DETECCIÓN DE FITOPLASMAS Y DESCRIPCIÓN DE SÍNTOMAS

DETECCIÓN DE FITOPLASMAS Y DESCRIPCIÓN DE SÍNTOMAS
EN REPOLLO (Brassica oleracea L. var. capitata)
EN AGUASCALIENTES Y ZACATECAS
Phytoplasmas detection and description of symptoms in cabbage (Brassica oleracea L. var.
capitata) in Aguascalientes and Zacatecas
Yukari Guillén-Peralta, Luis Roberto Reveles-Torres y Rodolfo Velásquez-Valle
Campo Experimental Zacatecas – INIFAP, Km. 24.5 Carr. Zacatecas – Fresnillo, Calera de V. R.,
Zacatecas, México. CP 98500. e-mail:[email protected]
RESUMEN
El repollo, es una de las más importantes especies en la
familia Cruciferae. En los estados de Aguascalientes y Zacatecas, México es un cultivo ampliamente distribuido, sin embargo,
a la fecha no existen reportes actuales sobre las enfermedades
de este cultivo en esta región. Últimamente, algunas plantas
de repollo han mostrado síntomas relacionados con la infección por fitoplasmas; por lo que el objetivo de este trabajo fue
describir su sintomatología y detectar la presencia de fitoplasmas por PCR. Los síntomas más comunes asociados con la
infección por fitoplasmas fueron enanismo, deformación de inflorescencia, presencia de hojas pequeñas y de color amarillo o
cloróticas; la raíz principal mostraba excesiva o baja producción
de raíces secundarias. De un total de 26 muestras analizadas
por PCR, el 38.5% resultaron positivas a la presencia de fitoplasmas; estos resultados hacen posible la asociación entre los
síntomas mencionados y la infección por fitoplasmas.
SUMMARY
The cabbage is one of the most important species in the
Cruciferae family. In the states of Aguascalientes and Zacatecas, Mexico, cabbage is a wide spread crop, however, to date
there are no current reports on the diseases affecting of this
crop in this region. Lately, some cabbage plants have shown
symptoms related to the infection by phytoplasmas, so the aim
of this work was to describe the symptoms as well as to detect the presence of phtoplasmas by PCR. The most common
symptoms associated to phytoplasma infection were dwarfing,
inflorescence deformation, presence of small, yellow or chlorotic leaf; the main root showed excessive or too low secondary
root production. A total of 26 samples were analyzed by PCR,
38.5 % were positive; these results make possible the asso-
ciation between the mentioned symptoms and the phytoplasma
infection.
INTRODUCCION
El género Brassica está integrado por 37 especies en el
mundo, cuya capacidad de adaptación a un amplio rango de
condiciones climáticas, las convierte en hortalizas de gran interés. Los tres cultivos más importantes de este género en México son brócoli, coliflor y repollo, destinados a consumo interno y
a exportación, principalmente como producto congelado a EUA
(Casseres, 1980). Aunque el principal estado productor de brasicáceas en México es Guanajuato, también son importantes
los estados de Nuevo León, Coahuila, Durango, Zacatecas,
Michoacán y Jalisco. En el noroeste de la República existe un
gran potencial de producción y se cultiva para consumos regionales y en ocasiones para exportación en fresco. El cultivo
del repollo está clasificado como hortaliza de hoja y ocupa los
primeros lugares en importancia en esta clasificación. La superficie sembrada a nivel nacional se estima entre 7,000 a 8,000
hectáreas según datos de la Dirección General de Economía
Agrícola de la Secretaria de Agricultura y Recursos Hidráulicos,
utilizándose exclusivamente para el consumo nacional (Nava
y Cárdenas, 1995). La col o repollo se desarrollan en climas
relativamente frescos y húmedos, pero se produce en una variedad de climas; la coliflor exige temperaturas frescas y ambientes húmedos. Los principales problemas identificados por
los productores al menos para repollo son: insectos plaga, falta
de fertilidad en el suelo y enfermedades de la planta.
