CINETICA DE AZUCARES DURANTE EL PROCESO DE

CINETICA DE AZUCARES DURANTE EL PROCESO DE GERMINACIÓN DEL Zea
Mays IOWA B73
Adrián García Casarrubias, Licenciatura en Biotecnología, Facultad de Química, Universidad
Autónoma de Querétaro
Dr. Axel Tiessen Favier, Laboratorio de Metabolómica y Fisiología Molecular, Depto. De
Ingeniería Genética, CINVESTAV-IPN Unidad Irapuato
RESUMEN
El maíz ha sido durante milenios la base de la alimentación de la población mesoamericana, pero
desafortunadamente el maíz como base de la alimentación presenta diferentes desventajas
nutricionales, entre ellas la elevada concentración de carbohidratos, que generan una elevada
ingesta calórica en la población cuya base de la alimentación es la tortilla o el maíz en general. Uno
de os objetivos del laboratorio de Metabolómica y Fisiología Molecular del CINVESTAV Unidad
Irapuato es crear, por mejoramiento genético tradicional, variedades de maíz que cumplan con los
requerimientos nutricionales de la población mexicana, siendo una de sus líneas de investigación el
estudio de los azucares presentes en el maíz, principalmente las solubles.
Con el objetivo de acelerar el proceso de identificación de las variedades con concentraciones
deseables de azucares solubles, en este trabajo se estudió la cinética que presentan las
concentraciones de azucares solubles durante el proceso de germinación, con lo que se intentará
determinar las concentraciones de azucares solubles que tendrá la planta madura, sin tener que
esperar a que esta madure, permitiendo descartar las no deseables y propagar las deseables.
Palabras Clave: Germinación Azucares solubles, Zea Mays, IOWA B73
INTRODUCCIÓN
A pesar de la importancia que durante milenios ha tenido el cultivo y consumo de maíz en nuestra
cultura hasta hace poco los métodos y materiales usados se basaban más en conocimientos
empíricos que en conocimientos científicos, la falta tanto de tecnología como de conocimientos
evitaron, por mucho tiempo la propagación de una cultura agronómica más científica en nuestro
país. Fue hasta hace pocos años cuando, gracias a la tecnología existente en otras partes del mundo
y los conocimientos adquiridos a lo largo del tiempo por personas con enfoque científico, que se
comenzó a buscar variedades mejoradas que satisficieran necesidades especificas para los distintos
usos que se le da al maíz. Fue así que se comenzaron a crear variedades resistentes a herbicidas y
plagas, así como variedades con rendimientos muy superiores a las variedades nativas, Cumpliendo
con las necesidades de los países que desarrollaron estas variedades, que únicamente lo emplean
como alimento pecuario, pero al no realizarse suficientes avances en esa materia en los países
consumidores de maíz como alimento, se descuido el aspecto nutricional del maíz.
Recientemente en centros de investigación nacionales como el Instituto Nacional de Investigación
Forestal Agrícola y Pecuaria (INIFAP) y el Centro de Investigaciones Avanzadas del Instituto
Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN) se ha buscado potenciar la investigación científica,
enfocada en productos agronómicos entre ellos el maíz, siendo parte importante de este esfuerzo el
Laboratorio de Metabolómica y Fisiología Molecular del CINVESTAV Unidad Irapuato, que se
enfoca en investigación y mejora genética tradicional de variedades de maíz rico en Aminoácidos
esenciales, Carotenos, Antocianinas, y con concentraciones adecuadas de carbohidratos. Uno de los
objetivos de éste laboratorio es el de generar variedades que posean suficientes carbohidratos para
proporcionar energía a quien los consuma, pero sin que esto represente una ingesta calórica
demasiado elevada. Para llegar a este objetivo es necesario conocer y estudiar todos los procesos
metabólicos en los que se involucran los carbohidratos, entre ellos el proceso de germinación, si
conocemos la cinética de los carbohidratos durante el proceso de germinación, podemos predecir la
concentración de los distintos carbohidratos solubles en la planta madura, lo que nos ahorrara
tiempo, pudiendo de esta manera descartar las plantas que consideremos que tienen concentraciones
inadecuadas de carbohidratos en las etapas tempranas de crecimiento, ahorrándonos tiempo y
recursos, a ser focalizados en las variedades que identifiquemos en etapas tempranas con las
concentraciones adecuadas de carbohidratos.
OBJETO DEL ESTUDIO
En este estudio buscaremos evaluar los cambios presentes en la concentración de las distintas
azucares soluble, tales como Glucosa, Fructosa y Sacarosa a lo largo de las distintas fases del
proceso de germinación del Zea Mays de la variedad IOWA B73, bajo condiciones ideales de
crecimiento.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-Determinar las condiciones ideales de germinación para la variedad IOWA B73, considerando las
variables de Agua, Temperatura, Oxigeno y Luz.
