VACUNA QUE CONTIENE UNA SERINA

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 39/00
11 Número de publicación:
2 130 426
6
51
ESPAÑA
A61K 38/48
C12N 15/52
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 94917738.0
kFecha de presentación : 14.06.94
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 703 789
kFecha de publicación de la solicitud: 03.04.96
T3
86
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87
87
k
54 Tı́tulo: Vacuna que contiene una serina-proteasa.
k
73 Titular/es: John Pius Dalton
k
72 Inventor/es: Dalton, John Pius y
k
74 Agente: Elzaburu Márquez, Fernando
30 Prioridad: 15.06.93 GB 9312324
22 Orpen Rise, Orpen Grove, Blackrock
County of Dublin, IE
Stuart John Andrews
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.07.99
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 130 426 T3
01.07.99
Aviso:
k
k
Andrews, Stuart John
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 130 426 T3
DESCRIPCION
Vacuna que contiene una serina-proteasa.
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10
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Esta invención se refiere al empleo de una clase de serina-proteasas como antı́genos protectores contra
parásitos helmı́nticos.
Cada especie de animal doméstico puede ser parasitada por cierto número de especies diferentes de
helmintos, un proceso que normalmente provoca enfermedades. Por ejemplo, se sabe que el trematodo
parásito Fasciola hepatica es causa de una enfermedad importante desde el punto de vista económico, la
fascioliasis, en rumiantes tales como las reses de ganado vacuno y lanar. El parásito entra en el mamı́fero
hospedante al penetrar por la pared intestinal y pasa aproximadamente siete semanas alimentándose y
cobijándose en la masa del hı́gado antes de migrar al conducto biliar. Después de la infección, el desarrollo de inmunidad en el huésped puede ser deficiente y la resistencia a la reinfección en hospedantes ya
infectados puede ser sólo parcial o inexistente. Otros trematodos parásitos incluyen Fasciola gigantica y
Dicrocoelium spp. y también Paramphistomum spp.
También causan problemas nematodos tales como los anquilostomas (p.ej., Necator, Ancylostoma,
Uncinaria y Bunostomum spp.).
20
De los nematodos que se alimentan de sangre, el género Haemonchus provoca anemia y pérdida de
peso y, si no se aplica tratamiento, frecuentemente producen la muerte. Los animales infectados con el
nematodo relacionado pero que no se alimenta de sangre, Ostertagia, no logran salir adelante y pueden
morir si no se someten a tratamiento.
25
Otros gusanos parásitos de importancia económica incluyen las diversas especies de los siguientes
géneros de helmintos: Trichostrongylus, Nematodirus, Dyctiocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris y Strongylus. Además, del ganado doméstico, las mascotas y los seres humanos también pueden
ser infectados, no pocas veces con resultados fatales, por lo que las infecciones e infestaciones helmı́nticas
plantean un problema de considerable importancia a nivel mundial.
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35
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45
Actualmente, la lucha contra parásitos helmı́nticos del ganado de pasto se basa principalmente en
el empleo de fármacos antihelmı́nticos combinados con el tratamiento de los pastos. Tales técnicas
suelen ser insatisfactorias, primero porque puede ocurrir que haya que administrar frecuentemente los
fármacos antihelmı́nticos, segundo porque cada vez se está extendiendo más la resistencia a los fármacos
antihelmı́nticos, y tercero porque con frecuencia no es posible un tratamiento apropiado de los pastos
en algunas granjas y aunque lo sea, puede poner limitaciones al máximo aprovechamiento de los pastos
disponibles.
Se han hecho numerosos intentos de lucha contra los parásitos helmı́nticos de los animales domésticos
por medios inmunológicos. Con muy pocas excepciones (p. ej. el gusano de los pulmones de las reses de
vacuno, Dictyocaulus viviparus) esto no ha resultado factible.
Se ha propuesto una vacuna contra F. hepatica en el documento de patente WO90/08819 que comprende una glutationa-S-transferasa a partir de F. hepatica como material antigénico.
