validación concurrente de cuatro tipos de desinfectantes utilizados

VALIDACIÓN CONCURRENTE DE CUATRO TIPOS DE DESINFECTANTES UTILIZADOS EN
EL LABORATORIO DE INDICADORES DE CALIDAD DE AGUAS Y LODOS DE LA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
LAURA ISABEL BEDOYA SALCEDO
LONERA DEL PILAR CORREDOR BARRERA
Director
Nubia Lorena Valencia Zuleta
Codirectora
Luz Karime Medina Cordoba M.Sc.
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C.
2013
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y
porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar a Dios , por habernos permitido tener la fuerza para
llegar hasta aquí.
A nuestros padres por los ejemplos de constancia y perseverancia que los caracterizan y
que siempre nos han infundido, por el valor y amor que nos han dado para salir
adelante sin desfallecer, por sus consejos, sus valores que nos han permitido ser personas
de bien.
A todas aquellas personas, familiares que nos rodean,
que
nos han apoyado
colaborado en los momentos de angustia que tuvimos durante la carrera.
y
A nuestra directora de tesis Lorena Valencia y a la codirectora Karime Medina de quienes
siempre recibimos consejos para hacer mejor las cosas. Y a Claudia Campos directora del
laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ......................................................................................................................................... 6
1.
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 7
2.
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................ 8
3.
OBJETIVOS .............................................................................................................................. 9
4.
3.1.
Objetivo general ................................................................................................................ 9
3.2.
Objetivos Específicos....................................................................................................... 9
MARCO TEÓRICO ................................................................................................................. 10
4.1. Descripción Del Laboratorio De Indicadores De Calidad De Aguas Y Lodos De La
Pontificia Universidad Javeriana .............................................................................................. 10
4.2.
Validación ........................................................................................................................ 10
4.3.
Programa De Limpieza Y Desinfección ...................................................................... 11
4.4.
Desinfectantes ................................................................................................................ 11
4.4.1.
4.5.
5.
Características De Un Buen Desinfectante ........................................................ 11
Clasificación De Los Desinfectantes ........................................................................... 12
4.5.1.
Según su potencia y efectividad contra microorganismos: .............................. 12
4.5.2.
Según su mecanismo de acción se clasifican en: ............................................. 13
4.5.3.
Según su grupo químico: ...................................................................................... 13
4.6.
Factores Que Afectan La Potencia De Los Antisépticos Y Desinfectantes .......... 16
4.7.
Resistencia De Los Microorganismos A Los Desinfectantes .................................. 17
4.8.
Mecanismos De Acción De Los Desinfectantes Sobre Los Microorganismos ..... 17
METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 18
5.1.
Diseño De La Investigación .......................................................................................... 18
5.2.
Lugar de muestreo ......................................................................................................... 18
5.3.
Población de estudio ...................................................................................................... 18
5.4.
Número de muestras...................................................................................................... 19
5.5.
Puntos de muestreo y toma de muestras ................................................................... 19
5.7.
Análisis De La Información ........................................................................................... 20
5.8.
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS ............................................................................. 21
5.9.
Técnicas para la validación de los desinfectantes .................................................... 21
6. RESULTADOS ........................................................................................................................... 23
2
6.3. ANALISIS ESTADÍSTICOS DE LOS RESULTADOS ................................................... 33
7 DISCUSIÓN DE RESULTADOS .............................................................................................. 35
8. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 41
9. RECOMENDACIONES ............................................................................................................. 42
ANEXOS .......................................................................................................................................... 45
3
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.
Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al
desinfectante de alto nivel NEW
FAGETRIALD teniendo en cuenta las
concentraciones y tiempos de acción determinados.
25
Tabla 2.
Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al
desinfectante de alto nivel NEW DESINFLOOR teniendo en cuenta las
concentraciones y tiempos de acción determinados
26
Tabla 3.
Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al
desinfectante TEGO 51 teniendo en cuenta las concentraciones y tiempos de acción
determinados.
27
Tabla 4.
Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al
desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO teniendo en cuenta las concentraciones y
tiempos de acción determinados.
Tabla 5.
Promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante NEW
FAGETRIALD con las diferentes concentraciones.
28
33
33
Tabla 6.
Promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante NEW
DESINFLOOR con las diferentes concentraciones
Tabla 7.
Promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante TEGO
51 con las diferentes concentraciones.
33
Tabla 8.
Promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante TEGO
51 con las diferentes concentraciones.
33
Tabla 9.
Rango estudentizado de Tukey (HSD) para inhibición
35
Tabla 10.
Tests t de Dunnett para INHIBICIÓN
35
Tabla 11.
tTests (LSD) para INHIBICIÓN
36
4
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Aislamiento e identificación de bacterias Gram negativas
Figura 2
Identificación de bacterias mesófilas Gram positivas
Figura 3
identificaciones de hongos mediante clave taxonómica
Fìgura 4
Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR y TEGO
51frente a Escherichia coli cepa nativa y de referencia en las diferentes concentraciones y
tiempos de exposición
23
23
24
29
Figura5
Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR y TEGO 51,
frente a Pseudomonas sp. nativa y de referencia en las diferentes concentraciones y tiempos
de exposición
29
Figura 6
Grafica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOR y TEGO 51,
frente a Staphylococcus aureus nativa y de referencia
30
Figura 7
Grafica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOR y TEGO 51,
frente a Bacillus subtilis nativa y de referencia.
30
Gráfica integrada del desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO, frente a Escherichia coli,
Pseudomonas sp y Staphylococcus aureus
33
Figura 8
33
Figura 9
Grafica integrada del porcentaje de inhibición de Bacillus subtilis cepa de referencia y cepa
nativa frente al desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO
Figura 10
Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOR y
TEGO 51, frente a Aspergillus flavus cepa nativa y de referencia y Penicillum sp.
cepa nativa cepa de referencia
34
Gráfica integrada de los desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO, frente a
Aspergillus flavus cepa nativa y de referencia y Penicillum sp. cepa nativa cepa de
referencia.
34
Figura 11
5
RESUMEN
En este estudio se busco determinar la carga microbiana que se presenta con mayor incidencia en las
superficies y áreas de trabajo del laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia
Universidad Javeriana, realizando un muestreo de superficies
por medio del método horizontal de
técnicas de muestreo de superficies usando cajas de contacto y escobillón, y para ambientes la técnica
de sedimentación;
a partir del aislamiento e identificación de los microorganismos Escherichia coli,
Pseudomonas sp, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Penicillum sp. y Aspergillus flavus se realizó
una validación concurrente de los desinfectantes
NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR,
HIPOCLORITO DE SODIO y TEGO 51 con el fin de asegurar que los agentes químicos son eficaces en
la eliminación y /o reducción de la carga microbiana presente, utilizando para bacterias la técnica del
coeficiente fenólico modificado, para evaluar en este caso otros compuestos químicos , y la técnica de
placa de agar mediante siembra en estría evaluando de esta manera diferentes concentraciones en
diferentes tiempos de acción frente a los microorganismos; y para hongos
por medio de la técnica de
dilución en agar se evaluaron las concentraciones de los desinfectantes determinando la concentración
mínima inhibitoria, mediante la medición del crecimiento radial de los microorganismos. De acuerdo a los
resultados obtenidos, se pudo observar que estos agentes químicos NEW FAGETRIALD
y NEW
DESINFLOOR inhiben el crecimiento de los microorganismos Escherichia coli, Pseudomonas sp,
Staphylococus aureus, Penicillum sp. y Aspergillus flavus presentando un porcentaje de inhibición mayor
o igual del 90%, en la concentración recomendada por el fabricante 0.50% , y en HIPOCLORITO DE
SODIO en la concentración 6,25% la recomendada por el fabricante frente a todos los microorganismos.
Los desinfectante de alto nivel NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR, a una concentración del 1% el
doble de la recomendada por el fabricante, obtuvieron un porcentaje de inhibición menor del 90 % frente a
Bacillus subtilis, debido a que estos agentes químicos presentaron una alteración en las propiedades
afectándose de esta manera su acción esporicida. Este es un microorganismo no patógeno para el
hombre, y no causa interferencia en los análisis ensayos y estudios que se realizan en el laboratorio. Se
demostró que el desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO presentó un excelente comportamiento, a la
concentración recomendada 6.25%
a los 10 minutos de exposición frente a
los microorganismos
Pseudomonas sp, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, y a las 4 horas de exposición para Bacillus
subtillis. Aspergillus flavus y Penicillum sp; teniendo una actividad esporicida, bactericida, y fungicida,
siendo así el desinfectante más eficaz en la inhibición o reducción de la carga microbiana presente.
6
1. INTRODUCCIÓN
La limpieza y desinfección es un conjunto de actividades aplicadas a cada uno de los procesos que se
realizan en un laboratorio, para eliminar o disminuir la carga microbiana presentes en los equipos, áreas
y superficies. Es por esto que el laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la pontificia
universidad javeriana, ha buscado optimizar sus procesos, contando con un programa de limpieza y
desinfección actualizado, que permita controlar las condiciones de desinfección, garantizando la
eliminación y/o reducción de microorganismos que puedan interferir en los análisis, estudios y ensayos
realizados en los laboratorios.
La selección de desinfectantes que cumplan con ciertas características siendo capaces de inhibir
diferentes tipos de microorganismos patógenos y saprofitos, a concentraciones adecuadas en los
intervalos de tiempo determinados, juegan un papel importante, en el desarrollo de un programa de
limpieza y desinfección, siendo un instrumento indispensable para asegurar la calidad de cada una de las
variables que intervienen en la limpieza y desinfección, garantizando de esta forma el cumplimiento de las
buenas prácticas de laboratorio. De ahí la importancia de establecer métodos de limpieza y desinfección
adecuados en las áreas de trabajo.
Para determinar la actividad bactericida o biocida de un agente químico es necesario conocer su eficacia
lo cual se logra mediante una validación. La validación de los desinfectantes, es parte esencial de las
buenas prácticas de laboratorio, para permitir el establecimiento de procedimientos consistentes, ya que
sin procesos validados y controlados es imposible obtener productos de calidad.
El objetivo de este trabajo fue validar los desinfectantes de amplio espectro FAGETRIALD DESINFLOOR,
HIPOCLORIO Y TEGO 51, utilizados en el laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA, siguen cumpliendo con un porcentaje de remoción mayor al
90%.
Se manejó un diseño experimental concurrente realizando el enfrentamiento de los desinfectantes
utilizados frente a los microorganismos aislados e identificados en superficies y ambientes en el
laboratorio. La población de estudio fue: los desinfectantes llamados FAGETRIALD, DESINFLOOR,
TEGO 51 e HIPOCLORITO DE SODIO. Las variables de estudio fueron microorganismos identificados,
inhibición microbiana, diferentes concentraciones de los desinfectantes y tiempos de exposición.
A partir de los resultados obtenidos en este estudio, se realizó una actualización del programa de limpieza
y desinfección, se estableció un nuevo cronograma de rotación de los desinfectantes usados, mostrando
las concentraciones ideales y el tiempo de acción de cada uno de estos agentes químicos, todo esto con
el fin de corregir y prevenir posibles alteraciones que puedan llegar a afectar los análisis, ensayos y
estudios que se realizan en el laboratorio.
7
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana realiza
estudios del comportamiento de los indicadores de contaminación microbiana (bacterias, virus y parásitos)
en diferentes tipos de aguas y lodos provenientes de sistemas de tratamiento de aguas residuales, y
estudia los niveles de toxicidad a través de bioensayos, prestando estos servició a empresas y a
particulares. Este laboratorio ha sufrido una serie de remodelaciones en sus instalaciones, por tal razón se
hace necesario detectar a tiempo la presencia de nuevos microorganismos, o la posible resistencia de la
carga microbiana presente en las superficies y áreas de trabajo, frente a los agentes químicos utilizados
en el proceso de limpieza y desinfección; y en miras de una acreditación, es de gran importancia contar
con un programa de limpieza y desinfección actualizado, ya que el uso correcto de los desinfectantes
como elementos indispensables dentro de éste, teniendo en cuenta las concentraciones utilizadas, su
modo de acción y adecuada rotación y el buen desempeño y eficacia de estos agentes químicos
(FAGETRIALD, HIPOCLORITO DE SODIO, TEGO 51 Y DESINFLOOR) van a generar condiciones que
permitirán disminuir la carga microbiana que se pueda presentar en el laboratorio, manteniendo así un
ambiente libre de contaminaciones y previniendo posibles alteraciones de estudios , análisis y ensayos
ejecutados en el.
