XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico MACRÓFAGOS Y LINFOCITOS B NICHOS DURANTE LA INFECCIÓN POR SALMONELLA TYPHIMURIUM EN RATONES C57BL/6 Paulina Monserrat Pintado de Haro, Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y Farmacéuticas de la Universidad Autónoma de Nayarit, [email protected]. Asesores: Dr. Vianney Ortiz Navarrete y Dra. Marcela López Medina, Departamento de Biomedicina Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, [email protected] y [email protected] PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Salmonella entérica Serovar Typhimurium es uno de los agentes causantes más frecuentes de enfermedades gastrointestinales a nivel mundial. Dentro de los diversos serotipos de Salmonella, los serovares S. typhi y S. paratyphi producen en humanos un cuadro infeccioso sistémico denominado fiebre tifoidea el cual tiene una alta incidencia a nivel mundial. Es por ello que su estudio es de gran importancia para entender los mecanismos inmunológicos y patogénicos que operan en la salmonelósis sistémica. Salmonella es capaz de infectar diversas células presentadoras de antígeno (CPA) como son los macrófagos y las células dendríticas. Mediante la secreción de diversas proteínas efectoras codificadas por las islas de patogenicidad 1 (SPI-1) y 2 (SPI-2) le permiten a la bacteria sobrevivir y resistir los mecanismos microbicidas para permanecer en el interior de sus células blanco. Estudios recientes en ratones susceptibles (Balb/c) han demostrado que Salmonella tiene la capacidad de infectar a los linfocitos B-1 y B-2 de bazo; además es capaz de infectar a células precursoras de linfocitos B y células plasmáticas de medula ósea por tiempos prolongados. Por lo tanto, los linfocitos B pueden considerarse como un nicho para Salmonella con el fin de permanecer por largos periodos de tiempo. Sin embargo, se desconoce la magnitud de infección en la cepa C57bl7/6 que también es susceptible a la infección por Salmonella. En este trabajo se cuantificó la infección en linfocitos B y macrófagos de bazo en un modelo de infección crónica por Salmonella. METODOLOGIA Se emplearon ratones C57bl/6 de 6-8 semanas los cuales fueron infectados con S. typhimurium que expresa la proteína verde fluorescente (del inglés, Green Fluorescent Protein) (S.typhimurium-GFP). La bacteria se cultivó toda la noche en caldo Luria Bernati (LB) suplementado con Ampicilina (50ug/mL) a 37°C y 180 rpm. Posteriormente, se hizo una dilución 1:10 con medio fresco y se dejó en crecimiento hasta alcanzar la fase logarítmica (Abs 0.600 a 600 nm). Los ratones se infectaron con 50 bacterias por vía intraperitoneal (i.p) y la dosis de infección se confirmó en placas de agar LB adicionado con Ampicilina (100ug/mL). Durante el periodo de infección, a los ratones se les proporcionó ad libitum agua con Ampicilina (2mg/mL). Al día 3, y 10 post infección los ratones se sacrificaron y se obtuvieron células del bazo con las cuales se determinó la magnitud de la infección mediante la obtención de UFCs en medio LB suplementado con ampicilina (100ug/mL) a partir de 1.0e6 células de bazo. Posteriormente, se realizó una tinción con anticuerpos primarios contra CD19 y CD11b para evaluar linfocitos B y macrófagos respectivamente. Brevemente, las células de bazo se incubaron con gama © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014 XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico globulinas humanas (50ug/mL) con la finalidad de bloquear los receptores Fc y después se incubaron con los anticuerpos referidos anteriormente por 20 minutos a 4ºC. Las células se lavaron con PBS, fijaron con PBS-formaldehido al 2% y se analizaron por Citometría de Flujo (CYAN, Becton Dickinson). Los datos obtenidos se analizaron con el programa FlowJo vX 0.7 y los análisis estadísticos fueron realizados con el programa GraphPad Prism 5.03. RESULTADOS Los datos obtenidos mostraron que la infección en macrófagos al día 3 es de 6490 y para linfocitos B es de 7946 células infectadas/ bazo; y para el día 10 es de 2024 y de 530 células respectivamente. Asimismo, al día 3 se obtuvieron 551 unidades formadoras de colonias (UFCs) provenientes de células de bazo y para al día 10 fueron 5.3e6. CONCLUSIONES Los macrófagos y linfocitos B de ratones C57BL/6 efectivamente son nichos durante la infección por Salmonella, conteniendo además una gran carga bacteriana por célula. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014