Bennett (documento de patente británica n◦ 2169606B) extrajo diversos antı́genos a partir de organismos de Fasciola por un procedimiento que separa los antı́genos especı́ficos para la fase joven de los
antı́genos presentes durante las fases joven y adulta.
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Más aún, en algunas circunstancias los productos excretores/secretores (E/S) in vitro brutos pueden
conferir inmunidad a ratas (Rajasekariah y col., Parasitol. 79 (1979), págs. 393-400).
Ahora se ha encontrado que los productos excretores/secretores de F. hepatica) contienen una nueva
proteı́na que tiene un tipo de actividad de dipeptidil-peptidasa (DPP), descrita más detalladamente aquı́
en lo sucesivo. Este descubrimiento abre camino a la posibilidad de vacunas contra F. hepatica y otros
helmintos, en base al empleo de la nueva enzima como un antı́geno y/o de las enzimas correspondiebntes
producidas por otros helmintos parásitos.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención proporciona una vacuna para uso en
la lucha contra una infestación parasitaria de helmintos en un mamı́fero, donde el material antigénico
comprende una serina-proteasa que tiene una actividad de tipo dipeptidil-peptidasa, en una forma al
menos parcialmente purificada, o un fragmento antigénico o epı́tope del mismo, junto con un vehı́culo
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y/o un adyuvante.
5
La invención también proporciona un método de lucha contra una infestación parasitaria de helmintos
en un mamı́fero, que comprende administrar a dicho mamı́fero una vacuna según la invención, como se
ha definido aquı́ en lo que antecede, en una cantidad eficaz para combatir dicha infestación.
Preferiblemente, el mamı́fero es un rumiante, por ejemplo, reses de ganado vacuno o lanar, pero la
vacuna y el método de la invención también pueden encontrar aplicación en seres humanos.
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Preferiblemente, la proteasa del tipo dipeptidil-peptidasa se obtiene a partir de trematodos tales como
Fasciola o Dicrocoelium, en particular a partir del trematodo del hı́gado Fasciola hepatica. Alternativamente se prefiere que la dipeptidil-peptidasa sea capaz de estimular una respuesta inmune que sea
eficaz contra Fasciola o Dicrocoelium, en particular F. hepatica y F. gigantica, tal como proteasas del
tipo dipeptidil-peptidasa de otras especies que sean capaces de conferir una respuesta inmune protectora
cruzada, formando ası́ un aspecto particularmente preferido de la invención.
La proteasa del tipo dipeptidil-peptidasa de F. hepatica que, según se indica aquı́ más adelante, posee
un peso molecular de aproximadamente 200 KDa, por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, en condiciones reductoras y no reductoras, y por cromatografı́a de filtración en gel, se
prefiere de modo particular para empleo en la vacuna y el método de la invención y como nueva proteı́na
por sı́ misma forma un aspecto adicional de la invención.
La dipeptidil-peptidasa incorporada en la vacuna de acuerdo con la invención está en forma al
menos parcialmente purificada. Preferiblemente, la dipeptidil-peptidasa comprende al menos 75 % de
las proteı́nas excretoras/secretoras totales presentes en la vacuna y más preferiblemente la dipeptidilpeptidasa tiene una pureza de al menos 95 %. Se apreciará que una vez que se haya obtenido la dipeptidilpeptidasa de al menos 95 % de pureza, se puede mezclar con una o más proteı́nas antigénicas purificadas
adicionales, incluyendo una o más proteı́nas excretoras/secretoras adicionales, para formar una vacuna
polivalente.
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35
40
Una forma preferida de vacuna polivalente de acuerdo con la invención contendrá una dipeptidilpeptidasa como las mencionadas anteriormente en combinación con un antı́geno del tipo Catepsina L,
como se describe más detalladamente en el documento de solicitud de patente internacional n◦ WO94/
09142. Tal vacuna polivalente, al inducir inmunidad en la especie hospedante frente a dos aspectos separados del parásito helmı́ntico invasor, aumentará considerablemente la probabilidad de protección contra
el helminto y disminuirá considerablemente las oportunidades de que ocurra infestación.