Este proyecto tiene la finalidad de validar los cuatro desinfectantes utilizados en el laboratorio de
indicadores de calidad de agua y lodos de la pontificia universidad javeriana, con el fin de asegurar que
estos agentes químicos siguen siendo eficaces y cumplen con las especificaciones requeridas (tiempo de
acción, y concentración) y a partir de esto garantizar que su uso es fiable y está dentro de los límites
operacionales especificados.
8
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Realizar una validación concurrente de cuatro tipos de desinfectantes utilizados en el proceso
de limpieza y desinfección del laboratorio de indicadores biológicos de lodos y aguas de la
Pontificia Universidad Javeriana.
3.2. Objetivos Específicos
Aislar e identificar la diversidad microbiana con mayor incidencia en las superficies de los
mesones, pisos y ambiente del laboratorio de indicadores biológicos de lodos y aguas de la
Pontificia Universidad Javeriana.
Evaluar la efectividad de 4 tipos de desinfectantes (HIPOCLORITO DE SODIO, DESINFLOOR
FAGETRIALD para superficies y TEGO 50 para ambientes) mediante el ensayo a diferentes
concentraciones y tiempos de acción.
Elaborar un nuevo cronograma de rotación de desinfectantes.
Revisar y ajustar el programa documentado de limpieza y desinfección con el cual cuenta el
laboratorio a partir de los resultados obtenidos en el estudio
9
4. MARCO TEÓRICO
4.1. Descripción Del Laboratorio De Indicadores De Calidad De Aguas Y Lodos De La Pontificia
Universidad Javeriana
La línea de indicadores biológicos de calidad de agua tiene por objeto realizar el diagnóstico de la calidad
de aguas potables, residuales y lodos, estudiando el comportamiento de los indicadores de contaminación
microbiana en relación a la presencia de microorganismos indicadores de contaminación fecal (bacterias,
virus y parásitos) en diferentes tipos de aguas y lodos provenientes de sistemas de tratamiento de aguas
residuales. Estudia los niveles de toxicidad en diferentes tipos de aguas, causados por los residuos de
origen químico, a través de bioensayos, modelos animales y vegetales. (1, 2)
En relación con los indicadores de contaminación microbiana se evalúan en:
Aguas Potables: Coliformes fecales,Clostridium perfringes, Colifagos somáticos,Enterococcus faecalis,
Escherichia coli, Fagos de bacteroides fragilis, Fagos F-específicos, Giardia y Cryptosporidium (recuento y
viabilidad).
Aguas residuales: Coliformes fecales, Clostridium perfringes, Colifagos somáticos, Daphnia magna,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Fagos de bacteroides fragilis, Fagos F-específicos, Giardia y
Cryptosporidium (recuento), Huevos de Helminto, Hydra attenuata, Lactuca sativa. Análisis de Lodos:
Coliformes fecales, Colifagos somáticos, Fagos F-específicos, Fagos de bacteroides fragilis, Huevos de
Helminto EPA modif.(1)
Este laboratorio presta servicios a empresas o a particulares y realiza proyectos de investigación con:
acueductos, humedales, lagunas de oxidación, rellenos sanitarios, plantas de tratamiento de aguas (1).
4.2. Validación
La validación es el proceso establecido, que consiste en demostrar con un alto grado de confianza por
medio de evidencia documentada, que un proceso específico producirá de forma consistente y
permanente productos que poseerán las características de calidad predefinidas (3, 4).
Validación Prospectiva: Se basa en información obtenida antes de implantar el proceso de
validación, se realiza un análisis de riesgos para determinar si podría conducir a situaciones
críticas; se investiga posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda.
Posteriormente se efectúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados son
aceptables al final, el proceso es satisfactorio (5).
Validación Concurrente: Este tipo de validación sirve para demostrar y establecer evidencia
documentada que un proceso hace lo que debe hacer basado en información generada durante
una implementación real del proceso. La validación concurrente es muy utilizada cuando se ha
variado alguna etapa del proceso. Esta da una información muy valiosa para modificar y corregir
el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua del proceso mientras se controla al
máximo para procurar que el producto o resultado final sea correcto (5).
Validación Retrospectiva (6): Este tipo de validación involucra la revisión y análisis de la
información histórica del proceso para proveer la evidencia documentada necesaria que el
proceso está haciendo lo que debe hacer. Los pasos involucrados en este tipo de validación
requieren la preparación de un protocolo específico, el reporte de los resultados de los datos
analizados que conlleve a unas conclusiones y recomendaciones (5).
10
Revalidación: Es la repetición de un procedimiento de validación o un procedimiento del mismo.
Esto no significa que el programa original deba ser repetido, pues la revalidación se efectúa para
asegurar que los cambios intencionales o no intencionales en los procesos no afecten las
características del proceso ni la calidad del producto (5).
4.3. Programa De Limpieza Y Desinfección
La limpieza: cubre todos los procesos implicados en la eliminación de todo tipo de suciedad de las
superficies, pero no los que corresponden a la esterilización. Cualquier proceso para la eliminación física
de cualquier suciedad.
La desinfección: hace referencia a un tratamiento físico químico o biológico aplicado a las superficies
limpias que tiene como propósito destruir las células vegetativas de los microorganismos que pueden
ocasionar un riesgo de salud pública y reducir sustancialmente el número de microorganismos patógenos
(7).
Los programas de limpieza y desinfección deben desarrollarse de manera que sean rentables, seguros,
en el menor tiempo posible y con un producto químico de bajo costo; es por esto que un proceso de
limpieza adecuado necesita que, factores como la fuerza mecánica o la acción física usada, temperatura,
tiempo de contacto y concentraciones del desinfectante sean elegidos cuidadosamente. Un procedimiento
de limpieza y desinfección eficiente consiste en una secuencia de enjuagues y aplicaciones de un
detergente o desinfectante, en varias combinaciones de temperatura y concentraciones; en donde el
objetivo es reducir la población de la superficie de los microbios viables después de la limpieza y para
evitar el crecimiento microbiano en las superficies (7).
En Colombia, el programa de limpieza y desinfección es definido por el decreto 3075 del 23 de diciembre
de 1997 capítulo VI, como “los procedimientos de limpieza y desinfección deben satisfacer las
necesidades particulares del proceso y del producto de que se trate. Cada establecimiento debe tener por
escrito todos los procedimientos, incluyendo los agentes y sustancias utilizadas así como las
concentraciones o formas de uso y los equipos e implementos requeridos para efectuar las operaciones y
periodicidad de limpieza y desinfección” (8). Este programa es uno de los requisitos de las buenas
prácticas de laboratorio (BPL) las cuales “son un conjunto de reglas, procedimientos operativos y prácticos
establecidas por una determinada organización para asegurar la calidad y la rectitud de los resultados
generados por un laboratorio" (9), estas comprenden los requisitos de personal, instalaciones y ambientes
adecuados, equipos, materiales, POE, documentación, auditorias y bioseguridad.
4.4. Desinfectantes
Definición
Según la EPA y OCDE, un desinfectante es una sustancia química que destruye o elimina
microorganismos infecciosos, pero no necesariamente esporas bacterianas (10), este término es
aplicable a los agentes utilizados para tratar objetos y materiales inanimados y puede usarse
también para los agentes que se emplean para tratar la piel y otras cavidades del organismo(11).
4.4.1.Características De Un Buen Desinfectante
Todo desinfectante debe cumplir con ciertos requisitos como:
- El producto debe ser una solución estable compuesta por una o más sustancias
limpiadoras y desinfectantes.
11
- El producto debe ser miscible en agua, a las diluciones de uso.
- El limpiador no debe dejar ningún olor residual desagradable en la superficie tratada.
- Estabilidad, indicando que el producto en condiciones de almacenamiento y manipulación
no debe presentar ningún cambio.
- La formulación del producto debe ser tal que no tenga efectos perjudiciales para la piel
humana y no sea tóxico (12) (según la norma NTC 2455 del 2000).
La elección del desinfectante depende del propósito para el que se utiliza y de los probables
microorganismos contaminantes (13), así mismo la efectividad de un desinfectante depende
de los factores intrínsecos, la concentración del desinfectante, el tiempo de contacto, la
naturaleza o material de la superficie desinfectada, la cantidad de materiales orgánicos
presente sobre la superficie y el tipo y numero de microorganismos presentes.
4.5. Clasificación De Los Desinfectantes
4.5.1.Según su potencia y efectividad contra microorganismos:
•
Desinfectantes de bajo nivel: son aquellos que pueden destruir la mayor parte de las formas
vegetativas bacterianas, bacterias Gram positivas, Gram negativas, algunos virus con envoltura
lipídica y hongos levaduriformes. No son eficaces frente a Mycobacterium spp, ni
microorganismos formadores de esporas (14)
•
Desinfectantes de nivel intermedio: inactivan todas las formas bacterianas vegetativas,
incluyendo Mycobacterium tuberculosis, virus con o sin envoltura y hongos filamentosos, pero no
destruyen necesariamente las esporas bacterianas (14).
•
Desinfectantes de alto nivel: destruyen todos los microorganismos, excepto algunas esporas
bacterianas. (14).
12
4.5.2.Según su mecanismo de acción se clasifican en:
Tipo de desinfectantes
Detergentes:
Catiónicos
Aniónicos
No aniónicos
Compuestos fenólicos:
Fenol
Cresol
Difenilos halogenados
Alquilésteres de para-hidroxibenzoico
Aceites esenciales de plantas
Alcoholes:
Etanol Isopropanol
Ácidos y bases fuertes
Ácidos orgánicos no
disociables
Metales pesados:
Mercuriales
Compuestos de plata
Compuestos de cobre
Agentes oxidantes:
Halógenos
Agua oxigenada
Permanganato de potasio
Acidoparacético
Colorantes:
Derivados de la anilina
Derivados de la acridina (flavinas)
Agentes alquilantes:
Formaldehído
Glutaraldehído Oxido de etileno B-propillactona
Sitio de acción
Membrana celular
Proteínas
Grupos funcionales
(SANCHEZ L. 2005)
4.5.3.Según su grupo químico:
4.5.3.1.
Aldehídos
Los aldehídos (formaldehído, glutaraldehído) son compuestos intermedios entre los alcoholes y
ácidos. Derivados de los alcoholes primarios por oxidación y eliminación de átomos de hidrógeno
y adición de átomos de oxígeno. Son usados como desinfectantes de alto nivel o para
esterilización de instrumentos como endoscopios, equipos de terapia respiratoria, hemodiálisis y
equipo dental.
Los aldehídos tienen un amplio espectro de actividad contra microorganismos y virus, son
compuestos bactericidas y bacteriostáticos. Los aldehídos más conocidos y utilizados son el
formaldehído y el glutaraldehído. Actúan mediante la alquilación de los grupos químicos de las
proteínas y ácidos nucleicos de las bacterias, virus y hongos.
El formaldehído actúa sobre las proteínas por desnaturalización, y sobre los ácidos nucleicos y las
proteínas por alquilación. El mecanismo de acción es dependiente del pH, llevándose a cabo
mejor a pH alcalino y mal a pH ácido o neutro. Mientras que el glutaraldehído actúa sobre la pared
celular, el glutaraldehído actúa a nivel de los puentes cruzados del peptidoglicano (14, 18)
Formaldehído:
Es un monoaldehído que existe libremente como un gas soluble en agua en una proporción de 34
a 38% en peso, conteniendo así mismo entre un 10 y un 15% de metanol para evitar su
polimerización. Es bactericida, esporicida y virucida, pero trabaja más lentamente que el
glutaraldehído. Las soluciones de formol que contienen concentraciones de formaldehído iguales
13
o superiores al 5% constituyen un eficaz desinfectante líquido de uso muy extendido. Nivel de
acción alto (14, 19).
