA10: Reconoce Ub libre y todo el conjunto de especies de Ub, antígeno Ub humana.
Obsequio Dra. Simona Polo – FIRC Institute of Molecular Oncology Foundation (IFOM).
-
FK1: Reconoce solo proteínas poliUb, no reconoce Ub libre ni monoUb (Enzo Life
Sciences). Monoclonal en ratón.
-
FK2: Reconoce Ub libre, proteínas monoUb y poliUb (Enzo Life Sciences). Monoclonal
en ratón.
-
mAb-K48: Reconoce específicamente cadenas de Lys48-poliUb (Millipore) [58].
Monoclonal en conejo.
-
mAb-k63: Reconoce específicamente cadenas de Lys63-poliUb (Millipore) [58].
Monoclonal en conejo.
4. Identificar proteínas de unión a Ub (UBPs)
Realizamos un experimento de “pull-down” para aislar proteínas de unión a Ub en G.intestinalis.
Utilizamos extractos NP40 de trofozoítos y como fuente de Ub utilizamos perlas (glutatiónsefarosa) acopladas a proteínas recombinantes de Ub y tri-Ub lineal (Ub-Ub-Ub) humana
fusionada a la glutatión-s-transferasa – GST (GST-Ub y GST-Ub3 respectivamente). Las
proteínas se separaron por SDS-PAGE y se identificaron por cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
56
5. Identificar proteínas ubiquitinadas.
Desarrollamos un sistema de ubiquitinación in vitro derivado de G.intestinalis y lo empleamos
para analizar, purificar e identificar proteínas ubiquitinadas en trofozoítos y durante el proceso
de enquistación. En este ensayo in vitro los componentes del sistema de ubiquitinación (E1,
E2s, E3-ligasas, sustratos, etc) son aportados por el extracto proteico y las proteínas son
marcadas con His6Ubiquitina enxógena, se suplementa con inhibidores de enzimas DUBs
(ubiquitina-aldehído) y del proteosoma (MG132); además se incorpora un sistema regenerador
de ATP (ATP, MgCl2, creatina kinasa y fosofocreatina). Las proteínas marcadas con
His6Ubiquitina fueron detectadas por inmunoblot con anti-His o anti-Ub (ZTA10), y fueron
purificadas por cromatografía de afinidad con resinas de Ni-NTA agarosa y analizadas por
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
A continuación se describen en detalle los métodos empleados.
4.1.
Obtención de células y extractos de trofozoítos, células enquistantes y quistes.
4.1.1. Cultivo y diferenciación de G.intestinalis.
Se cultivaron trofozoítos de G.intestinalis del clon WB/9B10 [168] en medio modificado Diamond
TYI-S-331 [169], pH 7.0 y 37°C, en tubos estériles de poliestireno (Fischerbrand) de 13 mL o
7mL, y con 15° de inclinación. Los trofozoítos se colectaron enfriando los tubos a 4°C por 10
min para que los parásitos adheridos se despegaran de las paredes del tubo, posteriormente
se centrifugó a 500 x g por 10 min y se retiró el medio. Las células se lavaron dos veces con
PBS2 y colectaron por centrifugación, se resuspendieron en 1mL de PBS y se contaron en
cámara de Neubauer. La enquistación in vitro se realizó por el método desarrollado por Kane y
col. [170]. Se cultivaron trofozoítos en medio TYI-S-33 por 72 horas, posteriormente se retiró
cuidadosamente el medio junto con los parásitos no adheridos. Se realizó la inducción de la
enquistación a la monocapa de trofozoítos adheridos incubando con medio de enquistación3 a
1
1 Litro de medio TYI-S-33 contiene: 1,3g de K2HPO4 trihidratado, 0,6g de KH2PO4 anhidro, 20g de peptona, 10 g de
extracto de levadura, 10g de D-glucosa, 2g de clorhidrato de L-cisteína, 200mg de ácido ascórbico, 22,8mg de citrato
férrico amónico, 0,5g de bilis bovina, se ajusta el pH a 7,0 con NaOH. Antibiótico a concentración final de 10U/mL de
penicilina y 1 μg/mL de estreptomicina. El medio se esteriliza por filtración a través de membranas de 0,2 μm
(Milipore) y se adicionan 100mL de suero bovino.
2
Buffer fosfato salino (PBS): NaCl 137mM, KCl 2,4mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1.8mM. pH 7,4 con HCl.
3
Medio de enquistación: Medio TYI-S-33 suplementado con bilis 10mg/mL y pH 7,8.
57
37°C por 24 horas. Las células se colectaron por centrifugación (500 x g por 10min) y el medio
de enquistación se retiró y reemplazó por medio normal de crecimiento TYI-S-33. Las células se
incubaron a 37°C por 24 horas más, para un total de 48 horas, tiempo en el cual se obtuvieron
los quistes. Las células se colectaron por centrifugación y se resuspendieron en agua destilada
y desionizada (H2O dd), se incubaron a 4°C por 24 horas para eliminar por lisis hipotónica los
trofozoítos y células enquistantes remanentes. Finalmente los quistes se colectaron por
centrifugación, se lavaron con PBS y se contaron en cámara de Neubauer. Se colectaron
células a las 6, 12, 24 y 48 (quistes) horas post-inducción.
4.1.2. Preparación de extractos proteicos.
Las células se resuspendieron en buffer de lisis4 (relación células:buffer 1:4) y se incubaron
durante una hora a 4°C con agitación constante. La suspensión se centrifugó a 8.000 x g
durante 30min a 4°C, el sobrenadante (extracto-NP40) fue colectado cuidadosamente. El
“pellet” se resuspendió en buffer de extracción nuclear5 y se incubo durante una hora a 4°C con
agitación constante. La suspensión se centrifugó a 8.000 x g durante 30min a 4°C, el
sobrenadante (fracción nuclear enriquecida – FNE) fue colectado cuidadosamente. Para romper
la pared de los quistes estos fueron macerados con N2 líquido antes de realizar la extracción. La
concentración de proteína se cuantificó por el método de Bradford [171]. Los extractos se
fraccionaron en varias alícuotas y se conservaron a -80°C.
4.2.
Caracterización bioquímica y funcional de la enzima activadora de ubiquitina (E1)
de G.intestinalis.
4.2.1. Expresión del RNA mensajero: extracción de RNA, síntesis de cDNA y PCR en
tiempo real.
RNA total de trofozoítos, células enquistantes y quistes fue aislado usando el reactivo TRIZOL
(Invitrogen). Las células se colectaron por centrifugación y se lavaron con PBS. El “pellet”
celular se resuspendió en 1mL de TRIZOL y se realizó extracción de DNA y proteínas con
cloroformo (0,2mL CHCl3 / 1ml TRIZOL). Se centrifugó a 8,000 x g durante 15min a 4°C y se
4
Buffer de lisis: Tris pH 7,5 30mM, NaCl 50mM, MgCl2 3mM, glicerol 10%, 2-mercaptoetanol 10mM, NP40 0,5% y
coctel de inhibidores de proteasas 1:100 (P8340 de Sigma).
5
Buffer de extracción nuclear: Tris 30mM pH 7,5, NaCl 400mM, MgCl2 2mM, glicerol 10%, 2-mercaptoetanol 10mM,
NP40 0,5% y coctel de inhibidores de proteasas 1:100 (P8340, Sigma).
58
retiró la fase acuosa (RNA). El RNA se precipitó de la fase acuosa con isopropanol (0,5mL
isopropanol / 1mL TRIZOL) y se colectó por centrifugación a 8,000 x g durante 10min a 4°C. El
“pellet” de RNA se lavó con etanol al 75% y se colectó nuevamente por centrifugación. Se
determinó la concentración del RNA aislado por medidas de absorbancia a 260nm. Las
muestras de RNA se evaluaron por PCR para descartar contaminación con DNA. Se sintetizó
cDNA a partir de 5μg de RNA total, usando la transcriptasa reversa M-MLV (Promega) y oligo(dT)20 (Invitrogen). Inicialmente se mezclaron 5μg del RNA total con 2,5μg de oligo-(dT)20
(15μL volumen final con H2O DEPC6), se incubó durante 5 min a 70°C y se enfrío sobre hielo.
La síntesis de cDNA se realizó en la siguiente mezcla de reacción: los 15μL de la reacción
anterior, 5μL de buffer M-MLV 5X7, 2,5μL de una mezcla de dNTPs (cada uno a concentración
5mM), 1,0μL de RNAsin (25U, Invitrogen), 1,0μL de enzima M-MLV (200U), y H2O DEPC para
completar a volumen final de 25μL. La mezcla de reacción se incubó durante 60 min a 37°C. El
cDNA se conservó a -80°C hasta el momento de su uso.
Para realizar las reacciones de PCR cuantitativo en tiempo real se utilizaron 5μL de cDNA, el kit
QuantiTec SYBR Green PCR (Quiagen). Se amplificó un fragmento de 145 pb de la región 3´
del gen e1 de G.intestinalis (NCBI XM_001707978.1, 3,279 pb) utilizando el oliglonucleótido8
sentido Gl-NTE1-F 5’-GAATTCACCCTACGTCAACATCAT-3’, y el oligonucleótido antisentido
Gl-NTE1-R 5-’GTCGACATTGTCAACCACCTCAAC-3’. Las condiciones para la amplificación
fueron las siguientes: 12,5μL de QuantiTec SYBR Green PCR Master Mix 2X9, 0,3μM de
oligonucleótido sentido y antisentido, 5μL de cDNA y H2O DEPC para completar a volumen final
de 25μL. El programa de ciclo térmico que se utilizó fue el siguiente: una desnaturalización
inicial a 94°C por 5min; seguida de 40 ciclos de desnaturalización 94°C por 45seg, anillaje a
55°C por 45seg y extensión 72°C por 1min; por último una extensión a 72°C por 7min. Se utilizó
el equipo real Chromo 4 real-time PCR detector Bio-Rad. Se realizó cuantificación absoluta, la
curva de calibración se realizó por triplicado utilizando el plásmido pGEM-T-GE1NT, este
contiene el fragmento de 145 pb del gen e1 que se amplificó por PCR en tiempo real.
6
H2O DEPC: Agua dd tratada con dietil pirocarbonate.
Buffer M-MLV: Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl2 3mM y DTT 10 mM.
8
Todos los oligonucleótidos se diseñaron con el programa Primer Designer version 1.01. Contenido GC: 40-60%;
Tm: 40-60°C. La lista de oligonucleótidos utilizados en este trabajo esta en el anexo 1.
9
QuantiTec SYBR Green PCR Master Mix 2X: HotStar Taq DNA polimerasa, buffer QuantiTect SYBR Green PCR
(Tris, KCl, (NH4)2SO4, 5 mM MgCl2, pH 8.7), dNTPs y colorantes fluorescentes SYBR Green I y ROX.
7
59
Para evaluar la integridad del mRNA del gen e1 (3,279 pb) y determinar si este se transcribía
completo se realizó PCR sobre el cDNA sintetizado empleando una pareja de oligonucleótidos
que amplifica un fragmento de 2,898 pb del gen e1 (158 bp a 3,056 pb, corresponde al 88% del
gen). Este fragmento contiene las dos regiones usadas para generar las dos proteínas
recombinantes
(mas
adelante).
