PATRÓN DE EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN CELULAR DE LA

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA
PATRÓN DE EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN CELULAR DE LA
PROTEÍNA DGF-1 EN Trypanosoma cruzi
Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar
por
Lic. Noelia Lander Manfredi
Como requisito parcial para optar al título de
Magíster en Ciencias Biológicas
Realizado con la asesoría de
Dr. José Luis Ramírez (Tutor)
Dr. José Bubis (Co-tutor)
Marzo, 2008
iv
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Simón Bolívar, mi eterna casa de estudios.
A mi tutor y mentor, Dr. José Luis Ramírez (IDEA), quien ha alimentado mi pasión
por la ciencia y la búsqueda del conocimiento.
Al Dr. Miguel Angel Chiurillo (UCLA), por sus acertados consejos, por el seguimiento
detallado de mi trabajo y su apoyo incondicional durante la realización del mismo.
A la Dra. Palmira Guevara (IBE-UCV), por compartir con nosotros valiosas horas de
discusión de resultados y por su colaboración constante en el desarrollo de este
trabajo.
Al Dr. José Bubis (USB), por alentarme a inscribir este trabajo como tesis de
Maestría y supervisar pacientemente su desarrollo.
A mis amigas y compañeras de laboratorio María Merceces Galindo y Evelyn
Rodríguez, con quienes discutí arduamente cada uno de los experimentos de esta
tesis. Trabajar con ellas ha sido una experiencia muy enriquecedora.
Al Dr. Iván Galindo (IDEA) por su colaboración en el diseño experimental de esta
tesis.
A la Dra. Katherine Figarella (IDEA) por su valioso aporte en los experimentos de
inmunofluorescencia.
A todos mis compañeros de laboratorio, especialmente a Mónica Suárez, Alvaro
Morales, Will Sandoval, Yornayser Pérez, María Gabriela Rojas y Marjorie Sayegh.
v
Al Prof. Néstor Áñez, la Lic. Agustina Rojas y la Lic. Gladys Crisante del Centro de
Investigaciones Parasitológicas “J.F. Torrealba” (ULA) por su colaboración en el
desarrollo de varios experimentos de este trabajo.
Al Lic. Héctor Rojas (Laboratorio de Permeabilidad Iónica – IVIC) por su colaboración
en la obtención de imágenes por microscopía confocal.
A la M.Sc. Noraida Artiles (Laboratorio de Inmunoproducción - IDEA) por su valiosa
asistencia en la realización de inmunodetecciones y purificación de anticuerpos.
A Mónica Gil, Deisy Pérez y la Sra. Gladys García, quienes día a día demuestran un
profundo compromiso con su trabajo, gracias por todo el apoyo que me brindaron a
lo largo de este proyecto.
A mi amigo y compañero de trabajo, M.Sc Héctor Urbina (IDEA), por su apoyo
incondicional y por la revisión detallada del manuscrito.
A mis padres, que siempre han confiado en mí y me han apoyado en cada una de las
decisiones de mi vida.
Este Trabajo de Grado fue realizado en el Laboratorio de Polimorfismos Genéticos
(Unidad de Genómica, Centro de Biotecnología) de la Fundación Instituto de
Estudios Avanzados (IDEA) y fue financiado por el proyecto POA 011 de dicha
institución.
vi
RESUMEN
Trypanosoma cruzi es el agente etiológico del Mal de Chagas, una enfermedad
endémica de América Central y Sudamérica que afecta entre 16 y 18 millones de
personas, contra la cual no se han desarrollado vacunas ni tratamientos eficaces.
Durante su ciclo de vida el parásito se diferencia en estadios correspondientes a las
formas proliferativas e infectivas que se desarrollan en el vector (epimastigotes y
tripomastigotes metacíclicos) y el hospedador vertebrado (amastigotes y
tripomastigotes sanguícolas). Como estrategia de supervivencia y adaptación a
ambientes tan disímiles este parásito ha desarrollado una gran diversidad de familias
de proteínas. Entre los genes que codifican a estas familias se encuentran los genes
DGF-1 (“Dispersed Gene Family-1”), cuya función aún se desconoce. El objetivo de
este trabajo fue estudiar el patrón de expresión y la localización celular de la proteína
DGF-1 en T. cruzi. Para ello se obtuvieron anticuerpos policlonales contra dos
péptidos recombinantes (RE1 y RE2) producidos en Escherichia coli, derivados de
dos fragmentos de ADN del gen DGF-1. Los sueros anti-RE1 y anti-RE2 se utilizaron
como herramientas para detectar la proteína DGF-1 en ensayos de inmunoblot e
inmunocitoquímica, en diferentes estadios del ciclo de vida del parásito. Los
resultados indican que DGF-1 se expresa en la fracción de organelas/citosol en los
estadios epimastigote y tripomastigotes obtenidos mediante infección de cultivo
celular, mas no en tripomastigotes metacíclicos. En epimastigotes se observó que
DGF-1 se localiza en un compartimiento subcelular alrededor del núcleo. Resultados
de otros laboratorios indican que la proteína DGF-1 está asociada a una fracción
enriquecida en acidocalcisomas. Es necesario realizar ensayos de co-localización
con marcadores específicos de varias organelas del parásito con el fin de establecer
una localización más precisa de esta proteína. Este estudio representa el primer
reporte de inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 en T. cruzi.
Palabras Clave: Trypanosoma cruzi, enfermedad de Chagas, DGF-1, familia de
genes, diversidad de proteínas.
vii
ÍNDICE GENERAL
AGRADECIMIENTOS................................................................................................ iv
RESUMEN ................................................................................................................. vi
ÍNDICE GENERAL.................................................................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ xi
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS ............................................................ xiii
MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 1
Trypanosoma cruzi y la Enfermedad de Chagas ..................................................... 1
Genes de Contingencia y Telómeros ....................................................................... 4
Diversidad Antigénica en T. cruzi............................................................................. 7
Genes DGF-1........................................................................................................... 8
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA E HIPÓTESIS DE TRABAJO ...................... 10
OBJETIVOS.............................................................................................................. 12
METODOLOGÍA ....................................................................................................... 13
Selección de las secuencias .................................................................................. 13
Diseño de oligonucleótidos .................................................................................... 14
Amplificación de fragmentos de ADN..................................................................... 15
Electroforesis en geles de agarosa ........................................................................ 16
Construcciones moleculares .................................................................................. 16
Digestión de ADN con enzimas de restricción ....................................................... 17
Reacciones de ligamiento ...................................................................................... 19
Preparación de células químicamente competentes.............................................. 19
viii
Transformación de E. coli por choque térmico....................................................... 20
Aislamiento de ADN plasmídico mediante lisis por choque térmico (boiling
miniprep) ................................................................................................................ 21
Análisis de plásmidos recombinantes .................................................................... 21
Expresión de proteínas recombinantes.................................................................. 22
Purificación de proteínas recombinantes ............................................................... 23
Obtención de anticuerpos policlonales anti-RE1 y anti-RE2 en ratón .................... 24
Obtención de anticuerpos policlonales anti-RE1 en conejo ................................... 24
Cultivo de parásitos................................................................................................ 25
Infección de células de mamífero en cultivo .......................................................... 26
Electroforesis en geles de poliacrilamida. .............................................................. 27
Inmunodetección de proteínas en membranas ...................................................... 27
Inmunodetección de proteínas en T. cruzi ............................................................. 28
RESULTADOS.......................................................................................................... 30
Amplificación y clonamiento de dos segmentos internos del gen DGF-1............... 30
Descripción de los segmentos internos RE1 y RE2 de la proteína DGF-1 putativa.
............................................................................................................................ 30
Amplificación de los fragmentos RE1 y RE2....................................................... 30
Clonamiento de los fragmentos RE1 y RE2 en vector de expresión .................. 32
Expresión y purificación de dos segmentos internos de la proteína DGF-1 putativa
............................................................................................................................... 42
Expresión de RE1 y RE2 en E. coli .................................................................... 42
Purificación de las proteínas recombinantes RE1 y RE2.................................... 45
Especificidad de sueros anti-RE1 y anti-RE2 obtenidos en ratón .......................... 47
Inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 en T. cruzi............................. 48
Inmunodetección de DGF-1 en epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener)...... 48
Inmunodetección de DGF-1 en epimastigotes y TCT de T. cruzi (aislado YBM) 50
ix
Inmunodetección de DGF-1 en epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de
T. cruzi (cepa CL Brener) utilizando anticuerpos obtenidos en conejo ............... 52
Localización celular de DGF-1 en T. cruzi (cepa CL Brener). ................................ 57
Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes de T. cruzi ........................... 57
Localización celular de DGF-1 en epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos
de T. cruzi y marcaje de ácidos nucleicos .......................................................... 59
Efecto de la permeabilización celular sobre la inmunodetección de DGF-1 en
epimastigotes de T. cruzi. ................................................................................... 61
DISCUSIÓN .............................................................................................................. 63
Expresión y solubilización de las proteínas RE1 y RE2 ......................................... 63
Especificidad de las regiones RE1 y RE2 respecto a la proteína putativa DGF-1
(BAC D6C) ............................................................................................................. 65
Inmunodetección de posibles miembros de la familia de proteínas DGF-1 en T.
cruzi ....................................................................................................................... 66
Otras evidencias de la expresión de DGF-1 en T. cruzi......................................... 70
Inmunodetección diferencial de miembros de la familia DGF-1 en dos cepas de T.
cruzi. ...................................................................................................................... 71
Patrón de expresión de DGF-1 en T. cruzi (cepa CL Brener) ............................... 72
Patrón de expresión de DGF-1 en T. cruzi (aislado YBM) .................................... 74
Localización celular de un posible miembro de la familia DGF-1 en epimastigotes
de T. cruzi (cepa CL Brener).................................................................................. 75
Posible función de la proteína DGF-1 en el estadio epimastigote de T. cruzi. ....... 78
El ambiente del gen DGF-1 en la región subtelomérica ..................................... 78
DGF-1 en acidocalcisomas................................................................................. 79
Papel de DGF-1 en el ciclo de vida de T. cruzi................................................... 82
Consideraciones finales...................................................................................... 83
CONCLUSIONES ..................................................................................................... 85
REFERENCIAS......................................................................................................... 88
x
ANEXOS ................................................................................................................... 93
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi ............................................................ 2
Figura 2. Organización de la secuencia del recombinante telomérico BAC D6C. ..... 14
Figura 3. Mapas de los vectores de expresión empleados para el clonamiento de los
segmentos RE1 y RE2.. ............................................................................................ 18
Figura 4. Posición de los segmentos RE1 y RE2 sobre la secuencia de la proteína
putativa DGF-1 deducida a partir del gen DGF-1 presente en el recombinante BAC
D6C. .......................................................................................................................... 31
Figura 5. Amplificación por PCR de los segmentos internos del gen DGF-1, RE1 y
RE2. .......................................................................................................................... 32
Figura 6. Digestión secuencial del vector pGEX-5X-2 y el fragmento RE1 con
enzimas de restricción............................................................................................... 34
Figura 7. Digestión secuencial del vector pGEX-5X-2 y el fragmento RE2 con
enzimas de restricción............................................................................................... 35
Figura 8. Ligamiento del vector pGEX-5X-2 con los fragmentos RE1 y RE2. ........... 36
Figura 9. Aislamiento de plásmidos recombinantes pGEX-5X-2/RE1 por boiling
minipreps................................................................................................................... 37
Figura 10. Aislamiento de plásmidos recombinantes pGEX-5X-2/RE2 por boiling
minipreps................................................................................................................... 38
Figura 11. Análisis de restricción de plásmidos recombinantes.. .............................. 39
Figura 12. Aislamiento de plásmidos recombinantes positivos mediante lisis alcalina..
.................................................................................................................................. 40
Figura 13. Representación esquemática del vector de expresión y los plásmidos
recombinantes obtenidos. ......................................................................................... 41
Figura 14. Expresión de las proteínas recombinantes GST, GST-RE1 y GST-RE2 en
extractos proteicos totales de E. coli. ........................................................................ 43
Figura 15. Expresión de las proteínas recombinantes GST, GST-RE1 y GST-RE2 en
fracciones del extracto proteico de E. coli. ................................................................ 44
xii
Figura 16. Geles preparativos para la purificación de proteínas recombinantes. ...... 46
Figura 17. Purificación de la proteína recombinante RE1-GST por elución pasiva. .. 47
Figura 18. Inmunodetección de péptidos recombinantes por Western Blot utilizando
anticuerpos policlonales producidos en ratón............................................................ 48
Figura 19. Inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 en extracto proteico
total de epimastigotes de T. cruzi por Western Blot, utilizando anticuerpos
policlonales producidos en ratón. .............................................................................. 49
Figura 20. Inmunodetección por Western Blot de posibles miembros de la familia
DGF-1 en fracciones subcelulares de epimastigotes y TCT de T. cruzi (aislado YBM),
utilizando anticuerpos policlonales anti-RE1 producidos en ratón............................. 51
Figura 21. Inmunodetección por Western Blot de miembros de la familia DGF-1 en
extractos proteicos totales de epimastigotes de T. cruzi, utilizando anticuerpos
policlonales anti-RE1 obtenidos en conejo................................................................ 53
Figura 22. Inmunodetección por Western Blot de miembros de la familia DGF-1 en
epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi, utilizando anticuerpos
policlonales obtenidos en conejo............................................................................... 54
Figura 23. Inmunodetección por Western Blot de miembros de la familia DGF-1 en
extractos proteicos totales de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T.
cruzi, obtenidos en presencia de inhibidores de proteasas....................................... 56
Figura 24: Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes de T. cruzi (cepa CL
Brener) utilizando anticuerpos policlonales obtenidos en ratón y anticuerpos antiratón conjugados al fluoróforo Texas Red ................................................................ 58
Figura 25: Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes y tripomastigotes
metacíclicos de T. cruzi (cepa CL Brener) utilizando anticuerpos policlonales
obtenidos en ratón y anticuerpos anti-ratón conjugados a Texas Red...................... 60
Figura 26. Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes de T. cruzi (cepa CL
Brener) utilizando anticuerpos policlonales obtenidos en conejo y anticuerpos anticonejo conjugados al fluoróforo Alexa Fluor 488....................................................... 62
Figura 27. Distribución de la acuaporina en epimastigotes de T. cruzi (cepa Y). ...... 81
xiii
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
aa
Aminoácido
ADN
Ácido desoxiribonucleico
ADNc
Ácido desoxiribonucleico complementario
ARN
Ácido ribonucleico
ARNm
Ácido ribonucleico mensajero
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
BSA
Albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin)
CDC
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
(Centers for Disease Control and Prevention)
CMT
Tripomastigote metacíclico
Trypomastigote)
Da
Daltons
DAPI
4',6-diamidino-2-fenilindol (4',6-diamidino-2-phenylindole)
DGF-1
Familia Dispersa de Genes-1 (Dispersed Gene Family-1)
DTU
Unidad discreta de tipificación (Discret Typing Units)
EDTA
Ácido etilendiaminotetraacético (Ethylenediaminetetraacetic Acid)
EST
Etiqueta de secuencia expresada (Expressed Sequence Tag)
Ext
Extracto total de proteínas
GAPDH
Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (Glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase)
GFP
Proteína de fluorescencia verde (Green Fluorescent Protein)
cultivado
(Cultured
Metacyclic
xiv
gp85
Gen de la glicoproteína de superficie de 85 Kda
GST
Glutatión - S - Transferasa
IPTG
Isopropiltiogalactósido
LB
Medio Luria-Bertani
LIT
Infusión de hígado triptosa (Liver Infusion Tryptose)
LTR
Repetido terminal largo (Long Terminal Repeat)
MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad (Major Histocompatibility
Complex)
MT
Tripomastigote metacíclico (Metacyclic Trypomastigote)
NCBI
National Center for Biotechnology Information
P
Fracción insoluble (Pellet)
pb
Pares de bases
PBS
Tampón fosfato salino (Phosphate Buffered Saline)
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain
Reaction)
PFK
Fosfofructoquinasa (Phosphofructokinase)
pI
Punto Isoeléctrico
RE1
Región Específica 1
RE2
Región Específica 2
rhs
Familia de
Hotspot)
RVD
Disminución regularoria del volumen (Regulatory Vomune
Decrease)
S
Fracción Soluble
SA
Ácido siálico (Sialic Acid)
SAS
Secuencia asociada a SIRE (SIRE Associated Sequence)
SDS
Dodecil sulfato de sodio (Sodium Dodecyl Sulphate)
genes
de
retrotransposones
(Retrotransposon
xv
SDS-PAGE
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
denaturalizantes (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
SFB
Suero Fetal Bovino
SIRE
Elemento corto repetitivo
Repetitive Element)
STET
Sacarosa Tritón EDTA Tris
TA
Temperatura Ambiente
TAE
Tris-Acetato EDTA
TBST
Tampón Tris Salino Tween-20 (Tris Buffered Saline Tween-20)
TcAQP
Acuaporina de Trypanosoma cruzi
TcMUC
Familia de Mucinas de Trypanosoma cruzi
TcPPX
Exopolifosfatasa de Trypanosoma cruzi
TCT
Tripomastigote obtenido mediante infección de cultivo de tejido
(Tissue Culture-derived Trypomastigotes)
TS
Trans-sialidasas
UFC
Unidades Formadoras de Colonias
V-H+-ATPasa
ATPasa vacuolar de protones (Vacuolar Proton ATPase)
V-H+-PPasa
Pirofosfatasa vacuolar
Pyrophosphatase)
de
protones
(Vacuolar
Proton
VSG
Glicoproteína
Glycoprotein)
de
Superficie
(Variant
Surface
WHO
Organización Mundial de la Salud (World Healh Organization)
Variable
intercalado
(Short
Interspersed
1
MARCO TEÓRICO
Trypanosoma cruzi y la Enfermedad de Chagas
El Mal de Chagas es una enfermedad parasitaria endémica de América Central y
Sudamérica que se estima afecta entre 16 y 18 millones de personas en este
continente (WHO, 2002). La dolencia en su fase crónica tardía se caracteriza por la
aparición de una miocarditis fibrótica progresiva y la degeneración de tejidos que son
inervados por el sistema nervioso autónomo (Colli, 1993). La enfermedad de Chagas
también es conocida como Tripanosomiasis Americana y produce daños fisiológicos
que pueden ser mortales. Adicionalmente, es la cuarta causa de morbilidad entre las
enfermedades infecciosas de América Latina y la tercera causa de morbilidad entre
las ocho principales enfermedades infecciosas tropicales (WHO, 2002).