Mecanismo de acción:
Es un producto químico extremadamente reactivo y que interactúa con proteínas, ADN y ARN in
vitro. Esto lo hace un producto esporicida, en virtud a su habilidad de penetrar dentro del interior
de la espora de la bacteria. Debe considerarse como un producto especialmente peligroso, ya que
además de su acción irritante y sensibilizante, es un producto reconocido como cancerígeno, por
lo que la exposición a él debe reducirse al máximo (14, 19).
Glutaraldehído:
Es un dialdehído saturado, denominado como desinfectante de alto nivel y esterilizante químico,
en particular para desinfección a temperatura baja y esterilización de endoscopios y equipos
quirúrgicos.
En solución acuosa el glutaraldehído es ácido, poco estable y no posee actividad esporicida. Sin
embargo, cuando la solución es alcalina (pH 7,5 a 8,5) se activa y posee actividad esporicida (14)
Su actividad biocida se debe a la alteración del ARN, ADN y síntesis de proteínas. El
glutaraldehído alcalino al 2% es bactericida, fungicida, virucida, en cortos periodos de tiempo,
pero necesita 6 horas de contacto para destruir las esporas bacterianas. Es menos tóxico, no
corrosivo y más potente que el formaldehído (7,19).
Un ejemplo es el NEW FAGETRIALD el cuales un desinfectante que contiene glutaraldehído,
glioxal, formaldehido, cloruro de alquildimetilbendilamonio, cloruro de alquimetibencilamonio,
alcohol isopropilico, humectantes, disolventes y aromatizantes. El mecanismo de acción de este
desinfectante es amplio, actuando en la inhibiendo la síntesis de proteínas, RNA, DNA, lo que
conllevara a una inhibición en la replicación de células y posible daño en la pared celular (18).
4.5.3.2.
Compuestos de amonio cuaternario (agentes activos catiónicos)
Los compuestos de amonio cuaternario (cloruro de benzalconio, cloruro de cetilpiridino,
etilbencetonio), contienen como estructura básica al ión amonio NH4, donde cada uno de los
hidrógenos está sustituido generalmente por radicales de tipo alquil y aril y se presentan en
forma de sales
Los compuestos de amonio cuaternario son generalmente incoloros, inodoros, no irritantes y
desodorantes. También tienen una acción detergente y son buenos desinfectantes. Son
solubles en agua y alcohol. La presencia de cualquier residuo proteico anula su efectividad
(19)
- Mecanismo de acción
Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desorganizan la disposición de
las proteínas y fosfolípidos, por lo que se liberan metabólitos desde la célula, interfiriendo con
el metabolismo energético y el transporte activo.
14
- Espectro de acción
Los derivados del amonio cuaternario son agentes activos catiónicos potentes, en cuanto a su
actividad desinfectante, siendo activos para eliminar bacterias Gram positivas y Gram
negativas. Son bactericidas, fungicidas y virucidas, actuando sobre virus lipofílicos pero no
sobre los hidrófilos. No tiene acción sobre las micobacterias, ni son esporicidas. Su actividad la
desarrollan tanto en medio ácido como alcalino, aunque es más efectivo en medio alcalino (14,
19).
Un ejemplo es el NEW DESINFLOOR el cual contiene glutaraldehído, isopropil-m-cresol,
cloruro de alquildimetilbendilamonio, cloruro de alquimetibencilamonio (compuestos de amonio
cuaternario) y aromatizantes.
Los compuestos de amonio cuaternario son utilizados
principalmente ya que son efectivos, no tóxicos ni corrosivas y tienen buenas propiedades
humectantes, y tiene la facilidad de adherirse a la parte hidrofobia de la membrana de los
microorganismos, causando la desintegración de esta.
Son inactivados en pH bajo y por sales (Ca+2 y Mg+2) (7)
4.5.3.3.
Compuestos de cloro
El cloro es un potente agente germicida con amplio espectro de actividad, activo frente a
bacterias, esporas, hongos, virus y protozoos. Presenta efectos bactericidas rápidos. Es un
agente oxidante que inactivan proteínas enzimáticas. La presencia de materia orgánica
disminuye su actividad.
Es uno los desinfectantes más utilizados y comercialmente está disponible en forma líquida
(hipoclorito sódico) o sólida (hipoclorito cálcico, dicloroisocianurato sódico); la fracción activa
antibacteriana de este, se forma cuando el compuesto de cloro se añade al agua, formándose
el ácido hipocloroso, el cual posteriormente se disociara en protones y aniones de hipoclorito.
El cloro es posiblemente el biocida industrial más usado hoy en día. Se utilizó durante mucho
tiempo para la desinfección de los abastecimientos de agua domésticos y para la eliminación
del sabor y los olores del agua (14, 19).
- HIPOCLORITO: son los desinfectantes más utilizados de los derivados clorados y están
disponibles comercialmente en forma líquida (hipoclorito de sodio) o sólida (hipoclorito cálcico,
dicloroisocianurato sódico).
- Mecanismo de acción: Actúan inhibiendo las reacciones enzimáticas y desnaturalizando las
proteínas
- Espectro de acción: son bactericidas, virucidas, fungicidas y esporicidas, pero actividad
variable frente a micobacterias, según la concentración en que se use
Son extremadamente efectivos frente a todo tipo de microorganismos, pero algunas de las
desventajas que presentan es que pierden gran parte de su actividad en presencia de materia
orgánica, además que su actividad esporicida se ve afectada por el pH e incremento de acidez
(20).
15
4.5.3.4.
Detergentes anicónicos
Con grupos carboxilo como porción hidrófila:
Jabones
Saponinas
Sales biliares
Ácidos grasos disociables
Con grupos sulfato como porción hidrófila:
Dodecilsulfato sódico (SDS), también llamado laurilsulfato sódico
Sulfonato de alquilbenceno
- Mecanismo de acción
Provocan una gran disrupción de membranas con efecto de lisis. Son activos sobre
todo a pH ácido, preferentemente sobre bacterias Gram positivas y poco sobre
bacterias Gram negativas por tener una barrera lipopolisacárida en la membrana
externa (14).
Un ejemplo es TEGO 51el cual es un desinfectante compuesto por aminoácidos de
alto peso molecular, tensoactivo. Es un anfótericida debido a que contiene grupos
catiónicos y aniónicos, soluble en agua y se utiliza una solución desinfectante caliente
a 50°C. Su mecanismo de acción radica en la adsorción de las paredes celulares,
también atraviesa la pared celular cargada negativamente reduciendo pérdida de
potasio y generando una desnaturalización de proteínas (21).
Por último cabe mencionar que es importante la selección adecuada del desinfectante
y así mismo la verificación de su efectividad sobre una superficie, realizando
procedimientos como por ejemplo: rotación de desinfectantes, y otros procesos que
garanticen la eficacia de estos (22) uno de estos procedimientos es la validación de
desinfectantes
Mediante la validación se va a establecer, por medio de estudios de laboratorio, que
las características de desempeño del método cumplen con los requisitos para las
aplicaciones analíticas previstas. La validación define características como precisión,
especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, robustez,
solides (23).
4.6. Factores Que Afectan La Efectividad De Los Antisépticos Y Desinfectantes
•
Concentración del agente y tiempo de actuación : existe una estrecha relación entre la
concentración del agente y el tiempo necesario para matar una determinada fracción de la
población bacteriana, debido a que no todas las bacterias mueren simultáneamente, ni siquiera
cuando se aplica un exceso del agente (14).
•
pH: afecta tanto la carga superficial neta de la bacteria como el grado de ionización del agente.
Las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a través de las membranas
biológicas y por lo tanto son más efectivos. Los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a pH
ácidos; los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos (14).
16
•
Temperatura: normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los
desinfectantes. Para muchos agentes el aumento en 10º C supone duplicar la tasa de muerte (14,
15).
•
Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población microbiana:
según la especie, fase de cultivo, presencia de cápsula o de esporas y número de
microorganismos se afecta la potencia. El bacilo tuberculoso suele resistir a los hipocloritos mejor
que otras bacterias. La presencia de cápsula o esporas suelen conferir más resistencia (14).
Presencia de materiales extraños: la presencia de materia orgánica como sangre, suero o pus
afecta negativamente la potencia de los antisépticos y desinfectantes de tipo oxidantes, como los
hipocloritos y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto de hacerlos inactivos en cuanto
a su poder desinfectante y/o esterilizante (14).
4.7. Resistencia De Los Microorganismos A Los Desinfectantes
Resistencia extrínseca: conseguida por mutación o adquisición de plásmidos (autorreplicación,
ADN extracromosómico) o transposones (cromosoma lo integrado en plásmidos, cassettes de
ADN transmisibles).
Los genes de resistencia naturales en plásmidos, se originan como mutaciones puntuales en los
genes blanco (sitios de inserción de los genes de resistencia) de bacterias susceptibles y también
de genes que les proveen protección contra otras bacterias (16).
Resistencia intrínseca: puede ser una propiedad natural de un organismo (intrínseca), se ha
demostrado para bacterias Gram negativas, esporas bacterianas, micobacterias y bajo ciertas
condiciones en especies del género Staphylococcus (16, 17).
4.8. Mecanismos De Acción De Los Desinfectantes Sobre Los Microorganismos
Su modo de acción se lleva a cabo por distintas etapas:
Fijación: es un fenómeno de naturaleza química eléctrica. Esta etapa ocurre en la pared
bacteriana y varía en función de la concentración y movimiento.
Penetración: los desinfectantes atraviesan la pared bacteriana y la membrana celular.
Acción: esta etapa se realiza en dos niveles: el primero sobre la membrana citoplasmática, cuya
alteración provoca la desorganización del metabolismo, la fuga de sustancias, la degradación
celular y finalmente la muerte celular. El segundo nivel se oxidan sustancias y hay una
desnaturalización de proteínas con daños en el metabolismo celular (10).
17
5. METODOLOGÍA
5.1. Diseño De La Investigación
Se realizó una investigación de tipo experimental, mediante una validación concurrente, en donde se
evaluaron cuatro tipos de desinfectantes a diferentes concentraciones y tiempos de contacto; con el
fin de verificar si estos agentes químicos siguen teniendo un porcentaje de remoción mayor al 90%, y
a partir de esto ajustar el programa de limpieza y desinfección del laboratorio de indicadores de
calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana, adicionalmente diseñar la rotación de
los desinfectantes.
5.2. Lugar de muestreo
El lugar de muestreo fue el laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia
Universidad Javeriana.
Laboratorios
Área de bacterias
Área de virus
Área de Parásitos
Área de Algas:
Área de Cultivo y mantenimiento
Área de Eisenia
Aéreas de muestreo
Mesón 1: zona de siembra
Piso 1: zona debajo del mesón de siembra
Método por sedimentación:
Zona de la puerta
Zona rejilla de aire
Mesón 1: zona de siembra
Piso 1: zona debajo del mesón de siembra
Método por sedimentación:
Zona de la puerta
Zona rejilla de aire
Mesón 1: zona de siembra
Piso 1: zona debajo del mesón de siembra
Método por sedimentación:
Zona de la puerta
Zona rejilla de aire
Mesón 1: zona de siembra
Piso 1: zona debajo del mesón de siembra
Método por sedimentación:
Zona de la puerta
Zona rejilla de aire
Mesón 1:
Piso 1
Método por sedimentación:
Zona de la puerta
Mesón 1:
Mesón 2
Piso 1 debajo del mesón 1
Piso 2 debajo del mesón 2
Método por sedimentación:
Zona de la puerta
5.3. Población de estudio
Los desinfectantes de amplio espectro llamados FAGETRIALD, DESINFLOOR, HIPOCLORITO DE
SODIO y TEGO 51 evaluados a diferentes concentraciones (0.25% la mitad recomendada por el
fabricante, 0.50%la recomendada por el fabricante y 1% el doble de la recomendada por el fabricante)
y distintos tiempos de contacto (5,10, y 15 minutos para células vegetativas y 2,4,6 horas para
microorganismos esporulados), utilizados en el proceso de limpieza y desinfección de ambientes y
superficies del laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad
Javeriana, y los microorganismos Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp.,
Staphylococcus aureus, Penicillum sp. y Aspergillus flavus tanto cepas nativas como de referencia.