GAATTCACCCTACGTCAACATCAT-3’
Se
y
utilizó
el
el
oligonucleótido
oligonucleótido
Gl-NTE1-F
antisentido
Gl-CTE1-R
5’5'-
GTCGACCCTTGAACTGTTACGGTT-3'. Para amplificar este fragmento se utilizó la enzima de
alta fidelidad y alta procesividad AccuPrimeTM Pfx DNA polimerasa (Invitrogen). Las condiciones
para la amplificación fueron las siguientes: 2,5μL de AccuPrimeTM Pfx reaction mix 10X10, 1,0μL
de oligonucleótido sentido (conc. final 0,5μM), 1,0μL de oligonucleótido antisentido (conc. final
0,5μM), 0,3μL de enzima AccuPrimeTM Pfx DNA polimerasa, 2,0μL de cDNA, y H2O DEPC para
completar a volumen de 25μL. El programa de ciclo térmico que se utilizó fue el siguiente: una
desnaturalización inicial a 94°C por 5min; seguida de 30 ciclos de desnaturalización 94°C por
45seg, anillaje a 55°C por 45seg y extensión 68°C por 4min; por último una extensión a 68°C
por 7min. El PCR también se realizó utilizando 100ng de DNA genómico de G.intestinalis como
plantilla (control positivo) o 200ng de RNA total de G.intestinalis como plantilla (control
negativo). Se utilizó un termociclador GeneAmp PCR System 2400 PerkinElmer. Los productos
se analizaron por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,8% en TBE11 0,5X. Se mezcló
4μL de producto con 1μL de buffer carga para electroforesis de DNA. Se aplicaron 70 voltios
hasta el final de la corrida. El gel se tiñó por suspensión en bromuro de etidio (1μg/mL) en TBE
0,5X durante 15 min, se visualizó y fotografió en un analizador de imágenes UV Gel Doc 1000
con el Molecular Analysis Software versión 1.5 de Bio-Rad.
4.2.2.
Análisis de la expresión de la proteína E1.
Generamos dos proteínas recombinantes de la proteína E1 (1,092 aa) de G.intestinalis, una de
la región N-terminal (53-101 aa, rgNTE1) y otra de la región C-terminal (918-1018 aa, rgCTE1).
Se utilizó el sistema de expresión pThioHis (Invitrogen, Anexo 2) que genera proteínas de fusión
a un “tag” de tioredoxina modificada, esta tioredoxina contiene un “patch” de His que permite la
purificación por afinidad con resinas de Ni. Estas proteínas se utilizaron como antígenos para
producir los anticuerpos policlonales en ratón anti-gNTE1 y anti-gCTE1, estos anticuerpos se
emplearon en estudios de la proteína E1 por inmunoblot e inmunofluorescencia.
10
11
TM
TM
AccuPrime Pfx reaction mix 10X: proteínas termoestables AccuPrime , MgSO4 1mM y dNTPs 0,3 mM
Buffer TBE 10X (1L): 107,80 g de Tris, 55 g de ácido bórico y 7,44 g de EDTA. pH 8,3.
60
4.2.2.1.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes rgNTE1 y rgCTE1.
Previamente en nuestro laboratorio se habían construido los vectores pThioHis-NTE1 y
pThioHis-CTE1, estos contenían insertos de la región 3’ (158-303 pb) y 5’ (2744-3056 pb) del
gel e1 (3,279 pb) respectivamente, estos constructos se había transfectado en células de
Escherichia coli JM109 y se contaba con estos clones (JM109-pThioHis-NTE1 y JM109pThioHis-CTE1) como punto de partida. Inicialmente se comprobó la presencia de los insertos
por PCR. A partir de los clones se realizó un cultivo en 5mL de medio líquido LB suplementado
con ampicilina 100ug/mL (LB-Amp) durante 16h a 37°C. Se seleccionaron 4 colonias de cada
clon
y
se
rastrearon
por
PCR
GAATTCACCCTACGTCAACATCAT-3’
con
los
y
oligonucleótidos
sentido
antisentido
Gl-NTE1-F
Gl-NTE1-R
5’5’-
GTCGACATTGTCAACCACCTCAAC-3’ para el clon JM109-pThioHis-NTE1; y con los
oligonucleótidos sentido Gl-CTE1-F 5'-GAATTCATGACATCCCGACTATTG-3' y antisentido GlCTE1-R 5'-GTCGACCCTTGAACTGTTACGGTT-3' para el clon JM109-pThioHis-CTE1. Estos
oligonucleótidos fueron los empleados para generar los insertos clonados.
Una colonia positiva de cada clon se utilizó pata inducir y comprobar la generación de las
proteínas recombinantes (grNTE1 18kDa y grCTE1 35kDa). Se inoculó una colonia de cada
clon en 1mL de medio LB-Amp y se incubó toda la noche a 37°C con agitación constante. Al
siguiente día se realizó una dilución 1:100 del cultivo en 10mL de medio LB-Amp y se incubó a
37°C con agitación constante. Cuando el cultivo presentó un OD550 alrededor de 0,500 se
realizó la inducción agregando IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Sigma)
a una
concentración final de 1mM y se incubó durante 4h a 37°C con agitación constante. Durante la
inducción se tomaron alícuotas de 1ml del cultivo (0, 1, 2, 3 y 4h) y se analizaron por SDSPAGE e inmunoblot con anticuerpo anti-tioredoxina (1:5,000 Invitrogen). Las bacterias se
colectaron por centrifugación y el “pellet” se resuspendió con 50μl de buffer carga para
electroforesis SDS-PAGE12 y se incubaron durante 10min a 94°C. Los extractos se resolvieron
por electroforesis vertical en geles de poliacrilamida al 13%. La electroforesis se corrió en buffer
de electroforesis SDS-PAGE13 a voltaje constante (100 voltios). Las proteínas separadas por
SDS-PAGE se transfirieron a membranas de PVDF (polyvinylidene fluoride – Immobilon P,
Millipore), empleando buffer de transferencia14 y aplicando 20 voltios durante toda la noche o
100 voltios por una hora. Después de la transferencia la membrana se bloqueó con TBST-leche
12
Buffer carga para electroforesis SDS-PAGE: 50mM Tris-HCl pH 6,8, 5% 2-mercaptoetanol, 2% SDS, 0,1% azul de
bromofenol y 10% glicerol.
13
Buffer de electroforesis SDS-PAGE: Tris 25mM pH 8,3, Glicina 192mM y SDS 1%.
14
Buffer de transferencia: Tris 25mM pH 8,3, Glicina 192mM, y metanol 10% v/v.
61
5%15 durante 1h. En seguida la membrana se incubó durante 1h con el anti-tioredoxina
monoclonal (1:5000), después se lavaron tres veces con TBST16 (10min cada lavado) y las
membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado
(1:2000, Sigma) durante una hora. Las membranas se lavaron tres veces con TBST y luego se
incubaron con el conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina (1:3000 en TBST, Promega)
durante 30min. Se lavó de nuevo con TBST y se reveló con el sustrato cromogénico NBT/BCIP
(Nitro-blue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3'-Indolyphosphate p-toluidine salt, Promega)
en buffer de reacción17.
Para la producción a gran escala de las proteínas recombinantes se realizó la inducción en
cultivos de 500mL durante 4h. Las bacterias se colectaron por centrifugación 5,000 x g durante
10min a 4°C. El “pellet” de bacterias se pesó y se resuspendió en buffer de unión18 (10ml de
buffer/gramo de “pellet”) suplementado con coctel de inhibidores de proteasas 1:100 (P8340
Sigma) y PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo, concentración final 1mM). Las bacterias se
lisaron por sonicación durante 3 minutos con pulsos de 15 segundos en un equipo Heat
Systems-ultrasonic model W-225 (20% power; 50% duty time). En seguida se realizaron cuatro
ciclos de choque térmico, N2 líquido – 37°C. Se centrifugó a 8,000 x g durante 10min a 4°C y el
sobrenadante (extracto) se colectó y cuantificó por Bradford. Tanto el “pellet” como el extracto
se evaluaron por SDS-PAGE e immunoblot con anti-tioredoxina para comprobar la presencia de
las proteínas recombinantes grNTE1 y grCTE1.
La proteína grNTE1 se detectó en el extracto soluble mientras que la proteína grCTE1 se
detectó en el “pellet” como cuerpos de inclusión. En cuanto a grNTE1 esta se purificó por
cromatografía de afinidad utilizando la resina ProBond (Invitrogen). La resina se lavo con H2O
dd y se equilibró con el buffer de unión. La resina se mezcló con 30mL de extracto proteico del
clon JM109-pThioHis-NTE1, y se incubó durante 2h a 4°C con agitación constante, en seguida
se retiró el sobrenadante por decantación y la resina se lavó con 8mL de buffer de unión
incubando 10min a 4°C con agitación constante. El buffer se retiró cuidadosamente por
decantación y se realizó un segundo lavado con buffer de unión. De la misma forma se lavó dos
veces con 8mL de buffer de lavado19. La resina se empacó en una columna y se realizan
lavados con buffer de lavado hasta Abs280 cercanas a 0.000. Se realizó la elución con buffer de
15
TBST-leche 5%: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 1% v/v y leche descremada 5%.
TBST: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 1% v/v.
17
Buffer de reacción: Tris-HCl 100mM pH 9.0, NaCl 150mM, MgCl2 1mM.
18
Buffer de unión: NaCl 500mM en buffer fosfato 20mM pH 7,8.
19
Buffer de lavado: NaCl 500mM, Imidazol 10mM en buffer fosfato 20mM pH 6,0.
16
62
elución20 aplicando un gradiente de concentración de IPTG 50-500mM, se colectaron fracciones
de 1mL. Las fracciones se cuantificaron por el método de Bradford y se evaluaron por SDSPAGE e inmunoblot con anti-tioredoxina. La proteína grNTE1 eluida de la columna presentaba
algunas impurezas de proteínas bacterianas, para purificarla completamente empleamos una
técnica de extracción a partir de geles de poliacrilamida [172]. Los eluidos de la cromatografía
con mayor cantidad de proteína grNTE1 se corrieron en geles de poliacrilamida al 13%, se
tiñeron los extremos del gel para localizar la proteína y esta región se aíslo del gel y se trituro
pasándolo varias veces a través de una jeringa de 5mL (sin aguja). El gel triturado se
resuspendió en 5mL de H2O dd y se incubó durante 2h a 37°C con agitación constante, se
centrifugó a 8,000 x g durante 10min a 4°C y se colectó el sobrenadante. Se concentró la
proteína a 1mL utilizando los filtros Microcon 10kDa (Millipore), se evaluó la purificación de la
proteína grNTE1 por SDS-PAGE y se cuantificó por Bradford.
La proteína rgCTE1 se solubilizó y purificó parcialmente a partir de los cuerpos de inclusión
como se describe a continuación. El “pellet” se pesó y se resuspendió en buffer de lavado –
cuerpos de inclusión (CP)21 (4 a 6mL de buffer/gramo de “pellet”) utilizando un homogenizador
de vidrio. La suspensión se centrifugó a 20,000 x g durante 30min a 4°C, el sobrenadante se
retiró y el “pellet” se lavó tres veces más con buffer de lavado – CP. El “pellet” se resuspendió
en buffer de lavado – CP sin Tritón X-100 y sin Urea, y se centrifugó a 20,000 x g durante 30min
a 4°C. El “pellet” se resuspendió en buffer de extracción – CP22 (2 a 4mL buffer/gramo de
“pellet” inicial), y se centrifugó a 20,000 x g durante 30min a 4°C. El sobrenadante se conservó
ya que aquí se encontraba la proteína solubilizada. Las fracciones correspondientes a los
lavados y extracción se evaluaron por SDS-PAGE e inmunoblot con anti-tioredoxina para
comprobar la presencia de las proteína recombinante grCTE1. La proteína grCTE1 solubilizada
presentaba algunas impurezas de proteínas bacterianas así que ésta se purificó completamente
extrayéndola de geles de poliacrilamida del 13% (como se describió para grNTE1).