El agente etiológico del Mal de Chagas es un protozoario flagelado llamado
Trypanosoma cruzi (orden Kinetoplastida) el cual es transmitido por insectos del
orden Hemíptera denominados triatominos. La tripanosomiasis americana es
considerada una zoonosis, y en el ciclo natural de transmisión, el insecto se alimenta
de la sangre de un hospedador vertebrado y deposita sus deyecciones portadoras de
las formas infectivas de T. cruzi sobre la piel lacerada del mismo. Durante su ciclo de
vida el parásito se diferencia en cuatro estadios correspondientes a las formas
replicativas e infectivas que se desarrollan en el vector y el hospedador vertebrado.
Los estadios replicativos, en los cuales el parásito se divide por fisión binaria, son los
epimastigotes (en la luz del intestino medio del vector) y los amastigotes (estadio
intracelular en la mayoría de los tejidos del mamífero). Las formas infectivas se
conocen como tripomastigotes metacíclicos, desarrollados en el tracto intestinal
posterior del triatomino, y tripomastigotes sanguícolas que se diferencian a partir
2
de los amastigotes en el interior de la célula y son liberados al torrente sanguíneo del
hospedador vertebrado (Fig. 1) (Colli, 1993).
Figura 1. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.
Figura 1. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.
Otra forma importante de transmisión del Mal de Chagas se produce por el consumo
de alimentos crudos contaminados por heces de insectos infectados (Camandaroba
y col., 2002). Hoft (1996) demostró que los tripomastigotes metacíclicos (metacyclic
trypomastigotes, MT) al ser administrados por vía oral, pueden invadir el epitelio de la
mucosa gástrica e infectar eficientemente a ratones. La enfermedad también puede
transmitirse por transfusiones sanguíneas, transplante de órganos y transmisión
congénita a través de la placenta (CDC, 2007).
3
El ciclo de vida de T. cruzi es bastante complejo. Durante su paso por el hospedador
vertebrado los tripomastigotes extracelulares están potencialmente expuestos a la
lisis mediada por anticuerpos (respuesta inmune humoral) así como a la captura y
posterior muerte mediada por células fagocíticas activadas (respuesta inmune
celular) (Martin y Tarleton, 2004). Las formas tripomastigotes infectan células de
diferentes tipos de tejidos y en su interior se diferencian en las formas amastigotes,
las cuales, luego de replicarse varias veces, se transforman nuevamente en
tripomastigotes que son liberados al torrente sanguíneo (Martin y Tarleton, 2004).
El control de la infección por T. cruzi opera a varios niveles e involucra una
combinación de respuestas inmunes adaptativas por parte del hospedador mamífero
(Rodrigues y col., 2003; Martin y Tarleton, 2004). La respuesta inmune humoral
(mediada por anticuerpos producidos por las células B del hospedador vertebrado)
que se genera frente a la infección es inducida por componentes de la superficie
celular y proteínas de secreción que expresan las formas infectivas del parásito
(tripomastigotes metacíclicos y sanguícolas) (Pereira-Chioccola y col, 2000; Martin y
Tarleton, 2004). Por otra parte, la respuesta inmune celular es llevada a cabo por los
linfocitos T del hospedador vertebrado (células CD4+ y CD8+). Estas células
reconocen antígenos del estadio amastigote del parásito, los cuales son presentados
por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (Major Histocompatibility
Complex, MHC) de las células infectadas. Posteriormente los linfocitos T activados
producen señales específicas mediante citoquinas, que son reconocidas por los
receptores de membrana de los macrófagos, los cuales llevan a cabo la
internalización y posterior lisis del parásito (Rodrigues y col., 2003; Martin y Tarleton,
2004). Un falla en cualquiera de estos tres mecanismos efectores (anticuerpos,
células T CD4+ y células T CD8+) conduce a una infección aguda incontrolada y letal
para el hospedador (Martin y Tarleton, 2004).
Aunque ha transcurrido casi un siglo desde que la enfermedad de Chagas fue
descrita por el médico brasileño Carlos Chagas, actualmente no existen vacunas
para prevenir la infección ni tratamientos eficaces contra la enfermedad. Durante los
4
últimos 15 años el avance exponencial de nuevas tecnologías en ciencia y medicina,
así como el descubrimiento de las herramientas moleculares, han permitido
profundizar en el conocimiento de la microestructura del parásito, las bases
moleculares del proceso de invasión celular de T. cruzi, la secuencia completa de su
genoma, la estructura y función de muchas de las proteínas que se expresan en los
diferentes estadios de su ciclo de vida, e importantes aspectos cualitativos y
cuantitativos de la respuesta inmune del hospedador vertebrado ante la entrada del
parásito (Martin y Tarleton, 2004; Atwood y col., 2005, 2006; El Sayed y col., 2005;
Yoshida, 2006). A pesar de estos hallazgos, no se han generado nuevas soluciones
preventivas (es decir, vacunas) o terapéuticas efectivas. La enfermedad ha sido
controlada en algunos países de Sudamérica gracias a recomendaciones propuestas
durante la primera mitad del siglo XX, las cuales se refieren fundamentalmente al
comportamiento de las poblaciones rurales (Dias y col., 2002).
Genes de Contingencia y Telómeros
Los telómeros son los extremos de cada uno de los cromosomas lineales de las
células eucariotas y de algunas eubacterias (Blackburn, 2001). Normalmente los
telómeros están compuestos por una región de repetidos nucleotídicos simples y un
conjunto de proteínas asociadas que conforman una estructura compleja, cuya
función es proteger los extremos del cromosoma de la degradación por nucleasas, y
facilitar la replicación de los telómeros sin que se produzca el acortamiento de los
mismos (Blackburn y Greider, 1995; Kipling, 1995).
Aguas arriba del telómero se encuentra la región subtelomérica o subtelómero, que
se define como la región entre el telómero y las primeras secuencias codificantes del
cromosoma, aunque esta definición puede variar por especie (Blackburn y Greider,
1995; Kipling, 1995). La estructura y longitud de los telómeros y subtelómeros es
muy variable entre los distintos grupos taxonómicos. El subtelómero típicamente
contiene repeticiones teloméricas degeneradas, otro tipo de secuencias repetitivas,
pseudogenes, transposones y genes intactos (Barry y col., 2003).
5
Los genes de contingencia se definen como genes que confieren fenotipos
relacionados con la supervivencia a cambios ambientales rápidos, cuya expresión
precede al cambio ambiental, de manera que no son controlados por sistemas
sensores. Estos genes presentan una tasa de mutación espontánea bastante
elevada y en parásitos están asociados frecuentemente a telómeros (Barry y col.,
2003). Como ejemplo clásico de este tipo de secuencias se encuentran los genes
que codifican para las glicoproteínas variantes de superficie (Variant Surface
Glycoproteins, VSG) de Trypanosoma brucei. Dichas proteínas participan en la
variación antigénica del parásito y juegan un papel fundamental en el proceso de
evasión de la respuesta inmune del hospedador vertebrado (Deitsch y col., 1997).
La localización preferencial subtelomérica de los genes de contingencia ha sido
explicada como una manera de controlar la expresión de antígenos, mediante los
efectos del silenciamiento génico asociado a estas regiones, o por el incremento de
la variabilidad mediado por mecanismos de duplicación y conversión génica, sin
comprometer las regiones internas ricas en marcos abiertos de lectura (Ralph y col.,
2005).
Tomando en cuenta que los telómeros son puntos activos de recombinación homóloga o mediada por mecanismos de transposición - (Lewin, 2004), es posible
pensar que muchas familias de genes se han originado a partir de una copia
ancestral localizada en la región subtelomérica. La frecuencia de recombinación en
estas regiones del genoma también explica la alta tasa de mutación observada en los
genes de contingencia asociados a telómeros, así como la regulación de su
expresión mediante el mecanismo de recombinación ectópica, que ocurre entre
secuencias homólogas localizadas en cromosomas no homólogos (Barry y col.,
2003, Kim y col., 2005).
Debido a que la función de los genes de contingencia en parásitos, suele estar
relacionada con el proceso de evasión del sistema inmune del hospedador
6
vertebrado, los mismos pueden ser considerados como blancos terapéuticos (Deitsch
y col., 1997). De allí la importancia de estudiar este tipo de secuencias.
Los organismos patógenos en donde mejor se han descrito los genes de
contingencia son T. brucei, agente etiológico de la enfermedad del sueño y
Plasmodium falciparum, agente etiológico de la malaria (Barry y col., 2003; Dzikowski
y Deitsch, 2006). El estudio de los sistemas de genes de contingencia también se ha
llevado a cabo en otros patógenos como Babesia bovis, T. cruzi, Theileria parva y
Giardia lambia (Barry y col., 2003; Dzikowski y Deitsch, 2006).
T. brucei presenta un complejo sistema de variabilidad antigénica que consiste en
una cubierta proteica constituida por VSGs que son codificadas por genes de
contingencia presentes en cientos de copias en el genoma del parásito, de las cuales
cerca de 200 copias se encuentran en las regiones subteloméricas de los
minicromosomas (Turner, 1999; Barry y col., 2005). Cada VSG es codificada por un
gen distinto, pero sólo uno de ellos se expresa mientras los demás permanecen
silentes (Turner, 1999). La expresión de un gen diferente en algunos de los
miembros de una población de parásitos es lo que determina que esta sub-población
pueda proliferar evadiendo la respuesta inmune innata y adquirida del hospedador
vertebrado (Beals y col., 1992; Turner, 1999; Barry y col., 2003; Machado, 2006).
La presencia de más de 200 copias de genes VSG en la región subtelomérica de los
minicromosomas pudiera explicar la gran variabilidad génica y consecuentemente
variabilidad antigénica que las VSGs confieren a T. brucei, ya que en esta región
ocurren frecuentemente
procesos de recombinación, duplicación y transposición
génica (Blackburn y Greider, 1995; Kipling, 1995; Blackburn, 2001; Barry y col.,
2003).
En T. cruzi se han descrito dos familias de genes multicopia cuyos productos
pudieran estar implicados en la patogenicidad y supervivencia del parásito, las cuales
también presentan copias en posición subtelomérica. Ellas son el grupo II de las
7
Trans-sialidasas, conocidas comúnmente como gp85, y la familia DGF-1 (Chiurillo y
col., 1999, 2002; El-Sayed y col., 2005; Kim y col., 2005).
Diversidad Antigénica en T. cruzi
Las formas infectivas de T. cruzi son las responsables de llevar a cabo el complejo
proceso de invasión celular, que implica atravesar una serie de barreras fisiológicas
con cambios ambientales abruptos. Evadir la respuesta inmune, atravesar la matriz
extracelular y penetrar la membrana plasmática son algunos de los desafíos que
enfrenta el parásito durante el proceso de infección (Giordano y col., 1999).
Para invadir las células blanco los tripomastigotes metacíclicos y sanguícolas
despliegan un conjunto de proteínas de superficie y secreción que intervienen, entre
otros, en procesos como la movilización intracelular del ión Ca+2 tanto en el parásito
como en la célula del mamífero, la hidrólisis de proteínas de la matriz extracelular, y
transferencia de ácido siálico desde glicoconjugados de las células del hospedador
hacia glicoproteínas de la superficie del parásito (función de protección y
enmascaramiento), (Colli, 1993; Giordano y col., 1999; Baida y col., 2006; Yoshida,
2006).
Una gran cantidad de antígenos de superficie que se expresan en los estadios
infectivos de T. cruzi son codificados por familias de genes multicopia cuyos
miembros presentan un elevado porcentaje de identidad (mayor al 80%). Tal es el
caso de las glicoproteínas de superficie, las mucinas y las trans-sialidasas (El Sayed
y col., 2005). Esta propiedad confiere una elevada diversidad antigénica que el
parásito utiliza como estrategia de supervivencia durante el proceso de infección,
facilitando la evasión del sistema inmune del hospedador vertebrado (Martin y
Tarleton, 2004).
Durante los últimos veinte años se ha estudiado la función de estas proteínas
mediante la producción de anticuerpos monoclonales y la generación de
8
tripomastigotes metacíclicos en cultivo (Cultured Metacyclic Tripomastigotes, CMT) y
tripomastigotes obtenidos mediante infección de cultivo de tejido (Tissue Culturedderived Trypomastigotes, TCT) que son equivalentes a los tripomastigotes
sanguícolas (Yoshida, 2006).
T. cruzi expresa en su superficie una gran cantidad de antígenos pertenecientes a
dos familias importantes de proteínas. Se trata de las mucinas y las trans-sialidasas
(TcMUC y TS). La relación funcional entre ellas radica en que las mucinas son el
principal aceptor de ácido siálico de las trans-sialidasas (SA, por sus siglas en inglés)
(Acosta-Serrano y col., 2001). Los ácidos siálicos constituyen una familia de
azúcares carboxilados de nueve carbonos que se encuentran normalmente como
monosacáridos terminales de los oligosacáridos de superficie. Estas moléculas
participan en muchos fenómenos biológicos tales como: mantenimiento de glóbulos
rojos y glicoproteínas en circulación, interacciones intracelulares, adhesión al
sustrato, enmascaramiento biológico, desarrollo neuronal, unión de virus a su célula
hospedadora, invasión de glóbulos rojos por merozoitos de P. falciparum y
patogénesis bacteriana (Colli, 1993). En T. cruzi, a excepción de las formas
amastigotes que carecen de actividad TS, la sialidación de la superficie del parásito
ocurre en todos los estadios de su ciclo de vida (Acosta-Serrano y col., 2001). Las
evidencias experimentales indican que la adquisición de ácido siálico es un proceso
importante para la infectividad del parásito y para su supervivencia en el hospedador
vertebrado (Colli, 1993; Acosta-Serrano y col., 2001).
Genes DGF-1
La familia de genes DGF-1 (Dispersed Gene Family-1) fue descrita por primera vez
por Wincker y col. (1992). Basándose en la secuencia nucleotídica del gen DGF-1,
estos autores describieron una proteína putativa de 3229 aa (334 KDa) que presenta
las siguientes características: 1) un motivo de 63-74 aa con ocho residuos de cisteína
que se repite siete veces a lo largo de la secuencia, 2) una región rica en prolina
correspondiente a los residuos 1460-1480 que aparece entre el cuarto y el quinto
9
motivo rico en cisteína, 3) dos tripéptidos Arg-Gly-Asp localizados en los residuos
272-274 y 777-779 y, 4) cuatro regiones hidrofóbicas localizadas en el carboxiterminal de la molécula. Diez años más tarde, durante el clonamiento y
caracterización de los telómeros de T. cruzi, Chiurillo y col. (2002) encontraron en la
región subtelomérica de este parásito un marco abierto de lectura de 10425 pb,
localizado aproximadamente a 14 Kpb de los repetidos hexaméricos (Kim y col.,
2005). Esta secuencia resultó tener un 82% de identidad con el gen descrito por
Wincker y col. (1992). Según los resultados publicados del Proyecto Genoma de T.
cruzi, la familia DGF-1 presenta 565 copias dispersas en el genoma del parásito,
con una longitud promedio de 10 Kpb y 85-95% de identidad entre ellas, las cuales
no han sido descritas en ningún otro organismo (El-Sayed y col., 2005). El estudio
del glicoproteoma de T. cruzi reveló la presencia de péptidos correspondientes a
DGF-1 en la fracción de organelas/citosol del estadio tripomastigote (Atwood y col.,
2006). Por otra parte la existencia de transcritos homólogos a DGF-1 en la forma
epimastigote del parásito ha sido evidenciada y sus secuencias están reportadas en
el GenBankTM. Sin embargo, la función y otros aspectos de estas proteínas aún se
desconocen.
10
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA E HIPÓTESIS DE TRABAJO
El tamaño del marco abierto de lectura de los genes DGF-1 y su abundancia en el
genoma de T. cruzi sugieren que esta secuencia es esencial para la supervivencia
del parásito. Por otra parte, la existencia de varios marcos abiertos de lectura de
DGF-1 en posición telomérica, siempre flanqueados por pseudogenes y otro tipo de
secuencias no codificantes, sugiere que este gen ha estado sometido a una fuerte
presión selectiva y por lo tanto debería expresarse en algún estadio del ciclo de vida
del parásito (Kim y col., 2005).