Se han aislado dipeptidil-peptidasas a partir de una fuente mamı́fera (J. Biol. Chem. 263 (1988),
páginas 6613-6618) y se caracterizaron por la capacidad de escindir sustratos dipeptı́dicos. Se observaron
cuatro especificidades diferentes que se describen más detalladamente aquı́ en lo sucesivo. Las dipeptidilpeptidasas de la presente invención se caracterizan también por su capacidad de escindir sustratos dipeptı́dicos enlazados por un fluorógeno mientras que no presentan actividad alguna contra sustratos de
mono-aminoácidos enlazados a fluorógeno, demostrando ası́ que las enzimas escinden aminoácidos por
parejas a partir del extremo N-terminal del sustrato.
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60
Las vacunas de acuerdo con la invención se pueden formular con vehı́culos y/o adyuvantes convencionales y la invención también proporciona un procedimiento para la preparación de las vacunas,
que comprende poner en asociación dipeptidil-peptidasa purificada o un fragmento antigénico o epı́tope
del mismo y uno o más adyuvantes o vehı́culos. Adyuvantes adecuados incluyen hidróxido de aluminio, saponina (ISCOMs), quil A y formas más purificadas del mismo, dipéptido de muramilo, aceites
minerales y vegetales, DEAE dextrano, copolı́meros de bloques no iónicos o liposomas tales como Novasomas (marca comercial de Micro Vesicular Systems Inc.), en presencia de uno o más vehı́culos o
diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los vehı́culos para secuencias peptı́dicas correspondientes a
epı́topes de dipeptidil-peptidasas de acuerdo con la invención pueden ser proteı́nas tales como el péptido
de antı́genos múltiples del antı́geno nuclear de la Hepatitis B, o lipopéptidos tales como tripalmitoilS-glicerilcisteinilserilserina (P3CSS). Diluyentes adecuados incluyen medios lı́quidos tales como solución
salina apropiada para uso como vehı́culos. Se pueden incluir componentes adicionales tales como conservantes.
La administración de la vacuna a la especie hospedante se puede efectuar por cualquiera de las rutas convencionales, p.ej., oral o parenteralmente, tal como por inyección intramuscular, opcionalmente a
intervalos, p.ej., dos inyecciones a un intervalo de 7-35 dı́as. Una dosis adecuada, cuando se administra
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por inyección, podrı́a ser tal que diera una cantidad de proteı́na dipeptidil-peptidasa dentro del intervalo
de 10-500 µg.
5
Aunque la dipeptidil-peptidasa para uso en la vacuna de acuerdo con la invención se puede preparar
por aislamiento de los productos excretores/secretores de helmintos y/o adultos jóvenes, también puede
ser conveniente prepararla por técnicas de ADN recombinante con las consabidas ventajas que originan
tales técnicas en lo que se refiere a aumento de escala de producción y reproducibilidad. Ası́, la invención
también proporciona una dipeptidil-peptidasa o una proenzima para la misma, o un fragmento antigénico
o epı́tope de la misma, producida por medios de técnicas de ADN recombinante.
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15
20
25
Aspectos adicionales de la invención relacionados con lo anterior incluyen las moléculas de ADN que
codifican dipeptidil-peptidasas o fragmentos antigénicos o epı́topes de las mismas; vectores que contienen
una o más secuencias de ADN de esta clase; células hospedantes, por ejemplo, bacterias tales como E.
coli o más preferiblemente células eucarióticas, transformadas por tales vectores, por ejemplo, por un
vector de baculovirus; y procedimientos para preparar dipeptidil-peptidasa recombinante o fragmentos
antigénicos o epı́topes de la misma, que comprenden cultivar tales células hospedantes transformadas y
aislar dicha dipeptidil-peptidasa o fragmento o epı́tope a partir de las células cultivadas.