4.2.2.2.
Producción de los anticuerpos policlonales en ratón anti-gNTE1 y anti-gCTE1.
Las proteína recombinantes grNTE1 y grCTE1 purificadas se usaron como antígenos para la
producción de anticuerpos policlonales en ratones hembras BALB/c de seis semanas de edad.
Realizamos este procedimiento en el bioterio del laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular
20
Buffer de elución: NaCl 500mM, imidazol (50-500mM) en buffer fosfato 20mM pH 6,0.
Buffer de lavado cuerpos de inclusión: Tris-HCl 100mM pH 7,0, EDTA 5mM, urea 2M y tritón X-100 2% p/v.
22
Buffer de extracción cuerpos de inclusión: Tris-HCl 50mM pH 7,0, EDTA 5mM, guanidina-HCl 8M y DTT 5mM.
21
63
de la Facultad de Medicina – Universidad Católica de Córdoba, Córdoba – Argentina bajo la
supervisión del Dr. Hugo Luján. Se inocularon 30μg de antígeno en adyuvante completo de
Freund (relación 1:1 antígeno:adyuvante) en un volumen total de 150μL. Se realizaron cuatro
inoculaciones, una por semana. Al final del procedimiento los ratones se sacrificaron y se
colectó el total de sangre periférica. La sangre se incubó 30min a 37°C y se centrifugó a 8,000 x
g durante 30min a 4°C, se colecto el suero (anticuerpos) y se conservó a -20°C.
4.2.2.3.
Inmunodetección e inmunofluorescencia.
Extractos proteicos de trofozoítos, células enquistantes y quistes se resolvieron en
electroforesis SDS-PAGE (geles de gradiente 6-20% de poliacrilamida23), se transfirieron a
membranas de PVDF, se bloqueó con TBST-leche 5% durante 1h. En seguida las membranas
fueron incubadas durante una hora con el anticuerpo policlonal anti-gNTE1 (1:500) o antigCTE1 (1:500) diluidos en TBST. Las membranas se lavaron tres veces con TBST-leche 5%
(10min cada lavado) y luego incubadas con el anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado
(1:2,000, Sigma) y se reveló con el sistema estreptavidina-fosfatasa alcalina (1:3,000, Promega)
y el sustrato cromogénico NBT/BCIP.
Trofozoítos, células enquistantes y quistes se colectaron por centrifugación y se resuspendieron
en 1mL de medio de cultivo TYI-S-33. En seguida se aplicó la suspensión celular en láminas
para microscopia (30μl/pozo) y se incubó a 37°C durante 1h, así se permitió que los trofozoítos
se adhirieran y que las células enquistantes y quistes se depositaran en la lámina. Se retiró
cuidadosamente el medio de cultivo y se fijaron las células adicionando p-formaldehído al 4%24
e incubando durante 10min. Se lavó exhaustivamente con PBS y las células se permeabilizaron
durante 1h a 37°C con una solución de Tritón X-100 al 0,1% y suero de cabra al 10% en PBS.
Las láminas fueron incubadas durante 1h a 37°C con los anticuerpos primarios anti-gNTE1
(1:500) o anti-gCTE1 (1:500) en PBS. En seguida se lavaron las láminas exhaustivamente con
PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con FITC (1:1000
en PBS, Sigma). De nuevo se lavaron las láminas exhaustivamente con PBS. Para detectar la
proteína CWP1, empleado como marcador de ESVs y pared de quiste, se incubaron las láminas
23
Geles de gradiente 6-20% de poliacrilamida: Se preparan mezclas independientes para dos geles de
poliacrilamida, uno del 6% y otro del 20%. Para un volumen de gel total de 4 mL, utilizando una pipeta de vidrio de
5mL se toman 2mL de la mezcla del 4% y en seguida 2mL de la mezcla del 20%, y se mezcla pasando
cuidadosamente tres burbujas de aire. La mezcla completa se sirve inmediatamente.
24
p-formaldehído al 4%: 0,4g de p-formaldehído se resuspenden en 8mL de PBS y se calienta a 60°C hasta
disolución completa, se ajusta el pH a 7,2 y se completa a 10mL. Se fracciona en alícuotas y se conserva a -20°C.
64
durante 1h a 37°C con el anticuerpo anti-CWP1-TAMRA diluido 1:100 en PBS (Waterborne Inc).
Los núcleos se tiñeron con DAPI, incubando las láminas 10 min con DAPI (4',6-diamidino-2phenylindole) diluido 1:1000 en PBS, y se lavaron las láminas exhaustivamente con PBS. Las
láminas se analizaron con el
microscopio de fluorescencia Leica IRME, las imágenes
capturadas con la cámara Hamamatsu ORCA ER II y procesadas con el programa Leica
QFluoro (Leica Microsystems).
4.2.3. Sobre-expresión de la proteína E1.
Los vectores pTubHApacNT y pTubHApacCT son específicos para expresar proteínas en
Giardia, estos fueron desarrollados por el laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular del Dr.
Hugo Luján (Universidad Católica de Córdoba, Córdoba – Argentina) (Anexo 3) [173]. Los
insertos clonados se inducen bajo el control del promotor del gen de tubulina y contienen la
región flanqueante 5’ del gen de la gamma giardina de G.intestinalis. Estos vectores contienen
un casette PAC (“puromincyn resitance gene”) que confiere a las células transfectadas
resistencia al antibiótico puromicina. Además las proteínas son generadas con un “tag” de
hemaglutinina (HA) en el N-terminal (pTubHApacNT) o C-terminal (pTubHApacCT), el cual
permite realizar estudios de inmunoblot, inmunofluorescencia o inmunoprecipitación empleando
anticuerpos anti-HA. El Dr. Hugo Luján nos obsequió los vectores pTubHApacNT y
pTubHApacCT.
La
región
codificante
completa
del
gen
e1
(3,279
pb)
se
clonó
independientemente en los vectores pTubHApacNT y pTubHApacCT, de esta forma se
generaron vectores para sobre-expresar en G.intestinalis la proteína E1 completa con “tag” HA
en el N-terminal o en el C-terminal.
El marco abierto de lectura completo del gen e1 se amplificó por PCR utilizando los
oligonucleótidos:
-
Clonación
en
vector
pTubHApacNT:
oligonucleótido
sentido
NT-UbiE1-F
5’-
CGCGGATCCATGAATCGAGACTATTCTCGCAC-3’ y oligonucleótido antisentido NT5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTAATTTACTAGGCAAAGTTTGGG-3’,
UbiE1-R
conteniendo los sitios de restricción para las enzimas BamHI y NotI respectivamente
(subrayados).
-
Clonación
en
vector
pTubHApacCT:
oligonucleótido
sentido
CT-UbiE1-F
5’-
CATGCCATGGATGAATCGAGACTATTCTCGCAC-3’ y oligonucleótido antisentido CT-
65
UbiE1-R 5’-GCGCGATATCATTTACTAGGCAAAGTTTGGG-3’, conteniendo los sitios de
restricción para las enzimas NcoI y EcoRV respectivamente (subrayados).
Se utilizó la enzima de alta fidelidad y alta procesividad AccuPrimeTM Pfx DNA polimerasa
(Invitrogen), las condiciones para la amplificación fueron las descritas anteriormente para esta
enzima (sección 3.2.1). Se utilizó el mismo programa de ciclo térmico de la sección 3.2.1
cambiando el tiempo de extensión a 4min. Se utilizaron 100ng de DNA genómico de
G.intestinalis como plantilla. Los productos de PCR se separaron por electroforesis
horizontal en gel de agarosa al 1,5% en TBE 0,5X como se describió antes. El gel se tiñó
por suspensión en bromuro de etidio (1μg/mL) en TBE 0,5X durante 15 min, se visualizó y
fotografió. El producto de amplificación fue purificado utilizando el Kit Wizard PCR Preps DNA
Purification System (Promega). Se realizó doble digestión de los vectores pTubHApacNT y
pTubHApacCT
con
10U
de
las
enzimas
BamHI-NotI
y
NcoI-EcoRV
(Invitrogen)
respectivamente, durante 2h a 37°C en un volumen de reacción de 20μL. Los vectores
digeridos se separaron por electroforesis horizontal y se purificaron a partir del gel como antes.
Para el inserto e1 a clonar en pTubHApacNT se realizó digestión total con la enzima NotI (2h,
37°C) y digestión parcial con la enzima BamHI (5min, 37°C), la digestión parcial se realizó ya
que la enzima BamHI también cortaba al fragmento en la posición 1950. Para el inserto e1 a
clonar en pTubHApacCT se realizó digestión total con la enzima NcoI (2h, 37°C) y digestión
parcial con la enzima EcoRV (5min, 37°C), la digestión parcial se realizó ya que la enzima
EcoRV también cortaba al fragmento en las posiciones 522 y 2437. Los productos de la doble
digestión se separaron por electroforesis horizontal y los productos de 3,279 pb digeridos se
purificaron del gel como antes. Los insertos se ligaron en los vectores utilizando una proporción
inserto:vector 1:5, la siguiente fue la mezcla de reacción: 1μL de enzima T4 ligasa (Invitrogen),
2μL de buffer T4 ligasa 10X, 2μL de polietilenglicol 4000 (50% p/v), 1μL de NaCl 1M, 10μL de
inserto, 2μL de vector y 2μL de H2O DEPC para un volumen total de 20μL. La mezcla de
reacción se incubó a 14°C durante 16h. En seguida se transformaron bacterias competentes
DH5α por choque térmico. A 100μL de bacterias competentes se adicionaron 10μL de ligación y
se incubaron a 4°C durante 10min, se realizó el choque térmico incubando la mezcla a 42°C por
2min seguido de 10min a 4°C. Las bacterias se resuspendieron en 1mL de medio LB y se
permitió la recuperación a 37°C durante 1h con agitación constante. Las bacterias se colectaron
por centrifugación a 4,000 x g durante 10 min a 4°C y se resuspendieron en 100μL de medio
LB, se sembraron en cajas de LB-Agar suplementadas con ampicilina 100ug/mL y se incubaron
a 37°C durante 16h. Las colonias que crecieron se rastrearon por PCR. Los constructos
66
pTubHApacNT-E1 y pTubHApacCT-E1 se aislaron a partir de 10mL de un cultivo líquido LBAmp de una colonia positiva (para cada uno), se utilizó el Kit Wizard Plus Minipreps DNA
Purification System (Promega). Los plásmidos se cuantificaron por absorbancia a 260nm.
Trofozoítos de G.intestinalis WB/9B10 se transfectaron por electroporación con los plásmidos
pTubHApacNT-E1 y pTubHApacCT-E1 utilizando el método reportado por Yee y Nash [174] con
una modificación. En el método de Yee y Nash la electroporación se realiza en medio TYI-S-33
con suero y nosotros empleamos medio TYI-S-33 sin suero con mejores resultados. Se
colectaron trofozoítos a partir de un tubo de cultivo (7mL) confluente, se resuspendieron en
300μL de medio TYI-S-33 sin suero y se transfieren a una cubeta de electroporación de 4mL
(BioRad) previamente enfriada (4°C). Se adicionaron 5μg de plásmido (pTubHApacNT-E1 o
pTubHApacCT-E1), se incubó a 4°C durante 10min y se electroporó. Las condiciones del pulso
de la electroporación fueron: 350 voltios, 1000μF de capacitancia y 700Ω de resistencia.
Inmediatamente los trofozoítos se transfirieron a un tubo de cultivo 7mL con medio TYI-S-33
completo y se incubó a 37°C durante 24h. En seguida se adicionó puromicina a una
concentración final de 100μM para seleccionar las células transfectadas. Los trofozoítos fueron
evaluados por inmunoblot e inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos anti-gNTE1 (1:500),
antigCTE1 (1:500) y anti-HA monoclonal (1:1000, Sigma).