La detección de un ARN mediante Northern blot en los distintos estadios del ciclo
celular de T. cruzi, no necesariamente se correlaciona con la expresión de la
proteína, ya que el proceso de transcripción en kinetoplastidos genera moléculas de
ARN mensajero (ARNm) de organización policistrónica, en las cuales múltiples
regiones codificantes son transcritas por un único promotor. Posteriormente ocurre el
mecanismo
molecular
de
trans-splicing,
mediante
el
cual
estas
unidades
7
policistrónicas dan origen a moléculas de ARNm maduro que poseen un 5’- mG cap,
una secuencia común de 39-41 nucleótidos (el mini-exón o spliced leader) y una cola
de poli-A en el extremo 3’ (Campbell y col., 2000). Por esta razón, generalmente la
regulación de la expresión génica en kinetoplástidos ocurre a nivel posttranscripcional (Bodley y col., 2003).
Hasta el momento se desconoce la función de los genes DGF-1 y su patrón de
expresión en los diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Tampoco se ha
establecido la localización celular de estas proteínas. La estructura deducida de la
proteína DGF-1 sugiere que carece de actividad enzimática (Anexo 1). La obtención
11
de anticuerpos que la reconozcan permitiría desarrollar diferentes metodologías y
estrategias para dilucidar su función. En vista de que la longitud del marco abierto de
lectura
de
los
genes
DGF-1
es
considerablemente
extenso
(10
Kpb
aproximadamente), la expresión de alguno de estos genes completo en un sistema
procariota es prácticamente imposible. De este modo se planteó la expresión de
proteínas recombinantes que contengan secuencias parciales de la proteína DGF-1
deducida. Las mismas fueron utilizadas como antígenos para la producción de
anticuerpos policlonales, que se utilizaron como herramientas para establecer el
patrón de expresión de la proteína DGF-1 nativa y su localización celular en
diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi.
El desarrollo racional de nuevas drogas contra la enfermedad de Chagas depende de
la identificación de diferencias entre el metabolismo humano y el metabolismo del
agente etiológico de esta enfermedad, T. cruzi. La secuencia de los genes DGF-1
sólo ha sido reportada en el genoma de este parásito (El-Sayed y col., 2005). El
estudio de su patrón de expresión y localización celular representa una contribución
importante en la búsqueda de posibles blancos terapéuticos que puedan utilizarse en
el diseño de drogas para combatir esta enfermedad.
12
OBJETIVOS
1. General:
Establecer el patrón de expresión y la localización celular de la proteína DGF-1 en
diferentes estadios del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.
2. Específicos:
2.1 Amplificar y clonar en un vector de expresión dos segmentos internos del gen
DGF-1 de T. cruzi.
2.2 Expresar dos regiones del gen DGF-1 en un sistema procariota y purificar los
productos de dicha expresión.
2.3 Producir anticuerpos policlonales contra dos polipéptidos correspondientes a
secuencias internas del gen DGF-1.
2.4 Comprobar la expresión de la proteína DGF-1 durante el ciclo de vida de T. cruzi.
2.5 Establecer la localización celular de la proteína DGF-1 en T. cruzi.
13
METODOLOGÍA
Selección de las secuencias
En este estudio se utilizó una de las copias teloméricas del gen DGF-1 (Anexo 2)
presente en el recombinante BAC D6C (número de acceso en GenBank™
AY551440), el cual fue obtenido por Chiurillo y col. (2002) en el vector pBeloBAC11,
empleando una metodología de clonamiento de telómeros denominado vectoradaptador telomérico. Tal y como se ha mencionado, la familia de genes DGF-1
presenta al menos 565 copias dispersas en el genoma de T. cruzi. (El Sayed y col.,
2005). Sin embargo, esta información se desconocía para el momento en que se
diseñó la metodología de este trabajo, porque todavía no se habían publicado los
resultados del Proyecto Genoma de este organismo. Para entonces sólo habían sido
reportadas dos secuencias de genes DGF-1 (Wincker y col., 1992; Chiurillo y col.,
2002). Se utilizó la secuencia del gen DGF-1 clonada en el recombinante BAC D6C
porque era la única secuencia telomérica de DGF-1 descrita y por la disponibilidad de
este recombinante en el laboratorio.
La secuencia presente en el recombinante BAC D6C proviene de la cepa CL Brener
de T. cruzi, que es la cepa de referencia utilizada en el Proyecto Genoma de este
parásito (El-Sayed y col., 2005). Este recombinante contiene un inserto de 29248 pb,
donde el gen DGF-1 presenta un tamaño de 10425 pb y yace entre secuencias
correspondientes a pseudogenes de las familias rhs (Retrotransposon Hot Spot) y
gp85 (Surface Glycoprotein of 85 KDa) (Fig. 2, Kim y col., 2005).
Con el fin de obtener anticuerpos contra proteínas derivadas de secuencias internas
del gen DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C, se seleccionaron dos
14
segmentos de este gen con base en un análisis de antigenicidad e hidrofobicidad de
la secuencia de la proteína DGF-1 deducida a partir del mismo, utilizando el
programa DNAMAN v. 5.2.2 (Lynnon BioSoftTM). A estas secuencias se les asignó el
nombre de Región Específica 1 (RE1) y Región Específica 2 (RE2).
Figura 2. Organización de la secuencia del recombinante telomérico BAC D6C. La flecha
indica el sentido de los genes. Diferentes secuencias aparecen identificadas en la parte
superior: gp85 ϕ y rhs ϕ son pseudogenes de las familias de multigenes gp85 y rhs
respectivamente; dgf-1 es una copia de la familia dispersed gene family-1; L1Tc es un
retrotransposon del tipo no-LTR; RS13Tc, RS1Tc y Seq3Tc son secuencias SIRE-asociadas;
189 bp es la unión de 189 pb; (TTAGGG)66 son los repetidos teloméricos. Las barras blancas
y negras indican regiones de secuencias repetidas (Tomado de Kim y col., 2005).
Diseño de oligonucleótidos
Con el fin de amplificar y realizar el clonamiento dirigido de los fragmentos RE1 y
RE2 en el vector pGEX-5X-2 se diseñaron oligonucleótidos que contienen sitios de
restricción (Tabla I). Para verificar que los oligonucleótidos diseñados permitieran la
inserción de cada fragmento en el vector de manera dirigida y conservando la fase
de traducción con respecto al promotor del vector de expresión, se simularon
clonamientos in silico empleando el programa DNAMAN v. 5.2.2 (Lynnon BioSoftTM).
15
Posteriormente, los oligonucleótidos diseñados fueron sintetizados por la casa
comercial Bioneer®.
Tabla I. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de los segmentos RE1 y RE2 a
partir de la secuencia del gen DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C.
Oligonucleótido
Secuencia*
Sitio de
restricción
Fragmento**
Fw RE1pGEX5X2
5’- GAT CGG ATC CGT GGT CTG TGC TTT GTC AAC-3’
BamHI
RE1
Rv RE1pGEX5X2
5’- GTA CGT CGA CTA CGA CAC CTC CTC ATC GT -3’
SalI
(915 pb)
Fw RE2pGEX5X2
5’- GAT CGG ATC CAG TCG ATG TCG GGG AGC-3’
BamHI
RE2
Rv RE2pGEX5X2
5’- TGC AAG CTT CGC GGA CAA ACA CAC TCG -3’
HindIII
(1117 pb)
*Las regiones resaltadas en gris indican la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción.
** Los tamaños de los fragmentos amplificados disminuyen a 901 pb y 862 pb para RE1 y RE2
respectivamente, después de ser digeridos con las enzimas de restricción BamHI y SalI. La secuencia
RE2 presenta un sitio de restricción SalI interno que permite generar el fragmento esperado al digerirlo
con este par de enzimas.
Amplificación de fragmentos de ADN
Los segmentos RE1 y RE2 fueron amplificados mediante la Reacción en Cadena de
la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction o PCR) utilizando 10-20 ng de ADN del
recombinante BAC D6C, MgCl2 1,5 mM, tampón 1X de PCR libre de Magnesio (TrisHCl 10 mM, KCl 50 mM y Tritón X-100 0,1%) (Promega), mezcla de
desoxiribonucleótidos 200 µM,
oligonucleótidos forward y reverse
a una
concentración final de 0,2 µM y 4 unidades de la enzima Taq DNA polymerase in
storage buffer B (Promega), en un volumen final de 100 µL. Las condiciones de la
PCR para RE1 fueron: paso inicial de desnaturalización: 95 ºC por 5 min; 30 ciclos de
amplificación: 94 ºC por 30 s, 50 ºC por 30 s y 74 ºC por 30 s; extensión final: 74 ºC
por 10 min. Las condiciones de la PCR para RE2 fueron: paso inicial de
desnaturalización: 95 ºC por 5 min; 30 ciclos de amplificación: 94 ºC por 30 s, 51 ºC
16
por 30 s y 74 ºC por 30 s; extensión final: 74 ºC por 10 min. Estas reacciones se
llevaron a cabo en un termociclador PTC-200 (MJ Research®). Los tamaños de los
productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%
en tampón Tris-Acetato-EDTA (TAE). Finalmente estos productos fueron purificados
utilizando el kit Wizard™ PCR Preps DNA Purification System (Promega) siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Electroforesis en geles de agarosa
Con el fin de verificar los tamaños de todos los fragmentos de ADN utilizados y
generados durante la realización de las construcciones moleculares, los mismos
fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa horizontales a una
concentración de 1% p/v en tampón TAE (Tris acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3).
Las muestras de ADN se mezclaron con tampón de carga 1X (azul de bromofenol
0,042%, xilen cianol 0,042%, glicerol 5%) antes de ser colocadas en el gel y las
corridas se realizaron en una cámara de electroforesis RunOne (Embi Tec®). Una
vez terminada la corrida, el gel se tiñó con una solución de bromuro de etidio 0,5
µg/mL por 5 min y el exceso fue removido colocando el gel en agua destilada durante
5 min adicionales. Finalmente, para visualizar las bandas de ADN, el gel fue
colocado en un transiluminador de intensidad dual (UVP™) y las imágenes de los
geles fueron digitalizadas con un sistema de análisis y documentación de
electroforesis Kodak Digital Science™ modelo 120.
Construcciones moleculares
Las secuencias RE1 y RE2 fueron clonadas en los siguientes vectores de expresión:
pET28a, pRSETb, pET43.1a y pGEX5-X-2 (Tabla II y Fig. 3). Después de sucesivos
ensayos de inducción en todos los sistemas de expresión, se estandarizaron las
condiciones para la expresión de las proteínas recombinantes RE1 y RE2 en el
vector pGEX-5X-2, que permite la obtención de péptidos fusionados a la proteína
17
Glutatión-S-Transferasa (GST) de Schistosoma japonicum. Con el resto de los
vectores no fue posible sobre-expresar estos péptidos.
Tabla II. Vectores de expresión utilizados para el clonamiento de los fragmentos RE1 y RE2.
Vector de
Expresión
Casa
Comercial
Promotor
Cepa de
Expresión
Sistema de purificación de la
proteína recombinante
pET28a
Novagen
T7
E. coli, BL21
(DE3) pLysS
Fusión a cola de polihistidina
pRSETb
Invitrogen
T7
E. coli, BL21
(DE3) pLysS
Fusión a cola de polihistidina
pET43.1a
Novagen
T7
E. coli, BL21
(DE3) pLysS
Fusión a cola de polihistidina
pGEX-5X-2
Amersham
Biosciences
tac
E. coli, BL21
(DE3) pLysS
Fusión al gen GST
Digestión de ADN con enzimas de restricción
Para el clonamiento de los fragmentos RE1 y RE2 en el vector pGEX-5X-2, cada
producto de PCR y el vector fueron digeridos en reacciones independientes y de
manera secuencial con las enzimas de restricción BamHI y SalI (Promega) en un
volumen final de 30 µL cada una, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Después de cada reacción de restricción los fragmentos se purificaron mediante
precipitación toda la noche a -20 ºC con 75 µL de etanol 100%, 3 µL de acetato de
sodio 3 M y 1 µL de glicógeno. Al día siguiente los fragmentos se centrifugaron
durante 30 min a 14000 rpm en una centrífuga Eppendorf modelo 5424, se agregó 1
mL de etanol 70% a las muestras y se centrifugaron durante 5 min adicionales. El
sobrenadante fue descartado y los pellets se dejaron secar a TA para ser
resuspendidos finalmente en 10 µL de agua grado PCR (desionizada y esterilizada
por filtración). El tamaño de cada inserto y del vector fue verificado en geles de
agarosa al 1% en tampón TAE.
18
A
B
C
D
Figura 3. Mapas de los vectores de expresión empleados para el clonamiento de los
segmentos RE1 y RE2. Los mapas fueron suministrados por las casas comerciales que los
producen. Cada mapa presenta el sitio de múltiple clonamiento con sus sitios de restricción.
A, pET28A; B, pET43.1a; C, pRSET(a,b,c); D, PGEX-5X-2.
19
Reacciones de ligamiento
Cada uno de los fragmentos digeridos (RE1 y RE2) fue colocado por separado en
una reacción de ligamiento con el vector pGEX-5-X-2 en una relación molar
aproximada de 2 a 1 (inserto : vector), empleando el kit LigaFast™ Rapid DNA
Ligation System (Promega). La mezcla de reacción consistió en 1 µg de inserto, 0,1
µg de vector, 4 µL de Rapid Ligation Buffer 5X y 1 unidad de T4 Ligasa, en un
volumen final de 20 µL. La reacción se incubó durante toda la noche a 16 ºC. Los
productos de las reacciones de ligamiento fueron verificados en geles de agarosa al
1% en tampón TAE.
Preparación de células químicamente competentes
Se utilizaron células de la cepa Escherichia coli TOP10F’ (genotipo: F´{lacIq,
Tn10(TetR)} mcrA
(mrr-hsdRMS-mcrBC)
80lacZ M15
lacX74 recA1 araD139
(ara-
leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG) (Invitrogen™) para ser transformadas con los
productos de las reacciones de ligamiento. El protocolo para la preparación de
células químicamente competentes se realizó en condiciones de esterilidad y
consistió en sembrar por agotamiento la cepa en una placa con medio PSI-A
(extracto de levadura 0,5%, triptona 2%, MgSO4·7H2O 0,5%, agar base 1,4%, pH 7,6)
suplementado con tetraciclina 10 µg/mL e incubarla toda la noche a 37 ºC. Luego se
tomó una colonia de la placa fresca (máximo 3 días después de haber sido rayada) y
se inoculó en 5 mL de PSI-B (extracto de levadura 0,5%, triptona 2%, MgSO4·7H2O
0,5%, pH 7,6) suplementado con el mismo antibiótico, en un tubo de ensayo para
incubar toda la noche con agitación a 37 ºC. Luego se inocularon 250 µL del cultivo
saturado en 100 mL de PSI-B con antibiótico en una fiola de 500 mL y se incubó con
agitación a 37 ºC hasta alcanzar una DO600nm= 0,48.
El cultivo se dividió en 8
alícuotas de 12,5 mL cada una, en tubos de 15 mL estériles que se colocaron en
hielo por 10 min. Las células se centrifugaron a 5000 rpm por 10 min a 4 ºC en una
centrífuga Beckman modelo GS-6R y se resuspendieron en 20 mL de CaCl2 50 mM
frío y estéril. En esta solución se incubaron por 10 min en hielo, luego se
20
centrifugaron y se repitió el lavado con CaCl2 50 mM una vez más. Posteriormente
las células se resuspendieron en 40 mL de solución TFB-I (acetato de potasio 30
mM, KCl 100 mM, CaCl2 10 mM, MnCl2 50 mM, glicerol 15%, pH 5.8) estéril y fría y se
incubaron durante 5 min en hielo. Después se centrifugaron nuevamente y se
resuspendieron en 4 mL de TFB-II (MOPS 10 mM, KCl 10 mM, CaCl2 75 mM, glicerol
15%, pH 6,5) para ser incubadas en hielo por 15 min. A medida que disminuía el
volumen de resuspensión, los pellets se mezclaron hasta llegar a tener en un solo
tubo todas las células resuspendidas en TFB-II. Finalmente, se colocaron en tubos
de 1,5 mL estériles previamente enfriados, repartidas en alicuotas de 100 µL que se
almacenaron a -70 ºC hasta el momento de su utilización. Con este protocolo las
células mantuvieron hasta por cuatro meses su máxima eficiencia de transformación
(5 × 106 UFC/µg de ADN aproximadamente).
Transformación de E. coli por choque térmico
Para obtener los plásmidos recombinantes pGEX-5X-2/RE1 y pGEX-5X-2/RE2 se
transformaron células E. coli químicamente competentes con los productos de
ligamiento antes descritos. Para ello se agregaron 2 µL de una dilución 1:5 de cada
reacción de ligamiento a 100 µL de células TOP10F’ químicamente competentes, en
condiciones de esterilidad. La mezcla se incubó durante 10 min en hielo y el tubo se
colocó en un baño a 42 ºC por 45 s. Rápidamente se colocó el tubo de nuevo en
hielo durante 5 min adicionales. Luego se añadió a las células 900 µL de medio SOC
sin antibiótico (triptona 2%, extracto de levadura 0,5%, NaCl 0,05%, KCl 2,5 mM,
glucosa 0,36%, MgCl2 10 mM, pH 7,0) y el cultivo se incubó a 37 ºC con agitación por
1 h. Transcurrido este tiempo, las células se sembraron por diseminación con
espátula de Drigalsky en medio Luria-Bertani o LB (triptona 1%, extracto de levadura
0,5%, NaCl 1%, pH 7,5) suplementado con ampicilina 100 µg/mL para la selección de
los clones positivos. Estas placas se incubaron a 37 ºC por 18 h para permitir el
crecimiento de los posibles clones recombinantes.
