area02-res130

XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
MACRÓFAGOS Y LINFOCITOS B NICHOS DURANTE LA INFECCIÓN POR
SALMONELLA TYPHIMURIUM EN RATONES C57BL/6
Paulina Monserrat Pintado de Haro, Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y
Farmacéuticas de la Universidad Autónoma de Nayarit, [email protected]. Asesores:
Dr. Vianney Ortiz Navarrete y Dra. Marcela López Medina, Departamento de Biomedicina
Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, [email protected]
y [email protected]
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Salmonella entérica Serovar Typhimurium es uno de los agentes causantes más
frecuentes de enfermedades gastrointestinales a nivel mundial. Dentro de los
diversos serotipos de Salmonella, los serovares S. typhi y S. paratyphi producen en
humanos un cuadro infeccioso sistémico denominado fiebre tifoidea el cual tiene
una alta incidencia a nivel mundial. Es por ello que su estudio es de gran importancia
para entender los mecanismos inmunológicos y patogénicos que operan en la
salmonelósis sistémica. Salmonella es capaz de infectar diversas células
presentadoras de antígeno (CPA) como son los macrófagos y las células
dendríticas. Mediante la secreción de diversas proteínas efectoras codificadas por
las islas de patogenicidad 1 (SPI-1) y 2 (SPI-2) le permiten a la bacteria sobrevivir y
resistir los mecanismos microbicidas para permanecer en el interior de sus células
blanco. Estudios recientes en ratones susceptibles (Balb/c) han demostrado que
Salmonella tiene la capacidad de infectar a los linfocitos B-1 y B-2 de bazo; además
es capaz de infectar a células precursoras de linfocitos B y células plasmáticas de
medula ósea por tiempos prolongados. Por lo tanto, los linfocitos B pueden
considerarse como un nicho para Salmonella con el fin de permanecer por largos
periodos de tiempo. Sin embargo, se desconoce la magnitud de infección en la cepa
C57bl7/6 que también es susceptible a la infección por Salmonella. En este trabajo
se cuantificó la infección en linfocitos B y macrófagos de bazo en un modelo de
infección crónica por Salmonella.
METODOLOGIA
Se emplearon ratones C57bl/6 de 6-8 semanas los cuales fueron infectados con S.
typhimurium que expresa la proteína verde fluorescente (del inglés, Green
Fluorescent Protein) (S.typhimurium-GFP). La bacteria se cultivó toda la noche en
caldo Luria Bernati (LB) suplementado con Ampicilina (50ug/mL) a 37°C y 180 rpm.
Posteriormente, se hizo una dilución 1:10 con medio fresco y se dejó en crecimiento
hasta alcanzar la fase logarítmica (Abs 0.600 a 600 nm). Los ratones se infectaron
con 50 bacterias por vía intraperitoneal (i.p) y la dosis de infección se confirmó en
placas de agar LB adicionado con Ampicilina (100ug/mL). Durante el periodo de
infección, a los ratones se les proporcionó ad libitum agua con Ampicilina
(2mg/mL). Al día 3, y 10 post infección los ratones se sacrificaron y se obtuvieron
células del bazo con las cuales se determinó la magnitud de la infección mediante
la obtención de UFCs en medio LB suplementado con ampicilina (100ug/mL) a partir
de 1.0e6 células de bazo. Posteriormente, se realizó una tinción con anticuerpos
primarios contra CD19 y CD11b para evaluar linfocitos B y macrófagos
respectivamente. Brevemente, las células de bazo se incubaron con gama
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014
XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
globulinas humanas (50ug/mL) con la finalidad de bloquear los receptores Fc y
después se incubaron con los anticuerpos referidos anteriormente por 20 minutos a
4ºC. Las células se lavaron con PBS, fijaron con PBS-formaldehido al 2% y se
analizaron por Citometría de Flujo (CYAN, Becton Dickinson). Los datos obtenidos
se analizaron con el programa FlowJo vX 0.7 y los análisis estadísticos fueron
realizados con el programa GraphPad Prism 5.03.
RESULTADOS
Los datos obtenidos mostraron que la infección en macrófagos al día 3 es de 6490
y para linfocitos B es de 7946 células infectadas/ bazo; y para el día 10 es de 2024
y de 530 células respectivamente. Asimismo, al día 3 se obtuvieron 551 unidades
formadoras de colonias (UFCs) provenientes de células de bazo y para al día 10
fueron 5.3e6.
CONCLUSIONES
Los macrófagos y linfocitos B de ratones C57BL/6 efectivamente son nichos durante
la infección por Salmonella, conteniendo además una gran carga bacteriana por
célula.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014