4.2.4. Inhibición de la expresión del gen e1 por silenciamiento antisentido.
La versatilidad de los vectores pTubHApacNT/CT permite generar RNA antisentidos específicos
al clonar de forma inversa un fragmento de DNA, y de esta forma realizar silenciamiento
genético por RNA antisentido de cualquier gen de interés en G.intestinalis. Un fragmento de
600pb de la región 3’ del gen e1 se clonó inversamente en el vector pTubHApacCT para
generar un vector antisentido. Se amplificó por PCR un fragmento de 600pb (1 – 600 pb) del
gen
e1
(3,279
pb)
utilizando
el
oligonucleótido
sentido
UbiE1AS-F
5’-
GCGGATATCATGAATCGAGACTATTCTCGCAC-3’ y el oligonucleótido antisentido UbiE1AS-R
5’-CATGCCATGGGAAAAAGCGCCAGTCACG-3’, conteniendo los sitios de restricción para las
enzimas EcoRV y NcoI respectivamente (subrayados). Se utilizó la enzima de alta fidelidad y
alta procesividad AccuPrimeTM Pfx DNA polimerasa (Invitrogen), las condiciones para la
amplificación fueron las descritas anteriormente para esta enzima (sección 3.3.2). Se utilizó el
mismo programa de ciclo térmico de la sección 3.3.2. Se utilizaron 100ng de DNA genómico de
G.intestinalis como plantilla. El producto de PCR se separó en electroforesis horizontal en gel
de agarosa al 1,5% en TBE 0,5X y se purificó del gel como se describió antes. Se realizó doble
67
digestión del vector pTubHApacCT con las enzimas EcoRV y NcoI (Invitrogen). Para el inserto
de 600pb purificado se realizó digestión total con la enzima NcoI (2h, 37°C) y digestión parcial
con la enzima EcoRV (5min, 37°C), la digestión parcial se realizó ya que la enzima EcoRV
también cortaba al fragmento en la posición 522. Los productos de la doble digestión se
separaron por electroforesis horizontal y el producto de 600pb digerido se purificó del gel como
antes. El inserto y el vector se ligaron y con esta ligación se transformaron bacterias
competentes DH5α por choque térmico, como antes. Las colonias se rastrearon por PCR, se
seleccionó una colonia positiva, y se purificó el constructor pTubHApacCT-E1AS a partir de un
cultivo líquido de 10mL LB-Amp. El plásmido se cuantificó por absorbancia a 260nm.
Trofozoítos de G.intestinalis WB/9B10 se transfectaron por electroporación con el plásmido
pTubHApacCT-E1AS y se seleccionaron con puromicina como antes.
4.3.
Análisis de la expresión y localización de la Ub y diferentes especies de Ub en
trofozoítos y durante la enquistación de G.intestinalis.
4.3.1. Inmunoblot para detectar la Ub (Ub-inmunoblot).
La Ub libre puede ser detectada por inmunblot empelando los métodos convencionales, sin
embargo para detectar las cadenas de poliUb conjugadas a las proteínas sustratos es necesario
asegurar la desnaturalización completa. Para tal fin las membranas de PVDF se tratan con una
solución que contiene los agentes desnaturalizantes guanidina y 2-mercaptoetanol, antes de
iniciar el inmunoblot [175]. Los extractos proteicos se mezclaron con buffer carga para
electroforesis SDS-PAGE y se incubaron durante 10 min a 94°C. Los extractos se resolvieron
por electroforesis SDS-PAGE (geles de gradiente 6-20%)y se transfirieron a membranas de
PVDF. La membrana se sometió a tratamiento con la solución desnaturalizante25 durante
30min. Después se lavó exhaustivamente con TBST para eliminar por completo la solución
desnaturalizante remanente, y la membrana se bloqueó con TBST-BSA 5%26 toda la noche a
4°C. Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo monoclonal anti-Ub ZTA10 en TBSTBSA 2% (1:3) durante 1h. Las membranas se lavaron tres veces con TBST y luego se incubó
con el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a peroxidasa (Cogentech-IFOM) en TBSTBSA 2% (1:10,000) durante 30min. Las membranas se lavaron tres veces con TBST y se reveló
25
26
Solución desnaturalizante: Cloruro de guanidina 6M, Tris 20mM pH 7,5, PMSF 1mM y 2-mercaptoetanol 5mM.
Solución de bloqueo (TBST-BSA 5%): Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 1% v/v y BSA 5%.
68
empleando un sistema quimioluminiscente (ECL – Enhanced chemiluminescence de
Amersham).
4.3.2. Inmunoprecipitación de especies de Ub.
Se realizaron inmunoprecipitaciones del conjunto completo de especies de Ub (con anticuerpo
FK2) o proteínas conjugadas con cadenas de Lys48-poliUb (con anticuerpo mAb-k48)
empleando extractos de trofozoítos, células enquistantes y quistes. 500μg de extracto proteico
suplementado con N-etilmaleimida 10mM (inhibidor de cisteína proteasas) y MG132 20μM
(inhibidor del proteosoma) se incubó con 3μl de anticuerpo FK2 o mAb-K48 durante 1h a 4°C
con agitación constante, el volumen final fue de 100μl. Para retirar los conjugados proteínaanticuerpo se adicionaron 30μL de perlas de sefarosa-A CL4B (GE Healthcare life sciences) y
se incubó durante 1h a 4°C con agitación constante. Las perlas se colectaron por centrifugación
a 500 x g por 5min y se lavaron cinco veces con 500μl de PBS. Las perlas se resuspendieron
en 20μL de buffer de carga para electroforesis SDS-PAGE y se incubaron durante 10min a
94°C. Los inmunoprecipitados se analizaron por SDS-PAGE (geles de gradiente 6-20%) y se
transfirieron a membranas de PVDF, se realizó inmunoblot con anticuerpo anti-Ub ZTA10 como
se describió antes.
4.3.3. Inmunolocalización de especies de Ub.
Trofozoítos, células enquistantes y quistes se fijaron con p-formaldehído al 4% en láminas para
microscopia. Las células se permeabilizaron durante 1h a 37°C con una solución de Tritón X100 al 0,1% y suero de burro al 10% en PBS. Las láminas fueron incubadas durante 1h a 37°C
con los anticuerpos primarios (pAb-gUb 1:500, FK1 1:200, FK2 1:200, mAb-K48 1:250 y mAbK63 1:100) diluidos en PBS. En seguida se lavaron las láminas exhaustivamente con PBS y se
incubaron con los anticuerpos secundarios (anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo desarrollados
en burro) marcados con AlexaFluor 488 (1:100 en PBS) (IFOM-Congentech). De nuevo se
lavaron las láminas exhaustivamente con PBS. La detección de CWP1 (ESVs y pared del
quiste) y la tinción de núcleos con DAPI se realizaron como en 3.2.2.3. Se incluyeron controles
en los cuales se omitían los anticuerpos primarios. Las láminas se analizaron con el
microscopio de fluorescencia Olympus Upright BX51.
69
4.4.
Identificación de proteínas de unión a ubiquitina en Giardia intestinalis.
4.4.1. Producción y purificación de proteínas recombinantes GST, GST-Ub y GST-Ub3.
Las proteínas GST, GST-Ub y GST-Ub3 se expresaron y purificaron a partir de clones de
bacterias DH5α que contenían los constructos pGEX-6P2, pGEX-4T3-Ub y pGEX-6P2-Ub3
respectivamente. Una colonia de cada clon se inoculó en 50mL de medio LB-Amp y se incubó
16h a 37°C con agitación constante. Se realizó una dilución 1:20 en 1L de medio LB-Amp y se
incubó a 37°C con agitación constante, cuando se alcanzó un OD550 de 0,600 se realizó la
inducción con IPTG a concentración final 500μM durante 3h a 37°C y agitación constante. Se
colectaron las bacterias por centrifugación (5,000 x g durante 10 min a 4°C), el “pellet” se
resuspendió en buffer de lisis27 (20ml de buffer/1L de cultivo) suplementado con coctel de
inhibidores de proteasas 1:100 (P8340 Sigma), y las bacterias se lisaron por sonicación. Se
centrifugó a 8,000 x g durante 10 min a 4°C y el sobrenadante (extracto) se colectó. Se
adicionaron 800μl de suspensión de perlas glutatión-sefarosa (Amersham, 50% equilibradas en
buffer de lisis) y se incubó durante 2h a 4°C con agitación constante. Se colectaron las perlas
por centrifugación a 1000 x g durante 2min a 4°C y se lavaron dos veces con 1mL de PBSTriton X-100 0,1%, en seguida 1mL de PBS y finalmente 1mL de buffer de lavado GST28. Las
perlas se resuspendieron en buffer de lavado GST en proporción 1:1, se analizaron y
cuantificaron por electroforesis SDS-PAGE comparando con un patrón de albúmina.
4.4.2. “Pull down” y SDS-PAGE
A 1000μg de extracto NP40 de trofozoítos se adicionaron perlas acopladas a GST, GST-Ub o
GST-Ub3 a concentración final 20μM previamente equilibradas en buffer YY29, cóctel de
inhibidores de proteasas 1:10, N-etilmaleimida 10mM en un volumen de reacción de 100μl. Se
incubó la mezcla durante 2h a 4°C y agitación constante. Las perlas se colectaron por
centrifugación a 1000 x g durante 2 min a 4°C y se lavaron 5 veces con 500μl con buffer YY.
Las perlas se resuspendieron en 30μl de buffer carga para electroforesis – masas30, incubadas
a 94°C durante 10 min y las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en geles de
poliacrilamida de gradiente 4-12% Nu-PAGE Novex Bis-tris de 1mm de espesor. El gel fue
teñido con coomassie coloidal (Colloidal blue staining kit Novex de Invitrogen).
27
Buffer de lisis: Hepes 50mM pH 7,5, NaCl 150mM, EDTA 1mM, Glicerol 5% y NP40 0,1%.
Buffer de lavado GST: Tris 50mM pH 7,4, EDTA 1mM, NaCl 100mM, DTT 1mM, Glicerol 10% y cóctel de
inhibidores de proteasas (1:100).
29
Buffer YY: Hepes 50mM pH 7,5, Nacl 150mM, Glicerol 10%, Triton X-100 1%, EDTA 1mM y EGTA 1mM.
30
Buffer carga para electroforesis – masas: 50mM Tris-HCl pH 6,8, DTT 200mM, 2% SDS, 0,1% azul de bromofenol
y 10% glicerol.