-Germinar las semillas bajo las condiciones evaluadas como las ideales y evaluar la concentración
de azucares solubles en diferentes momentos del proceso de germinación
MATERIALES Y MÉTODOS
En primer lugar realizamos un experimento en el que el objetivo era encontrar las condiciones
ideales de germinación para la variedad IOWA B73 ,variedad ampliamente utilizada en estudios
científicos por los conocimientos genéticos que se tienen de ella, considerando las variables de
Agua, Oxigeno, Temperatura y Luz. Para esto realizamos un diseño experimental basado en 2
niveles de cada variable. (Tabla 1)
El tiempo de germinación fue de 4 días, y se evaluaron factores de Apariencia, asi como largo del
coleotilo y raíz, para determinar las condiciones ideales, Una vez concluidos los 4 días de
germinación bajo las condiciones expuestas previamente, solo se observó germinación en los
tratamientos 1 y 9. Consideramos como condiciones ideales las del tratamiento 1 ya que el
Tratamiento 9 presentó decoloración del coleotilo, principalmente por la baja síntesis de clorofila
ocasionada por la falta de luz. (Tabla 2 y Figura 1 )
Una vez determinadas las condiciones ideales, se determinó que los tiempos para tomar las
muestras para el experimento serían en los días 0, 3, 5, y 7 para así obtener puntos de comparación
en al menos cuatro momentos de la germinación. (Figura2)
El protocolo que se siguió para realizar las mediciones de azucares solubles fue el siguiente,
germinando con semillas de Zea Mays de la variedad IOWA B73 provenientes del Centro
Internacional de Mejoramiento de maíz y Trigo (CIMMYT), tomando 5 semillas para cada
medición y validándolo por triplicado.
Protocolo de determinación de azucares solubles:
Germinar bajo condiciones ideales
Tomar muestras los días 0, 3, 5, y 7, utilizando tanto la semilla como el coleoptilo y la raíz.
Congelar con Nitrógeno liquido durante 10min y almacenar a -80oC en equipo REVCO ®
Premoler en molino de postas durante 1min a 30Hz en equipo Retsch MM301 ®
Liofilizar durante 36hrs en equipo LABCONCO®
Moler de nuevo en molino de postas, 1min a 30Hz en el mismo equipo
Pesar 20mg de muestra en una microplaca Deepwell
Extraer las azucares solubles con 1ml de agua desionizada por pozo de la microplaca, durante 1hr
en agitación constante a 65oC
Centrifugar 5 min a 3700rpm en equipo Eppendorf® y utilizar el sobrenadante
Prepara el reactivo Sugar Assay que contiene ATP, NADP, G6P
Tomar 5µl del sobrenadante y mezclar con 200µl de Suggar Assay en una placa Greiner®
Tomar lectura de blanco en el lector de microplacas µQuant ® a 340nm
Esperar a que la lectura se estabilize
Agregar Hexoquinasa (HK) Bayer ®, mezclar y esperar a que la lectura se estabilice
Agregar Isomerasa (PGI) Fluka ®, mezclar y esperar a que la lectura se estabilice
Agregar Invertasa (I) Sigma ® , mezclar y esperar a que la lectura se estabilice
La lectura a 340nmse basa en el principio de acoplamiento enzimático de la reacción de la
hexoquinasa con la reacción de la G6P deshidrogenasa y la comparación contra la lectura a 405nm
en referencia al valor de absorbancia máxima del NADPH bajo estas condiciones de lectura
(Figura4 y Figura 5)
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Después de realizar la metodología previamente expuesta, y obtener las lectura a 340nm se
procesaron los datos en un paquete informático obteniendo de esta manera las concentraciones de
azúcares solubles en micromol por gramo de peso fresco (µmol/gFW), para posteriormente realizar
los cálculos estadísticos entre las distintas repeticiones del experimento, para con los datos ya
sintetizados realizar la siguiente gráfica. (Figura 6)
En los resultados, claramente se observa un aumento exponencial en la concentración de Glucosa
conforme aumenta el tiempo de germinación principalmente causado por la degradación del
almidón de la semilla, mientras que tanto la Fructosa como la Sacarosa presentan un
comportamiento complementario, mostrándose las mayores diferencias tanto en el día 0 como en el
día 5 siendo la causa del aumento en la concentración de Fructos, la degradación de Sacarosa, en
tanto que el aumento final en la concentración de Sacarosa se debe al inicio del proceso
fotosintético.
CONCLUSIONES
En primer lugar, consideramos que este experimento mostro alto índice de repetitividad entre las
tres repeticiones, se mostraron datos consistentes y reproducibles.
En cuanto a las causas de los resultados obtenidos, el comportamiento de la Glucosa, Sacarosa y
Fructosa, puede ser fácilmente explicado, por la degradación de la Sacarosa en Glucosa +Fructosa,
por lo que podemos observar que en los puntos en los que la fructosa se encuentra en el máximo, la
sacarosa se encuentra en sus valores mínimos, mientras que los valores de Glucosa derivada de
sacarosa se van aumentando al valor de Glucosa libre proveniente de la degradación del almidón.
La utilidad de este estudio se puede centrar en la posibilidad de obtener datos de la
proporción de la concentración de azúcares en una planta con pocos días de germinada,
para relacionarla con la concentración de azucares solubles de una planta madura, lo que
aceleraría el proceso de selección para el mejoramiento genético pudiendo seleccionar las
plantas con las concentraciones adecuadas de azucares solubles y descartar las que
presenten concentraciones de azucares solubles no deseadas.
REFERENCIAS
*/Rodriguez Montessoro, Rafael, El cultivo de maíz Temas selectos Mundi Prensa 1ª
Edición, 2008
*Tiessen Favier, Axel Conceptos Básicos y metodologías innovadoras del mejoramiento
genético del maíz 1ª Edicion 2008
*Poehlman Milton, John Mejoramiento genético de las Cosechas, Limusa Wiley 2da
Edición 2005
*Journal of Experimental Botany, Vol 85 No 9, 2007 pp2270-3389