21
Aislamiento de ADN plasmídico mediante lisis por choque térmico (boiling
miniprep)
Partiendo de las colonias obtenidas mediante la transformación de células de E. coli,
se realizó el aislamiento de plásmidos por el método de boiling miniprep, para lo cual
se tomó cada colonia con un palillo de madera estéril y se colocó en 1 mL de caldo
LB suplementado con 100 µg/mL de amplicilina. El cultivo se incubó toda la noche a
37 ºC con agitación. Posteriormente se transfirió a un tubo de 1,5 mL y se centrifugó
a 14000 rpm por 20 s en una microcentrífuga Eppendorf modelo 5424. Después de
descartar el sobrenadante, el pellet se resuspendió en 110 µL de solución STET
(sacarosa 8%, Tritón X-100 0,5%, EDTA 50 mM, Tris base 50 mM) suplementada
con lisozima a una concentración final de 1 mg/mL, e inmediatamente se colocó en
baño hirviendo durante 45 s. Luego se centrifugó a 14000 rpm a TA por 15 min y el
pellet fue retirado con un palillo de madera. Al sobrenadante que quedó en el tubo se
le agregaron 110 µL de isopropanol al 100%. Luego de mezclar por inversión y dejar
reposar la muestra por 5 min a TA se centrifugó de nuevo a 14000 rpm por 15 min y
se descartó el sobrenadante. Finalmente, el pellet que contenía el ADN plamídico se
resuspendió en 30 µL de agua grado PCR.
Análisis de plásmidos recombinantes
Por cada experimento de clonamiento se analizaron 30 colonias. Los plásmidos
recombinantes se sometieron a un análisis de restricción el mismo día de su
aislamiento por boiling meniprep, para lo cual se digirieron con las enzimas de
restricción BamHI y SalI, que permiten la liberación del inserto en el caso de los
clones positivos. Estos recombinantes positivos fueron aislados nuevamente por el
método de lisis alcalina utilizando el kit Wizard® SV Plasmid DNA Purification System
(Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente la secuencia de
cada inserto fue verificada mediante química de terminadores y electroforesis capilar
empleando el BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)
22
en un secuenciador automático modelo ABI Prism™ 310 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems).
Expresión de proteínas recombinantes
Para la expresión de los dos polipéptidos internos de la secuencia de DGF-1
fusionados a GST, cada uno de los recombinantes obtenidos en el vector pGEX-5X-2
(pGEX-5X-2/RE1 y pGEX-5X-2/RE2) fue transformado en la cepa E. coli BL21 (DE3)
pLysS, genotipo: F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CamR), (Invitrogen™)
químicamente competente, siguiendo el mismo protocolo utilizado para la
transformación de las células de E. coli TOP10F’. El ensayo de inducción de la
expresión consistió en cultivar la cepa recombinante en medio LB, suplementado con
al antibiótico apropiado según el marcador de selección (en este caso cloranfenicol
30 µg/mL y ampicilina 100 µg/mL) en un volumen de 25 mL a 37 ºC con agitación,
hasta alcanzar una DOλ600nm= 0,4 - 0,6; momento en el cual se indujo la expresión de
la proteína recombinante añadiendo al medio IPTG para alcanzar una concentración
final de 1 mM. El cultivo inducido se continuó incubando en las mismas condiciones
durante 3 h adicionales, para permitir la sobreexpresión de la proteína de interés.
Posteriormente las células fueron lavadas con tampón fosfato salino pH 7,4 (PBS) y
lisadas con lisozima 10 mM y Tritón X-100 0,2% en PBS para la extracción total de
las proteínas. A los extractos proteicos se les añadió 1 U/mL de DNAsa I
(Calbiochem), 1 U/mL de Ribonucleasa A (Sigma) y 0,5 µL de mezcla de inhibidores
de proteasas Set VII (Calbiochem) (AEBSF 100 mM, bestatina 5 mM, E-64 1,5 mM,
pestatina 2 mM y fosforamidon 200 µM) por cada mL de cultivo celular lisado. Luego
fueron incubados por 15 min a 4 ºC y se centrifugaron a 5000 rpm en una centrífuga
Beckman modelo GS-6R durante 30 min a 4 ºC. El sobrenadante (fracción soluble)
se separó en un nuevo tubo, mientras que el pellet (fracción insoluble) fue
solubilizado con 20 µL de NaOH 0,2 N por cada mL de cultivo celular lisado. Ambas
fracciones fueron analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones denaturalizantes (SDS-PAGE).
23
Purificación de proteínas recombinantes
El protocolo de purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad
empleando una resina de glutatión sefarosa, sólo es viable si se utiliza un extracto
proteico soluble. Debido a que las proteínas recombinantes RE1 y RE2 se agregaban
formando cuerpos de inclusión y no estaban presentes en la fracción soluble del
extracto proteico de la cepa E. coli inducida, su purificación no fue realizada
empleando columnas de afinidad a GST. Alternativamente se utilizaron los siguientes
protocolos:
Para la purificación de las proteínas utilizadas en la inmunización de ratones, se
tomó la fracción insoluble del extracto proteico de la cepa de E. coli inducida. Esta
fracción se resolvió en un gel de poliacrilamida preparativo (SDS-PAGE, gel de 1 mm
de espesor) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, tal y como se describe
más adelante en el apartado de inmunodetección de proteínas en membranas.
Posteriormente la membrana se tiñó con solución colorante (Rojo Ponceau 0,2%,
ácido acético 0,1%) y la banda correspondiente al polipéptido recombinante sobreexpresado fue cortada para su utilización en la obtención de anticuerpos policlonales
en ratón.
Para la purificación de las proteínas recombinantes destinadas a inmunizar conejos
se empleó otro método de purificación, el cual consistió en cortar directamente la
banda de la proteína sobre-expresada a partir de geles preparativos de poliacrilamida
al 10%. Para ello se realizó un corte vertical del gel (una porción de 1 cm de ancho
aproximadamente) y se tiñó con solución colorante (azul de Coomasie 0,25%,
metanol 45%, ácido acético 10%). Esta porción del gel se destiñó con una solución
de ácido acético al 10% mientras el resto del gel se conservó sumergido en tampón
de corrida. La porción teñida se colocó nuevamente al lado del gel y se cortó el
espacio donde debería estar la banda de interés en el gel no teñido. Este fragmento
de poliacrilamida fue triturado y colocado en 1 mL de tampón de elución pasiva (50
mM NaHCO3, 0,1% SDS) más 2 µL de mezcla de inhibidores de proteasas Set VII
24
(Calbiochem) con agitación constante a 4 ºC toda la noche. La preparación se
centrifugó a 5000 g por 1 min y el sobrenadante conteniendo el péptido purificado se
analizó por SDS-PAGE.
Obtención de anticuerpos policlonales anti-RE1 y anti-RE2 en ratón
Los anticuerpos policlonales producidos en ratón fueron obtenidos por la Lic.
Agustina Rojas en el Centro de Investigaciones Parasitológicas “J.F. Torrealba” de la
Universidad de los Andes (ULA) dirigido por el Profesor Néstor Añez.
La
metodología consistió en incubar las tiras de nitrocelulosa conteniendo entre 80 y
100 µg de péptido a 40 ºC durante toda una noche, y luego triturarlas con un mortero
en 1 mL de solución salina (0,85% NaCl). Cada preparación se utilizó para inocular
ratones de la línea NMRI que pesaban cerca de 20 g. En total se realizaron 3
inoculaciones cada 15 días, incluyendo un ratón adicional al que se le inoculó
solamente nitrocelulosa como control. Finalmente, los ratones fueron sangrados 15
días después de la última inoculación y los sueros se analizaron mediante ensayos
de inmunoblot para verificar la producción de anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2.
Obtención de anticuerpos policlonales anti-RE1 en conejo
El péptido RE1 purificado por elución pasiva fue cuantificado utilizando el reactivo
Quick Start™ Bradford (BIO-RAD) siguiendo el protocolo recomendado por el
fabricante, utilizando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 UV-Vis (Thermo
Fisher Scientific). Para la producción del suero policlonal se inoculó un conejo macho
de la línea Nueva Zelanda de 12 semanas de edad. Para la primera inoculación se
preparó una mezcla de inmunización que consistió en 200 µg del péptido RE1
(antígeno) en un volumen de 0,5 a 1 mL más 500 µL de adyuvante completo de
Freund. De esta mezcla se inyectaron al conejo por vía subcutánea cuatro tandas de
200 µL cada una. A los 15 y 30 días después de la primera inoculación se repitió el
procedimiento con adyuvante incompleto de Freund. La última inoculación se realizó
25
45 días después de la primera inyección y se administró sin adyuvante. A excepción
de la primera inoculación, el resto de las inyecciones contenían 100 µg de antígeno
cada una. Posteriormente se extrajeron 20 mL de sangre del animal por punción
cardiaca a los 60 días después de la primera inoculación. La sangre se colocó en
tubos de 15 mL y se incubó en hielo por 30 min para inducir la formación del coágulo.
Luego se separó el suero por centrifugación a 3000 rpm (en rotor angular) y se
desechó el pellet. Los sueros fueron separados en alicuotas de 1 mL y almacenados
a -20 ºC.
Cultivo de parásitos
En la mayoría de los experimentos se utilizó la cepa CL Brener de T. cruzi, la cual fue
seleccionada por la Organización Mundial de la Salud para desarrollar el Proyecto
Genoma de este organismo (El-Sayed y col., 2005). Para los ensayos de
fraccionamiento subcelular se empleó el aislado venezolano T. cruzi MHOM/VE/92/292-YBM. La cepa Leishmania major MHOM/JL/80/Friedlin fue utilizada como control
negativo en algunas inmunodetecciones.
Los epimastigotes de T. cruzi se mantuvieron en cultivos axénicos a 27 ºC a partir de
un inóculo de 5 × 106 parásitos/mL en medio Liver Infusion Tryptose (LIT)
suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Internegocios S.A). Para inducir
el proceso de metaciclogénesis in vitro, se empleó la metodología utilizada por
Santos y col. (2005) que consiste
en
inocular 8 × 107 epimastigotes en fase
estacionaria en el medio de diferenciación Grace´s Insect Medium (Sigma)
suplementado con 10% de SFB, hasta diluir el inóculo 1:5. Estos cultivos se
incubaron a 27 ºC sin agitación durante 10 días. A partir del día 6, se prepararon
láminas mediante tinción Giemsa y los parásitos fueron observados al microscopio
para confirmar la morfología característica del estadio tripomastigote, que se
evidencia por la migración del kinetoplasto con respecto al núcleo de la célula. La
eficiencia de la diferenciación de los parásitos alcanzó su tope al noveno día de ser
cultivados en medio Grace, cuando aproximadamente el 50% de los parásitos se
26
diferenciaban en tripomastigotes metacíclicos. Debido que las formas metacíclicas
no son proliferativas, después del décimo día de cultivo los parásitos entraban en
fase de muerte celular. Por este motivo, los ensayos realizados con parásitos en el
estadio metacíclico se llevaron a cabo con cultivos en medio Grace que tenían entre
7 y 9 días de haber sido preparados.
Infección de células de mamífero en cultivo
La diferenciación in vitro de los parásitos al estadio amastigote y tripomastigotes
parecidos a la forma sanguícola (trypomastigote-like), se realizó mediante la
infección de células de riñón de mono pertenecientes a la línea LLC-MK2 (Hull y col.,
1962). Las células fueron mantenidas en viales de cultivo formando monocapas,
utilizando medio RPMI (Sigma) suplementado con 10% SFB, en atmósfera de 5%
CO2 a 37 ºC. Antes de sembrar las células a infectar, se depositaron en el fondo de
los pozos cubreobjetos estériles que posteriormente se utilizaron para la observación
de amastigotes al microscopio. Para la infección con T. cruzi se utilizó un inóculo de
1 × 105 células tripsinizadas (0,05% tripsina, 0,02% EDTA) en 5 mL de medio RPMI
(10% SFB) en viales de 6 pozos. Las células fueron incubadas durante la noche a 37
ºC en atmósfera de 5% CO2. Se empleó una proporción 10:1 de parásitos en estadio
metacíclico por célula. Antes de la infección los parásitos fueron incubados 1 h a 37
ºC en medio RPMI (2% SFB). Una vez formada la monocapa de células LLC MK2, el
medio de cultivo fue reemplazado por RPMI suplementado con 2% de SFB y luego
se colocó el inóculo de tripomastigotes metacíclicos, trabajando en ambiente estéril
(en campana de flujo laminar). Las células inoculadas se incubaron durante 5 h a 37
ºC en atmósfera de 5% CO2. Para remover los parásitos que no completaron la
invasión celular, el cultivo fue lavado 3 veces con PBS estéril. Luego se le colocó
nuevamente medio RPMI (10% SFB) y se incubó en las mismas condiciones. Para
verificar la presencia del estadio amastigote en el interior de las células, tres días
después de la infección se examinaron las láminas depositadas en los pozos
mediante tinción Giemsa. A los 5 días se observaron los primeros tripomastigotes en
27
el medio de cultivo, los cuales fueron colectados sucesivamente entre los días 5 y 7
post-infección.
Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Los anticuerpos policlonales anti-RE1 y anti-RE2 fueron utilizados en ensayos de
inmunoblot para la detección de los antígenos GST-RE1 y GST-RE2, y para detectar
la proteína DGF-1 nativa en diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Los
extractos proteicos totales de los estadios epimastigote y tripomastigote metacíclico
se obtuvieron colocando directamente en tampón de carga 6X (Tris-HCl 300 mM pH
6,8, SDS 12%, glicerol 60% y azul de bromofenol 0,6%) en una relación 5:1
(muestra-tampón de carga) un total de 5 × 106 parásitos contados en cámara de
Neubauer y resuspendidos en 5 µL de PBS más 1 µL de mezcla de inhibidores de
proteasas (Calbiochem). Las muestras fueron calentadas en baño a 100 ºC por 5 min
y sometidas a SDS-PAGE en tampón de corrida (Tris base 25 mM, glicina 250 mM,
SDS 0,1%, pH 8,3) a 100 V en un sistema Mini PROTEAN® 3 Electrophoretic Cell
(BIO-RAD). Debido a que el tamaño de la proteína DGF-1 putativa es de 360 KDa
aproximadamente, todos los extractos proteicos de parásitos fueron analizados en
geles de poliacrilamida al 8%. Los extractos proteicos de TCT fueron suministrados
por el Centro de Investigaciones Parasitológicas “J.F. Torrealba” de la Universidad de
los Andes (ULA), donde se realizó el fraccionamiento subcelular de epimastigotes y
TCT según metodología descrita por Añez-Rojas y col. (2006).