28
70
4.4.3. Identificación de proteínas por LC-MS/MS
Estos experimentos los realizamos en el FIRC Institute of Molecular Oncology Foundation
(IFOM) (Milán-Italia) bajo la supervisión de la Dra. Simona Polo. Una vez se realizó la tinción
con coomassie coloidal se cortaron las piezas de gel donde se encontraban las proteínas de
interés. Las piezas de gel fueron desteñidas incubándolas en solución de distinción31 durante
2h, y posteriormente deshidratadas tratándolas con acetonitrilo al 100% durante 5min. Se
realizó tratamiento con DTT 10mM en NH4HCO3 100mM durante 1h a 56°C min para reducir las
proteínas. Se dejó enfriar a temperatura ambiente y se retiró el DTT, se incubó con
iodoacetamida 100mM en NH4HCO3 100mM durante 45min en oscuridad, y se lavó con 100μl
de NH4HCO3 100mM durante 10 min. Se realizaron dos ciclos de deshidratación-hidratación con
NH4HCO3 100mM, y se removió el líquido y las piezas de gel se secaron por centrifugación
(Speed Vac). Para la tripsinización las piezas de gel se re-hidrataron en buffer de digestión32,
se adicionó tripsina (Promega) a 12ng/μL, y se incubó a 4°C durante 45 min. Se removió el
sobrenadante y se reemplazó con 5-10μl de buffer de digestión sin tripsina, las piezas se
dejaron en digestión enzimática incubando a 37°C toda la noche. Las muestras se filtraron a
través de puntas Zip Tip C18 (Millipore), después de la filtración la muestra se combino con 5μl
de acetonitrilo que permitió la elusión del material enlazado a la punta. Las muestras se secaron
por centrifugación (Speed Vac) y se resuspendieron en 7μl de ácido trifluoroacético (TFA) al
1%. 5µL de cada muestra se analizó por LC-ESI-MS/MS en un espectrómetro de masas FTLTQ Ultra (Thermo Electron). El modo de adquisición de datos consistió en un primer barrido de
MS seguido por cinco barridos MS/MS de los cinco iones más intensos en cada barrido MS. Los
espectros MS/MS fueron limitados a un barrido por ión precursor seguido de 1min de exclusión.
La búsqueda en las bases de datos fue realizada usando Mascot Daemon utilizando los
siguientes parámetros: Base de datos: NCBInr, taxonomia: todas las entradas, enzima: tripsina,
tolerancia MS/MS: 0,5 Da, instrumento: ESI-TRAP.
31
32
Solución de destinción: acetonitrilo 50%, bicarbonato de amonio 50mM.
Buffer de digestión: NH4HCO3 50mM y CaCl2 5mM.
71
4.5.
Identificación de proteínas ubiquitinadas.
4.5.1. Desarrollo del sistema de ubiquitinación in vitro
Desarrollamos un sistema de ubiquitinación in vitro derivado de G.intestinalis con la finalidad de
analizar, purificar e identificar proteínas ubiquitinadas en trofozoítos y durante el proceso de
enquistación. El ensayo se fundamenta en que las enzimas del sistema de ubiquitinación (E1,
E2s, E3s-ligasas) así como las proteínas sustrato son aportadas por el extracto proteico.
Incorporamos Ub exógena para la conjugación, con el fin de marcar las proteínas conjugadas
(productos) empleamos una Ub que en sí estuviera marcada, una His6Ubiquitina recombinante
humana (Sigma). El “tag” de His6 nos permitía reconocer las proteínas ubiquitinadas generadas
en el ensayo utilizando un anticuerpo anti-His, además la posibilidad de purificar los conjugados
con resinas de níquel. Como la ubiquitinación es un proceso dependiente de ATP debíamos
suministrar y regenerar esta molécula, por lo tanto adicionamos ATP y un sistema regenerador
de este basado en la reacción catalizada por la enzima creatina kinasa sobre el sustrato
fosfocreatina. También debíamos garantizar que los sustratos ubiquitinados no fueran
degradados por el proteosoma o que la o las moléculas de Ub conjugadas fueran hidrolizadas
por las enzimas DUBs, así que suplementamos la reacción con MG132 (inhibidor del
proteosoma) y Ub-aldehído (inhibidor de DUBs). Por referencias bibliográficas y datos propios
conocíamos las concentraciones a las cuales podíamos trabajar los inhibidores [162,167]. Por
otra parte desconocíamos las concentraciones apropiadas para His6Ubiquitina y ATP; además
de las condiciones adecuadas de tiempo y temperatura. Por lo tanto tuvimos que evaluar el
efecto de la [His6Ubiquitina] (10-1000ng), [ATP] (0,0-2,5mM), tiempo de reacción (0, 30, 60 y
120min) y temperatura de reacción (20, 25, 30 y 37°C) sobre la formación de los conjugados
Ub-proteína. También debimos establecer el tipo de extracto (sonicado o NP40) y la cantidad
adecuada de este. De esta forma establecimos las siguientes condiciones de reacción: 250ng
de His6-Ubiquitin (Sigma), 1,0mM de ATP (Sigma), sistema regenerador de ATP – 0,5U creatina
kinase CK (Sigma), 10mM creatine phosphate CP (Sigma), y 2,5mM MgCl2 (Sigma) –, 2µM Ubaldehído (Boston Biochem), 20µM MG132 (Boston Biochem), 50µg de extracto NP40, en buffer
Tris-HCl 10mM pH 7,5, temperatura de 25°C, tiempo de reacción de 30min, para un volumen de
reacción de 15μl. Al finalizar la reacción se adicionaron 5μl de buffer carga de electroforesis y
se incubó la mezcla a 94°C durante 10min. Se separaron las proteínas por SDS-PAGE y se
transfirieron a membranas de PVDF, los conjugados (proteínas His6Ub-ubiquitinadas) se
analizaron por inmunoblot con anti-His 1:5000 (Amersham) y anti-Ub ZTA10 1:3 utilizando
detección
cromogénica
(sistema
estreptavidina
fosfatasa
alcalina
–
NBT/BCIP)
o
72
quimioluminiscente. La reacción se realizó con extractos de trofozoítos y de diferentes etapas
del proceso de enquistación (0, 6, 12, 24 y 48h).
4.5.2. Purificación e identificación de proteínas His6Ub-ubiquitinadas.
Las proteínas His6Ub-ubiquitinadas fueron purificadas por cromatografía de afinidad empleando
una resina de níquel-nitriloacetato – agarosa (Ni-NTA Quiagen), e identificadas por
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Con el fin
de identificar proteínas realizamos la reacción de ubiquitinación in vitro a gran escala, se usaron
1000μg de extracto NP40, 5μg His6-Ubiquitina, incubación a 25°C durante 2h en un volumen de
reacción de 300μl. Se utilizaron extractos de trofozoítos y de diferentes etapas del proceso de
enquistación (0, 6, 12, 24 y 48h). Una vez se completó el tiempo de reacción se adicionó urea
(conc. final 8M), y 100ul de resina Ni-NTA (previamente equilibrada en buffer Tris-HCl 10mM pH
7,5), y se incubó a 4°C durante 1h con agitación constante. Con el fin de evaluar y descartar las
uniones inespecíficas se realizaron simultáneamente cromatografías control, utilizando la misma
cantidad de extracto sin los componentes de la reacción. La resina se colectó por centrifugación
(3000 x g a 4°C durante 5 min) y se lavó 10 veces con 500μl de buffer de lavado33. Después se
adicionaron 200μl de buffer de elusión34 y se incubó a 4°C durante 15min con agitación
constante. La resina se colectó por centrifugación (3000 x g a 4°C durante 5min) y el
sobrenadante (proteínas His6Ub-ubiquitinadas) se colectó cuidadosamente, la elusión se repitió
dos veces más. Para eliminar la urea y el imidazol las proteínas fueron precipitadas con etanol
(conc. final 90%). Se adicionó etanol en relación 9:1 etanol:eluido y se incubó a -80°C durante
15min, en seguida se centrifugó a 10,000 x g a 4°C durante 30min, el sobrenadante se retiró y
el “pellet” de proteínas se lavó con etanol al 90%. De nuevo se centrifugó, el “pellet” de
proteínas se resuspendió en 30μl de de buffer carga para electroforesis – masas, se incubó a
94°C durante 10min y se separaron por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida de gradiente 412% Nu-PAGE Novex Bis-tris de 1mm de espesor. El gel fue teñido con coomassie coloidal
(Colloidal blue staining kit Novex de Invitrogen) y cada carril fue cortado en varios segmentos.
Las piezas de gel fueron trpisinizadas y analizadas por cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (sección 3.4.3). Se analizaron los datos y se
compararon reacciones contra controles para cada punto (trofozoítos, 6, 12, 24 y 48h), de este
forma se eliminaron las proteínas inespecíficas y se obtuvo el consolidado de proteínas His6Ububiquitinadas.
33
34
Buffer de lavado: Tris 10mM pH 7,5, urea 8M e Imidazol 5mM.
Buffer de elusión: Tris 10mM pH 7,5, urea 8M e imidazol 500mM.
73
Capítulo 5
Resultados y Discusión
___________________________________________________
5.1.
Una E1 con modificaciones inusuales – el análisis de la enzima activadora de Ub
(E1) de G.intestinalis muestra a la ubiquitinación como un proceso fundamental
para su supervivencia y diferenciación.
Para que una proteína sustrato sea ubiquitinada es necesaria la acción secuencial de tres
enzimas (E1, E2 y E3-ligasas) (Figura 2) [6,17]. La ubiquitinación se inicia con la activación, de
la Ub por parte de la enzima conjugadora de Ub (E1), y por esto esta enzima es considerada
como el ápice (“apex”) de los procesos de señalización mediados por Ub. La caracterización de
esta enzima y su manipulación es de gran utilidad para hacer inferencias sobre el papel de la
ubiquitinación y su relevancia en el desarrollo celular. Con base en esta premisa realizamos la
caracterización de la E1 de G.intestinalis para determinar el papel de la ubiquitinación y su
relevancia en la biología de este eucariota tempranamente divergente.
5.1.1
La secuencia de la proteína E1 de G.intestinalis presenta todos los dominios
característicos de esta familia de proteínas.
La secuencia del gen e1 de G.intestinalis fue identificada previamente por nosotros empleando
herramientas de bioinformática [162], posteriormente en el proyecto de secuenciación del
genoma de G.intestinalis también fue identificado [13], y se encuentra en las base de datos del
NCBI como XM_001707978.1 (gen e1) y UniProt como A8BBP6 (proteína E1). La región
codificante del gen e1 de G.intestinalis es de 3,279pb y codifica una proteína de 1,092 aa
(121kDa). Realizamos el análisis de la secuencia de la proteína E1 de G.intestinalis utilizando
los programas Pfam (http://pfam.janelia.org/) y SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) con el
fin de determinar los dominios presentes en esta secuencia (Figura 14). Con el fin de comparar
con otras enzimas de la familia E1 se realizó el mismo análisis para las secuencias de la enzima
E1 para Ub (UBA1), y las enzimas heterodiméricas E1 para SUMO (SAE1/UBA2) y NEDD8
(NAE1/UBA3) de homo sapiens (Figura 14). Nuestro análisis identificó los tres dominios
característicos de la familia de proteínas E1s en la secuencia de la E1 de G.intestinalis, dos
74
motivos MoeB o ThiF en su región N-terminal, el dominio catalítico, y el dominio UFD de unión a
la enzima E2 en su región C-terminal. Además estos dominios están localizados de forma
similar a la presentada en la enzima activadora de Ub UBA1 humana. La E1 de G.intestinalis
contiene dos importantes motivos con secuencias consenso conservados en todas las enzimas
E1, el motivo altamente conservado del dominio de unión a ATP GXGXXGCE (GAGALGCE,
aminoácidos 503-510) y el motivo consenso putativo PXCTXXXXP (PACTIHNFP, aminoácidos
658-666) para el sitio activo con la Cys660 que forma el enlace covalente tioester con la Ub.
Figura 14. Estructura de dominios presentes en la enzima E1 de G.intestinalis. Se utilizaron los
programas Pfam (http://pfam.janelia.org/) y SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) para identificar
dominios presentes en la secuencia de la proteína E1 de G.intestinalis (A8BBP6). Esta se comparó con
las secuencias de homo sapiens para la enzima activadora de Ub UBA1 (P22314), el heterodímero de la
enzima activadora de SUMO SAE1/UBA2 (Q9UBE0 y Q9UBT2 respectivamente) y el heterodímero de la
enzima activadora de NEDD8 NAE1/UBA3 (Q13564 y Q8TBC4 respectivamente). Los números indican las
posiciones de los aminoácidos. El dominio MoeB o ThiF esta representado por cajas azules, el dominio
catalítico por cajas naranjas y el “ubiquitin-folding domain” (UFD) por cajas verdes. Se indica la posición de
la Cisteína (Cys) involucrada en la unión covalente con la molécula de Ub. Las secuencias y posiciones de
los motivos conservados para el dominio de unión a ATP (GXGXXGCE) y del sitio activo (PXCTXXXXP) se
muestran en la secuencia la proteína E1 de G.intestinalis.