18
5.4. Número de muestras
El número de muestras (n) para cada lugar de muestreo fue 14, las muestras se tomaron antes y
después del proceso de limpieza y desinfección. Este número de muestra fue obtenido teniendo en
cuenta un error del 0.05 utilizando el programa TAMAMU versión 1.
5.5. Puntos de muestreo y toma de muestras
Los puntos de muestreo fueron seleccionados teniendo en cuenta las áreas donde se realizan la
mayoría de procedimientos, análisis y ensayos con muestras que involucran la presencia de
microorganismos.
La toma de muestra se realizó en los 14 puntos seleccionados, antes y después del proceso de
limpieza y desinfección, para determinar la carga microbiana presente en las superficies y áreas de
trabajo, utilizando el método horizontal de técnicas de muestreo de superficies usando cajas de
contacto y escobillón (24); Y el muestreo de ambientes mediante la técnica de sedimentación (25)en
agar Nutritivo para mesófilos aerobios y Saboraud para hongos y levaduras.
5.6. Variables De Estudio
Variable dependiente:
•
Porcentaje de inhibición de cada concentración de los diferentes desinfectantes evaluados.
•
Porcentaje de crecimiento que presenten los microorganismos al contacto con cada desinfectante.
Variable independiente:
Los diferentes tiempos de exposición 5, 10 y 15 minutos para células vegetativas y 2,4 y 6 horas
para microorganismos esporulados.
Las Diferentes concentraciones a las cuales se evaluaron los diferentes desinfectantes (0.25%,
0.50% y 1%).
19
5.7. Análisis De La Información
Modelo estadístico
Los resultados que se obtuvieron a través del ensayo experimental se analizaron por medio de un estudio
descriptivo, a través de histogramas y medidas estadísticas para determinar el comportamiento de cada
microorganismo, al momento de ser expuestos a los diferentes desinfectantes utilizados, su
comportamiento y a que concentración es más efectivo, en los diferentes tiempos de exposición.
Los datos obtenidos durante el estudio se analizaron estadísticamente mediante la prueba de Kruskal –
Wallis, con un nivel de confianza del 95%, determinando así la eficacia de las diferentes concentraciones
de los desinfectantes frente a los microorganismos evaluados.
Se realizaron tres replicas para la técnica empleada por cada microorganismo enfrentado al desinfectante
para que se tenga una muestra estadísticamente representativa
Las hipótesis nula y alterna de esta prueba son:
Para este caso se usara la prueba para una proporción con
y
.
Se fijó el nivel de significancia del 5% y la estadística de prueba es:
Para este caso el estadístico de prueba cayó en la región de rechazo ya que 2.507 es mayor que 1.64 lo
que significa que se rechaza la hipótesis nula la cual indica que la proporción promedio de inhibición es
menor a 90%, aceptando la hipótesis alterna, evidenciando que le porcentaje de inhibición es mayor al
90%.
20
5.8. MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS
Procedimiento de muestreo y obtención de microorganismos: Se realizó mediante dos técnicas
para el aislamiento de microorganismos:
5.8.1. Método horizontal de técnicas de muestreo de superficies usando cajas de contacto y
método de escobillón: para la toma de muestra de superficies se utilizó una plantilla de cartón
debidamente esterilizada con un área de 20 cm², la cual se colocó sobre la superficie a analizar
realizando la toma en cinco puntos, lo que correspondería a un área total de 100cm² con el fin de
obtener una muestra representativa. Con el escobillón previamente humedecido con agua peptonada,
se realizó un frotis de forma horizontal y vertical por toda la superficie, cubriendo el área de la plantilla.
Este procedimiento se repitió en cada punto de muestreo. Posteriormente el escobillón se depositó en
el tubo de agua peptonada y se realizó un recuento microbiano estimado mediante la siembra en
profundidad
de 1 ml en agar nutritivo para mesófilos aerobios, agar Mac Conckey para
enterobacterias y agar Sabouraud para levaduras y hongos. Se incubaron a 37°C durante 24 horas
las cajas de agar Mac Conckey y Nutritivo, las cajas de agar Sabouraud se incubaron a 24°C durante
7 días. (24, 25).
5.8.2. Técnica de Sedimentación en placa: es un método utilizado para la determinación de
microorganismos presentes en el ambiente. Se utilizaron cajas de petri con agar nutritivo para el
aislamiento de mesófilos y agar Sabouraud para el aislamiento de hongos y levaduras, estas cajas se
situaron en los 14 puntos a muestrear, las cuales fueron expuestas al ambiente, dejando circular el
aire sobre cada medio de cultivo durante 15 minutos. Pasado el tiempo se taparon las cajas de petri y
se llevaron a incubar; la de agar Nutritivo a 37°C durante 24 horas y la de agar Sabouraud a 24°C
durante 7 días (25)
5.8.3. Identificación de microorganismos:se realizó un análisis de la carga microbiana presente en
las áreas y superficies del laboratorio; a partir de esto se escogieron las colonias que presentaron
mayor incidencia antes del proceso de limpieza y desinfección con hipoclorito de sodio; cada
microorganismo aislado fue sometido a caracterización microscópica (basadas en pruebas de tinción
de Gram para bacterias y azul de lactofenol en hongos) e identificados mediante pruebas bioquímicas.
Conjuntamente a estos microorganismos se les realizó pruebas bioquímicas primarias, como es el
caso de oxidasa, catalasa. Y pruebas bioquímicas imvic, utilizadas para la identificación de
enterobacterias TSI, SIM, LIA, Citrato, Urea.
También se utilizaron medios selectivos como agar Chromocult para Escherichiacoli, King B para
diferenciar especies de Pseudomonas sp, agar Sangre para la identificación de microorganismos
Gram positivos, Bacillus subtillis y Staphylococcus aureus y Baird Parker, medio selectivo para la
identificación de Staphylococcus aureus.
5.9. Técnicas para la validación de los desinfectantes
5.9.1. Preparación del inoculo – escala de Mac Farland: se preparó una suspensión de cada
microorganismo a evaluar, en solución salina, con el fin de comparar su densidad contra el tubo No 1
8
del patrón de la escala de Mc Farland; obteniendo una concentración equivalente a 3 x 10 UFC/ml,
cumpliendo de esta forma con las exigencias de la norma 2455 del ICONTEC (12). Posteriormente se
inoculo 0.5 ml de la solución salina con el microorganismo inmerso, en 4.5 ml de caldo nutritivo y se
llevó a incubar a 35 °C. Se realizó el mismo procedimiento con las cepas de referencia (26)
5.9.2.Técnica del Coeficiente Fenólico (modificada usando otros agentes químicos):se preparó
una serie de tubos con 5 ml de las diferentes concentraciones del desinfectante NEW DESINFLOOR,
NEW FAGETRIALD, TEGO 51 e HIPOCLORITO DE SODIO, al 0.25 % correspondiente a la mitad de
la concentración recomendada por el fabricante, 0.5 % la recomendada por el fabricante y 1.0% el
doble de la recomendada por el fabricante, a cada una de estas concentraciones, fueron inoculadas
21
con 0,5 ml de un cultivo de caldo de los microorganismos de prueba (cepas nativas y cepas del
cepario de la Pontificia Universidad Javeriana).
Se sacó alícuotas a los 5, 10, 15 minutos (Escherichia coli, Pseudomonas sp, Staphylococcus aureus)
y 2, 4 y 6 horas (Bacillus subtillis) para ser sembradas en un agar nutritivo.
Como prueba adicional los tubos inoculados se incubaron durante 24 a 48 horas para observar el
crecimiento del microorganismo (aparición de turbidez) (27).
5.5.3. Técnica de estrías: a partir de los tubos que contenían el microorganismo y el desinfectante
en las distintas concentraciones, se tomo con un asa muestra de cada concentración para ser
sembrada por medio de la técnica de estrías,teniendo en cuenta los tiempos de exposición 5, 10,15
minutos y 2, 4, 6 horas(para microorganismos esporulados). Se realizaron siembras con 4 estrías
sobre la superficie de los agares en cada cuadrante (la caja se dividió en 4 cuadrantes 1: control
positivo, cuadrante 2: 5 min y 2 horas cuadrante 3: 10 min, 4 horas y cuadrante 4: 15 minutos, 6
horas), luego se llevaron a incubar las cajas a 35°C por 24 horas.
La lectura de las cajas incubadas se realizó de la siguiente manera: se observó el número de estrías
que presentaron crecimiento del microorganismo, teniendo en cuenta que cada una de ellas tiene un
valor del 25% sobre un total de 100% equivalente a las cuatro estrías del cuadrante. Se consideró que
una estría es válida al presentar un crecimiento mayor o igual al 50% de su longitud. Finalmente se
sumaron los valores de las estrías, este valor corresponde al porcentaje de crecimiento del
microorganismo confrontado con la solución evaluada. Dichos resultados se restaron al 100 %, que es
el equivalente a la totalidad de las estrías, esto con el fin de determinar el porcentaje de inhibición
(28).
5.5.4. Técnica de dilución en agar para hongos: por medio de la técnica de dilución en agar, las
diferentes concentraciones de los desinfectantes a evaluar (0.25%, 0.50% y 1%) fueron incorporados
al medio de cultivo antes de su solidificación. (PAHO). Una vez solidificado el medio, se realizó la
siembra del microorganismo por punción central Penicillium sp y Aspergillus niger y se incubo a 24 °C
durante 7 días.
La lectura se realizó determinando la concentración mínima inhibitoria, mediante la medición del
crecimiento radial de los microorganismos Penicillum sp. yAspergillus flavus. (29).
22
6. RESULTADOS
6.1. Aislamiento e identificación
Para conocer la carga microbiana presente en el laboratorio se realizó un análisis de superficies y áreas
de trabajo antes y después del proceso de limpieza desinfección. Mediante una descripción
macroscópica y microscópica se observó la presencia de bacterias Gram negativas, cocos Gram positivos
y hongos.
Medio de cultivo MAC CONKEY
Escherichiacoli
Bacillos Gram negativos
Pseudomonassp.
Bacilos Gram negativos
Figura No. 1 Aislamiento e identificación de bacterias Gram negativas
Agar sangre
Staphylococcusaureus
Hemolisis beta
Bacillus subtilis
Hemolisis beta
Figura 2. Identificación de bacterias mesófilas Gram positivas
23
Características macroscópicas
Penicillumsp
Colonias pulverulentas centro verde debido a la
producción de esporas y borde blanco regular,
reverso amarillo pálido
Características microscópicas
Penicillumsp.
Hifas hialinas septadas, conidios esféricos,
fiálides ramificadas
Características macroscópicas
Aspergillus flavus
Colonias aterciopeladas, en un cultivo joven
presentan un color blanco y en el transcurso se
vuelve verde
Características microscópicas
Aspergillus flavus
Hifas hialinas, septadas conidióforos largos que
originan en la parte basal donde ubican las hifas
y termina la formación de la vesícula en el ápice
Figuras No. 3 identificaciones de hongos mediante clave taxonómica
24
6.2. Resultados De La Validación De Los Cuatro Desinfectantes
Tabla No1.Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al desinfectante
de alto nivel NEW FAGETRIALD teniendo en cuenta las concentraciones y tiempos de acción determinados .
DESINFECTANTE FAGETRIALD
0.25%
0.50%
1%
MICROORGANISMOS VEGETATIVOS
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
Escherichiacoli cepa nativa
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Escherichiacoli cepa de referencia
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa nativa
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa de referencia
99.9%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Staphylococcusaureus cepa nativa
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Staphylococcusaureuscepa de referencia
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
0.25%
0.50%
1%
MICROORGANISMOS ESPORULADOS
2h
4h
6h
2h
4h
6h
2h
4h
6h
Bacillussubtillis cepa nativa
0%
12.5%
20.8%
6.5%
22.8%
32.5%
12.5%
38.5%
59.9%
Bacillussubtillis cepa de referencia
0%
18.5%
23.27
6.5%
34.3%
42.2%
23.4%
45.6%
68.5%
Tabla No2.Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al desinfectante
de alto nivel NEW DESINFLOOR teniendo en cuenta las concentraciones y tiempos de acción determinados.