Una formulación de vacuna viva o inactivada alternativa puede comprender un virus atenuado o virulento o una célula hospedante, p.ej. un microorganismo tal como una bacteria, que tiene insertado en
ella una molécula de ácido nucleico (p.ej. una molécula de ADN) de acuerdo con la invención para la
estimulación de una respuesta inmune dirigida contra polipéptidos codificados por la molécula de ácido
nucleico insertada. Se prefiere de modo particular un vector bacteriano que incite inmunidad local en la
mucosa intestinal frente a un antı́geno de trematodos, que después bloquee la migración de trematodos
jóvenes, y se prefieren de modo notable especies invasivas tales como especies de Salmonella.
También pueden estar presentes materiales antigénicos adicionales en la vacuna, produciendo ası́ un
efecto protector intensificado contra el parásito helmı́ntico en cuestión o un efecto protector combinado
contra una o más infestaciones parasitarias adicionales.
30
Todavı́a otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo monoclonal o policlonal capaz de inducir inmunidad frente a una dipeptidil-peptidasa en un mamı́fero cuando se administra a dicho mamı́fero,
teniendo el anticuerpo una afinidad para la región variable de uno o más anticuerpos adicionales, tendiendo dichos anticuerpos adicionales una afinidad para dicha dipeptidil-peptidasa.
35
Esta estrategia, la denominada estrategia del “anti-idiotipo”, permite la formulación de una vacuna
que se dispensará ı́ntegramente con el antı́geno original y puede ofrecer ventajas aun mayores en términos
de seguridad, ausencia de efectos secundarios y comodidad de fabricación.
40
La invención se ilustra por los siguientes ejemplos:
1) Preparación de productos liberados in vitro
45
Se retiraron trematodos maduros de Fasciola hepatica de los conductos biliares de hı́gados de reses
de vacuno, obtenidos en un matadero de Irlanda. Los trematodos se lavaron seis veces con solución
salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,3, y después se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial
Institute (RPMI) - 1640, pH 7,3, que contenı́a 2 % de glucosa, Hepes 30 mM y 25 mg/l de gentamicina
durante una noche a 37◦ C. Después se retiró el medio (productos excretores/secretores o E/S), se congeló
y se guardó a -20◦ C.
50
2) Purificación de proteasa del tipo dipeptidil-peptidasa
55
60
Se concentraron 500 ml de productos E/S de trematodos adultos hasta un volumen de 10 ml en una
unidad de ultrafiltración Amicon 8400, utilizando una membrana UM 3. La muestra se retiró y se centriR
S200,
fugó a 15.000 x g durante 45 min. Después se aplicó el sobrenadante a una columna de Sephacryl
de 300 ml de capacidad, equilibrada en Tris 0,1 M, pH 7,0. La columna se eluyó con Tris 0,1 M, pH 7,0.
Se recogieron fracciones (5 ml) después de haber pasado el volumen evacuado de 100 ml. El eluato se
vigiló, para evaluar el contenido de proteı́na, a 280 nm y las fracciones se ensayaron para determinar la
actividad de dipeptidil-peptidasa utilizando el sustrato Gly-Pro-AMC en HEPES 0,25 M, pH 6,8 (Figura
1) (AMC es 7-amino-4-metilcumarina). Las fracciones que contenı́an actividad DPP se reunieron (aproximadamente 40 ml) y se concentraron hasta 8 ml en una unidad de ultrafiltración Amicon, utilizando
una membrana UM3. El concentrado se dividió en ocho fracciones de 1 ml y se guardó congelado a -20◦ C.