75
5.1.2. Desarrollo de anticuerpos policlonales anti-gE1.
Para analizar la expresión y localización de la enzima E1 durante la diferenciación de
G.intestinalis se produjeron dos anticuerpos policlonales anti-gE1 (anti-gNTE1 y anti-gCTE1).
Como antígenos se utilizaron dos proteínas recombinantes, una del extremo N-terminal
(grNTE1) y otra del extremo C-terminal (grCTE1) de la proteína E1. Para producir las proteínas
recombinantes se partió de los clones JM109-pThioHis-NTE1 y JM109-pThioHis-CTE1
(generados previamente en nuestro laboratorio), estos contienen los constructos pThioHisNTE1 y pThioHis-CTE1 respectivamente y contienen insertos de la región 3’ (158-303 pb) y 5’
(2744-3056 pb) del gel e1 (3,279 pb) respectivamente.
Figura15. Inducción de proteínas recombinantes grNTE1 y grCTE1. (A) Presencia de los insertos NTE1 y
CTE1 en los clones JM109-pThioHis-NTE1 (panel superior) y JM109-pThioHis-CTE1 (panel inferior). Se
realizaron cultivos en medio líquido LB-Amp de cada clon y se estriaron sobre cajas LB-Agar, se seleccionaron
4 colonias y se realizó PCR de colonia. Se indican los productos de amplificación de los tamaños predichos,
145pb para el inserto NTE1, y 312pb para el inserto CTE1. (+) PCR control positivo sobre 100ng de DNA
genómico de G.intestinalis. (M). Marcador de peso molecular 1Kb. (B) Inducción de la proteína recombinante
grNTE1. (C) Inducción de la proteína recombinante grCTE1. Se indujeron cultivos con IPTG 1mM y durante 4h
se tomaron alícuotas de 1mL cada hora. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE en geles del 13%. Se
corrieron dos geles, uno se tiñó con azul de coomassie y el otro se transfirió a PVDF y se realizó inmunoblot
con anticuerpo anti-tioredoxina, anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado, sistema de revelado
estreptavidina fosfatasa alcalina (1:3000) y NBT/BCIP. Las proteínas recombinantes inducidas se indican con
sus respectivos tamaños, 18kDa para grNTE1 y 24kDa para grCTE1.
76
Antes de iniciar los experimentos de inducción de las proteínas comprobamos la presencia de
los dos insertos, se rastrearon cuatro colonias de cada clon por PCR y se amplificaron
productos con los tamaños predichos para cada inserto (NTE1-145pb y CTE1-312pb) (Figura
15A). Se seleccionó una colonia positiva de cada clon, se crecieron en medio líquido LB-Amp y
se realizó la inducción de las proteínas recombinantes con IPTG (Figura 15B). Las regiones
clonadas del gen e1 generaban proteínas de 5,7kDa (NTE1) y 11,4kDa (CTE1), y como el
sistema de expressión pThioHis genera proteínas de fusión a un tag de tioredoxina de 12,5kDa
se esperaba obtener proteínas recombinantes de 18kDa (grNTE1) y 24kDa (grCTE1).
Efectivamente la inducción con IPTG generó las proteínas recombinantes grNTE1-18kDa y
grCTE1-24kDa, y su expresión aumento con el tiempo de inducción (Figura 15B y 15C).
Para purificar las proteínas recombinantes se realizó cultivo a gran escala (500mL) y se
generaron extractos por sonicación seguida de choque térmico, tanto el extracto como el “pellet”
se analizaron por SDS-PAGE e inmunblot. Como se observa en la figura 16A la proteína
grNTE1 se encontró soluble en el extracto mientras que la proteína grCTE1 se encontró en el
“pellet” insoluble como cuerpos de inclusión. Por lo tanto se abordaron estrategias de
purificación diferentes para cada proteína. En el caso de grNTE1 se realizó cromatografía de
afinidad empleando la resina ProBond y se logró purificar parcialmente la proteína recombinante
(Figura 16B). Los eluidos de la columna estaban enriquecidos en la proteína recombinante pero
presentaban otras proteínas bacterianas contaminantes que al parecer también interactúan con
la columna. La proteína grNT-E1 se purificó completamente a partir de los eluidos de la
cromatografía extrayéndola directamente de geles de poliacrilamida. Se concentró la proteína a
1mL utilizando filtros Microcon 10kDa (Millipore) y se cuantificó por el método de Bradford, se
obtuvieron 800μg de proteína grNTE1 purificada (Figura 16D). La proteína grCT-E1 se solubilizó
del “pellet” por tratamientos con urea y extracción con guanidina. A pesar que parte de ella se
solubilizó en pasos intermedios del proceso gran parte se encontraba en la fracción final del
proceso y era visible fácilmente en el gel teñido con coomassie (Figura 16C), la proteína se
purificó completamente extrayéndola de geles de poliacrilamida a partir de esta fracción, se
concentró y se cuantificó por Bradford, se obtuvieron 750μg de proteína grCTE1 purificada
(Figura 16D). Dos ratones hembras BALB/c de seis semanas de edad se inocularon
independientemente con las proteínas recombinantes purificadas grNTE1 y grCTE1 (sección
3.2.2.2). Al cabo de un mes se obtuvo los sueros policlonales anti-gNTE1 y anti-gCTE1, estos
se evaluaron contra las proteínas recombinantes obteniéndose una excelente respuesta (Figura
16E), y se utilizaron en los experimentos de inmunblot e inmunofluorescencia posteriores.
77
Figura16. Purificación de las proteínas recombinantes grNTE1 y grCTE1 y evaluación de los
anticuerpos anti-gE1 producidos. (A) Se generaron extractos proteicos a partir de 500mL de cultivo líquido
LB-Amp para cada clon (JM109-pThioHis-NTE1 y JM109-pThioHis-CTE1). Los extractos y “pellets” se
analizaron por SDS-PAGE, tinción del gel con azul de Coomassie e inmunblot con anti-tioredoxina. (Ext)
extracto soluble, (P) “pellet” insoluble. Las flechas indican a las proteínas recombinantes grNTE1 (18kDa) y
grCTE1 (24kDa). (B) Purificación parcial de la proteína grNTE1 por cromatografía de afinidad sobre resina
ProBond (Invitrogen). (NE) fracción no enlazada. Se indican las fracciones de los lavados, (1) lavado con
buffer de unión, (4) lavado con buffer de lavado y (20) último lavado. La elusión se realizó con gradiente de
imidazol de 50 a 500mM. El panel superior es el gel teñido con azul de coomassie, y el panel inferior el
inmunoblot con anti-tioredoxina. Las flechas indican a la proteína recombinante grNTE1 (18kDa). (C)
Solubilización de los cuerpos de inclusión para grCTE1. Se realizaron tres lavados del “pellet” con Urea 2M y
Tritón X-100 2% p/v (L1-L3), un cuarto lavado solo con Urea 2M (L4), y finalmente extracción y solubilización
con Guanidina 8M (S). Las flechas indican a la proteína recombinante grCTE1 (24kDa). (D) Proteínas grNTE1
(18kDa) y grCTE1 (24kDa) purificadas. (E) Immunoblot con los anticuerpos producidos anti-gNTE1 y antigCTE1. SDS-PAGE y transferencia de 20ng de proteínas recombinantes grNTE1 y grCTE1, inmunoblot con
anticuerpos en dilución 1:2000, anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado, sistema de revelado
estreptavidina fosfatasa alcalina (1:3000) y NBT/BCIP.
78
5.1.3. La proteína E1 de G.intestinalis sufre un procesamiento proteolítico posttraduccional.
La region codificante completa del gen e1 (3,279 pb) de G.intestinalis fue clonada en los
vectores de expresión pTubHApacNT y pTubHApacCT (Anexos 3 y 4), generando así los
constructos pTubHApacNT-E1 y pTubHApacCT-E1 para sobre-expresar la proteína E1 marcada
con un “tag” de hemaglutinina (HA) en el N-terminal o en el C-terminal respectivamente. Se
realizó la clonación y transfección con los dos plásmidos ya que no sabíamos si la posición del
“tag” podía alterar o no la localización de la proteína. Se transfectaron, de forma independiente,
trofozoítos WB/9B10 con los constructos pTubHApacNT-E1 y pTubHApacCT-E1, las células se
seleccionaron
con
puromicina
y se
analizaron
por
inmunblot
y microscopia
de
inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA y anticuerpos anti-gE1 (anti-gNTE1 y anti-gCTE1)
generados previamente (4.1.2).
En las figuras 17A y 17B se muestra la inmunolocalización de E1 en trofozoítos silvestres (“wildtype”) y transfectados usando los anticuerpos anti-gNTE1 y anti-gCTE1. Tanto en trofozoítos
silvestres como transfectados la proteína E1 se localiza en el citoplasma de los trofozoítos en
varios y pequeños puntos. Como los trofozoítos transfectados con pTubHApacNT-E1 y
pTubHApacCT-E1 presentan el mismo patrón de localización podemos asegurar que la
localización del “tag” de HA no afecta la localización de la proteína. El patrón de localización
puntual y no difusa sugiere que la proteína E1 se encuentra mayoritariamente asociada a algún
complejo de membranas o complejos proteícos más que de forma completamente libre en el
citoplasma. En los trofozoítos transfectados se observa una localización definida en cercanías a
la membrana plasmática, sugiriendo que E1 podría participar en mecanismos de señalización a
través de la membrana o proteínas de membrana. Esta señal no se observa en los trofozoítos
silvestres, esto puede deberse a una baja concentración de la proteína endógena o a un rápido
recambio de ésta en las cercanías de la membrana, y que sólo puede observarse cuando la
concentración de la proteína se aumenta drásticamente (sobre-expresión). No se detectó
ninguna señal en las inmunofluorescencias con el anticuerpo anti-HA, esto sugiere que el “tag”
HA fue eliminado probablemente a través de un procesamiento de los extremos N-terminal y Cterminal de la proteína E1 sobre-expresada. Esta es la primera evidencia de un procesamiento
proteolítico de la proteína E1 de G.intestinalis. Vale la pena mencionar que el anti-HA se evaluó
con trofozoítos transfectados con otras proteínas y se comprobó que funcionaba perfectamente
y la ausencia de señal en nuestros transfectantes no se debía a que el anti-HA no funcionaba.
