NTE INEN 1529-18: Control microbiológico de los

Re
p
u
b
l
i
co
fEc
u
a
d
o
r
≠ EDI
CTOFGOVERNMENT±
I
no
r
d
e
rt
op
r
o
mo
t
ep
u
b
l
i
ce
d
u
c
a
t
i
o
na
n
dp
u
b
l
i
cs
a
f
e
t
y
,e
q
u
a
lj
u
s
t
i
c
ef
o
ra
l
l
,
ab
e
t
t
e
ri
n
f
o
r
me
dc
i
t
i
z
e
n
r
y
,t
h
er
u
l
eo
fl
a
w,wo
r
l
dt
r
a
d
ea
n
dwo
r
l
dp
e
a
c
e
,
t
h
i
sl
e
g
a
ld
o
c
u
me
n
ti
sh
e
r
e
b
yma
d
ea
v
a
i
l
a
b
l
eo
nan
o
n
c
o
mme
r
c
i
a
lb
a
s
i
s
,a
si
t
i
st
h
er
i
g
h
to
fa
l
lh
u
ma
n
st
ok
n
o
wa
n
ds
p
e
a
kt
h
el
a
wst
h
a
tg
o
v
e
r
nt
h
e
m.
NTE INEN 1529-18 (1998) (Spanish): Control
microbiológico de los alimentos. Clostridium
perfringens. Recuento en tubo por siembra en
masa
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN
Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA
NTE INEN 1 529-18:98
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS.
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. RECUENTO EN TUBO POR
SIEMBRA EN MASA
Primera Edición

First Edition
DESCRIPTORES: Alimentos, control microbiológico, Clostridium perfringens
AL 01.05-315
CDU: 614.31:579.672:579.85
CIIU: 9320
ICS: 07.100.30
CDU: 614.31:579.672:579.85
ICS: 07.100.30
Norma Técnica
Ecuatoriana
Opcional
CIIU: 9320
AL 01.05-315
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS RECUENTO EN TUBO POR
SIEMBRA EN MASA
NTE INEN
1 529-18:98
1998-01
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
1 . OBJETO
1.1 Esta norma describe el método de recuento en tubo por siembra en masa para determinar
el número de células viables de Clostridium perfringens, presentes en un gramo o centímetro
cúbico de muestra de alimento.
2. ALCANCE
2.1 Este método es útil para situaciones en que se requiera de un método rápido y altamente selectivo.
3. DEFINICIONES
3.1 Clostridium perfringens. Es una especie bacteriana del género Clostridium, que tiene forma
bacilar, inmóviles, esporulados con esporo central o subterminal, capsulados, Gram. positivos,
°
crecen abundantemente a 43-47 C. Las esporas son resistentes al calor, frío y antisépticos.
3.2 Recuento de Clostridium perfringens. Es la determinación del número de células viables de
3
Cl .perfringens que, a partir de un gramo o cm de alimento, se desarrollan sobre medios selectivos.
4. FUNDAMENTO
4.1 Este método se basa en tres características importantes del Clostridium perfringens: alta tolerancia a la
°
polimixina y neomicina, poder reductor del sulfito y su crecimiento óptimo a 46 C. La utilización de estas
características para el cultivo primario toma innecesario realizar pruebas confirmatorias
adicionales.
4.2 Para efecto de esta norma, se utiliza la técnica de recuento en tubos y el agar TSN que
es altamente selectivo para el Clostridium perfringens. Utilizar el agar-triptosa-sulfito-cicloserina,
TSC, para el cultivo de clostridios lesionados por el calor o el frío.
5. MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
5.1 Medios de cultivo y reactivos
5.1.1 Requisitos básicos. Para que haya uniformidad en los resultados, es necesario que los
componentes de los medios sean de una calidad uniforme y de grado analítico o, a su vez, se
debe utilizar medios completos deshidratados, reconstituir y utilizarlos según las instrucciones del fabricante.