Inmunodetección de proteínas en membranas
Los antígenos y extractos proteicos de E. coli y T. cruzi separados por SDS-PAGE
fueron transferidos por electroblotting a membranas de nitrocelulosa (BIO-RAD) en
un sistema Mini-Trans Blot® Electrophoretic Cell (BIO-RAD), siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se utilizó tampón de transferencia (Tris base 48 mM,
glicina 39 mM, SDS 0,037%, metanol 20%) y las condiciones fueron 100 V durante 1
28
h para geles de 0,75 mm de espesor y 1,5 h para geles de 1 mm de espesor. Para la
inmunodetección las membranas se incubaron en solución de bloqueo (leche
descremada al 5% en tampón Tris-Buffered Saline Tween-20, TBST) durante 1 h a
37 ºC o durante toda la noche a 4 ºC. Posteriormente las membranas fueron
incubadas con el anticuerpo primario al título óptimo establecido para cada uno
(1:100 para anticuerpos producidos en ratón y 1:7500 para anticuerpos producidos
en conejo) durante toda una noche a 4 ºC con agitación. Luego se realizaron 5
lavados de 15 min cada uno con TBST y agitación fuerte y se procedió a incubar las
membranas con el anticuerpo secundario (anti ratón o anti conejo, según el caso)
conjugado a peroxidasa (Santa Cruz Biotechnologies) usando un título de 1:2000
durante 1 h a TA. Posteriormente se realizaron de nuevo 5 lavados con TBST y la
actividad peroxidasa se reveló empleando el sistema SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrate (Pierce) y películas Amersham Hyperfilm ECL (GE
Heathcare) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Inmunodetección de proteínas en T. cruzi
Los ensayos de inmunofluorescencia se realizaron siguiendo la metodología descrita
por Figarella y col. (2007) con algunas modificaciones. Para cada preparación se
utilizaron 1 × 106 parásitos lavados dos veces con PBS y resuspendidos en 0,2 mL
de PBS en tubos de 1,5 mL. Los parásitos fueron fijados con 0,3 mL de una solución
de paraformaldehido 4% y glutaraldehido 0,1% en PBS durante toda una noche a 4
ºC. Posteriormente se realizó un lavado con PBS y se incubaron los parásitos
durante 15 min a TA en 0,5 mL de solución de bloqueo (Na2HPO4 100 mM, glicina
100 mM, pH 7,2). Luego se añadieron 0,5 mL de Tritón X-100 0,2% en PBS para la
permeabilización de las células. Después de 5 min los parásitos se lavaron con
albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumine, BSA) 1% en PBS y se incubaron
durante toda una noche a 4 ºC con 200 µL de anticuerpo primario diluido en esta
misma solución, empleando el título preestablecido mediante los ensayos de
inmunodetección. Los parásitos se lavaron nuevamente 2 veces con BSA 1% y se
incubaron 1 h a 4 ºC en oscuridad con 200 µL de anticuerpo secundario (anti ratón o
29
anti conejo según el caso) conjugado al fluoróforo Alexa Fluor 488™ (Invitrogen) o
Texas Red™ (Santa Cruz Biotechnologies) empleando un título de 1:1000 y 1:2000
respectivamente para estos anticuerpos. Luego se añadieron 5 µL de DAPI (4',6diamidino-2-fenilindol) 10 µg/mL (Santa Cruz Biotechnologies) y se incubó la
preparación por 20 min adicionales a TA. Finalmente las células se lavaron una vez
con BSA 1% en PBS y dos veces con agua destilada y fueron resuspendidas en 15
µL de agua. Se colocaron 5 µL de esta preparación sobre una lámina portaobjeto
limpia y se dejó secar la muestra a TA. Los parásitos inmunomarcados se cubrieron
con 2 µL de Fluoromount-G™ (SouthernBiotech) y se les colocó una lámina
cubreobjeto limpia para su visualización en un microscopio confocal marca Nikon
modelo D-Eclipse C1 acoplado a CL Laser U2 (Neón 543 nm, Argón 488 nm)
controlado con interfase de eclipse C1 (Laboratorio de Permeabilidad Iónica, Centro
de Biofísica y Bioquímica, IVIC) o un microscopio confocal marca Nikon modelo DEclipse C1 acoplado a CL Laser U2 (Neón 543 nm, Argón 488 nm, UV 405 nm)
controlado con interfase de eclipse TE2000U (Laboratorio de Genómica y
Proteómica, Centro de Biotecnología, IDEA). Como control positivo se utilizaron
anticuerpos policlonales anti-PFK de T. cruzi y como control negativo se emplearon
preparaciones a las que no se le colocó el anticuerpo primario. Las secciones ópticas
fueron grabadas utilizando las mismas
condiciones de intensidad del láser y
ganancia para todas las muestras: 100 unidades para el láser de UV, 125 unidades
para el láser de argón y 120 unidades para el láser de neón. Las imágenes fueron
procesadas con el programa EZ-C1 FreeViewer Silver Version 3.00 (Nikon).
30
RESULTADOS
Amplificación y clonamiento de dos segmentos internos del gen DGF-1
Descripción de los segmentos internos RE1 y RE2 de la proteína DGF-1
putativa.
Con el objeto de obtener proteínas recombinantes antigénicas que representaran
secuencias parciales de la proteína DGF-1 putativa, se realizó un análisis de
antigenicidad e hidrofobicidad de la proteína deducida a partir del marco abierto de
DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C. El resultado de este análisis permitió
la selección de 2 segmentos internos correspondientes a los aminoácidos 880-1177
(RE1) y 2089-2374 (RE2) de los 3474 aminoácidos que conforman la proteína DGF-1
putativa (Fig. 4, Anexo 3). En la Tabla 3 se muestran algunas características de
estas regiones, según predicciones establecidas con el programa DNAMAN.
Amplificación de los fragmentos RE1 y RE2
Los fragmentos RE1 y RE2 se obtuvieron mediante amplificación por PCR utilizando
el recombinante BAC D6C como ADN molde. Los productos de PCR purificados
fueron analizados junto a sus controles negativos en un gel de agarosa al 1% (Fig.
5). Los tamaños de los fragmentos amplificados fueron 915 pb y 1117 pb para RE1 y
RE2, respectivamente.
31
Glicopéptido
DGF-1 putativa
RE1
RE2
Proteína DGF-1 putativa
Figura 4. Posición de los segmentos RE1 y RE2 sobre la secuencia de la proteína putativa
DGF-1 deducida a partir del gen DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C. Aguas abajo
de RE2 se encuentra la secuencia del glicopéptido reportado por Atwood y col. (2006) en el
glicoproteoma de T. cruzi.
Tabla III. Características de las secuencias nucleotídicas y de las proteínas putativas DGF-1,
RE1 y RE2.
Secuencia
Longitud del
fragmento (pb)
Longitud de la
proteína putativa (aa)
Masa
Molecular (Da)
Punto
Isoeléctrico
DGF-1 en
BAC D6C
10425
3474
359573.5
5,61
RE1
896
298
31615,6
4,33
RE2
862
286
29078,6
8,48
32
L RE1 C1 RE2
C2
pb
12000
6000
4000
3000
2000
1650
1000
850
650
500
Figura 5. Amplificación por PCR de los segmentos internos del gen DGF-1, RE1 y RE2.
Electroforesis en gel de agarosa al 1%. C1 y C2, controles negativos de las reacciones de
PCR para la amplificación de los fragmentos RE1 y RE2 respectivamente. L, escalera de
masa molecular 1 Kb plus (Invitrogen). Se cargaron 5 µL de producto de PCR por carril.
Clonamiento de los fragmentos RE1 y RE2 en vector de expresión
Para el clonamiento de los fragmentos RE1 y RE2 en el vector de expresión pGEX5X-2, ambos insertos y el vector fueron digeridos de manera secuencial con las
enzimas de restricción BamHI y SalI en reacciones individuales. Los productos de las
reacciones de restricción fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al
1%. En la Figura 6 se observan los productos de las digestiones del vector y el
fragmento RE1 con BamHI (panel A) y SalI (panel B). Las bandas de
aproximadamente 5000 pb corresponden a la forma lineal del plásmido pGEX-5X-2,
mientras que las bandas ubicadas entre 850 y 1000 pb corresponden al fragmento
RE1 digerido con cada una de las enzimas mencionadas. El resultado de la digestión
del fragmento RE2 se muestra en la Figura 7. Este fragmento disminuye de tamaño
al ser digerido con la enzima SalI debido a la presencia de un sitio de reconocimiento
33
para esta enzima en la secuencia del producto de PCR. El producto de esta digestión
es un fragmento de 862 pb (Fig. 7B).
Los fragmentos RE1, RE2 y el vector pGEX-5X-2 digeridos con las enzimas BamHI y
SalI se utilizaron para realizar las reacciones de ligamiento cuyos productos se
muestran en la Figura 8. Estos productos de ligamiento se emplearon para
transformar células de E. coli (TOP10F’) químicamente competentes, obteniéndose
una eficiencia de transformación en el orden de 1 × 106 UFC / µg de ADN.
Para cada experimento de clonamiento se aisló ADN plasmídico de 30 colonias
mediante la técnica de boiling minipreps, y se determinó el tamaño de los plásmidos
por electroforesis en geles de agarosa al 1% (Fig. 9 y 10). Como puede observarse
en estas figuras, la eficiencia de cada uno de los clonamientos fue mayor al 85%, ya
que la mayoría de los recombinantes presentaron tamaños superiores al del
plásmido pGEX-5X-2 control (sin inserto).
Posteriormente, para el clonamiento pGEX-5X-2/RE1 se analizaron por restricción
los plásmidos correspondientes a los clones 3, 4, 6, 7, 10, 11, 15, 20 y 24. De ellos,
los clones 3, 6, 7, 10, 15 y 20 liberaron el inserto de 901 pb al ser digeridos con las
enzimas BamHI y SalI (Fig. 11A). Para el clonamiento pGEX-5X-2/RE2 se analizaron
por restricción los clones 2, 4, 9, 17, 21 y 29; observándose la banda de 862 pb del
inserto RE2 en todos ellos (Fig. 11B). Luego se aisló nuevamente ADN plasmídico a
partir de todos los clones positivos (Fig. 12) y la secuencia de sus insertos fue
verificada por secuenciación mediante química de terminadores. Una representación
esquemática de los recombinantes obtenidos se presenta en la Figura 13.
pb
RE1 (SalI)
Ladder
pGEX-5X-2 (SalI)
B
RE1 (BamHI)
Ladder
A
pGEX-5X-2 (BamHI)
34
pb
12000
12000
5000
4000
3000
5000
4000
3000
2000
1650
2000
1000
850
1000
1650
850
650
650
500
500
Figura 6. Digestión secuencial del vector pGEX-5X-2 y el fragmento RE1 con enzimas de
restricción. Electroforesis en geles de agarosa al 1%. A, digestión de inserto y vector con
la enzima BamHI. B, digestión de inserto y vector con la enzima SalI. Ladder, escalera
de masa molecular 1 Kb plus (Invitrogen). Se cargó 1 µL de ADN por carril.
pb
RE2 (SalI)
Ladder
pGEX-5X-2 (SalI)
B
RE2 (BamHI)
Ladder
A
pGEX-5X-2 (BamHI)
35
pb
12000
12000
5000
4000
3000
2000
1650
1000
850
650
5000
4000
3000
2000
1650
1000
850
650
500
500
Figura 7. Digestión secuencial del vector pGEX-5X-2 y el fragmento RE2 con enzimas de
restricción. Electroforesis en geles de agarosa al 1%. A, digestión de inserto y vector con
la enzima BamHI. B, digestión de inserto y vector con la enzima SalI. Ladder, escalera
de masa molecular 1 Kb plus (Invitrogen). Se cargó 1 µL de ADN por carril.
pb
12000
7000
6000
5000
4000
Lig pGEX-5X-2/RE2 (5µL)
pb
Inserto +
Vector
3000
Trímeros
de Inserto
2000
Dímeros
de Inserto
1650
Lig pGEX-5X-2/RE2 (1 µL)
B
Ladder
Ladder
A
Lig pGEX-5X-2/RE1 (4 µL)
36
12000
7000
6000
5000
4000
Inserto +
Vector
3000
2000
1650
1000
850
Dímeros
de Inserto
Inserto religado
Inserto
650
1000
850
650
500
Inserto
500
400
300
200
100
Figura 8. Ligamiento del vector pGEX-5X-2 con los fragmentos RE1 y RE2. Electroforesis en
geles de agarosa al 1%. Productos de reacciones de ligamiento utilizando como inserto el
fragmento RE1 (A) y RE2 (B). Ladder, escalera de masa molecular 1 Kb plus (Invitrogen).
37
L P
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
pb
12000
6000
4000
3000
2000
1000
L P 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
pb
12000
6000
4000
3000
2000
1000
Figura 9. Aislamiento de plásmidos recombinantes pGEX-5X-2/RE1 por boiling minipreps.
Electroforesis en geles de agarosa al 1%. L, escalera de masa molecular 1 Kb plus
(Invitrogen). P, Plásmido pGEX-5X-2 sin inserto. El número de cada recombinante se indica
en la parte superior del gel. Se cargaron 3 µL de ADN por carril.
38
L P
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
pb
12000
4000
3000
2000
1000
L P 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
pb
12000
6000
4000
3000
2000
Figura 10. Aislamiento de plásmidos recombinantes pGEX-5X-2/RE2 por boiling
minipreps. Electroforesis en geles de agarosa al 1%. L, escalera de masa molecular 1 Kb
plus (Invitrogen). P, Plásmido pGEX-5X-2 sin inserto. El número de cada recombinante
se indica en la parte superior del gel. Se cargaron 3 µL de ADN por carril.
39
L
A
C1
3
4
6
7
10
11
15
20
24
pb
Plásmido sin digerir
12000
7000
5000
pGEX-5X-2
3000
2000
RE1
1000
850
650
B
L
C2
2
4
9
17
21
29
pb
12000
7000
5000
Plásmido sin digerir
pGEX-5X-2
3000
2000
1000
850
650
RE2
Figura 11. Análisis de restricción de plásmidos recombinantes. Electroforesis en geles de
agarosa al 1%. Digestión de algunos clones del recombinante pGEX-5X-2/RE1 (A) y
pGEX-5X-2/RE2 (B) utilizando las enzimas BamHI y SalI. L, escalera de masa molecular
1 Kb plus (Invitrogen). P, Plásmido pGEX-5X-2 sin inserto. El número de cada
recombinante se indica en la parte superior del gel. Se cargaron 15 µL del producto de la
reacción de restricción por carril.
40
A
L
pb
12000
7000
5000
3000
2000
P
3
6
7
10
20
B
P
2
4
9
17
21
L
pb
12000
7000
5000
3000
1000
2000
650
400
1000
200
650
Figura 12. Aislamiento de plásmidos recombinantes positivos mediante lisis alcalina.
Electroforesis en geles de agarosa al 1%. Clones del recombinante pGEX-5X-2/RE1 (A)
y pGEX-5X-2/RE2 (B). L, escalera de masa molecular 1 Kb plus (Invitrogen). P, Plásmido
pGEX-5X-2 sin inserto. El número de cada clon se indica en la parte superior del gel. Se
cargaron 3 µL de ADN por carril.
41
Ptac
A
GST
BamHI
EcoRI
SMC
lac I
SmaI
SalI
XhoI
pGEX-5X-2
NotI
4973 pb
Amp
AMPr
pBR322
B
Ptac
C
Ptac
GST
GST
BamHI
lac I
BamHI
lac I
pGEX-5X-2/RE1
RE1
pGEX-5X-2/RE2
RE2
5855 pb
5816 pb
SalI
pBR322 ori
SalI
pBR322 ori
Amp
AMPr
Ptac, promotor tac
Amp
AMPr
GST, gen de la proteína Glutatión-S-Transferasa
SMC, sitio de múltiple clonamiento
gen DGF-1)
RE1 y RE2 (segmentos internos del
Amp, gen de resistencia a ampicilina
lac I, gen del represor lac
Figura 13. Representación esquemática del vector de expresión y los plásmidos
recombinantes obtenidos. A, vector pGEX-5X-2. B, recombinante pGEX-5X-2/RE1. C,
recombinante pGEX-5X-2/RE2.
42
Expresión y purificación de dos segmentos internos de la proteína DGF-1
putativa
Expresión de RE1 y RE2 en E. coli
El sistema de expresión pGEX-5X-2 presenta el promotor tac, un híbrido de los
promotores trp y lac que es regulado por el represor lac y por tanto puede ser
químicamente inducido en presencia de isopropiltiogalactósido (IPTG) (Sambrook y
Russell, 2001). Este inductor se une al represor lac y lo inactiva, impidiendo así su
unión al operador. Posteriormente la ARN polimerasa se une al promotor tac y se
inicia la transcripción de la secuencia insertada en el vector (Lewin, 2004). Los
recombinantes obtenidos en este vector de expresión (pGEX-5X-2/RE1 y pGEX-5X2/RE2) se utilizaron para transformar la cepa E. coli BL21 (DE3)/pLysS que expresa
la ARN polimerasa del fago T7 y es portadora del lisógeno DE3 y el plásmido pLysS,
el cual permite la expresión constitutiva de niveles basales de la lisozima de T7. Esto
reduce la expresión basal de los genes recombinantes mediante la inhibición de los
niveles basales de la T7 ARN polimerasa en la célula (Catálogo en línea de
Invitrogen™).
Al alcanzar la densidad óptica adecuada, se le añadió IPTG a los cultivos y se
extrajeron las proteínas totales justo antes de inducir (t0) y 3 h después de la
inducción (t1). Estos extractos se analizaron por SDS-PAGE, utilizando como control
el extracto proteico de la cepa E. coli BL21 sin transformar y el de la cepa E. coli
BL21 transformada con el vector pGEX-5X-2 sin inserto.
Para ambos recombinantes a t1 se observó una banda atrapada en la parte superior
del carril, muy cerca del gel de apilamiento (Fig. 14, carriles 4 y 5) que no se observó
a t0 ni en los extractos control. Este resultado sugirió que las proteínas recombinantes
GST-RE1 y GST-RE2 se estaban agregando como cuerpos de inclusión. De este
modo se procedió a separar la fracción soluble e insoluble a partir de los extractos
proteicos totales de las cepas recombinantes para ser analizados por SDS-PAGE. En
43
la Figura 15 se observan las bandas correspondientes a las proteínas recombinantes
GST (carril 5), GST-RE1 (carril 7) y GST-RE2 (carril 9), estando presente estas dos
últimas en la fracción insoluble de los cultivos inducidos a t1.
La masas moleculares de las proteínas recombinantes coincidieron con las masas
moleculares derivadas de las secuencias nucleotíticas de los segmentos GST, GSTRE1 y GST-RE2 utilizando el programa DNAMAN (Tabla 4).
1
2
3
4
5
Gel de
apilamiento
KDa
220
100
GST-RE2
70
60
50
GST-RE1
40
30
25
20
GST
Figura 14. Expresión de las proteínas recombinantes GST, GST-RE1 y GST-RE2 en
extractos proteicos totales de E. coli a t1. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%. 1,
Escalera de masa molecular Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen). 2, E. coli (BL21). 3, E.
coli (BL21)/pGEX-5X-2. 4, E. coli (BL21)/pGEX-5X-2/RE1. 5, E. coli (BL21)/pGEX-5X-2/RE2.