79
Figura 17. Análisis de trofozoítos que sobre-expresan la proteína E1. La región codificante completa del gen
e1 fue clonada en los vectores pTubHApacNT y pTubHApacCT, y se transfectaron trofozoítos WB/9B10 con los
constructos generados pTubHApacNT-E1 y pTubHApacCT-E1. (A) y (B) Inmunolocalización de proteína E1 en
trofozoítos silvestres y transfectados (sobre-expresión). Trofozoítos silvestres y transfectados se colectaron, se
fijaron en láminas con p-formaldehído al 4%, y se analizaron por inmunofluorescencia con los anticuerpos antiHA y anti-gE1. (A) Inmunofluorescencia con anti-gNTE1 (1:500) y anti-HA (1:1000). (B) Inmunofluorescencia con
anti-gCTE1 (1:500) y anti-HA (1:1000). (DIC) Microscopía de luz. Los núcleos se tiñeron con DAPI. La barra
corresponde a 10μM. (C) Detección por inmunoblot de la proteína E1 en trofozoítos silvestres y transfectados
(pTubHApacNT-E1 and pTubHApacCT-E1). 30μg de extracto de proteínas fue separado por SDS-PAGE (geles
4-20%), transferidos a membranas de PVDF y analizados por inmunoblot con anti-gNTE1 (1:500) y anti-gCTE1
(1:500). Anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado, sistema de revelado estreptavidina fosfatasa
alcalina (1:3000) y NBT/BCIP. (D) Reacción de ubiquitinación in vitro. 50μg de extracto de proteínas de
trofozoítos silvestres o transfectados se usaron en la reacción de ubiquitinación in vitro. Los productos de la
reacción (proteínas ubiquitinadas con His6-ubiquitina) se detectaron por immunoblot con anti-His (1-5000),
anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado, sistema de revelado estreptavidina fosfatasa alcalina
(1:3000) y NBT/BCIP. (-) reacción de ubiquitinación con extracto de proteínas de trofozoítos silvestres sin
incubación, es decir tiempo de 0min. (WT) reacción de ubiquitinación con extracto de proteínas de trofozoítos
silvestres, tiempo de reacción 30min. Las reacciones con los extractos de proteínas de parásitos transfectados
se indican como pTubHApacNT-E1 and pTubHApacCT-E1. Calmodulina (CaM) se uso como control de carga y
se detectó con anti-gCaM (1:1000). El asterisco indica el área que corresponde a los productos His6-Ub80
ubiquitinados.
El gen e1 de G.intestinalis codifica para una proteína de 121 kDa, sin embargo el análisis por
inmunoblot reveló un comportamiento inusual para esta proteína (Figura 17C). Los inmunoblot
se realizaron sobre 30μg de extracto, con el anti-gNTE1 (contra la región N-terminal de E1) se
detectó una proteína de 68kDa (E1-68), mientras que con el anti-gCTE1 (contra la región Cterminal de E1) se detectó una proteína de 40kDa (E1-40). Sólo fue posible detectar estas
proteínas en trofozoítos silvestres usando 100μg de extracto o más (mas adelante) lo que
demuestra que si se llevo a cabo la sobre-expresión. El resultado del inmunoblot muestra que la
proteína E1 de G.intestinalis parece sufrir un procesamiento proteolítico que genera los dos
productos detectados con los anti-gE1. Más adelante se muestra el inmunoblot sobre trofozoítos
silvestres. Se realizó el ensayo de ubiquitinación in vitro para evaluar y comparar la actividad de
la enzima E1 en trofozoítos silvestres y transfectados (Figura 17D), el desarrolló del ensayo de
ubiquitinación in vitro se describe mas adelante (sección 4.4.1). Se observó una mayor cantidad
de productos con extractos de trofozoítos transfectados que sobre-expresan la proteína E1
comparados con extractos de trofozoítos silvestres. Este resultado muestra que la
procesamiento proteolítico post-traduccional que sufre la proteína E1 no afecta su actividad
catalítica, además demuestra la funcionalidad del gen clonado y sobre-expresado.
5.1.4. La expresión de E1 es regulada durante la enquistación.
Para determinar la expresión del mRNA de E1 durante la enquistación se realizó real-time PCR
cuantitativo utilizando como plantilla cDNAs de diferentes etapas de la enquistación. Trofozoítos
WB/9B10 fueron inducidos a enquistar in vitro y se colectaron células en diferentes periodos de
tiempo (0, 6, 12, 24 y 48h), el punto de 48h corresponde a los quistes completamente formados.
Se extrajo RNA total de las células colectadas y se utilizó para sintetizar cDNA, este cDNA se
utilizó como plantilla para las reacciones de real-time PCR cuantitativo. La figura 18A muestra el
resultado obtenido (Anexo 5 – datos númericos). El nivel del mRNA de E1 incrementó durante
las primeras 12h de la enquistación, y en este punto se observó el más alto nivel de expresión
siendo tres veces mayor que en los trofozoítos. En seguida el nivel del transcrito decreció y
alcanzó el nivel más bajo en el estadio de quiste (48h), aproximadamente 1/3 comprada con los
trofozoítos. Este resultado muestra que la transcripción del gen e1 es regulada durante la
enquistación. Ya que se había observado que la proteína E1 presentaba un comportamiento
inusual y no se había detectado la proteína completa de 121kDa (Figura 14) decidimos evaluar
la integridad de su mRNA, esto con el fin de definir si el comportamiento observado se debía a
un procesamiento de su mRNA. Se evaluó la integridad del mRNA por RT-PCR utilizando una
pareja de oligonucleótidos que amplifican un fragmento de 2,898pb (158-3056 pb del gen), este
81
fragmento contiene las dos regiones contra las que se generaron los anticuerpos anti-gE1
(región 3’: 158-303 pb, y región 5’: 2744-3056 pb) y corresponde al 88% del mRNA completo.
Como se observa en la figura 18B el producto fue amplificado y este resultado demostró que el
transcrito de E1 se genera completo sin sufrir procesamiento proteolíticos (splicing u otro
procesamiento de mRNA). Ya que las regiones que reconocen los anticuerpos anti-gNTE1 y
anti-gCTE1 estan presentes en este mRNA amplificado podemos asegurar que se transcriben
en el mismo mRNA, y por lo tanto que el procesamiento observado en la proteína se debe a
eventos post-traduccionales.
Figura 18. La expresión de E1 es regulada durante la enquistación. (A). Análisis de los niveles del mRNA del gen e1
por real-time PCR cuantitativo. Se purificó RNA total de trofozoítos y células colectadas durante el proceso de
enquistación (0, 6, 12, 24 y 48h), este se utilizó en la síntesis de cDNA. El cDNA se utilizó como plantilla en las
reacciones de real-time PCR cuantitativo. Se realizó cuantificación absoluta, la curva de calibración se hizo por triplicado
con el plásmido pGEMT-GE1NT que contiene el fragmento del gen e1 amplificado por real-time PCR (145pb). (B)
Integridad del mRNA del gen e1. Se realizó RT-PCR sobre cDNA de trofozoítos con la pareja de oligonucleótidos GlNTE1-S y Gl-CTE1-AS que amplifican un producto de 2898pb. Se indican: (M) Marcador 1Kb, (cDNA) 5μl de cDNA
como plantilla, (DNA) 100ng de DNA como plantilla (control positivo), y (RNA) 200ng de RNA como plantilla (control
negativo). (C) Detección por inmunoblot de la proteína E1 en trofozoítos. 100μg de extracto citoplasmático NP40 (EC) o
fracción nuclear enriquecida (EN) se separaron por SDS-PAGE y se analizaron por inmunoblot con los anticuerpos antigNTE1 (1:500) y anti-gCTE1 (1:500). (D). Trofozoítos de G. intestinalis fueron inducidos a enquistar y se colectaron
células en diferentes etapas del proceso (0, 6, 12, 24 y 48h). Extractos citoplasmáticos (100ng) de cada punto se
separaron por SDS-PAGE y se analizaron por inmunoblot con anticuerpos con los anticuerpos anti-gNTE1 (1:500) y
anti-gCTE1 (1:500). Se indican los tamaños de las proteínas detectadas: 114, 90 y 68 kDa con anti-gNTE1; 47 y 40 kDa
con anti-gCTE1. (*) indica las señales inespecíficas del anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón biotiniliado 1:2000).
Sistema de revelado estreptavidina fosfatasa alcalina (1:3000) y NBT/BCIP.
82
Se analizó la expresión de la proteína E1 en trofozoítos y durante la enquistación para
determinar el comportamiento de esta, y determinar si el evento proteolítico observado en las
células transfectadas se presentaba en la proteína E1 endógena. Inicialmente se analizó la
expresión de la proteína E1 en trofozoítos, utilizando extractos citoplasmáticos y fracciones
nucleares enriquecidas, y solo se detectaron señales cuando se utilizó una elevada cantidad de
proteína (100μg de extracto). El inmunoblot (Figura 18C) mostró un comportamiento similar al
observado en las células transfectadas (Figura 17C). Con el anticuerpo anti-gNTE1 se
detectaron dos proteínas en el extracto citoplasmático, una señal muy débil alrededor de
114kDa (E1-114) y una señal intensa de 68kDa (E1-68), esta última se había detectado en las
células transfectadas con este anticuerpo. En la fracción nuclear enriquecida se detectó una
banda adicional de 90kDa (E1-90), la cual podría ser debida a una modificación posttraduccional de E1-68 o un producto proteolítico adicional de E1-114. La proteína E1-114 podría
ser la proteína E1 completa (tamaño predicho 121kDa), el tamaño inferior al predicho podría ser
debido al procesamiento proteolítico de los extremos N- y C-terminal de la proteína E1 que se
sugirió por los experimentos de sobre-expresión (perdida de los “tags” HA). La proteína E1-68
fue la especie más abundante presente tanto en extractos nucleares como fracción nuclear
enriquecida. Con el anticuerpo anti-gCTE1 se detectaron dos proteínas en el extracto
citoplasmático, de alrededor 47kDa (E1-47) y 40kDa (E1-40); y una única señal de 40kDa en la
fracción nuclear enriquecida. Los resultados obtenidos en los inmunblot demuestran de nuevo
que la proteína E1 sufre una modificación proteolítica, y además que hay diferencias entre las
especies de esta proteína en el citoplasma y en el núcleo. Las proteínas E1-68 y E1-47 son las
proteínas mas abundantes detectadas con los anticuerpos anti-gE1. En las células
transfectadas solo se detectaron las especies E1-68 y E1-40, sugiriendo que la sobre-expresión
incrementa el proceso proteolítico de alguna forma que no podemos explicar con los datos que
tenemos hasta el momento. Los resultados obtenidos nos permiten sugerir que el gen e1 se
transcribe completo (Figura 17B) y se traduce en la proteína E1 completa (121kDa), esta es
procesada en sus extremos generando la proteína E1-114 que a su vez es procesada
rápidamente y genera las dos proteínas E1-68 y E1-47. Mas adelante ampliamos esta
propuesta proteolítica con un modelo que proponemos.
Durante la enquistación la proteína E1 presenta un comportamiento similar al observado para
su mRNA (Figuras 18A y 18D). Las proteínas más abundantes durante la diferenciación de
trofozoítos a quistes fueron E1-68 y E1-47. Los niveles de ambas proteínas incrementan
durante las primeras 12h de la enquistación, siendo más evidente para E1-68, y posteriormente
83
disminuyen (Figura 18D). La proteína E1-114 (E1 completa) fue detectada en trofozoítos noenquistantes (0h) y en células enquistantes tempranas (6 y 12h), momento en el que E1-68
alcanza su nivel de expresión mas alto. Esto podría indicar que durante la enquistación el
evento proteolítico se incrementa o es más rápido. Estos resultados demuestran que la proteína
E1 es regulada durante la enquistación y alcanza su nivel más alto de expresión a las 12h de
inducción.