5.1.2 Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos. Ver NTE INEN 1529-1
(Continúa)
DESCRIPTORES: Alimentos, control microbiológico, Clostridium perfringens
-1-
1994-046
NTE INEN 1 529-18
1998-01
5.1.2.1 Agar TSN
5.1.2.2 Agar triptosa-sulfito-cicloserina TSC
5.1.2.3 Agua peptona 0,1 %
5.1.2.4 Medio SIM
5.1.2.5 Reactivo de Kovacs
5.1.2.6 Tubos para el diagnóstico de Cl. perfringens (CPT).
5.1.2.7 Medio tioglicolato fluido
5.1.2.8 Vaselina liquida.
5.2 Instrumental y vidriería
5.2.1 La vidriería y utensilios que se utilicen en los ensayos deben ser de material inerte y resistente a
esterilizaciones repetidas, además, deben estar perfectamente limpios y estériles.
3
5.2.1.1 Pipetas bacteriológicas de boca ancha graduadas en 1/10 de cm .
5.2.1.2 Tubos de ensayo de 22 mm x 200 mm
5.2.1.3 Tubos de ensayo de 12 mm x 120 mm
5.2.1.4 Frascos con tapa de rosca, para muestras
5.2.1.5 Jarras anaeróbicas o cualquier otro equipo adecuado para cultivo anaeróbico.
°
5.2.1.6 Incubador 46 C
5.2.1.7 Contador de colonias
6. MUESTREO, CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
6.1 Tomar las muestras según la NTE INEN 1529-2
6.2 Las unidades de muestras perecederas que llegan al laboratorio deben mantenerse en
°
°
refrigeración, entre 0 C y 5 C, por no más de 24 h. En general, las muestras deben mantenerse en las
condiciones adecuadas al producto, hasta el momento del examen.
6.3 La unidad analítica debe provenir de una unidad de muestra de por lo menos 100 g y ser
preparada según la NTE INEN 1529-2.
(Continua)
-2-
1994-046
NTE INEN 1 529-18
1998-01
7. PROCEDIMIENTO
7.1 Siembra
°
7.1.1 En tubos que contengan agar TSN fundido y temperado entre 50 y 55 C, de cada dilución
3
decimal, pipetear por duplicado volúmenes de 1 cm , introduciendo la pipeta hasta el fondo y dejando caer la
muestra al retirar la pipeta con movimiento helicoidal ascendente. Utilizar una nueva pipeta
estéril para cada dilución.
7.1.2 Poner los tubos en pie en un baño de agua fría para que el agar se solidifique rápidamente.
7.1.3 Cubrir la siembra con una capa de vaselina líquida estéril de 1 cm de espesor (vaselina-parafina, agar al 2%,
parafina) o poner los tubos en una jarra anaeróbica.
°
7.1.4 Incubar a 46 C por 16 a 18 h.
7.2 Recuento de colonias
7.2.1 Elegir los dos tubos de la dilución que contengan entre 30 ± 10 colonias negras, contarlas y
calcular el número de unidades formadoras de colonias (células vegetativas y esporos) por gramo o
centímetro cúbico de alimento. Cuando la siembra ha sido en placas, realizar el recuento
inmediatamente después de abrirlas, antes que las colonias empalidezcan.
7.2.2 Si parte de los tubos están completamente ennegrecidos y es difícil contar las colonias
aisladas características, hacer el recuento en los dos tubos de la dilución inmediata más alta y, aún
cuando el número sea menor de 15, anotar la media aritmética de estos dos valores.
7.2.3 Si todos los tubos contienen más de 40 colonias, contar en los tubos inoculados con la dilución más alta.
7.2.4 Si no hay desarrollo de colonias características en los tubos sembrados con muestras no diluidas (liquidas)
-1
o con la suspensión inicial (10 ), anotar: "no se observan colonias".
7.3 Pruebas confirmatorias
7.3.1 Selección y purificación de colonias
7.3.1.1 De las colonias sospechosas contadas en 7.2, seleccionar al azar, las bien aisladas, en
un número equivalente a la raíz cuadrada del total, con un mínimo de cinco. Evitando cualquier roce, tocar en
el centro de cada una de éstas y hacer un frotis; teñirlo por el método de Gram y verificar la
presencia de sólo bacilos Gram positivos, rectos, de extremos romos, solos o agrupados en pares, de 0,6 a
2,4µm x 1,3 a 19,0 µm; esporos grandes, ovales, centrales o subterminales y la célula distendida (en
condiciones normales de cultivo raramente esporulan). Continuar con el numeral 7.3.2 para
verificar la no producción de indo e movilidad.