DESINFECTANTE DESINFLOOR
MICROORGANISMOS VEGETATIVOS
0.25%
0.50%
1%
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
Escherichiacoli cepa nativa
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Escherichiacoli cepa de referencia
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa nativa
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa de referencia
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Staphylococcusaureus cepa nativa
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Staphylococcusaureuscepa de referencia
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
MICROORGANISMOS ESPORULADOS
0.25%
0.50%
1%
2h
4h
6h
2h
4h
6h
2h
4h
6h
Bacillussubtillis cepa nativa
0%
0%
0%
0%
0.54%
1.083%
3.25%
12.5%
48%
Bacillussubtillis cepa de referencia
0%
0%
0%
0%
1.083%
3.25%
6.5%
18.5%
50%
25
Tabla No3.Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al desinfectante
TEGO 51 teniendo en cuenta las concentraciones y tiempos de acción determinados.
DESINFECTANTE TEGO 51
0.25%
0.50%
1%
MICROORGANISMOS VEGETATIVOS
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
Escherichiacoli cepa nativa
3.25%
93.5%
100%
73.4%
100%
100%
100%
100%
100%
98.4%
100%
100%
Escherichiacoli cepa de referencia
6.5%
96.8%
100%
100%
0%
0%
6.5%
3.5%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa de referencia
0%
0%
12.5%
25%
100%
100%
Staphylococcusaureus cepa nativa
0%
0%
0%
0%
6.5%
25%
12.5%
32.5%
50%
12.5%
37.5%
72.85
50%
93.7%
100%
0%
MICROORGANISMOS ESPORULADOS
Bacillussubtillis cepa de referencia
25%
0.25%
2h
Bacillussubtillis cepa nativa
0%
0%
0%
4h
0%
0%
100%
0.50%
6h
0%
0%
26
2h
4h
100%
100%
Pseudomonassp. cepa nativa
Staphylococcusaureuscepa de referencia
96.7%
100%
100%
100%
100%
1%
6h
2h
4h
6h
0%
0%
0%
0%
6.5%
32.5%
0%
0%
0%
1.63
8.5%
39.5%
Figura No. 4 Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR y TEGO 51frente a
Escherichia coli cepa nativa y de referencia en las diferentes concentraciones y tiempos de exposición
Figura No. 5Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR y TEGO 51,frente a
Pseudomonas sp. nativa y de referencia en las diferentes concentraciones y tiempos de exposición.
27
Figura No. 6 Grafica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOR y TEGO 51, frente a
Staphylococcus aureus nativa y de referencia
Figura No. 7 Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOR y TEGO 51, frente a
Bacillus subtilis nativa y de referencia.
28
Tabla No4.Resultado del promedio de inhibición de los diferentes microorganismos frente al desinfectante
HIPOCLORITO DE SODIO teniendo en cuenta las concentraciones y tiempos de acción determinados.
DESINFECTANTE HIPOCLORITO DE SODIO
MICROORGANISMOS VEGETATIVOS
3.125%
6.25%
12.5%
5 min
10 min
15
min
5 min
10 min
15 min
5 min
10 min
15 min
Escherichiacoli cepa nativa
98.9%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Escherichiacoli cepa de referencia
98.9%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa nativa
93.7%
98.9%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Pseudomonassp. cepa de referencia
94%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Staphylococcusaureus cepa nativa
87.5%
100%
100%
98.9%
100%
100%
100%
100%
100%
Staphylococcusaureuscepa de referencia
89.5%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
MICROORGANISMOS ESPORULADOS
3.125%
6.25%
12.5%
2h
4h
6h
2h
4h
6h
2h
4h
6h
Bacillus subtilliscepanativa
12.5%
25%
50%
75%
98.9%
100%
99.5%
100%
100%
Bacillussubtillis cepa de referencia
12.5%
50%
75%
75%
98%
100%
100%
100%
100%
29
Figura No. 8 Gráfica integrada del desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO, frente a Escherichia coli, Pseudomonas
sp y Staphylococcus aureus.
Figura No. 9Gráfica integrada del porcentaje de inhibición de Bacillus subtilis cepa de referencia y cepa nativa frente
al desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO.
30
Tabla No. 5. Promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante NEW FAGETRIALD
con las diferentes concentraciones.
DESINFECTANTE FAGETRIALD
Concentraciones
Hongos
0.25%
0.50%
Aspergillus flavus cepa nativa
60%
72%
Aspergillus flavus cepa de referencia
66%
77%
Penicillumsp. cepa nativa
78%
81%
Penicillumsp. cepa de referencia
81%
87%
1%
90%
91%
89.5%
93%
Tabla No. 6.promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante NEW DESINFLOOR
con las diferentes concentraciones.
DESINFECTANTE DESINFLOOR
Concentraciones
Hongos
0.25%
0.50%
Aspergillus flavus cepa nativa
75.5%
84.4%
Aspergillus flavus cepa de referencia
77%
85.5%
Penicillumsp. cepa nativa
74%
82%
Penicillumsp. cepa de referencia
77%
89%
1%
90.4%
91%
92%
93%
Tabla No. 7. Promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante TEGO 51 con las
diferentes concentraciones.
DESINFECTANTE TEGO 51
Concentraciones
Hongos
0.25%
Aspergillus flavus cepa nativa
62.2%
Aspergillus flavus cepa de referencia
64.4%
Penicillumsp. cepa nativa
81%
Penicillumsp. cepa de referencia
85%
0.50%
66.6%
72.2%
85%
87%
1%
78.8%
81%
91%
92%
Tabla No. 8.promedio del porcentaje de inhibición de los hongos, frente al desinfectante TEGO 51 con las
diferentes concentraciones.
DESINFECTANTE HIPOCLORITO DE SODIO
Concentraciones
Hongos
3.123%
6.25%
Aspergillus flavus cepa nativa
43%
73%
Aspergillus flavus cepa de referencia
50%
78%
Penicillumsp. cepa nativa
79%
84.5%
Penicillumsp. cepa de referencia
80%
86%
31
12.5%
89%
90%
92.3%
92.5%
Figura No. 10 Gráfica integrada de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOR y TEGO 51, frente a Aspergillus
flavus cepa nativa y de referencia y Penicillumsp. cepa nativa cepa de referencia
Figura No. 11 Gráfica integrada de los desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO, frente a Aspergillus flavus cepa nativa y de
referencia y Penicillum sp. cepa nativa cepa de referencia.
32
6.3. ANALISIS ESTADÍSTICOS DE LOS RESULTADOS
Para el análisis de los resultados obtenidos en este estudio, fue necesario conocer la naturaleza de los
datos, utilizando la prueba de deShapiro-Wilk W y D, Cramer-von Mises y Anderson-Darling., las cuales
determinan si los datos tienen una distribución normal o no; así mismo se realizó el test de Levene Y de
Bartlett para comprobar la homoceasticidad de los datos. Estas pruebas demostraron que los datos no
tienen una distribución normal, por lo cual fue necesario aplicar pruebas no paramétricas, con el fin de
verificar, que existe una diferencia significativa en el comportamiento de los desinfectantes entre sí,
utilizados en el laboratorio de indicadores de calidad de Aguas y Lodos de la Pontificia Universidad
Javeriana.
Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de Kruskal-Wallis, utilizada para comparar
tres o más tratamientos.
Como el valor p dio 0.000 menor que 0.05, se rechaza la hipótesis nula y se concluye que los
desinfectantes tuvieron un comportamiento diferente en cuanto a efectividad, es decir que alguno de los
tres desinfectantes TEGO 51, NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR, presento una diferencia
estadísticamente significativa respecto a los otros. Para saber cuáles fueron las diferencias significativas y
cuál de los desinfectantes es el menos efectivo o más efectivo se procedió a hacer test de
comparaciones múltiples.
Se estudiaron tres tipos de test, el de Tukey basado en la realización de combinaciones posibles entre los
desinfectantes, con el fin de que estos agentes químicos puedan ser comparados entre sí. Este test
proporciona un intervalo de confianza que no está dentro del cero, representando de esta manera, que
esa diferencia entre los promedios de inhibición es significativa. En la tabla 7 se muestra que las
comparaciones entre los desinfectantes NEW DESINFLOOR – TEGO 51, NEW FAGETRIALD- TEGO 51,
TEGO 51 – DESINFLOR, TEGO 51- NEWFAGETRIALD son significativas, en cambio las comparaciones
entre los desinfectantes NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR no lo fueron, frente a los
microorganismos Escherichia coli, Pseudomonas sp. YStaphylococus aureus..
Desinfectantes
New Desinfloor - New Fagetriald
New Desinfloor – Tego 51
New Desinfloor - New Fagetriald
New Fagetriald - Tego 51
Tego 51 – New Desinfloor
Tego 51 – New Fagetriald
Diferencia entre medias
0.01852
41.78889
-0.01852
41.77037
-41.78889
-41.77037
Límites de confianza del 95%
-0.05886
0.09589
41.71152
41.86626 ***
-0.09589
0.05886
41.69300
41.84774 ***
-41.86626
-41.71152 ***
-41.84774
-41.69300 ***
Tabla 8. Rango estudentizado de Tukey (HSD) para inhibición
Las comparaciones importantes del nivel 0.05 están indicadas por ***.
El test t de Dunnet muestra que la única diferencia significativa en el porcentaje promedio de inhibición se
dio con el desinfectante TEGO 51, ya que los límites del intervalo de confianza son negativo.Se puede
concluir que el desinfectante NEW FAGETRIALD es mejor.
Comparación
Diferencia entre medias Límites de confianza del 95%
New Desinfloor - New Fagetriald
0.01852
-0.05886
0.09589
Tego 51 – New Fagetriald
-41.7703
-41.8434
-41.69736 ***
Tabla 9. Tests t de Dunnett para INHIBICIÓN
33
También se aplicó el test t o método de la diferencia mínima significativa sugerido por Fisher en 1935,
más conocido como LSD que genera agrupamientos indicados por una letra. Así, este test indica que el
desinfectante NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR, no se diferencian entre ellos pero si con el
TEGO 51.
T Agrupamiento Media
N
Desinfectante
A
100
162 New Desinfloor
A
99.98 162 New Fagetriald
B
58.21 162
Tego 51
Tabla 10. tTests (LSD) para INHIBICIÓN
Finalmente se aplicaron los test de Tukey, Duncan y Bonferroni que generaron la misma conclusión:
existe una diferencia significativa entre los desinfectantes NEW FAGETRIALD y TEGO 51, así mismo
entre los desinfectantes NEW DESINFLOOR y TEGO 51 frente a los microorganismos evaluados
Pseudomonas sp cepa de referencia y cepa nativa, Escherichia coli cepa de referencia y cepa nativa y
Staphylococcus aureus cepa de referencia y cepa nativa. No existe una diferencia estadísticamente
significativa entre el NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR.
En hongos se realizaron las mismas pruebas descritas anteriormente en microorganismos vegetativos
con el fin de determinar la normalidad de los datos. Se concluyó que los datos no presentaron una
distribución normal, por lo cual se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para datos no paramétricos.
Como el valor p es 0.062 mayor que 0.05, no se rechaza la hipótesis nula y se concluye que los
métodos son todos iguales.
No se pudo realizar una comparación del HIPOCLORITO DE SODIO con los demás desinfectantes, ya
que las concentraciones utilizadas en este agente químico eran diferentes a las presentadas por los
desinfectantes TEGO 51, NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR.
En cuanto a Bacillus subtilis, no se pudo realizar una comparación de porcentaje de inhibición con los
demás microorganismos Pseudomonas sp, Escherichia coli y Staphylococcus aureus, frente a los
desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR y TEGO 51, ya que este microorganismo
esporulado presentaba tiempos de exposición distintos (2,4 y6 horas) los cuales no son comparables con
los otros tiempos (5,10 y 15 minutos) utilizados con los microorganismos vegetativos.