5.1.5. Modelo de los eventos proteolíticos que sufre la proteína E1.
Nuestro análisis de la proteína E1 utilizando anticuerpos específicos anti-gE1 tanto en
trofozoítos silvestres como en células que sobre-expresan la proteína nos revelaron
características inusuales para esta proteína, las cuales no han sido observadas en otras E1
[4,176,177]. La proteína E1 de G.intestinalis es proteolíticamente modificada generando dos
proteínas mayoritarias, una de 68kDa – E1-68 (N-terminal) y otra de 47kDa – E1-47 (Cterminal). Este evento fue observado en inmunoblots de trofozoítos silvestres y transfectados
(sobre-expresan E1), además en los diferentes estados de diferenciación (Figuras 17C, 18C y
18D). Además el evento proteolítico no genera la pérdida de la actividad tal y como se observó
con el ensayo de ubiquitinación in vitro, demostrando que los productos proteolíticos generados
son funcionales (Figura 14D). Con base en nuestros resultados proponemos el siguiente
modelo para el procesamiento proteolítico de la proteína E1 (Figura 19):
a. El gen e1 de G.intestinalis codifica para una proteína de 121kDa. El gen e1 se transcribe
completo sin eventos de splicing (Figura 18B) (la modificación es post-traduccional). Un
primer evento proteolítico ocurre tan pronto la proteína E1 es sintetizada, una proteolísis
específica elimina péptidos cortos en los extremos N- y C-terminal de la proteína
generando la proteína E1-114. Esta propuesta es soportada por los experimentos de
sobre-expresión que mostraron la pérdida de los “tags” HA tanto en el N- como en el Cterminal.
b. Un segundo evento proteolítico ocurre en una zona interna de la proteína E1 generando
dos péptidos, E1-68 y E1-47. Este procesamiento divide los dominios de la proteína. El
dominio con los dos motivos ThiF o MoeB (unión no-covalente de Ub) se encuentran en
la región N-terminal de la proteínas E1 de G.intestinalis, tal y como ocurre en todas las
proteínas E1 (Figura 14). El dominio UFD (unión a la enzima E2) se encuentra en el
extremo C-terminal. Por lo tanto el procesamiento proteolítico estaría dividiendo estos
dos dominios. En cuanto al dominio catalítico no podemos decir nada por ahora ya que
84
este se encuentra localizado en una región interna de la proteína, y con los datos que
tenemos no es posible discriminarlo en E1-68 o E1-47. Ya que los tres dominios son
indispensables para la actividad de las enzimas E1 [27] proponemos entonces una reasociación en una proteína heterodimérica. La inmunofluorescencia mostró un patrón de
localización similar para E1-68 y E1-47 lo cual soporta la posibilidad de una reasociación (Figuras 17A, 17B).
c. La proteína E1-47 parece tener un procesamiento adicional, generando el péptido E140. Con el anticuerpo contra la región C-terminal de E1 (anti-gCTE1) se demostró que el
péptido E1-47 esta presente en citoplasma y núcleo, mientras que E1-40 solo esta
presente en cantidades detectables en el citoplasma. Por lo tanto los dos péptidos
podrían tener una localización celular diferente.
d. El inmunoblot con el anticuerpo anti-gNTE1 detecta una proteína extra de 90kDa (E1-90)
en el extracto citoplasmático. Proponemos que E1-90 podría ser generado por una
modificación post-traduccional de E1-68 o ser un producto proteolítico menos abundante
de E1-114.
Otras proteínas miembro de la familia E1, como las enzimas activadoras de SUMO y NEDD8
(proteínas similares a Ub), son heterodímeros [23]. Las proteínas SAE1 (para SUMO) y NAE1
(para NEDD8) son homologas a la región N-terminal de la enzima E1 de Ub, y las proteínas
UBA2 (para SUMO) y UBA3 (para NEDD8) son homologas a la región C-terminal (Figura 14).
Las dos subunidades son esenciales para la activación de SUMO y NEED8, de tal manera que
deben asociarse y formar los heterodímeros [23,27]. Las dos proteínas E1-68 y E1-47 que se
generan del procesamiento proteolítico que sufre la E1 de G.intestinalis podrían ser proteínas
análogas a las subunidades de estas enzimas E1. Por lo anterior sugerimos que podría ser
posible que el procesamiento proteolítico que sufre la enzima E1 de G.intestinalis sea un
comportamiento ancestral que se mantenga en las enzimas activadoras de SUMO y NEDD8, y
podría ser una forma primitiva o ancestral de regular la actividad de la enzima.
85
Figura 19. Modelo del procesamiento proteolítico de la proteína E1 de G.intestinalis. El gen e1 de
G.intestinalis codifica para una proteína de 121kDa. (a) El transcrito del gen e1 es generado sin
splicing, la proteína es sintetizada y procesada proteolíticamente en sus extremos N- y C-terminal
eliminando dos pequeños péptidos y generando la proteína E1-114. (b) Un segundo evento proteolítico
ocurre en una región interna de la proteína E1-114 generando los péptidos E1-68 y E1-47. Estas dos
proteínas se re-asocian para generar la proteína E1 funcional. (c) La proteína E1-47 sufre un
procesamiento adicional que genera el péptido E1-40. E1-47 se encuentra en núcleo y citoplasma
mientras que E1-40 aparentemente se restringe al citoplasma. (d) Una especie de 90kDa (E1-90) puede
ser generada por modificación post-traduccional de E1-68 o puede ser otro producto proteolítico de e1114. Los compartimientos celulares se indican como (N) núcleo y (PM) membrana plasmática.
5.1.6. Localización de la proteína E1 durante la enquistación.
Con el fin de analizar la distribución celular de la proteína E1 en trofozoítos, células
enquistantes y quistes, se realizó microscopía de inmunofluorescencia con los anticuerpos antigE1 (Figura 20). Se observó patrones de localización similar con ambos anticuerpos, antigNTE1 y anti-gCTE1. En trofozoítos la proteína E1 se distribuye en un patrón punteado definido
(“spots”), este patrón de localización sugiere que la proteína se encuentra mayoritariamente
asociada con membranas o complejos proteícos altamente estructurados que no permiten su
difusión libre en el citoplasma. Además puede estar reflejando que en Giardia hay una
regulación por ubiquitinación en compartimientos específicos dentro de la célula.
86
Figura 20. Inmunolocalización de la proteína E1 durante la enquistación. Trofozoítos, células
enquistantes y quistes fueron colectados, fijados en láminas con p-formaldehído al 4% y analizados por
inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-gE1 1:500 (anti-gNTE1 y anti-gCTE1). Como anticuerpo
secundario se utilizó un anti-IgG de ratón marcado con FITC. La proteína CWP1 (marcador de ESVs y
pared del quiste) se detectó con el anti-CWP1-TAMRA 1:100 (Waterborne Inc). (A)
Immunofluorescencia con anti-gNTE1. (B) Inmunofluorescencia con anti-gCTE1. Los diferentes estadios
se indican como: (T) trofozoítos, (ENC) células enquistantes, y (Q) quistes. (ESVs) es vesículas
específicas de enquistation, DIC es microscopía de luz (“differential interference contrast”). La barra
corresponde a 10 μM.
87
Cuando los trofozoítos fueron inducidos a enquistar el patrón de localización de la proteína E1
cambió, se observó una distribución citoplasmática difusa. Durante la enquistación ocurren
importantes procesos moleculares y celulares, además de la síntesis, clasificación y transporte
regulado de los componentes que formaran la pared del quiste [15] (Sección 3.2.2). El cambio
en la distribución de la proteína E1 en células enquistantes refleja una regulación inducida y
dependiente de la enquistación, que podría deberse a algún tipo de asociación de la
ubiquitinación con esos procesos mencionado anteriormente. La proteína E1 se encuentra
prácticamente en todo el cuerpo de la célula enquistante, incluso se observó co-localización con
las ESVs. Las ESVs con los gránulos secretorios que transportan las proteínas CWPs a la
superficie de la célula para su posterior liberación y ensamble de la pared. En los quistes la
proteína E1 se localiza en ambas formas, difusa y punteada en el cuerpo del quiste (interior); y
de forma muy interesante también se localiza en la pared del quiste o muy cerca de ella
sugiriendo alguna relación entre la ubiquitinación y esta matriz. El encontrar a la proteína E1 en
la pared del quiste es muy interesante ya que hasta la fecha son pocas las proteínas que se han
identificado o localizado en esta estructura. Hasta la fecha los únicos anticuerpos que marcan la
pared del quiste son los que reconocen las proteínas CWPs [121,123] (Sección 3.1.1). Otras
proteínas han sido localizadas en la pared utilizando proteínas marcadas con diferentes
epítopes, la “high cysteine non-variant cyst protein” (HCNCp) y un grupo de proteínas con
repeticiones similares a EGF (“EGF-like cyst proteins” – EGFCPs) [127,128]. De estas proteínas
EGFCPs se ha especulado que pueden actuar en procesos de señalización durante la
exquistación, ya que pueden comunicar el medio externo con el interior del quiste, nosotros
podemos sugerir lo mismo para la proteína E1. Por lo tanto la localización de la proteína E1 en
la pared del quiste sugiere una relación entre la ubiquitinación y procesos involucrados en la
formación y rompimiento de la matriz del quiste, procesos que son aún poco conocidos.
5.1.7. La proteína E1 es esencial en los trofozoítos y esta implicada en la enquistación.
Para determinar el papel y funcionalidad del gen e1 en el desarrollo y diferenciación de
G.intestinalis manipulamos su expresión, reduciéndola con RNA antisentido e incrementándola
por sobre-expresión. En cuanto a la inhibición se transfectaron trofozoítos con el plásmido
pTubHApacCT-E1AS, este genera un transcrito antisentido de 500pb del gen e1 y puede inhibir
la traducción del mRNA de E1 por RNA antisentido. Se realizó el experimento tres veces y no
se obtuvieron células viables, los controles de la transfección (vector pTubHApacCT vacío)
trabajaron bien lo cual demostró que la transfección funcionaba bien. Este resultado demuestra
que e1 es un gen esencial en G.intestinalis, sugiriendo que la ubiquitinación tiene papeles
88
fundamentales en este organismo. Con los trofozoítos que sobre-expresaban la proteína E1
(transfectados con pTubHApacNT-E1 y pTubHApacCT-E1) se realizaron experimentos de
enquistación in vitro, y de esta forma se pudo determinar si el aumento en la expresión del gen
e1 afectaba o no este proceso (Figura 21). La sobre-expresión incrementó de 5 a 6 veces el
porcentaje de enquistación con respecto a los trofozoítos silvestres. Esta es la primera
evidencia que la proteína E1 y la ubiquitinación tienen un papel importante en el proceso de
diferenciación de trofozoítos a quistes en G.intestinalis. Previamente en nuestro grupo se había
determinado que la inhibición del proteosoma no afecta la proliferación de los trofozoítos ni el
desarrolló de la enquistación [167], es decir que los papeles de la Ub asociados a degradación
no son indispensables en G.intestinalis. Nuestros resultados por otra parte demuestran que la
proteína E1 es indispensable para el desarrolló de los trofozoítos y participa en la enquistación,
es decir que la ubiquitinación si tiene un papel protagónico en este microorganismo.
Proponemos que más que los procesos asociados con degradación proteosomal son los
papeles de la ubiquitinación en procesos no degradativos (señalización, transporte, etc) los
indispensables en el desarrollo de este eucariota primitivo. Este comportamiento nos hace
sugerir que tempranamente en la evolución los papeles no degradativos de la ubiquitinación
pudieron primar sobre los degradativos, y que la Ub pudo ser originalmente una molécula
señalizadora.
Figura 21. Efecto de la sobre-expresión del gen e1 sobre la enquistación in vitro. 200,000
células de trofozoítos silvestres y transfectados con los vectores pTubHApacNT-E1 y
pTubHApacCT-E1 fueron inducidas a enquistar. Se contaron los quistes formados y el porcentaje
de enquistación se determinó. Los valores de enquistación se expresaron relativos al porcentaje de
enquistación de los trofozoítos silvestres (28%). El experimento se realizó por triplicado.
89