Con respecto a estos problemas, en los últimos años, se
han incrementando las patologías producidas por fitoplasmas
en diversos cultivos como jitomate, chile, frijol, nopal entre otros
(Velásquez et al., 2011). Debido a que los fitoplasmas no se han
podido aislar o cultivar en medios artificiales y a su restrictiva
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presencia en concentraciones muy bajas en el tejido del floema de las plantas, hasta ahora la técnica de PCR es el único
método eficiente y confiable para su detección e identificación
(Bertaccini, 2007). Atribuyendo a que ciertas patologías como la
presencia de viriscencia, filodia, proliferación de yemas o brotes
grandes y amarillamientos como típicas sintomatologías causadas por fitoplasmas, se han observado en parcelas de repollo,
se creó la inquietud de determinar su sintomatología y detección por PCR, el cual fue el objetivo de este trabajo.
600 ml de isopropanol frío. Las muestras se mezclaron y se
dejaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Enseguida se
centrifugaron a 13,000 rpm por 15 minutos, el sobrenadante fue
descartado y los tubos se invertidos por 5 minutos para secar
la pastilla de ADN. Posteriormente la pastilla se resuspendío en
100 ml de buffer TE (Tris- EDTA 0.01 mM pH 8.0) y 100 ml de
etanol al 100 %.
MATERIALES Y MÉTODOS
La primera amplificación, y la PCR anidada fueron hechas
utilizando los pares de primers universales, para amplificar secuencias de rRNA 16S de los fitoplasmas, P1/Tint y R16F2n/
R16R2, respectivamente (Gundersen y Lee, 1996; Smart et
al., 1996; Lee et al., 1998). Las PCR se realizaron en un termociclador de Applied Biosystems con el programa: 1 ciclo de
desnaturalización a 95°C durante 2 min y 30 ciclos adicionales
con el siguiente programa: 1 min de desnaturalización a 94°C:
1 min de hibridación a 55°C, 2 min de polimerización a 72°C,
y una extensión final de 72°C durante 5 min. Las muestras de
extracción de DNA y los productos de PCR, se analizaron por
electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio y
visualizados mediante luz ultravioleta (Smart et al., 1996).
Toma de muestras en campo
Las muestras de crucíferas se tomaron de parcelas comerciales ubicadas en los municipios de Loreto, Zacatecas (una
parcela); y Villa Juárez, Aguascalientes (dos parcelas), en las
que se presentaban plantas con síntomas de la enfermedad. La
recolección de muestras se llevó a cabo en los primeros meses
de 2013. Para colectar plantas con síntomas de infección por
fitoplasmas se realizó un recorrido por la parcela para detectar plantas con enanismo, amarillamientos u otros cambios de
color, proliferación y malformación de hojas, malformación de
inflorescencia (fruto). A las plantas sintomáticas se les tomaron
fotografías para evidenciar las infecciones; también se tomaron
muestras de plantas aparentemente sanas de la misma variedad, con la finalidad de corroborar los resultados sintomatología. Ambos grupos de muestras colectadas se identificaron y
etiquetaron y fueron trasladadas al Campo Experimental Zacatecas del INIFAP.
Registro de síntomas
En las muestras colectadas se registraron síntomas asociados con enfermedades provocadas por fitoplasmas como crecimiento reducido, hojas anormalmente pequeñas y modificadas, con pérdida de color verde o con coloraciones diferentes,
proliferación de hojas y raíces, una vez concluido su proceso
de caracterización fitopatológica, se tomaron fotografías de las
partes dañadas de cada planta, se separaron por órganos (raíces, tallo y hojas).
Extracción de DNA
A cada muestra se le extrajo DNA total por el protocolo de
Dellaporta et al., (1983), en la cual las muestras de los tejidos son molidos en nitrógeno líquido y traspasados a un tubo
Eppendorf de 1.5 ml; a este se le añadió 600 ml de Buffer de
extracción (1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl ph 8.0,
2 % CTAB w/v, 1 % de b-mercaptoetanol) agitando la mezcla
hasta homogeneizar. Las muestras fueron incubadas por 20
minutos a 65ºC. (homogenizando cada 3 minutos). Después
de la incubación se le agregaron 600 ml de cloroformo-isoamil
alcohol (24:1) (frío), y fueron mezclados con agitación por 15
minutos. Los tubos se centrifugan a 13,000 rpm por 15 minutos
y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo conteniendo
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PCR- Anidada
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se analizaron un total de 26 muestras de repollo en tres
localidades, con sintomatología aparente. En la parcela de
Loreto, Zac., las plantas muestreadas expresaban enanismo
generalizado, deformación de inflorescencia (fruto) sin centro
y reducida principalmente, presencia de manchas amarillas en
general, hojas pequeñas mayoritariamente amarillas y con clorosis, la venación normal con bordes aserrados y el desarrollo
de la raíz desde poca, pasando por normal y en algunos casos
llegando a ser abundante. En la parcela 1 de Villa Juárez se
observó también el enanismo en la mayoría de las muestras,
la deformación de la inflorescencia fue rosetada, manchas
amarillas en las hojas, gran variación en el tamaño de las hojas
que podían mostrar un color verde o clorosis hasta amarillo, la
venación desde poca a numerosa, bordes foliares aserrados y
con poco desarrollo radicular. En la parcela 2 de Villa Juárez
se observaron plantas con enanismo pero expresando otras
sintomatologías características de la presencia de fitoplasmas
como inflorescencias sin centro, hojas pequeñas y de color verde pero con venación numerosa y los bordes ondulados. Con
respecto al desarrollo radicular este fue calificado visualmente
como pobre o abundante (Cuadro1).