Las líneas negras señalan las bandas correspondientes a la proteína GST, y a las proteínas
recombinantes GST-RE1 y GST-RE2 aparentemente insolubles.
44
1
2
3
4
5
6
7
8
9
GST-RE1
KDa
60
GST-RE2
50
40
30
25
20
t0
t1
t0
t1
t0
t1
S
t0
t1
P
GST
Figura 15. Expresión de las proteínas recombinantes GST, GST-RE1 y GST-RE2 en
fracciones del extracto proteico de E. coli. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%. 1,
escalera de masa molecular Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen). 2 y 3, fracción S de E.
coli (BL21) a t0 y t1. 4 y 5, fracción S de E. coli (BL21)/pGEX-5X-2 a t0 y t1. 6 y 7, fracción P de
E. coli (BL21)/pGEX-5X-2/RE1 a t0 y t1. 8 y 9, fracción P de E. coli (BL21)/pGEX-5X-2/RE2 a
t0 y t1. Las líneas negras señalan las bandas correspondientes a las proteínas recombinantes
GST, GST-RE1 y GST-RE2.
Tabla IV. Características de las proteínas recombinantes GST, GST-RE1 y GST-RE2.
Proteína
Recombinante
Longitud
(aa)
Masa Molecular
(Da)
Punto
Isoeléctrico (pI)
GST
218
25494,4
6,52
GST-RE1
516
57110,0
4,94
GST-RE2
504
54573,0
7,52
45
Purificación de las proteínas recombinantes RE1 y RE2
El protocolo de purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad
empleando una resina de glutatión sefarosa, sólo es viable si se utiliza un extracto
proteico soluble. En vista de que las proteínas recombinantes GST-RE1 y GST-RE2
premanecían en la fracción insoluble de los extractos proteicos, surgió la necesidad
de diseñar una estrategia alternativa para la purificación de las mismas.
Con el objeto de extraer estas proteínas sin que se agregaran en cuerpos de
inclusión se utilizaron algunas recomendaciones propuestas por Villaverde y Carrió
(2003). Entre los diferentes métodos de lisis probados se realizó choque térmico
(congelamiento / descongelamiento de las células), lisis con tampón RIPA (NaCl 150
mM, β-mercaptoetanol 5 mM, nonidet P-40 1%, SDS 0,1%, Tris-HCl 50 mM pH 8),
lisis con lisozima / Tritón X-100 y lisis mediante sonicación del cultivo. Con todos los
métodos de lisis ensayados el resultado fue el mismo: las proteínas recombinantes
GST-RE1 y GST-RE2 permanecían en la fracción insoluble.
Posteriormente, para solubilizar las proteínas recombinantes se probaron 3
soluciones diferentes: a) úrea 8 M, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM pH
8,0; b) Tris-HCl 300 mM pH 6,8, SDS 12%, y c) NaOH 0,2 N en PBS. Únicamente
con las soluciones a y c fue posible solubilizar las proteínas recombinantes, pero
ambos procedimientos eliminaban por completo la afinidad de las mismas por la
resina de glutatión sefarosa, y al dializar las proteínas recombinantes para remover la
solución de solubilización, las mismas se volvían nuevamente insolubles.
Finalmente se ensayó la resolución de la fracción insoluble de los extractos proteicos
en geles preparativos (1,5 mm de espesor) de poliacrilamida al 10 %, donde se pudo
apreciar una banda prominente entre 50 y 60 KDa (Fig. 16). Tal y como se observa
en la Figura 16B, una porción de la proteína recombinante GST-RE2 se queda
atrapada en la parte superior del gel, lo que indica que su solubilización fue parcial.
46
Por el contrario, se logró la solubilización completa de GST-RE1 (Fig. 16A), razón por
la cual el rendimiento de su purificación siempre fue más elevado.
A
B
KDa
100
KDa
100
70
60
50
RE1 70
40
50
30
40
RE2
insoluble
60
RE2
25
20
30
Figura 16. Geles preparativos para la purificación de proteínas recombinantes. Electroforesis
en geles de poliacrilamida al 10% (1,5 mm de espesor). A, fracción P de E. coli
(BL21)/pGEX-5X-2/RE1. B, fracción P de E. coli (BL21)/pGEX-5X-2/RE2. Se empleó la
escalera de masa molecular Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen). En cada bolsillo del gel
se colocó la fracción insoluble completa extraída a partir de 5 mL de cultivo inducido.
Los geles preparativos con los extractos proteicos de las cepas recombinantes
inducidas fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa y la banda de interés fue
recuperada para la obtención de anticuerpos en ratón. Alternativamente, la proteína
recombinante GST-RE1 fue purificada por elución pasiva (Fig. 17) y luego fue
utilizada para la producción de anticuerpos policlonales en conejo.
47
KDa
L
RE1
220
160
120
100
80
70
60
50
40
30
25
20
Figura 17. Purificación de la proteína recombinante GST-RE1 por elución pasiva.
Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%. Se empleó la escalera de masa molecular
Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen). Se cargaron 2 µg de proteína aproximadamente en
el carril.
Especificidad de sueros anti-RE1 y anti-RE2 obtenidos en ratón
Los anticuerpos policlonales anti-RE1 y anti-RE2 obtenidos en ratón fueron probados
en ensayos de inmunodetección utilizando las fracciones insolubles de los extractos
proteicos de las cepas E. coli BL21 transformadas e inducidas. El reconocimiento de
los antígenos RE1 y RE2 fue específico (Fig. 18, carriles 1 y 5).
48
B
A
SDS-PAGE
Inmunoblot
1
2
3
SDS-PAGE
4
Inmunoblot
5
6
7
8
KDa
KDa
100
100
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
25
BL21/RE1
GST-RE1
BL21/RE2
GST-RE2
Figura 18. Inmunodetección de péptidos recombinantes por Western Blot utilizando
anticuerpos policlonales producidos en ratón. A, péptido RE1 en el extracto proteico de E.
coli (BL21)/RE1 inducida. B, péptido RE2 en el extracto proteico de E. coli (BL21)/RE2
inducida. Anticuerpos: 1, suero anti-RE1 (1:100); 2 y 6, suero de ratón inoculado con
nitrocelulosa; 3 y 7, control negativo (sin anticuerpo secundario); 4 y 8, control negativo (sin
anticuerpo primario); 5, suero anti-RE2 (1:100). Las líneas negras señalan las bandas
correspondientes a los péptidos RE1 y RE2 detectados. Se empleó la escalera de masa
molecular Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen).
Inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 en T. cruzi
Inmunodetección de DGF-1 en epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener)
Una vez demostrada la especificidad de los anticuerpos obtenidos en ratón, estos se
utilizaron en ensayos de inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 en
extractos proteicos totales de T. cruzi en el estadio epimastigote (cepa CL Brener). El
anticuerpo RE1 reconoció una banda de masa molecular cercana a 60 KDa y un
49
grupo de proteínas cuyos tamaños están alrededor de 160 KDa (carril 1, Fig. 19).
Por otra parte, el anticuerpo anti-RE2 también reconoció un conjunto de proteínas de
alto peso molecular, alrededor de 160 KDa (carril 2, Fig 19).
Con el objeto de descartar que los anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 estuviesen
reconociendo en el parásito algún epítope propio de la proteína GST, se utilizó un
anticuerpo comercial anti-GST (Amersham Biosciences) como control (carril 3, Fig
19).
1
2
3
160
120
100
90
80
70
60
50
40
30
25
T. cruzi EPI
Figura 19. Inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 en extracto proteico total de
epimastigotes de T. cruzi por Western Blot, utilizando anticuerpos policlonales producidos en
ratón. Anticuerpos: 1, anti-RE1 (1:100); 2, anti-RE2 (1:100); 3, anti-GST (1:2000).
50
Inmunodetección de DGF-1 en epimastigotes y TCT de T. cruzi (aislado YBM)
Con el fin de establecer si la expresión de los miembros de la familia DGF-1 es
estadio específica y si la utilización de una cepa diferente es determinante en la
expresión de estas proteínas, se realizaron ensayos de inmunodetección utilizando
fracciones subcelulares de los estadios epimastigote y TCT del aislado YBM (Fig.
20). Las fracciones subcelulares analizadas fueron: extracto total (Ext), fracción de
proteínas de membrana (P) y fracción de organelas/citosol (S). Como controles del
ensayo se emplearon los extractos proteicos totales de la cepa E. coli BL21 sin
transformar y la cepa E. coli BL21 transformada con el recombinante pGEX-5X2/RE1 (inducida para la expresión de RE1).
Los anticuerpos anti-RE1 reconocieron principalmente una banda entre 70 y 80 KDa
en el extracto total de epimastigotes y una banda inferior a 220 KDa en la fracción S
del estadio TCT. En la Figura 20 se observan otras bandas de alto peso molecular
(>160 KDa) pero de menor intensidad que las antes mencionadas. Estas bandas
fueron detectadas en las fracciones S y P del estadio epimastigote y en el extracto
total y la fracción P del estadio TCT.
En la fracción S del estadio epimastigote se detectó también una banda menos
intensa, cuyo peso molecular se encuentra entre 60 y 70 KDa. Otras cuatro bandas
de poca intensidad fueron detectadas en el estadio TCT: una banda de 60 y otra de
30 KDa aproximadamente en el extracto total, una banda alrededor de 90 KDa en la
fracción S y una banda de 100 KDa aproximadamente en la fracción P. También se
observa una banda muy tenue entre 80 y 90 KDa en la fracción P del estadio TCT
(Fig. 20).
51
KDa
(37 KDa)
Figura 20. Inmunodetección por Western Blot de posibles miembros de la familia DGF-1 en
fracciones subcelulares de epimastigotes y TCT de T. cruzi (aislado YBM), utilizando
anticuerpos policlonales anti-RE1 producidos en ratón (título 1:100). C-, control negativo,
extracto proteico total de E. coli (BL21). C+, control positivo, extracto proteico total de E. coli
(BL21) expresando el péptido GST-RE1. Ext, extracto proteico total. S, fracción soluble
(organelas/citosol). P, fracción insoluble (proteínas de membrana). Se emplearon anticuerpos
anti-GAPDH humana (título 1:2000) como control del fraccionamiento subcelular.
52
Inmunodetección de DGF-1 en epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos
de T. cruzi (cepa CL Brener) utilizando anticuerpos obtenidos en conejo
El título de los anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 producidos en ratón necesario para
detectar bandas específicas en los extractos proteicos de T. cruzi fue bastante bajo
(1:100), lo que indica que la concentración de estos anticuerpos en los sueros de
ratón era muy baja. Con el objeto de producir una mayor cantidad de anticuerpos
anti-DGF-1 y obtener un control de suero pre-inmune, se produjeron anticuerpos
policlonales anti-RE1 en conejo.
De estos anticuerpos producidos en conejo se probaron diferentes diluciones contra
extractos proteicos totales de epimastigotes de T. cruzi, utilizando como control
positivo del ensayo la proteína recombinante GST-RE1 purificada por elución pasiva
(Fig. 21). En este ensayo se observó por primera vez una banda nítida entre 120 y
160 KDa en los extractos totales del estadio epimastigote y se estableció que el título
adecuado para la inmunodetección en estos extractos se encontraba entre 1 en 5000
y 1 en 10000.
El siguiente ensayo de inmunodetección consistió en estudiar la presencia de
miembros de la familia DGF-1 en extractos totales de epimastigotes y tripomastigotes
metacíclicos, utilizando como control negativo el suero preinmune de conejo y un
extracto proteico total de promastigotes de L. major. Como control positivo del
ensayo se empleó la proteína GST-RE1 purificada por elución pasiva y la proteína
recombinante GST purificada por cromatografía de afinidad con columna de glutatión
sefarosa (Fig. 22). La banda entre 120 y 160 KDa fue detectada nuevamente en
epimastigotes y también en tripomastigotes metacíclicos. La utilización del suero
preinmune permitió confirmar la especificidad de los anticuerpos, ya que esta banda
no se detecta en ninguno de los dos estadios al emplearlo y tampoco fue detectada
en el extracto proteico total de L. major.
53
B
T. cruzi (Epi)
KDa
220
220
160
160
120
100
120
100
80
80
70
60
70
60
50
50
40
40
1:1000
KDa
RE1
1:20000
RE1
1:10000
T. cruzi (Epi)
1:5000
L
1:2000
A
Inmunoblot
1:20000
Proteínas en membrana
Anti-RE1 (conejo)
Figura 21. Inmunodetección por Western Blot de miembros de la familia DGF-1 en extractos
proteicos totales de epimastigotes de T. cruzi, utilizando anticuerpos policlonales anti-RE1
obtenidos en conejo. A, membrana de nitrocelulosa teñida con Rojo Ponceau conteniendo
los extractos proteicos totales de epimastigotes de T. cruzi y la proteína recombinante RE1.
B, inmunodetección contra la membrana del panel A. Los títulos del suero probados se
muestran en la parte inferior del Western. Se empleó la escalera de masa molecular Bench
Mark Protein Ladder (Invitrogen).
54
6
7
B
1
60
50
50
40
40
30
30
25
25
T. cruzi (Meta)
60
T. cruzi (Meta)
120
100
80
70
T. cruzi (Epi)
120
100
80
70
T. cruzi (Epi)
220
160
L. Major (Prom)
220
160
GST
KDa
RE1
KDa
2
3
4
5
Post Post Post Pre Post
6
7
Pre
Post
T. cruzi (Meta)
5
T. cruzi (Epi)
4
T. cruzi (Epi)
3
L. Major (Prom)
2
GST
1
RE1
A
Inmunoblot
T. cruzi (Meta)
Proteínas en membrana
Figura 22. Inmunodetección por Western Blot de miembros de la familia DGF-1 en
epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi, utilizando anticuerpos policlonales
obtenidos en conejo (título 1:7500). A, Membrana de nitrocelulosa teñida con Rojo Ponceau
conteniendo los extractos proteicos totales de T. cruzi y L. major, así como las proteínas
control. B, Inmunodetección sobre las membranas del panel A. Post, suero anti-RE1. Pre,
suero preinmune. Los números de la parte superior del panel A se corresponden con los
números de la parte superior del panel B.
55
Debido a que el tamaño de la proteína DGF-1 putativa es 360 KDa
aproximadamente, se realizó un ensayo adicional de inmunodetección con los
anticuerpos anti-RE1 producidos en conejo, colocando 1 µL de mezcla de inhibidores
de proteasas (Calbiochem) durante el proceso de extracción de proteínas. Todo esto
con la finalidad de evaluar si la banda entre 120 y 160 KDa detectada por los
anticuerpos anti-RE1 corresponden al producto de la degradación de una proteína de
mayor tamaño. Nuevamente se utilizó el suero preinmune de conejo y un extracto
total de proteínas de L. major como control del ensayo.
Aunque se utilizó la misma cantidad de parásitos para ser cargados en cada carril del
gel (5 × 106 parásitos), los extractos proteicos de T. cruzi y L. major obtenidos
añadiendo la mezcla de inhibidores de proteasas resultaron ser mucho más
abundantes (Fig 23A, carriles 2, 3 y 4). La detección de antígenos empleando los
anticuerpos anti-RE1 contra estos extractos fue más inespecífica (Fig. 23, páneles B
y C). En este ensayo, los anticierpos anti-RE1 reconocieron una mayor cantidad de
bandas en los extractos proteicos de T. cruzi, siendo las más intensas una banda de
aproximadamente 220 KDa que hasta el momento no había sido detectada, y una
banda inferior a 50 KDa que pareciera ser inespecífica debido a que también es
detectada en el extracto proteico de L. major, y es reconocida por el suero preinmune
en los tres extractos (Fig. 23, páneles A y B, carriles 2, 3 y 4). La banda cuyo
tamaño se encuentra entre 120 y 160 KDa se observa nuevamente en esta
inmunodetección (Fig. 23B, carriles 2 y 3), pero ahora es menos intensa en
comparación con el resto de las bandas detectadas. También se observó una banda
cercana a 120 KDa que no aparece tan abundante en el extracto proteico (Fig 23,
paneles A y B, carriles 2 y 3). Los anticuerpos anti-RE1 detectaron 4 bandas en el
extracto proteico de L. major (Fig. 23B, carril 4), siendo 2 de ellas inespecíficas por
ser reconocidas también al incubar los extractos con el suero preinmune de conejo.
El estadio TCT no pudo ser analizado en los ensayos de inmunodetección porque la
cantidad de parásitos recuperados mediante infección de cultivo celular no fue
56
suficiente para la obtención de un extracto proteico abundante que pudiese
analizarse por SDS-PAGE y Western Blot.
A
B
SDS-PAGE
L
1
2
3
4
1
2
3
Suero
preinmune
C
Anti RE1
1
4
KDa
KDa
KDa
220
160
120
100
220
160
120
100
220
160
120
100
80
70
60
80
70
60
80
70
60
50
50
50
40
40
40
30
30
30
2
3
4
Figura 23. Inmunodetección por Western Blot de miembros de la familia DGF-1 en extractos
proteicos totales de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi, obtenidos en
presencia de inhibidores de proteasas. A, electroforesis en gel de poliacrilamida al 8%
utilizando las mismas muestras y cantidades de proteína que en B y C. B, inmunodetección
empleando anticuerpos policlonales anti-RE1 producidos en conejo (título 1:5000). C, control
negativo de inmunodetección empleando suero preinmune de conejo (título 1:5000). L,
escalera de masa molecular Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen). 1, GST-RE1. 2,
epimastigotes de T. cruzi. 3, tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi. 4, promastigotes de L.
major.