4
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5
Se descongeló un ml de concentrado y se dializó frente a HEPES 0,025 M, pH 6,8, y se aplicó a una
R
, de 12 ml de capacidad, (1,5 x 8 cm), equilibrada en el mismo
columna de dietilaminoetil-Sepharose
tampón. La columna se eluyó con un gradiente salino (NaCl 0-40 mM en tampón de equilibración) y se
recogieron fracciones (2,5 ml). El eluato se vigiló a una DO de 280 nm y se obtuvieron dos picos. Se
ensayaron fracciones para determinar la actividad DPP utilizando el sustrato Gly-Pro-AMC. La actividad DPP estuvo presente en el primer pico y eluyó a una concentración de NaCl aproximadamente 100
mM (Figura 2). Estas fracciones se reunieron, concentraron en una unidad de ultrafiltración Amicon, se
dializaron contra agua desionizada, se liofilizaron y se guardaron a -20◦C.
10
3) Estimación del tamaño molecular de dipeptidil-peptidasa
15
20
R
S200 como se ha descrito antes
La cromatografı́a de filtración en gel llevada a cabo sobre Sephacryl
(utilizando inmunoglobulina, 150 kDa, albúmina, 68 kDa, ovoalbúmina, 45 kDa y β-lactoglobulina, 18,4
kDa, como patrones) indicó un tamaño molecular de aproximadamente 200 kDa para el pico de actividad
del tipo DPP. También se analizaron muestras de proteasa purificada por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % con 0,1 % de SDS, en condiciones no reductoras. El tamaño molecular se estimó en 200
kDa (véase la Fig. 3, calle 1: productos E/S, calle 2; proteasa purificada). El análisis por electroforesis
en gel de poliacrilamida al 10 % con 0,1 % de SDS reveló un tamaño molecular similar, lo que indica que
la proteasa está formada por una sola cadena polipeptı́dica.
4) Caracterización de pH óptimo para la actividad del tipo dipeptidil-peptidasa
25
Se estimó la actividad de la proteasa tanto sobre sustrato gly-pro-AMC como sobre sustrato lys-alaAMC a lo largo del intervalo de pH de 4,5 a 8,2. Se determinó que el pH para la actividad óptima era
6,8. También se demostró que la actividad de la proteasa era óptima en tampón HEPES; tanto el tampón
Tris como el tampón fosfato afectaban de modo adverso a la actividad (véase la Tabla 1). Por lo tanto,
el tampón HEPES (50 mM pH 6,8) ha sido el tampón rutinario utilizado en todos los experimentos y
procedimientos de purificación.
30
TABLA 1
Actividad del tipo DPP utilizando diferentes sistemas de tampón y pH
35
40
45
50
55
60
Tampón (pH)
Lys-Ala-AMC
% de actividad
Gly-Pro-AMC
% de actividad
Hepes 50 mM (6,8)
100
100
Hepes 50 mM (7,6)
61
20
Hepes 50 mM (8,2)
22
1
Citrato sódico 0,1 M
(4,5)
11
8
Tris HCl 0,1 M (6,8)
10
15
PBS 0,1 M (7,2)
14
35
5) Especificidad de proteasa para el sustrato
Se utilizó la especificidad para el enlace peptı́dico utilizando varios sustratos peptı́dicos fluorogénicos
que se habı́an utilizado previamente para clasificar las dipeptidil peptidasas de mamı́fero, I, II, III y IV (J.
Biol. Chem. 263 (1989), páginas 6613-6618). Estos sustratos fueron gly-arg-AMC (DPP-I), lys-ala-AMC
(DPP-II), arg-arg-AMC (DPP-III) y gly-pro-AMC (DPP-IV).
La mezcla de ensayo contenı́a 200 µl de sustrato 20 µM, 100 µl de solución enzimática y 900 µl de
Hepes 50 mM, pH 6,8. La reacción se dejó transcurrir a 37◦C y se detuvo por adición de 200 µl de
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ácido acético 1,7 M. La AMC liberada se midió en un fluorómetro con longitudes de onda de excitación
y emisión de 370 nm y 440 nm, respectivamente.