34
7 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Después de haber realizado el muestreo de ambientes y superficies en el laboratorio de
indicadores de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana se encontraron
microorganismos como Escherichia coli una enterobacteria que habita generalmente en
intestinos de animales, aguas negras y es un organismo ubicuo. Esta bacteria fue aislada
de mesones y pisos de las áreas de bacterias, virus (en el laboratorio 235) y área de Eisenia
(en el laboratorio de bioensayos 237), debido a que el personal del laboratorio manipula
muestras que contienen la presencia de estos y anteriormente en el área de Esenia existía un
baño donde posiblemente puede estar presente. Escherichia coli en recuentos elevados es
patógeno para el hombre y así mismo puede llegar a interferir en los análisis y ensayos que se
realizan en el laboratorio si no se cuenta con una adecuada limpieza y desinfección. Otro
microorganismo aislado e identificado fue Pseudomonas sp un microorganismo encontrado en
suelos, aguas y de ahí pasan a plantas o animales, en el hombre son oportunistas. Esta bacteria
se encontró en el área de parásitos y área de lavado, la presencia de este microorganismo en
estas superficies puede deberse a que anteriormente en el área de parásitos existía un cepario
donde posiblemente habitaba este microorganismo. El microorganismo Staphylococcus aureus
es el patógeno humano más importante entre los Staphylococos causante de enfermedades
nosocomiales, se encuentran en ambientes extremos y en las narinas anteriores en los adultos
y coloniza el periné, las axilas y los pliegues cutáneos; es por esto que se debe controlar la
presencia de esta bacteria aislada en el laboratorio, con el fin de evitar la proliferación y el
contagio entre humanos. Otro microorganismo aislado e identificado en el área de bacterias,
virus, parásitos y en el laboratorio de bioensayos (en el laboratorio 237) fue Bacillus subtilis,
microorganismo formador de espora hallado ampliamente en la naturaleza. Este microorganismo
no interfiere en los análisis, ensayos y estudios que se realizan el laboratorio de indicadores de
calidad de aguas y lodos de la Pontificia universidad Javeriana ya que esta bacteria es común
del ambiente y no es un microorganismo patógeno para el hombre. Aspergillus flavus y
Penicillum sp son microorganismos ampliamente distribuidos en la naturaleza, los cuales fueron
aislados del ambiente del laboratorio.
Una vez realizada la identificación de la carga microbiana presente en el laboratorio se
validaron de manera concurrente los cuatro desinfectantes utilizados en el laboratorio de
indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana; en donde NEW
FAGETRIALD presentó un porcentaje de inhibición mayor al 90%, utilizando la mínima
concentración y el menor tiempo de exposición, frente a los microorganismos Escherichia coli,
Pseudomonas sp. y Staphylococcus aureus.
La efectividad de un desinfectante está relacionada por su concentración y tiempo de acción,
siendo esta la variable mas importante en el proceso de desinfección, ya que se ha observado
que para una concentración dada de desinfectante la mortalidad aumenta cuanto mayor sea el
tiempo de exposición, pero en este caso ni el tiempo (5,10 y 15 minutos) ni la concentración
(0.25%, 0.50% y 1%) mostraron una diferencia significativa (p mayor a 0.05) en la inhibición de
los microorganismos. Este resultado se debió fundamentalmente a la acción bactericida del
desinfectante desarrollada por sus cuatro principios activos que logran inhibir gran parte de la
35
carga microbiana presente en las superficie, el más importante es el glutaraldehido donde su
mecanismo de acción implica una fuerte asociación con las capas externas de las células
bacterianas, específicamente con aminas no protonadas de la superficie celular, efecto que
podría explicar su acción inhibitoria en el transporte y en los sistemas enzimáticos, donde no hay
acceso de sustrato a las enzimas. Se ha demostrado en estudios realizados una fuerte unión del
glutaraldehído a las capas externas de organismos como E.coli y Staphylococcus aureus,
causando la inhibición en el transporte de sustancias en bacterias Gram positivas y en bacterias
Gram negativas la inhibición de la actividad deshidrogenasa y enzimas periplásmicas como
también la inhibición de ARN, ADN y síntesis de proteínas (13). Por otro lado el siguiente
principio activo es el formaldehido que actúa desnaturalizando las proteínas de la células y
sobre los ácidos nucleicos actúa por alquilación (14). Finalmente el didecildimetilamonio es
compuesto de amonio cuaternario que actúa lesionando la membrana celular debido a que
desorganiza la disposición de las proteínas y fosfolípidos, por lo que se liberan metabolitos
desde la célula, interfiriendo con el metabolismo energético y el transporte activo (14). Cabe
mencionar que los componentes de la pared celular de los microorganismos evaluados, son
importantes respecto a la capacidad que tiene el desinfectante de penetrar más fácilmente en
esta. Por ejemplo la pared de Staphylococcus aureus se compone esencialmente de ácido
peptidoglicano y teicoico, ninguno de estos componentes pareció actuar como una barrera
efectiva a la entrada del desinfectante de alto peso molecular logrando atravesar fácilmente la
pared celular de este microorganismo.
La reducción de la población en promedio fue de 100% en las diferentes concentraciones
0.25%, 0.50% y 1% frente a los microorganismos vegetativos Pseudomonas sp, Staphylococcus
aureus y Escherichia coli; con estos resultados se puede determinar que el desinfectante de alto
nivel NEW FAGETRIALD a base de formaldehido y glutaraldehido es efectivo en un 100%
cuando se emplea la mitad de la concentración recomendada por el fabricante 0.25% en el
menor tiempo de exposición obteniendo resultados satisfactorios y similares a los presentados
en estudios anteriores realizados en el laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de
la Pontificia Universidad Javeriana (Cufiño, 2009).
En lo referente a Bacillus subtiis cepa de referencia No. de lote 50035 y Bacillus subtilis cepa
nativa frente al agente químico NEW FAGETRIALD, es necesario aumentar el tiempo de
exposición ya que este tipo de microorganismo es formador de esporas y es por esto que los
tiempos correspondieron a 2, 4 y 6 horas, a diferencia de los tiempos establecidos para los
microorganismos vegetativos. Las esporas presentan grandes cantidades de proteinas de bajo
peso molecular, una corteza compuesta de peptidoglicano y una lactama de acido murámico, y
capas que contienes proteínas con una fracción alcali-soluble, así mismo su núcleo además de
contener una gran cantidad de dipicolinato de calcio, se encuentra parcialmente deshidratado, lo
que le confiere una termoresistencia y resistencia frente a agentes químicos (30).
La resistencia de Bacillus subtilis a los desinfectantes se atribuye a que los microorganismos
esporulados forman una barrera de entrada frente a los agentes antimicrobianos ya que las
membranas que rodean al núcleo de la endospora actúan como factor adicional al limitar la
penetración del agente químico. Durante la esporulación, la célula se convierte menos
susceptible al glutaraldehído, y este compuesto ejerce un efecto temprano en el proceso de
36
germinación. (30).
El comportamiento de este microorganismo fue muy variado en las diferentes concentraciones y
tiempos de exposición. El mayor porcentaje de inhibición presentado fue del 60% para la cepa
nativa y 69% de inhibición para la cepa de referencia en un tiempo de exposición de 6 horas, en
la concentración 1%, lo que difiere respecto a los resultados obtenidos en estudios anteriores
(CUFIÑO 2009) ya que este agente químico utilizado en el laboratorio de indicadores de calidad
de aguas y lodos de la Pontificia Universidad Javeriana, presento un porcentaje de inhibición a
las 6 horas del 100 %. Esta diferencia de resultados posiblemente se dio ya que durante el
presente estudio a diferencia del anterior, realizado en el año 2009, el pH de este agente
químico NEW FAGETRIALD fue acido (4), y de acuerdo a referencia bibliográfica se ha
demostrado que el glutaraldehído en soluciones ácidas es poco estable y no posee una
actividad esporicida (30), a diferencia de cuando la solución es alcalina (pH 7,5 a 8,5) (31), este
fenómeno es debido a que a pH acido no hay una penetración de la espora y este compuesto
permanece solo en la superficie celular, lo cual lo hace menos efectivo mientras que el
glutaraldehído a pH alcalino penetra más profundamente en las capas de la espora (30, 14). Por
otro lado el formaldehido, compuesto activo del desinfectante y producto químico
extremadamente reactivo, depende del pH para su actividad esporicida ya que este compuesto
actúa por desnaturalización sobre las proteínas y por alquilación sobre los ácidos nucleícos. En
este último proceso ocurre una hidroximetilación con los nucleótidos receptivos, acción que
dependerá del pH, llevándose a cabo mejor a un pH alcalino que a un pH ácido (14).
El desinfectante de alto nivel NEW DESINFLOOR presentó un porcentaje de inhibición del 100%
frente al crecimiento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonassp, en las
diferentes concentraciones evaluadas 0.25, 0.50% y 1%, y a los diferentes tiempos de contacto
5, 10 y 15 minutos. Este desinfectante llego a inhibir en la misma proporción que NEW
FAGETRIALD el crecimiento de los microorganismos debido a que este producto se encuentra
formulado con glutaraldehido un derivado fenólico, un amonio cuaternario y tensoactivos. Su
acción bactericida es desarrollada por sus tres principios activos, los dos primeros, de estructura
fenólica actúan sobre todo tipo de bacterias y el modo de acción de estos compuestos se da
mediante la alquilación de los grupos químicos de las proteínas y ácidos nucleídos de las
bacterias; por otro lado el cloruro de didecildimetilamonio actúa lesionando la membrana celular
debido a que desorganiza la disposición de las proteínas y fosfolípidos, por lo que se liberan
metabolitos desde la célula interfiriendo con el metabolismo energético y el transporte activo, el
modo de acción de los compuestos de amonio actúan lesionando la membrana celular debido a
que desorganizan la disposición de las proteínas y fosfolípidos por lo que se liberan metabolitos
desde la célula interfiriendo con el metabolismo energético y el transporte activo. De acuerdo a
estos resultados se confirma que es un desinfectante de alto nivel que logró inhibir en su
totalidad los microorganismos vegetativos, en la concentración más baja 0.25% en el menor
tiempo de acción.
Por otro lado el comportamiento de Bacillus subtilis frente a este agente químico presento un
comportamiento similar al obtenido con FAGETRIALD, ya que al analizar los resultados este
microorganismo en las concentraciones 0.25% y 0.50% no presento inhibición en ninguno de
los tiempos de contacto (2,4 y 6 horas) evaluados. En la concentración del 1% el doble de la
37
recomendada por el fabricante, a las 2 horas de contacto presento un porcentaje de inhibición
de 0.54%, a las 4 horas en esta misma concentración una inhibición de 6.5%, finalmente a las 6
horas se obtuvo un porcentaje de inhibición del 56% frente a la cepa nativa y un .en Estudios
realizados DESINFLOOR presentó una total acción inhibitoria contra especies de bacilos Gram
positivos, a una concentración del 2% (1/5) (RAMOS 2001). Una de las causa del porque este
desinfectante no inhibió un 100% a este microorganismo esporulado, pudo deberse, al igual que
en lo presentado con FAGETRIALD, el glutaraldehído activa sus propiedades esporicidas a un
pH alcalinos (7.5-8) (14), y al momento de evaluar el pH de DESINFLOOR, este agente
químico presento un pH acido de 5 y a pH ácidos estas sustancias no presentan actividad
esporicida, y su porcentaje de inhibición fue muy bajo.
Existen factores que afectan la efectividad de un desinfectante, en este caso el pH de los
agentes químicos se vio alterado ya que cada compuesto presenta un pH optimo en el cual
actúan mejor (DESINFLOOR Y FAGETRIALD actúa en pH de 6 a 6.5), y al momento de evaluar
el pH de FAGETRIALD y DESINFLOOR, se obtuvieron pH ácidos (4). Estos cambios en el pH
de los dos agentes químicos se deben a que en resientes estudios (Echeverri 2007) se ha
podido demostrar que la concentración del glutaraldehído disminuye del 2,1% (pH 8.5) a 1,3%
(pH 7,5) a lo largo del tiempo o durante el tiempo de almacenamiento.