7.3.1.2 Si no es posible seleccionar colonias sospechosas bien aisladas, elegir cinco colonias
e inocularlas individualmente en tubos que contengan tioglicolato fluido.
°
7.3.1.3 Incubar los tubos en anaerobiosis a 46 C durante 16 a 18 horas
(Continua)
-3-
1994-046
NTE INEN 1 529-18
1998-01
7.3.1.4 De este subcultivo, con un asa, sembrar en estría sobre la superficie seca de placas de
°
agar TSC e incubarlas en anaerobiosis a 46 C durante 16 a 18 horas.
7.3.1.5 De cada placa, seleccionar, por lo menos, una colonia típica bien aislada y confirmarla
según 7.3.2
7.3.2 Pruebas de movilidad y producción de indo
7.3.2.1 Con una aguja de cultivo y haciendo una picadura profunda en el tubo de diagnóstico CPT,
sembrar individualmente cada una de las colonias purificadas (7.3.1). El tubo CPT contiene tres capas de
medio de cultivo de 2 cm de alto cada una, la del fondo es de agar TSN ó TSC, la del medio de
agar-agar y la superior de medio SIM.
°
7.3.2.2 Poner los tubos sembrados en jarras anaeróbicas e incubarlos a 46 C durante 16 a 24 h.
7.3.2.3 Lectura de la movilidad: ver el tipo de crecimiento a lo largo de la línea de siembra. Si el
crecimiento es difuso, fuera de la línea de picadura, la movilidad es positiva. El Cl.perfringens es
inmóvil, crecerá sólo a lo largo de la picadura sin extenderse fuera de ella.
7.3.2.4 Lectura de la prueba del indol: cubrir la superficie del medio con unas gotas de reactivo de
Kovacs. El aparecimiento de un color púrpura indica una reacción positiva. El Cl. perfringens produce reacción
negativa.
7.4 Interpretación
7.4.1 Considerar como Cl. perfringens a aquellas bacterias que producen colonias negras en agar TSN o
°
TSC al ser incubadas a 46 C.
8. CÁLCULOS
8.1 Colonias típicas
3
8.1.1 Productos diluidos: Si al sembrar 1 cm de las diluciones solo se desarrollan colonias típicas,
calcular el número (N) de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o centímetro cúbico
de muestra mediante la siguiente ecuación:
N=nxf
En donde:
n
f
= media aritmética de las colonias contadas;
= factor de dilución (valor inverso de la dilución de la muestra)
3
8.1.2 Productos líquidos no diluidos: Cuando se siembran alícuotas de 1 cm de productos líquidos
no diluidos la ecuación que se aplica es:
N=n
(Continua)
-4-
1994-046
NTE INEN 1 529-18
1998-01
8.2 Colonias atípicas: Cuando se realizan pruebas complementarias, calcular N basándose en el
número de las colonias atípicas confirmadas en relación al número total de las colonias atípicas
contadas.
3
-2
8. 2 .1 Productos diluidos: Por ejemplo, si al sembrar 1,0 cm de la dilución 10 de la muestra, en uno de los
tubos se desarrollan 25 colonias típicas y en el otro, 20; del tubo que contiene las 25, seleccionar cinco
colonias y someterlas a confirmación. Si de éstas, todas fueren bacilos Gram positivos, inmóviles e indol
negativos, considerar a las 25 colonias como de Cl perfringens. Si tres de las cinco colonias
seleccionadas del tubo que contiene las 20, también presentaren estas características, considerar como de
Cl. perfringens a 12 colonias.