5
10
La proteasa del trematodo del hı́gado escindió selectivamente lys-ala-AMC y gly-pro-AMC, siendo las
constantes de Michaelis-Menton (Km) para estos sustratos 58 y 25 µM, respectivamente. La proteasa no
escindió los sustratos gly-arg-AMC y arg-arg-AMC. Estos datos demuestran que la proteasa es nueva;
no se ha descrito antes de ahora una enzima del tipo DPP que tenga afinidades (Km) tan similares para
estos dos sustratos. La enzima de trematodo muestra tanto actividad de tipo DPP-II como DPP-IV si
se utiliza la clasificación aplicada a las DPP de mamı́fero. La enzima no mostró actividad alguna contra
diversos sustratos para aminopeptidasa, incluyendo lys-, ala-, leu- y pro-AMC. Estos datos demuestran
la especificidad de la enzima para sustratos dipeptı́dicos.
6) Visualización directa de actividad del tipo DPP en geles de poliacrilamida
15
20
25
Para verificar que era una sola proteasa con actividad tanto del tipo DPP2 como del tipo DPP4 la que
estaba presente en productos E/S del trematodo del hı́gado, se separaron electroforéticamente muestras
de E/S en geles de poliacrilamida nativa al 10 % (preparados como se ha descrito anteriormente, con la
excepción de que no se añadió SDS a las muestras o los geles) y después de la electroforesis los geles se
sumergieron en soluciones de los diversos sustratos enlazados por fluorógeno (50 µM en HEPES 50 mM).
Después de la incubación, los geles se ubicaron en un transiluminador UV y se fotografiaron utilizando
R
. Únicamente se visualizó una sola banda, con una movilidad idéntica, utilizando
pelı́cula polaroid
los sustratos gly-pro-AMC y lys-ala-AMC. No se visualizaron bandas utilizando gly-arg-AMC, arg-argAMC, ala-AMC ni pro-AMC (Fig. 4 y tabla 2, más adelante). También se observó que la proteasa del
tipo DPP purificada migraba de modo similar en estos geles y exhibı́a una especificidad similar para el
sustrato. G-R, K-A, R-R, G-P, A y P son, respectivamente, Gly-Arg-AMC, Lys-Ala-AMC, Arg-ArgAMC, Gly-Pro-AMC, Ala-AMC y Pro-AMC. Los valores de Km son como los que se han dado en la
sección inmediatamente anterior.
TABLA 2
30
Especificidad de proteasa del tipo DPP, procedente de productos E/S de F. hepatica, para sustratos
Sustrato
Actividad
(unidades arbitrarias)
35
40
45
50
Gly-Arg-AMC (DPP I)
-
Lys-Ala-AMC (DPP II)
++++
Arg-Arg-AMC (DPP III)
-
Gly-Pro-AMC (DPP IV)
+++
Pro-AMC
-
Ala-AMC
-
7) Estudios de inhibidores
55
60
Se examinó el efecto de diversos iones metálicos sobre la actividad hidrolı́tica de la enzima utilizando
tanto gly-pro-AMC como lys-ala-AMC como sustratos en ensayos como los que se han descrito anteriormente. Los resultados demuestran que iones metálicos tales como calcio, magnesio y manganeso tienen
poco efecto sobre la actividad enzimática, mientras que zinc a concentración 1 mM inhibe la actividad en
>85 %. Los metales pesados hierro, mercurio, cadmio y cobalto inhiben todos la actividad enzimática a
>90 % a una concentración de 5 mM, mientras que el plomo mostró <20 % de inhibición a esta concentración. La enzima no fue inhibida por los inhibidores de proteinasas EDTA, pepstatina ni aprotinina,
lo que indica que la enzima no es una metalo- o aspartil-proteasa. La enzima es inhibida por fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF), un inhibidor de serina- y cisteinil-proteinasas; sin embargo, como no se
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5
observa ninguna activación de la enzima con agentes activantes tiólicos tales como cisteı́na, ditiotreitol
y mercaptoetanol, no parece que la enzima sea una cisteinil-proteinasa. Benzamidina, un inhibidor de
serina-proteinasas, inhibe la actividad de la DPP. La conclusión es que la enzima del trematodo del hı́gado
es una serina-proteı́nasa. Estos estudios de inhibición también apoyan la conclusión de los autores de
esta invención de que una sola enzima escinde ambos sustratos gly-pro-AMC y lys-ala-AMC, ya que se
observó un perfil similar de inhibidores cuando se utiliza cualquier sustrato (Tabla 3).