57
Localización celular de DGF-1 en T. cruzi (cepa CL Brener).
Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes de T. cruzi
Con el fin de estudiar la localización celular de la proteína DGF-1 en epimastigotes
de T. cruzi se realizaron ensayos de inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos
policlonales anti-RE1 y anti-RE2 obtenidos en ratón. Los primeros ensayos fueron
analizados en un microscopio confocal acoplado a láser de Neón (543 nm) y de
Argón (488 nm). Para la detección se emplearon anticuerpos secundarios anti-ratón
conjugados al fluoróforo Texas Red. Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-PFK
de T. cruzi obtenidos en ratón como control positivo del ensayo (Fig. 24, páneles G y
H) y preparaciones a las que no se le colocó anticuerpo primario como control
negativo de la inmunodetección (Fig 24, páneles A y B). Los resultados indican la
presencia intracelular de miembros de la familia DGF-1 concentrados en un
compartimiento subcelular alrededor del núcleo del parásito (Fig. 24, páneles C, D, E
y F). La señal observada en las preparaciones marcadas con el anticuerpo anti-RE1
es muy similar a la observada con el anticuerpo anti-RE2, lo que sugiere que ambos
anticuerpos reconocen los mismos antígenos en el interior de la célula.
La señal detectada por anti-RE1 y anti-RE2 difiere de la señal arrojada por los
anticuerpos anti-PFK, ya que esta última se observa agrupada a manera de gránulos
dispersos en el interior del parásito. En conjunto, estos resultados indican que los
anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 detectan antígenos específicos en el interior del
parásito y estos antígenos pudieran ser miembros de la familia DGF-1.
58
Control Negativo
anti-RE1
anti-RE2
anti-PFK
A
C
E
G
B
D
F
H
Figura 24: Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener)
utilizando anticuerpos policlonales obtenidos en ratón (título 1:50) y anticuerpos anti-ratón
conjugados al fluoróforo Texas Red (título 1:2000). Imágenes obtenidas por microscopía
confocal. Los anticuerpos primarios utilizados se indican en la parte superior de la figura.
Escala: 5 µm. Los resultados se muestran por duplicado.
59
Localización celular de DGF-1 en epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos
de T. cruzi y marcaje de ácidos nucleicos
El siguiente análisis de inmunofluorescencia se llevó a cabo empleando un
microscopio confocal acoplado a láser de Neón (543 nm), Argón (488 nm) y UV (405
nm), lo que permitió la visualizacion del núcleo y el kinetoplasto de los parásitos
mediante el marcaje de ácidos nucleicos con DAPI. En este ensayo se utilizaron
anticuerpos anti-RE1 para la detección de la proteína DGF-1 en epimastigotes y
tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi y anticuerpos secundarios anti-ratón
conjugados al fluoróforo Texas Red. Nuevamente se emplearon anticuerpos anti-PFK
como
control
positivo
de
la
reacción
para
epimastigotes
y
metacíclicos,
encontrándose en estas preparaciones el patrón de localización glicosomal esperado
(Fig. 25, páneles N y O).
Los antígenos detectados por los anticuerpos anti-RE1 en epimastigotes de T. cruzi
se observan de nuevo en el interior de la célula, concentrados en un compartimiento
subcelular alrededor del núcleo (Fig. 25, páneles B y C). Por el contrario, el
inmunomarcaje de tripomastigotes metacíclicos utilizando anticuerpos anti-RE1 no
arrojó ninguna señal (Fig. 25, páneles E y F), siendo los niveles de fluorescencia roja
emitidos comparables con el control negativo realizado en tripomastigotes
metacíclicos (Fig. 25, páneles K y L). Cada ensayo se realizó por triplicado y el
resultado obtenido se reprodujo: los anticuerpos anti-RE1 producidos en ratón no
detectaron fluorescencia alguna en tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.
60
DAPI
Texas Red
A
B
Fusión
C
n
k
Epi
Anti-RE1
D
E
F
n
Meta
Anti-RE1
k
G
H
k
Epi
I
Control
Negativo
n
J
K
L
Control
Negativo
k
Meta
n
N
M
Epi
y
Meta
O
n
k
k
Anti-PFK
n
Figura 25: Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos
de T. cruzi (cepa CL Brener) utilizando anticuerpos policlonales obtenidos en ratón (título
1:50) y anticuerpos anti-ratón conjugados a Texas Red (título 1:2000). Imágenes obtenidas
por microscopía confocal. Los anticuerpos primarios utilizados se indican a la derecha. Los
estadios analizados se indican en la parte izquierda. En la parte superior de la figura se
indica el marcador utilizado. El núcleo y kinetoplástido (n, k) de los parásitos fue teñido con
DAPI. Escala: 5 µm.
61
Efecto de la permeabilización celular sobre la inmunodetección de DGF-1 en
epimastigotes de T. cruzi.
Con la finalidad de confirmar la localización intracelular de los antígenos reconocidos
por
los
anticuerpos
anti-RE1,
se
realizaron
ensayos
de
inmunodetección
comparativos utilizando epimastigotes de T. cruzi permeabilizados previo al
inmunomarcaje con anticuerpos anti-RE1 obtenidos en conejo y epimastigotes sin
permeabilizar.
En este ensayo se utilizaron anticuerpos secundarios anti-conejo
conjugados al fluoróforo Alexa Fluor 488.
La ausencia de fluorescencia verde en los epimastigotes no permeabilizados
confirma la ausencia de los antígenos reconocidos por los anticuerpos anti-RE1 en la
membrana plasmática del parásito (Fig. 26, páneles B y C). La localización de los
antígenos reconocidos por estos anticuerpos en un compartimiento subcelular
alrededor del núcleo fue confirmada (Fig. 26, páneles E y F). De nuevo los
anticuerpos anti-PFK emitieron fluorescencia en las preparaciones permeabilizadas
(Fig. 26, páneles K y L) mientras que no se observó señal para estos anticuerpos en
los parásitos que no fueron permeabilizados (Fig. 26, páneles H e I).
En general, la emisión observada utilizando anticuerpos primarios producidos en
conejo y anticuerpos secundarios conjugados a Alexa Fluor 488 fue de menor
intensidad que la fluorescencia obtenida empleando anticuerpos primarios obtenidos
en ratón y anticuerpos secundarios conjugados a Texas Red.
62
DAPI
A
Alexa 488
B
Fusión
C
k
NP
Anti-RE1
n
E
D
P
F
Anti-RE1
k
n
G
H
I
k
Anti-PFK
n
NP
K
J
n
P
L
Anti-PFK
k
Figura 26. Análisis de inmunofluorescencia de epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener)
utilizando anticuerpos policlonales obtenidos en conejo (título 1:5000) y anticuerpos anticonejo conjugados al fluoróforo Alexa Fluor 488 (título 1:1000). Imágenes obtenidas por
microscopía confocal. Los anticuerpos primarios utilizados se indican a la derecha. Las
condiciones de permeabilización de los parásitos se indican en la parte izquierda: NP, no
permeabilizados; P, permeabilizados. En la parte superior de la figura se indica el marcador
utilizado. El núcleo y kinetoplástido (n, k) de los parásitos fue teñido con DAPI. Escala: 5 µm.
63
DISCUSIÓN
Expresión y solubilización de las proteínas RE1 y RE2
Inicialmente los fragmentos RE1 y RE2 fueron clonados exitosamente en tres
vectores de expresión diferentes (pET28a, pRSETb y pET43.1a), en los cuales la
transcripción es controlada por el promotor T7. Sin embargo, no fue posible
evidenciar la expresión de las proteínas recombinantes empleando estos sistemas.
La expresión de los segmentos RE1 y RE2 se logró finalmente gracias a la utilización
del plásmido pGEX-5X-2, donde la diferencia más importante con respecto a los
otros tres vectores es la presencia del promotor tac (Tabla II). En vista de que todos
los plásmidos podían funcionar teóricamente con la misma cepa de E. coli receptora
(BL21 (DE3)/pLysS), es posible atribuir el éxito de la expresión en el vector pGEX5X-2 (bajo las condiciones probadas en el laboratorio) a la presencia del promotor
tac, que junto al gen del represor de la lactosa constituyen un sistema de expresión
inducible con IPTG bastante eficiente.
Las proteínas recombinantes GST-RE1 y GST-RE2 presentaron una solubilidad muy
baja, lo que dificultó los protocolos posteriores de purificación necesaria para la
inmunización de animales. La poca solubilidad que presentaron las proteínas
recombinantes puede ser adjudicada a dos causas principalmente: el punto
isoeléctrico (pI) y la naturaleza exógena de las regiones de DGF-1 expresadas en E.
coli.
El punto isoeléctrico de una proteína corresponde al valor de pH al cual la misma
tiene carga neta cero. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula
64
(Nelson y Cox, 2005). El punto isoeléctrico predicho para las proteínas GST-RE1 y
GST-RE2 es 4,94 y 7,52 respetivamente (Tabla IV). Los diferentes métodos de lisis
empleados implicaban el uso de soluciones a pH neutro. Esto explica que la proteína
GST-RE2 fuese más insoluble que GST-RE1, ya que el pI de la primera era cercano
a 7. Sin embargo, a pesar de presentar un pI ácido, la proteína GST-RE1 también
permanecía en la fracción insoluble del extracto proteico (Fig. 14, carril 4), lo que hizo
pensar que podía haber otro factor intrínseco a la naturaleza de ambas proteínas que
estuviese afectando la solubilidad de las mismas.
Durante su síntesis, las proteínas se pliegan para adoptar la estructura nativa en un
proceso durante el cual se forman intermediarios de plegamiento de estructura
inestable. Este proceso está parcialmente dirigido por chaperonas celulares que se
encargan de ayudar a las proteínas a adoptar su forma nativa (Nelson y Cox, 2005).
Cuando la síntesis proteica se lleva a cabo a velocidades elevadas, en condiciones
limitadas de chaperonas, los intermediarios de plegamiento se pueden agregar
mediante la unión intermolecular de sus dominios hidrofóbicos anormalmente
expuestos al medio intracelular. Esto causa la formación de depósitos proteicos en el
interior celular, constituidos por proteína insoluble e inactiva que se agregan de
manera poco ordenada, formando precipitados más o menos amorfos denominados
cuerpos de inclusión. En bacterias recombinantes que producen proteínas
heterólogas bajo el control de promotores fuertes es frecuente la formación de estas
estructuras (Villaverde y Carrió, 2003).
Tomando en cuenta estas afirmaciones, se siguieron algunos métodos propuestos
por distintos autores (Sambrook y Russell, 2001; Villaverde y Carrió, 2003) para
evitar la formación de los cuerpos de inclusión y para la solubilización de las
proteínas recombinantes. Sólo el más agresivo de ellos, la utilización de una solución
a pH extremo (NaOH 0,2 N), permitió la solubilización de ambas proteínas. Sin
embargo, este método puede ocasionar modificaciones irreversibles a las mismas,
por lo cual es posible que los anticuerpos obtenidos contra estos polipéptidos
65
reconozcan epítopes secuenciales, mas no epítopes conformacionales de ambas
proteínas.
Especificidad de las regiones RE1 y RE2 respecto a la proteína putativa DGF-1
(BAC D6C)
Para interpretar los resultados obtenidos en las inmunodetecciones realizadas con
los anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 es necesario tomar en cuenta cuán conservadas
son las secuencias de las proteínas RE1 y RE2 en el universo de las secuencias
reportadas para DGF-1 en T. cruzi. Para el momento en que se seleccionaron las
regiones RE1 y RE2 aún no se conocían los resultados del Proyecto Genoma de T.
cruzi. Por esta razón, sólo se compararon con la secuencia reportada por Wincker y
col. (1992), encontrándose que estas dos regiones eran específicas para la copia
presente en el recombinante BAC D6C. De allí el nombre asignado a las mismas:
Región Específica 1 (RE1) y Región Específica 2 (RE2). Sin embargo, después de
haber sido depositadas las secuencias del Proyecto Genoma de T. cruzi en el
GenBank™, al comparar RE1 y RE2 con las secuencias de proteínas de T. cruzi, se
confirmó que la región RE1 es específica de la proteína putativa DGF-1 (BAC D6C),
mientras que RE2 resultó ser más conservada entre todas las proteínas deducidas
de la familia DGF-1.
A pesar del alto grado de identidad que presentan los miembros de la familia de
genes DGF-1 entre sí (superior al 85%), y sus respectivas proteínas putativas
(superior al 80% entre ellas), al realizar el análisis de identidad del segmento RE1
contra la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes utilizando el
algoritmo blastp de la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, NCBI
Home Page, 2008), se observa que dicha región presenta un porcentaje máximo de
identidad de 81% para una de las proteínas putativas DGF-1 de T. cruzi (número de
acceso en GenBank™ EAN98600). Esta proteína corresponde a un miembro de la
familia de genes DGF-1 que no está presente en la región subtelomérica del genoma
66
(número de acceso en GenBank: AAHK01000049). Para el resto de las proteínas
DGF-1 putativas el porcentaje de identidad es inferior a 75%.
Por el contrario, la secuencia de la proteína RE2 es más conservada dentro de la
familia de proteínas DGF-1, ya que al analizar el porcentaje de identidad de esta
secuencia con los demás miembros de la familia DGF-1 mediante el algoritmo blastp,
se observa un porcentaje de identidad superior al 90% con al menos 100 de estas
proteínas putativas. Sin embargo, el porcentaje de identidad es del 100% únicamente
con la proteína putativa DGF-1 (BAC D6C), de donde se obtuvo inicialmente su
secuencia.
Por ser RE2 una región más conservada que RE1 en la familia DGF-1, los
anticuerpos anti-RE2 pudieran reconocer a más de un miembro de esta familia en
los extractos proteicos del parásito y en los ensayos de inmunofluorescencia. Sin
embargo, la solubilización de esta proteína recombinante fue parcial (Fig. 14) y esto
redujo notablemente la eficiencia de su purificación. Es por esta razón que sólo se
obtuvieron anticuerpos policlonales en conejo contra la proteína RE1, y se espera
que dichos anticuerpos reconozcan únicamente a la proteína codificada por el gen
DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C (número de acceso en GenBank™
AY551440).
Inmunodetección de posibles miembros de la familia de proteínas DGF-1 en T.
cruzi
Los ensayos de inmunodetección de antígenos en extractos proteícos totales de
epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener) utilizando anticuerpos policlonales antiRE1 y anti-RE2 obtenidos en ratón, permitieron el reconocimiento de proteínas de
alto peso molecular (alrededor de 160 KDa) con un patrón de detección similar para
ambos anticuerpos, excepto por una banda inferior a 60 KDa que sólo es reconocida
por el anticuerpo anti-RE1 (Fig 19). En vista de que el segmento RE1 es bastante
67
específico para la proteína putativa DGF-1 (BAC D6C), la presencia de varias bandas
en este ensayo pudiera adjudicarse a varias causas: a) una degradación proteolítica
parcial de la proteína DGF-1 nativa (cuya masa molecular predicha es de 360 KDa
aproximadamente); b) la modificación post-traduccional de esta proteína; y/o c) el
reconocimiento inespecífico de alguna de las bandas. La similitud del patrón de
bandas de alto peso molecular reconocidas por anti-RE1 y anti-RE2, sugiere que
ambos anticuerpos están reconociendo los mismos antígenos, y que la banda
cercana a 60 KDa reconocida por anti-RE1 es inespecífica. La imposibilidad de
obtener un suero preinmune en ratones (debido a que no sobreviven al
procedimiento de sangrado), impidió resolver esta interrogante con exactitud.
Esta misma dificultad se presentó al utilizar los anticuerpos anti-RE1 producidos en
ratón contra las fracciones subcelulares de los estadios epimastigote y TCT (Fig. 20).
En esta ocasión el reconocimiento de bandas de alto peso molecular se hizo
evidente en las fracciones S y P de ambos estadios, siendo la detección más intensa
de este ensayo una banda de aproximadamente 220 KDa en la fracción P del estadio
TCT. Nuevamente se aprecia una detección inespecífica en el extracto total de
epimastigotes (una banda intensa entre 70 y 80 KDa) y otras bandas de menor
intensidad que se observan entre 30 y 100 KDa principalmente en el estadio TCT.
La obtención de anticuerpos anti-RE1 en conejo permitió la incorporación del suero
preinmune como control de los ensayos de inmunodetección en extractos totales de
epimastigotes. Adicionalmente, con estos anticuerpos se examinaron extractos
proteicos totales de tripomastigotes metacíclicos obtenidos en cultivo (Cultured
Tissue-derived Trypomastigotes, CMT) de la cepa CL Brener. Los resultados de
estos inmunoblots arrojaron detecciones más precisas. Lo primero que llama la
atención es el reconocimiento de una banda nítida entre 120 y 160 KDa (Fig. 21 y 22)
que aparece en ambos estadios del parásito. La ausencia de bandas detectadas por
encima de 160 KDa hizo pensar que durante el tiempo transcurrido entre la lisis de
los parásitos y el proceso de cargar las muestras en el gel había ocurrido la
degradación rápida del extracto proteico. Al añadir una mezcla de inhibidores de
68
proteasas a los parásitos antes del proceso de lisis, se obtuvieron extractos proteicos
más abundantes (Fig 23A) y esto permitió la detección de varias bandas de alto peso
molecular
en
epimastigotes
y
CMT,
cercanas
a
220,
160
y
120
KDa
aproximadamente (Fig 23B, carriles 2 y 3). La banda más intensa es la de
aproximadamente 220 KDa, mientras que las otras dos presentan una intensidad
menor y similar para ambas. Una posible explicación a este resultado es la
fragmentación parcial de la proteína alrededor de 220 KDa en dos proteínas de
menor peso molecular. A pesar de que estos extractos fueron analizados en geles de
poliacrilamida al 8%, el nivel de resolución en esta parte del gel no permite visualizar
con exactitud el tamaño de estos tres fragmentos.