Cálculo:
nc=
CxCT
Cs
CT = número total de colonias atípicas contadas;
Cs = número de colonias atípicas sometidas a confirmación;
C = número de colonias atípicas confirmadas;
nc = número total calculado de colonias atípicas confirmadas
Aplicando la fórmula al ejemplo presentado se tiene que:
5x 25
= 25
5
3x 20
nc=
= 12
5
nc=
La media aritmética n es:
25 + 12
= 18,5 redondear a 18 (NTE INEN 52)
2
N
N
= nc x f
= 18 x 100
3
= 1 800 expresar como 1,8 x 10
3
8.2.2 Productos líquidos no diluidos: Cuando se siembran alícuotas de 1 cm de productos líquidos no
diluidos la ecuación que se aplica es:
N=nc
9. INFORME DEL ENSAYO
3
9.1 Expresar el resultado como N de UFC de CI. perfringens/g ó cm de producto, utilizando solo dos
X
cifras significativas multiplicadas por 10 , donde x es la correspondiente potencia de 10. Ejemplo:
(Continua)
-5-
1994-046
NTE INEN 1 529-18
1998-01
N de UFC de Cl.perfringens/g ó cm
3=
3
1,8 x 10
-1
9.2 Si en los tubos de la dilución inicial (10 ) no hay colonias típicas, expresar el resultado como
número estimado (NE), de la siguiente manera:
3
1
NE de UFC de CI. perfringens/g ó cm = < 1,0 x 10
3
9.3 Si no hay colonias características en los tubos sembrados con 1 cm de muestra no diluida
(producto original líquido), expresar el resultado de la siguiente manera:
3
°
NE de UFC de CL.perfringens/cm = < 1,0 x 10 .
9.4 En el informe del ensayo, indicar la norma de referencia, temperatura de incubación, resultados
obtenidos, todas las condiciones operativas no especificadas en esta norma o aquellas
consideradas como opcionales y los incidentes que puedan haber influenciado en el resultado.
Además, se debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra.
(Continua)
-6-
1994-046
NTE INEN 1 529-18
1998-01
APENDICE Z
Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 52:73
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-1:94
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-2:94
Reglas para redondear números.
Control microbiológico de los alimentos.
Control microbiológico de los alimentos. Toma y
preparación de muestras.
Z.2 BASES DE ESTUDIO
Norma Internacional ISO 7937-1985 "MICROBIOLOGY-GENERAL GUIDANCE FOR
ENUMERATION OF Clostridium perfringens" - Colony count technique. International Organization
for Standardization. Switzerland, 1985.
Norma Uruguaya UNIT 758-85 "NORMA PARA MICROBIOLOGIA - RECUENTO DE Clostridium
perfringens" - Método práctico. Instituto Uruguayo de Normas Técnicas. Montevideo, 1985
Mossel, D.A.A., Moreno García B. "MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS", 1a. edición
española. Acribia. Zaragoza-España, 1982.
Manual Centro Nacional de Alimentación y Nutrición. "METODOS DE EXAMEN
MICROBIOLOGICO PARA ALIMENTOS Y BEBIDAS'; Normas recomendadas- Manual práctico. Madrid,
1976.
-7-
1994-046

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
Documento:
TITULO:
CONTROL
MICROBIOLOGICO
DE
LOS Código:
ALIMENTOS. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. RECUENTO EN AL 01.05-315
TUBO POR SIEMBRA EN MASA.
ORIGINAL:
REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: 1993-01-14
Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo
Oficialización con el Carácter de
por Acuerdo No.
de
publicado en el Registro Oficial No.
de
NTE INEN 1529-18
Fecha de iniciación del estudio:
Fechas de consulta pública: de
a
Subcomité Técnico: Control microbiológico de los alimentos
Fecha de iniciación: 1994-04-28
Integrantes del Subcomité Técnico:
Fecha de aprobación: 1994-05-31
NOMBRES:
INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
Dr. Ramiro Gallegos (Presidente)
Bioq. Elena Larrea
SUBDIRECTOR TECNICO
DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,
MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS
DIRECCION DE PROTECCION AL
CONSUMIDOR Y DIRECCION DE
NORMALIZACIÓN
DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,
MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS
Ing. Bolívar Cano
Dra. Hipatia Navas s. (Secretaria Técnica)
Otros trámites:
El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1995-01-10
Oficializada como: OPCIONAL
Registro Oficial No. 229 de 1998-01-06
Por Acuerdo Ministerial No. 0424 de 1997-12-29

















