TABLA 3
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Efectos de metales pesados e inhibidores sobre actividad DPP
Sustancia
Concentración
(mM)
15
Ninguna
20
25
30
35
40
45
Actividad residual
( %)
Lys-Ala
Gly-Pro
100
100
66
66
104
102
76
78
105
116
Mn
1
Mn
0,5
Mg
1
Mg
0,5
Ca
1
62
57
Ca
0,5
96
133
Zn
1
14
3
Zn
0,5
37
80
Pb
1
103
109
Pb
5
82
70
Cd
1
19
26
Cd
5
5
6
Co
1
28
20
Co
5
6
4
Fe
1
5
6
50
55
60
7
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TABLA 3 (continuación)
Sustancia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Concentración
(mM)
Actividad residual
( %)
Lys-Ala
Gly-Pro
Fe
5
2
2
Hg
1
4
7
Hg
5
2
5
2-Mercaptoetanol
1
75
87
EDTA
2
121
108
Pepstatina
5 µg/ml
92
108
Aprotina
5 µg/ml
116
109
PMSF
2
3
2
DTT
1
62
90
DTT
0,5
61
77
Cisteı́na
1
105
104
Cisteı́na
0,5
112
104
Benzamidina
1
ND
77
Benzamidina
5
ND
35
Benzamidina
10
ND
23
Puromicina
0,1
100
100
Puromicina
0,02
100
100
Bacitracina
0,1
100
100
Bacitracina
0,02
100
100
8) Estudios de inhibición con puromicina y bacitracina
60
DPP2 y DPP4 de mamı́fero se pueden distinguir utilizando los inhibidores puromicina y bacitracina;
la puromicina sólo inhibirá DPP2 mientras que la bacitracina sólo inhibe DPP4 (J. Biol. Chem. 263
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(1988), 6613-6618). Cuando estos dos sustratos se ensayaron en estudios de inhibición con la enzima del
trematodo, tampoco mostraron ningún efecto inhibidor que destacara otra diferencia entre las DPP de
mamı́fero y la enzima del trematodo (véase la Tabla 3 anterior).
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REIVINDICACIONES
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1. Una vacuna para empleo en la lucha contra una infestación parasitaria de helmintos en un mamı́fero,
en la que el material antigénico comprende una proteasa que tiene actividad del tipo dipeptidil-peptidasa,
en forma al menos parcialmente purificada, o un fragmento antigénico o epı́tope del mismo, junto con un
vehı́culo y/o adyuvante.
2. Una vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho material antigénico se obtiene a partir de
una especie de Fasciola o Dicrocoelium.
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3. Una vacuna según la reivindicación 2, en la que el material antigénico se obtiene a partir de Fasciola
hepatica.
4. Una vacuna según la reivindicación 3, en la que el material antigénico es dipeptidil-peptidasa que
tiene un peso molecular de 200 kDa por electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio
en condiciones reductoras y no reductoras.
5. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho material antigénico comprende de 75 % a 100 % de las proteı́nas excretoras/secretoras helmı́nticas totales presentes.
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6. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un
antı́geno del tipo Catepsina L.
7. Una dipeptidil-peptidasa de origen F. hepática, que tiene un peso molecular de 200 kDa por electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio, en condiciones reductoras y no reductoras,
y que escinde selectivamente los sustratos dipeptı́dicos lys-ala y gly-pro.
8. Un procedimiento para la preparación de una vacuna según la reivindicación 1, que comprende
poner en asociación dicho material antigénico y uno o más adyuvantes y/o vehı́culos.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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