La estabilidad de un desinfectante depende por una parte de factores ambientales tales como la
temperatura, la humedad y la luz ambiental, y por otra parte factores relacionados con el
producto como es el caso de las condiciones químicas y físicas de las sustancias activas, su
composición y el proceso de fabricación; alguno de estos factores pudo haber sido alterado,
causando así los resultados obtenidos en cuanto a la actividad esporicida de los desinfectantes
NEW DESINFLOOR y NEW FAGETRIALD frente a Bacillus subtilis, cabe mencionar que la
inhibición parcial de este microorganismo, no causa problemas en los análisis ensayos y
estudios que se realizan en el laboratorio y este microorganismo no es patógeno para el
hombre.
Respecto a la tabla 4 el desinfectante HIPOCLORITO DE SODIO presentó una inhibición mayor
al 90% en la concentración 3.125% a los 5 minutos frente a Escherichia coli cepa nativa y
cepa de referencia, así mismo Pseudomonas sp nativa y la cepa de referencia obtuvieron un
porcentaje de inhibición del 100 % en todas las concentraciones y tiempos de exposición,
evidenciando la susceptibilidad que estos microorganismos presentan frente a la acción del
cloro ya este agente químico presenta un amplio espectro de actividad frente a bacterias,
presentando de esta forma efectos bactericidas rápidos (14). El mecanismo de acción de
este desinfectante actúa inhibiendo enzimas esenciales y oxida los grupos tiol de las proteínas
de la membrana produciendo cambios en la permeabilidad de la membrana celular (19,31).
En Staphylococcus aureus cepa nativa y cepa de referencia se evidencio un menor porcentaje
de inhibición que el presentado por E. coli y Pseudomonas sp, siendo estos del 87.5 % y 89.5 %
en la concentración del 0.25% a los 5 minutos de exposición, este resultado se debe a que el
microorganismo presenta varios mecanismos de resistencia ante agentes biocidas como es el
caso de la modificación de algunos sitios específicos de la anatomía celular generando de esta
manera una pequeña resistencia, ya que la pared celular de este microorganismo está
compuesta principalmente por ácido peptidoglicano y ácido teicoico, y estos no parecen actuar
38
como una barrera altamente efectiva a la entrada de sustancias de alto peso molecular (30) .
Respecto a Bacillus subtilis tanto la cepa de referencia como nativa, presentaron una inhibición
mayor del 90 % en la concentración 6.25% a las 4 horas de exposición, este porcentaje de
inhibición aumento a medida que fue aumentando la concentración, ya que a las 2 horas a una
concentración del 3.125% solo evidencio un porcentaje de inhibición del 12.5 %, luego a las 4
horas un porcentaje del 25% y a las 6 horas un porcentaje del 50%. Por otra parte se presento
un porcentaje de inhibición del 75%, 98.9 % y 100 % a la concentración del 6.25% a medida que
aumentaba el tiempo de exposición 2, 4 y 6 horas respectivamente; según estudios esto indica
que a concentraciones altas el hipoclorito de sodio presenta una acción esporicida, en donde las
esporas de Bacillus subtilis pierden su refractividad y la capa de la espora se separa de la
corteza, produciendo una lisis incrementándose la permeabilidad de la capa de la espora,
permitiendo que los agentes químicos penetren en esta (30). Los bacilos Gram positivos
formadores de esporas, en este caso Bacillus subtillis presento una alta sensibilidad al
HIPOCLORITO DE SODIO durante las pruebas de estudio en la concentración recomendada
por el fabricante 6.25% a las 4 y 6 horas de contacto.
El HIPOCLORITO DE SODIO es un desinfectante altamente efectivo contra la carga microbiana
presente en las áreas y superficies de trabajo del laboratorio, hecho que confirma el amplio
espectro de su actividad antimicrobiana. En este desinfectante si se ve una reducción
significativa cuando se aumenta el tiempo de exposición y la concentración de este agente
químico frente a los microorganismo evaluados, ya que la efectividad del desinfectante está
relacionada con su concentración y tiempo de acción, siendo esta la variable mas importante en
el proceso de desinfección, ya que se ha observado que para una concentración dada de
desinfectante, la mortalidad aumenta cuanto mayor sea el tiempo de contacto. Se recomienda
utilizar el HIPOCLORITO DE SODIO a una concentración de 3.125%, en el laboratorio. Cabe
mencionar que no se puedo realizar una comparación entre NEW DESINFLOOR, NEW
FAGETRIALD frente a HIPOCLORITO DE SODIO, ya que en este último se manejaron
concentraciones diferentes que las evaluadas en los otros desinfectantes.
De acuerdo a la tabla 3, TEGO 51 fue el desinfectante que presento una actividad muy variada,
obtuvo un porcentaje de remoción del 93.75 % en Escherichia coli nativa a una concentración
del 0.25 % a los 10 minutos, lo que difiere del porcentaje de remoción de la cepa de referencia,
el cual fue mayor 96.75 %, esto debido a que la cepa de referencia al no formar parte de la flora
nativa del laboratorio ni haber sido expuesta al desinfectante anteriormente no ha adquirido
cierta resistencia hacia al agente químico, como lo pudo hacer la cepa nativa que si estuvo en
contacto con el desinfectante anteriormente. Respecto a Pseudomonas sp.se presento un
porcentaje de inhibición del 100 % a una concentración del 0.50 % a los 10 minutos,
evidenciando que esta bacteria es más resistente que Escherichia coli, ya que la membrana
externa de este microorganismo es responsable de su alta resistencia y esta resistencia se basa
en la composición de la membrana la cual presenta diferencias en comparación con otros
microorganismos; la composición de lipopolisacaridos (LPS ) y en el contenido de cationes como
magnesio producen enlaces estables entre moléculas de lipopolisacariodos, evitando la
desintegración de estos; pese a las características descritas anteriormente, se obtuvo un
porcentaje de remoción significativo, debido a que el tiempo de exposición fue de 15 minutos y
39
TEGO 51 es un desinfectante de tipo aniónico, compuesto por dodecildieblendiaminoglicina y
dodecilanopropilglicina 9.0 %, que causa la disrupción de membrana causando lisis y muerte
celular. Staphylococcus aureus evidencio una mayor resistencia ya que este solo presento un
porcentaje de inhibición del 47.83% a una concentración del 1% a los 15 minutos. Por último
Bacillus subtilis solo obtuvo un porcentaje de remoción del 32.08 a los 15 minutos al 1%, debido
a que el desinfectante no tiene acción esporicida. Este es un desinfectante de bajo espectro y es
utilizado para el ambiente, a diferencia de los otros desinfectantes los cuales son utilizados para
las superficies del laboratorio.
Finalmente los resultados obtenidos de los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR,
TEGO 51 e HIPOCLORITO DE SODIO frente a los hongos Aspergillus flavus y Penicillum sp, se observó
que no existe una diferencia estadísticamente significativa (valor de p mayor que 0.05) del actuación de
los desinfectantes frente a estos microorganismos, mostrando de esta forma que estos agentes químicos
presentaron una actividad fungicida, obteniendo un porcentaje de inhibición promedio 90% en la
concentración recomendada por el fabricante, cabe mencionar que estos microorganismos son
formadores de esporas y estas son menos resistentes que las esporas bacterianas
frente a los
desinfectantes, generando de esta manera un porcentaje de inhibición mayor que el presentado por
Bacillus subtilis (30).
De acuerdo a los resultados de la validación concurrente de los desinfectantes se puede concluir que
las concentraciones en las cuales se utilizan los desinfectantes 0.25% y 0.50% para NEW FAGETRIALD y
NEW DESINFLOOR son adecuadas para el laboratorio porque eliminan la carga microbiana presente,
por tal motivo se recomienda seguir con las mismas concentraciones. En el caso de HIPOCLORIO DE
SODIO las concentraciones utilizadas actualmente en el laboratorio fueron modificadas y se pudo
observar un aumento en el porcentaje de inhibición de los microorganismos mostrando que los
microorganismos van adquiriendo resistencia al desinfectante hipoclorito de sodio ya que se pudo
observar que las concentración de Blancox en este estudio fuero muy superiores al compararlas con el
estudio anterior (Cufiño 2010), Finalmente a partir de los resultados de este estudio se actualizó el
programa de limpieza y desinfección modificando de esta manera las concentraciones del HIPOCLORITO
DE SODIO las cuales serán 3.125% y se realizaron los nuevos instructivos de validación de los
desinfectantes en el laboratorio donde muestra los pasos a seguir para realizar la validación y el
instructivo de limpieza y desinfección donde se explican los pasos que se deben seguir para realizar la
limpieza y desinfección del laboratorio. También se realizó el nuevo cronograma de rotación de los
desinfectantes del año 2013 fundamentada en los resultados de la validación concurrente de los 4
desinfectantes utilizados en el laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la Pontificia
Universidad Javeriana, con los porcentajes de inhibición de cada uno de los microorganismos evaluados,
frente a las distintas concentraciones del desinfectante y tiempos de desinfección, de NEW FAGETRIALD,
NEW DESINFLOOR e HIPOCLORITO DE SODIO siendo el hipoclorito de sodio el que presento mayor
actividad esporicida. La rotación de estos desinfectantes es la mejor medida para prevenir la aparición de
fenómenos de resistencia y adaptación este modelo de rotación cambio respecto al que se estaba
utilizando teniendo en cuenta que la concentración de Hipoclorito de sodio fue modificada respecto a la
anterior utilizada en el laboratorio aumentando de esta manera su concentración (ver anexo 1).Para la
determinación de la periodicidad de aplicación de cada agente, se tuvo en cuenta el espectro de acción y
potencia de cada desinfectante, que lleva a un alternado en el uso de los mismos, previniendo evitar la
creación de resistencia por parte de los microorganismos presentes, a los agentes con los cuales se
busca eliminarlos, todo esto teniendo en cuenta la toxicidad de cada desinfectante. Para realizar el
monitoreo de la acción de los tres desinfectantes, en los próximos cuatro años, es necesario realizar el
procedimiento de muestreo al menos 2 veces seguidas en el año para saber si estos desinfectantes se
siguen comportando de igual manera.
40
8. CONCLUSIONES
Se logró aislar e identificar los microorganismos que se presentan con mayor incidencia en las
áreas y superficies de trabajo del laboratorio de indicadores de calidad de aguas y lodos de la
Pontificia Universidad Javeriana, obteniendo como resultado la presencia de bacterias Gram
negativas como es el caso de Escherichia coli, Pseudomonas sp. bacterias Gram positivas como
es el caso de Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, y finalmente hongos Penicillum sp y
Aspergillus flavus antes del proceso de limpieza y desinfección realizado en el laboratorio.
Al validar los desinfectantes NEW FAGETRIALD, NEW DESINFLOOR Y BLANCOX frente a los
diferentes microorganismos enfrentados Pseudomonas sp, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Penicillum sp. y Aspergillus flavus se pudo observar que estos agentes químicos inhiben
el crecimiento de los microorganismos presentando un porcentaje de inhibición mayor o igual del
90%, en la concentración recomendada por el fabricante 0.50% para FAGETRIALD
y
DESINFLOOR, y en el HIPOCLORITO DE SODIO en la concentración 3.125% la mitad de la
recomendada por el fabricante
Los desinfectante de alto nivel NEW FAGETRIALD y NEW DESINFLOOR, a una concentración
del 1% el doble de la recomendada por el fabricante, obtuvieron un porcentaje de inhibición menor
del 90 % frente a Bacillus subtilis, debido a que los desinfectantes de alto nivel presentaron una
alteración en las propiedades afectándose de esta manera su acción esporicida.
Según los datos obtenidos se determino que la mejor concentración de NEW FAGETRIALD y
NEW DESINFLOOR a emplear en el laboratorio es al 0.50%, la recomendada por el fabricante,
teniendo en cuenta que Bacillus subtilis no interfiere en los ensayos, ya que al aumentar la
concentración los microorganismos podrían adquirir resistencia. Y para TEGO 51 seguir
utilizando la concentración la concentración del 1 %
Se demostró que el desinfectante BLANCOX
presentó el mejor comportamiento, a la
concentración recomendada 3.125%
a los 10 minutos de exposición frente a
los
microorganismos Pseudomonas sp, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, y a las 4 horas de
exposición para Bacillus subtillis. Aspergillus flavus y Penicillum sp, teniendo una actividad
esporicida, bactericida, y fungicida, siendo así el desinfectante más eficaz en la inhibición o
reducción de la carga microbiana presente.