PRODUCCIÓNAGRÍCOLA
Cuadro 1. Características sintomatológicas asociadas con la presencia de fitoplasmas en plantas de repollo en
tres parcelas comerciales de Zacatecas y Aguascalientes, México.
Dentro del diagnóstico de la presencia de fitoplasmas por
PCR anidado, para el municipio de Loreto, Zac, el 41.7% de las
muestras resulto positiva. En el estado de Aguascalientes se
encontró que para los sitios de muestreo (parcelas) uno y dos
en el municipio de Villa Juárez, los resultados positivos fueron
del 80 y 22.2% respectivamente (Cuadro 2). De tal forma que
de las 26 muestras de repollo, el 38.5% resultó positiva (Figura
1).
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Cuadro 2. Presencia de fitoplasmas en 26 muestras de repollo analizadas por PCR-Anidada y obtenidas en parcelas comerciales de Aguascalientes y Zacatecas, México.
Con respecto a la detección de fitoplasmas en diversos órganos de la planta, se analizaron por medio de PCR muestras
de hojas, tallos y raíces, encontrando presencia de esos patógenos tanto en muestras de hojas y tallos procedentes de
dos plantas, sin embargo se obtuvieron resultados negativos
para las muestras obtenidas de raíz de todas las plantas analizadas. Es importante señalar que las muestras provenientes
de la planta testigo (planta aparentemente sana, es decir sin
ninguno de los síntomas mencionados), resultaron negativas
(Cuadro 3).
Cuadro 3. Identificación de fitoplasmas en órganos de las plantas de repollo analizadas por medio de PCR.
.* Planta de repollo aparentemente sana
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PRODUCCIÓNAGRÍCOLA
Estudios recientes han demostrado que la distribución de
estos patógenos dentro de las plantas hospederas es irregular
(Sugio et al., 2011), y que diversos vectores pueden ser transmisores de diferentes fitoplasmas causando distintas sintomatologías (Firrao et al., 2006; Gao et al., 2011; Hernández, 2005;
Kakizawa et al., 2006; Sugio et al., 2011); lo anterior explicaría,
al menos parcialmente, la falta de consistencia en los resultados de distribución de esos patógenos en los distintos órganos
de repollo obtenidos en el presente trabajo.
Figura 1. Electroforesis en Gel de Agarosa de los productos amplificados por PCR-anidada de extractos de 18
individuos de Brassica oleraceae var. capitata. Amplificación de una banda de 1600 pb en las muestras de las
líneas 1,3, 6,7, 11, 12, 13, 14, 15, 17. Linea 18 individuo Sano. Control positivo línea (+). 1 kb marcador molecular
Invitrogen (M).
El rango de infección de los fitoplasmas es amplio, afectando a una gran variedad de plantas con interés económico
alrededor de todo el mundo (Hogenhout et al., 2008) por lo que
es necesario continuar con los estudios que permitan la identificación completa del o los fitoplasmas involucrados en la producción de los síntomas anteriores.
CONCLUSIONES
En plantas de repollo (Brassica oleraceae var. capitata),
colectadas en Aguascalientes y Zacatecas los síntomas de
enanismo, malformación de hojas y de inflorescencia (fruto) y
producción anormal de raíces secundarias se encontraron asociados con la presencia de fitoplasmas.
Hasta donde sabemos este es el primer reporte de fitoplasmas asociados con plantas de repollo en México.
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