La efectividad de un desinfectante depende de factores ambientales y factores relacionados con
las condiciones químicas y físicas de las sustancias activas, su composición y el proceso de
fabricación, siendo estos factores limitantes en la estabilidad de los desinfectantes.
Se realizó un nuevo esquema de rotación de los desinfectantes y se actualizó el programa de
limpieza y desinfección en el laboratorio.
Se realizaron los ajustes al programa de limpieza y desinfección teniendo en cuenta la
modificación de las concentraciones del desinfectante hipoclorito de sodio, además se realizaron
dos instructivos el primero correspondió al instructivo de validación de los desinfectantes y el
segundo instructivo a los procesos de limpieza y desinfección.
41
9. RECOMENDACIONES
Se recomienda para posteriores estudios pedir pruebas de estabilidad al fabricante de los
desinfectantes usados en el laboratorio de Indicadores de Calidad de Aguas y Lodos de la
Pontificia Universidad Javeriana con el fin de tener certeza sobre calidad de los agentes químicos
y comprobar sus propiedades.
Hacer un muestreo de ambientes y superficies mensualmente, para comprobar si hay una
reducción de la carga microbiana presente en las áreas y superficies del laboratorio.
Si se alteran las condiciones ambientales del laboratorio es importante hacer la revalidación de los
desinfectantes utilizados con el fin de verificar su efectividad teniendo en cuenta concentraciones
y tiempos de acción.
42
10. BIBLIOGRAFÍA
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de
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44
ANEXOS
Anexo 1. ROTACIÓN DE DESINFECTANTES 2013- 2014
MES
BIOENSAYOS
ENERO
FEBRERO
MARZO
ABRIL
MAYO
JUNIO
JULIO
AGOSTO
SEPTIEMBRE
OCTUBRE
NOVIEMBRE
DICIEMBRE
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.25%
Hipoclorito3.125%
Fagetriald0.25%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor0.25%
Hipoclorito3.125%
Fagetriald0.25%
Hipoclorito3.125%
Desinfloor0.25%
Hipoclorito3.125%
Fagetriald0.25%
MES
BIOENSAYOS
ENERO
FEBRERO
MARZO
ABRIL
MAYO
JUNIO
JULIO
AGOSTO
SEPTIEMBRE
OCTUBRE
NOVIEMBRE
DICIEMBRE
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.25%
Hipoclorito 3.125%
MES
BIOENSAYOS
ENERO
FEBRERO
MARZO
ABRIL
MAYO
JUNIO
JULIO
AGOSTO
SEPTIEMBRE
OCTUBRE
NOVIEMBRE
DICIEMBRE
Desinfloor 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.25%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
BACTERIAS Y
VIRUS
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
BACTERIAS Y
VIRUS
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
BACTERIAS Y
VIRUS
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
45
PARASITOLOGÍA
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
PARASITOLOGÍA
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
PARASITOLOGÍA
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Fagetriald 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.15%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Hipoclorito 3.125%
Desinfloor 0.50%
Hipoclorito 3.125%
Anexo 2. Tabla del recuento en superficie de los 14 puntos de muestreo, por medio del método
horizontal antes y después de la limpieza y desinfección con HIPOCLORITO DE SODIO
recuento en superficie por medio del método horizontal
Recuento de microorganismos en agar nutritivo
Puntos de muestreo
P1
P2
P4
P6
P7
P8
P 10
P 11
P 12
P13
Antes de LyD
Mesófilos
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
Antes LyD
Mesófilos
1
44
110
5
2
188
13
1
8
Antes L y D
Mesófilos
10
recuento en superficie por medio del método horizontal
Recuento de microorganismos en agar nutritivo después de la limpieza y desinfección
Puntos de muestreo
P1
P2
P4
P6
P7
P8
P 10
P11
P12
P13
Después Ly D
Mesófilos
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
Después L y D
Mesófilos
0
3
2
5
3
11
7
0
0
Después L y D
Mesófilos
2
recuento en superficie por medio del método horizontal
Recuento de microorganismos en agar Mac conkey
Puntos de muestreo
P1
P2
P4
P6
P7
P8
P 10
P 11
P 12
P13
Antes de LyD
Coliformes
fecales y
totales
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
Antes LyD
Coliformes
fecales y
totales
0
2
174
X108
1
0
12
0
Antes L y D
Coliformes
fecales y
totales
4
8
0
46
recuento en superficie por medio del método horizontal
Recuento de microorganismos en agar macconkey después de la limpieza y desinfección
Puntos de muestreo
P1
P2
P4
P6
P7
P8
P 10
P11
P12
P13
Después Ly D
Coliformes
fecales y
totales
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
UFC
Después L y D
Coliformes
fecales y
totales
0
0
0
0
0
7
2
0
0
Después L y D
Coliformes
fecales y
totales
0
recuento en superficie por medio del método horizontal
Recuento de microorganismos en agar Sabouraud
Puntos de muestreo
P1
P2
P4
P6
P7
colonia
Coloni
a
Colina
colonia
colonia
0
2
1
1
2
P8
P 10
P 11
Colonia
colonia
Colonia
2
2
2
P 12
P13
Antes de
LyD
Hongos
colonia
colonia
Antes LyD
Hongos
Antes L y D
Hongos
1
1
recuento en superficie por medio del método horizontal
Recuento de microorganismos en agar sabouraud
Puntos de muestreo
P1
colonia
0
P2
P4
P6
P7
P8
Colonia
colonia
colonia
colonia
colonia
0
1
0
1
0
P 10
colonia
0
P 11
P 12
P13
Antes de LyD
Hongos
colonia
colonia
colonia
Antes LyD
Hongos
0
0
0
Antes L y D
Hongos
47
Anexo 3.Tablas del Resultado del recuento de microorganismos mediante Método de sedimentación en
placa.
método de sedimentación
Recuento de microorganismos en agar nutritivo
Puntos de muestreo
P3
P5
P9
P 14
UFC
UFC
UFC
UFC
5
6
2
8
Antes Ly D
Mesofilos
Antes L y D
Mesófilos
método de sedimentación
Recuento de microorganismos en agar nutritivo
Puntos de muestreo
P3
P5
P9
P 14
UFC
UFC
UFC
UFC
4
3
0
4
después Ly D
Mesofilos
Después Ly D
Mesófilos
método de sedimentación
Recuento de microorganismos en agar sabouraud
Puntos de muestreo
P3
P5
P9
P 14
colonias
colonias
colonias
colonias
1
1
1
2
Antes Ly D
microorgan
ismos
Antes L y D
Hongos
método de sedimentación
Recuento de microorganismos en agar sabouraud
Puntos de muestreo
P3
P5
P9
P 14
colonias
colonias
colonias
Colonias
0
1
0
2
después Ly D
Microorgani
smos
hongos
Después Ly D
48
Hongos
ANEXO 4. Resultados de la parte estadística
Normalidad
En la tabla 4 se observan los test de normalidad aplicados a los residuales que utilizan la hipótesis nula de
que la distribución es normal vs que no es normal. En todos los casos el p valor fue menor a 0.05 lo que
rechaza la hipótesis nula, es decir, la distribución de los residuales no es normal.
Tabla 4. Test de normalidad para los residuales
Test
Estadístico P valor
ShapiroWilk W
0.17551
Pr < W <0.0001
ShapiroWilk D
0.462963
Pr > D <0.0100
Cramer von Mises 34.89888
Pr > W-Sq <0.0050
Anderson Darling 162.6986
Pr > A-Sq <0.0050
En la gráfica 1 se ve el QQ plot que contrasta la distribución de los residuales con la distribución normal
esperada, si el ajuste fuese perfecto esperaríamos una línea roja idéntica a la azul, pero en este caso se
ve que la distribución de los residuales tiene colas más delgadas que la distribución normal.
Gráfica de probabilidad de RESID
Normal - 95% de IC
99,9
Media
Desv.Est.
N
AD
Valor P
99
95
Porcentaje
90
7,500904E-14
0,2417
486
162,689
<0,005
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
0,1
-2
-1
0
RESID
1
2
Figura 1. QQ plot para los residuales del GLM
No correlación
La no correlación de los residuales se puede ver en el gráfico 2, ya que no se presenta ningún patrón
definido cuando el ajuste crece.
49
Gráfica de dispersión de RESID vs. INHIBICION
2
RESID
1
0
-1
-2
0
20
40
60
INHIBICION
80
100
Grafica 2. Diagrama de dispersión para los residuales vs ajustados
Homoceasticidad
Para probar la homoceasticidad (varianza igual) de los residuales se utilizan frecuentemente dos test, el
de Bartlett y el de Levene, el primero usa la distribución chi cuadrado y el segundo la Fisher. La hipótesis
nula es
vs la hipótesis alternativa
. Cada test por su parte rechazo este supuesto con un pvalor menor a 0.05. En la tabla 5 se observan los resultados del test de Bartlett y en la tabla 6 del test de
Levene.
50
ANEXO 5. Figuras del porcentaje de inhibición de los diferentes microorganismos aislados e
identificados frente a los 4 desinfectantes validados
HIPOCLORITO DE SODIO ENFRENTADO A LOS DIFERENTES MICROORGANISMOS
DESINFECTANTE
Escherichia coli
cepa de referencia
CONCENTRACIONES
3.125%
6.25%
Escherichia coli
cepa
Pseudomonas sp.
cepa de referencia
Pseudomonas sp.
cepa nativa
Pstaphylococcus
aureus cepa de
referencia
Pstaphylococcus
aureus cepa nativa
Bacillus subtillis
cepa de referencia
Bacillus subtillis
cepa nativa
51
12.5 %
NEW FAGETRIALD ENFRENTADO A LOS DIFERENTES MICROORGANISMOS
DESINFECTANTE
Escherichia coli
cepa de referencia
CONCENTRACIONES
0.25%
0.50%
Escherichia coli
cepa nativa
Pseudomonas sp.
cepa de referencia
Pseudomonas sp.
cepa nativa
Pstaphylococcus
aureus cepa de
referencia
Pstaphylococcus
aureus cepa nativa
Bacillus subtillis
cepa de referencia
Bacillus subtillis
cepa nativa
52
1%
NEW DESINFLOOR ENFRENTADO A LOS DIFERENTES MICROORGANISMOS
DESINFECTANTE
Escherichia coli
cepa de referencia
CONCENTRACIONES
0.25%
0.50%
Escherichia coli
cepa nativa
Pseudomonas sp.
cepa de referencia
Pseudomonas sp.
cepa nativa
Pstaphylococcus
aureus cepa de
referencia
Pstaphylococcus
aureus cepa nativa
Bacillus subtillis
cepa de referencia
Bacillus subtillis
cepa nativa
53
1%
TEGO 51 ENFRENTADO A LOS DIFERENTES MICROORGANISMOS
DESINFECTANTE
Escherichia coli
cepa de referencia
CONCENTRACIONES
0.25%
0.50%
Escherichia coli
cepa nativa
Pseudomonas sp.
cepa de referencia
Pseudomonas sp.
cepa nativa
Pstaphylococcus
aureus cepa de
referencia
Pstaphylococcus
aureus cepa nativa
Bacillus subtillis
cepa de referencia
Bacillus subtillis
cepa nativa
54
1%
Penicillum sp cepa nativa promedio de las 3 replicas
DESINFECTANTES
CONCENTRACIONES
0.25%
0.50%
1%
FAGETRIALD
DESINFLOOR
TEGO 51
HIPOCLORITO DE
SODIO
Aspergillus flavus cepa nativa promedio de las 3 replicas
CONCENTRACIONES
DESINFECTANTES
0.25%
0.50%
FAGETRIALD
DESINFLOOR
TEGO 51
HIPOCLORITO DE
SODIO
55
1%
56