Por otra parte, la inespecificidad de los anticuerpos observada al añadir los
inhibidores de proteasas a los extractos proteicos de los parásitos, también interfiere
con la interpretación de los resultados, aunque en principio, las bandas inferiores a
100 KDa pudieran atribuirse a un efecto de sobrecarga de las proteínas presentes en
estos extractos, así como a la calidad y título elevado de los anticuerpos que es
necesario diluir para evitar la detección de bandas inespecíficas.
Igualmente, las bandas detectadas en el extracto proteico total de L. major (Fig. 23B,
carril 4) corresponden a las bandas más prominentes de dicho extracto (Fig. 23A,
carril 4). Las secuencias de las proteínas RE1 y RE2 fueron comparadas
previamente con la base de datos de proteínas no redundantes de L. major mediante
el algoritmo blastp, y no se observó identidad alguna con las proteínas de este
parásito, razón por la cual se empleó el extracto proteico de este organismo como
control negativo de la inmunodetección. Es posible entonces que las bandas
detectadas en el extracto de L. major correspondan también a señales inespecíficas
reconocidas por un efecto de sobrecarga en el gel (Fig. 23B, carril 4). Sin embargo,
al disminuir la cantidad de parásitos colocada en cada carril (cargando 1×106
parásitos en lugar de 5 ×106 parásitos por carril), las bandas de alto peso molecular
dejaron
de
ser
detectadas
(datos
no
mostrados).
Estas
observaciones
experimentales sugieren que el nivel de expresión de esta copia de DGF-1 en T.
69
cruzi es bastante bajo, y es necesario obtener una fracción enriquecida con proteínas
de alto peso molecular para lograr una detección específica de la misma.
La porción hidrofóbica de la proteína DGF-1 (BAC D6C) putativa comprende una
hélice transmembranal en el extremo N-terminal de la proteína y 9 hélices
transmembranales localizadas en el extremo C-terminal de la proteína (Anexo 1). En
total esta porción hidrofóbica está constituida por 413 aa, estando conformada
entonces la porción hidrofílica de la proteína por los restantes 3061 aa. Tomando en
cuenta esto, pudiera pensarse que si ocurriera una fragmentación de la proteína
nativa durante el proceso de lisis celular o del fraccionamiento subcelular del extracto
proteico, se generaría entonces un fragmento de 307 KDa aproximadamente,
correspondiente a los 3061 KDa de la porción hidrofílica de la proteína. Sin embargo,
esto no es lo que se observa en los ensayos de inmunodetección realizados contra
los extractos proteicos de T. cruzi. La proteína de mayor tamaño detectada por los
anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 fue de 220 KDa aproximadamente, lo que sugiere
que la proteína está sufriendo más de una fragmentación durante el proceso de
extracción.
Es importante tener en cuenta que el tamaño esperado de la DGF-1 (BAC D6C)
putativa (360 KDa aproximadamente) ha sido deducido a partir del marco abierto de
lectura de 10425 pb encontrado por Chiurillo y col. (2002) en la región subtelomérica
de uno de los cromosomas de T. cruzi. Sin embargo, el primer aminoácido de la
proteína nativa madura no necesariamente corresponde a la primera metionina de
esta secuencia, bien sea porque ocurren modificaciones post-traduccionales de la
proteína, o porque el codón de iniciación de la traducción corresponde a una
secuencia ATG localizada aguas abajo sobre el mismo marco abierto de lectura,
dando origen a una proteína de menor tamaño que el esperado.
70
Otras evidencias de la expresión de DGF-1 en T. cruzi
La expresión de algunos miembros de la familia de proteínas DGF-1 ha sido
evidenciada en otros estudios. La base de datos dbEST (Expressed Sequence Tags)
es una división del GenBank™ que contiene información cobre secuencias de ADNc
de una gran cantidad de organismos (Boguski y col., 1993). Mediante la búsqueda de
los genes DGF-1 en esta base de datos se encontraron siete secuencias de ESTs en
epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener), correspondientes a miembros de esta
familia, lo que indica que al menos algunas copias de estos genes se están
transcribiendo hasta la formación del ARNm maduro. Los ESTs correspondientes a
DGF-1 están identificados con los siguientes números de acceso en GenBank™:
AI668747, AI664815, AI069841, AI046042, AI043470, AI043303, AA556036; estando
en negritas aquellos que presentan un alto porcentaje de identidad con segmentos
del gen DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C. Al alinear estos ESTs con la
secuencia DGF-1 (BAC D6C), se encuentra que los mismos corresponden a los
siguientes segmentos del gen:
AI668747: nucleótidos 9693 a 10156 del gen (95,25% de identidad).
AI069841: nucleótidos 9686 a 10001 del gen (93,67% de identidad).
AI043303: nucleótidos 1216 a 1449 del gen (93,25% de identidad).
Estas observaciones evidencian la expresión de miembros de la familia DGF-1 que
en el estadio epimastigote de T. cruzi, pudiendo presentar el transcrito maduro al
menos 8945 nucleótidos que equivalen a una proteína putativa de 2981 aa y una
masa molecular de 306 KDa aproximadamente.
Los estudios del proteoma y del glicoproteoma de T. cruzi han reportado péptidos
correspondientes a miembros de la familia DGF-1 (Atwood y col., 2005, 2006),
71
presentando este último trabajo la primera evidencia experimental de una
modificación post-traduccional de la proteína DGF-1: la N-glicosilación de un péptido
hallado en la fracción enriquecida con proteínas de organelas y proteínas citosólicas
del estadio TCT (Atwood y col., 2006). Este péptido se localiza 123 aa aguas debajo
del segmento RE2 en la proteína putativa DGF-1 (BAC D6C) y presenta dos
aminoácidos diferentes a esta secuencia (Fig. 4).
Otro péptido correspondiente a DGF-1 fue detectado en la fracción de proteínas
hidrofóbicas del estadio tripomastigote metacíclico (José Franco Da Silveira,
comunicación
personal,
2008).
La
secuencia
de
este
péptido
es
LSSVFYMDNCVVKSR y se localiza en el aminoácido 622 de la proteína putativa
DGF-1 (BAC D6C), presentando una diferencia de 3 aminoácidos con esta
secuencia.
La evidencia más contundente hasta el momento encontrada es la presencia de
varios péptidos correspondientes a DGF-1 en la fracción subcelular de epimastigotes
enriquecida en ácidocalcisomas del parásito, cinco de los cuales corresponden a la
proteína DGF-1 putativa deducida a partir del gen presente en el recombinante BAC
D6C (Roberto Docampo, comunicación personal, 2007). Esta evidencia es
consistente con la localización del glicopéptido de DGF-1 encontrado por Atwood y
col. (2006) en la fracción de organelas/citosol de T. cruzi. Todas estas evidencias
experimentales apuntan hacia el hecho de que algunos miembros de la familia DGF1 se expresan en diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi.
Inmunodetección diferencial de miembros de la familia DGF-1 en dos cepas de
T. cruzi.
En general, la inmunodetección de miembros de la familia DGF-1 utilizando
anticuerpos anti-RE1 obtenidos en ratón contra las fracciones subcelulares del
aislado YBM resultó en el reconocimiento de una mayor cantidad de antígenos en
72
comparación con los niveles de detección observados en epimastigotes de la cepa
CL Brener (Fig 19 y 20).
Estos resultados indican una expresión diferencial entre las cepas CL Brener y YBM
analizadas, ya que el patrón de bandas detectadas en el extracto proteico total de
epimastigotes de CL Brener fue mucho más específico que el patrón observado en
las distintas fracciones subcelulares de epimastigotes del aislado YBM.
Es importante destacar que las cepas CL Brener y YBM pertenecen a dos linajes
diferentes, evolutivamente hablando, de T. cruzi. Según Westenberger y col. (2005)
la cepa CL Brener es una cepa híbrida clasificada bioquímica y molecularmente
como DTU IIe (Discret Typing Units; Tibayrenc, 2003) cuyos linajes ancestrales
corresponden a DTU IIb y DTU IIc (Zimodemos II y III respectivamente según la
clasificación de Miles y col., 1978). Por otra parte, el aislado YBM ha sido clasificado
mediante perfil de isoenzimas como miembro del Zimodemo I, siendo una cepa
bastante virulenta (Riviera y col., 2000). Las diferencias genéticas que existen entre
estas dos cepas utilizadas en los ensayos de inmunodetección, son consistentes con
la disminución de la especificidad de los anticuerpos policlonales anti-RE1 al utilizar
las fracciones subcelulares del aislado YBM, ya que la secuencia de RE1 fue
deducida a partir de la secuencia del recombinante BAC D6C, proveniente de la
cepa CL Brener.
Patrón de expresión de DGF-1 en T. cruzi (cepa CL Brener)
Los resultados obtenidos mediante los ensayos de inmunodetección en extractos
proteicos de T. cruzi y análisis de inmunofluorescencia, indican que el antígeno
reconocido por los anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 corresponde a una o varias
proteínas de alto peso molecular que se expresan en el estadio epimastigote de la
cepa CL Brener (Fig 19, 21, 22, 23, 24, 25 y 26). La expresión de este mismo
antígeno en el estadio tripomastigote metacíclico fue observada inicialmente
mediante ensayos de inmunoblot empleando anticuerpos anti-RE1 obtenidos en
73
conejo (Fig. 22B, carril 7 y Fig 23B, carril 3). Sin embargo, el inmunomarcaje de
tripomastigotes metacíclicos con los anticuerpos anti-RE1 obtenidos en ratón no
detectó ningún antígeno. La inconsistencia entre estos resultados podría tener varias
explicaciones. La primera de ellas es la heterogeneidad de los cultivos en medio
Grace para la diferenciación de epimastigotes en tripomastigotes metacíclicos,
donde la eficiencia máxima de diferenciación fue de aproximadamente 50%. Tal y
como fue verificado mediante observaciones al microscopio (datos no mostrados),
los cultivos utilizados para la extracción de proteínas del estadio metacíclico eran en
realidad cultivos mixtos de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos, que fueron
útiles a la hora de realizar los ensayos de infección celular e inmunofluorescencia,
mas no arrojaron ninguna diferencia con respecto al cultivo de epimastigotes de T.
cruzi en los ensayos de inmunoblot (Fig. 22 y 23). Por lo tanto es posible que la
proteína DGF-1 (BAC D6C) se esté expresando en el estadio epimastigote y no en el
estadio tripomastigote metacíclico (Fig. 25, páneles E y F).
También debe tenerse en cuenta que la calidad de los anticuerpos producidos en
ratón fue diferente a la de los anticuerpos producidos en conejo. Los primeros
resultaron ser más específicos pero menos abundantes, por ello constituyeron una
buena herramienta para el análisis por inmunofluorescencia. Por el contrario, el suero
anti-RE1 obtenido en conejo, presentó una concentración de inmunoglobulinas
bastante elevada, razón por la cual pudieron diseñarse más experimentos de
inmunoblot e incorporar como control negativo la utilización del suero preinmune. No
obstante, estos anticuerpos detectaron un mayor número de bandas inespecíficas,
por lo cual no fueron adecuados para el inmunomarcaje de los parásitos. Para
solucionar esta dificultad se ha sugerido la purificación de las inmunoglobulinas
presentes en los sueros obtenidos en conejo mediante cromatografía de afinidad, así
como la inmunoadsorción de los anticuerpos específicos empleando el antígeno RE1
contra el cual fueron obtenidos (José Franco Da Silveira, comunicación personal,
2008; Roberto Docampo, comunicación personal, 2008).
74
La expresión de DGF-1 en T. cruzi ha sido evidenciada en la fracción hidrofóbica de
tripomastigotes metacíclicos (José Franco Da Silveira, comunicación personal, 2008).
Sin embargo, tal y como se mencionó anteriormente, la secuencia péptido de DGF-1
hallado en ese trabajo (LSSVFYMDNCVVKSR) presenta tres aminoácidos diferentes
con respecto a la secuencia de esa región en la proteína putativa DGF-1 (BAC D6C):
LSSVFYMDNCAVVSQ, lo que indica que el péptido encontrado en ese estudio
corresponde a una proteína DGF-1 diferente a la que es codificada por el gen a partir
del cual se seleccionó el segmento poco conservado RE1, y esto pudiera explicar el
hecho de que dichos anticuerpos no la reconozcan.
Patrón de expresión de DGF-1 en T. cruzi (aislado YBM)
A pesar de la inespecificidad del reconocimiento de antígenos en la cepa YBM
utilizando anticuerpos anti-RE1 obtenidos en ratón, el patrón de bandas observado
en el estadio epimastigote del aislado YBM es diferente al observado en el estadio
TCT (Fig. 20).
En este ensayo se utilizó como control un anticuerpo comercial contra la enzima
Gliceraldehido
3-fosfato
deshidrogenasa
humana
(GADPH)
(Santa
Cruz
Biotechnologies), una enzima de la ruta glicolítica que se expresa constitutivamente y
que es bastante conservada en la escala evolutiva. El tamaño esperado de la
proteína putativa GAPDH de T. cruzi es 36482 Da y los anticuerpos anti-GAPDH
humana reconocen una banda específica de aproximadamente 37 KDa en los
extractos proteicos del parásito. Sin embargo, por ser una proteína que se espera
aparezca en la fracción soluble del extracto proteico, no puede usarse como control
de carga en las inmunodetecciones donde se emplean diferentes fracciones
subcelulares para la obtención de extractos proteicos. En ese sentido, este
anticuerpo fue empleado como control de la eficiencia del fraccionamiento subcelular
(Fig. 20). Otros autores han utilizado anticuerpos anti-GAPDH de T. brucei como un
marcador glicosomal en inmunoblots contra fracciones subcelulares de T. cruzi,
75
observándose una reactividad fuerte contra una proteína de 37 KDa que se
encuentra en mayor proporción en la fracción glicosomal (Ferella y col., 2006).
Asumiendo que las bandas cuya masa molecular está comprendida entre 30 y 100
KDa corresponden a detecciones inespecíficas del anticuerpo anti-RE1, se puede
observar una diferencia importante en la detección de bandas de alto peso molecular
presente en epimastigotes y TCT. Esta diferencia radica en la detección de una
banda prominente de aproximadamente 220 KDa en la fracción soluble del estadio
TCT, que aparece con menor intensidad en el estadio epimastigote. Este resultado
representa el único análisis realizado en el estadio TCT durante el desarrollo de esta
investigación, ya que no se pudo recuperar una cantidad adecuada de parásitos en
este estadio que fuese suficiente para obtener un extracto proteico abundante, ni
siquiera cuando se realizó el cultivo de las células LLC MK2 a gran escala
(empleando viales de 100 mL) para la infección con tripomastigotes metacíclicos de
T. cruzi.
La expresión de DGF-1 en el estadio TCT ha sido evidenciada en el glicoproteoma
de T. cruzi (Atwood y col., 2006), por lo tanto, esta inmunodetección representa una
evidencia adicional de la expresión de esta proteína en un estadio infectivo del
parásito.
Localización celular de un posible miembro de la familia DGF-1 en
epimastigotes de T. cruzi (cepa CL Brener)
El inmunomarcaje de epimastigotes empleando anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2
obtenidos en ratón arrojó un resultado importante con respecto a la localización
celular de un posible miembro de la familia DGF-1. Los resultados de la Figura 24
(C, D, E y F) indican que los antígenos reconocidos por estos anticuerpos presentan
un patrón de localización celular similar, estando concentrados intracelularmente en
un compartimiento subcelular alrededor del núcleo. En estas imágenes puede
observarse que la proteína DGF-1 no se localiza en la membrana plasmática del
76
parásito, lo que contradice las predicciones de varios autores a partir del análisis in
silico de la proteína putativa (Wincker y col., 1992; Kim y col., 2005; Atwood y col.,
2006). Tal y como se observó en los ensayos de inmunoblot realizados con los
anticuerpos obtenidos en ratón (Fig. 19) estas inmunofluorescencias apoyan la idea
de que ambos anticuerpos (anti-RE1 y anti-RE2) estén reconociendo los mismos
antígenos en el estadio epimastigote de la cepa CL Brener.
Los glicosomas son peroxisomas especializados que al igual que estas organelas,
contienen enzimas de las rutas metabólicas de síntesis de éteres lípidos, β-oxidación
de ácidos grasos y metabolismo de peróxido, pero adicionalmente contienen las
enzimas de la ruta glicolítica (Ferella y col., 2006). La proteína fosfofructoquinasa
(PFK) es una enzima que participa en la cascada de reacciones de la glicólisis, por lo
tanto se infiere que se localiza intracelularmente en los glicosomas (Nelson y Cox,
2005; Ferella y col., 2006). Por esta razón se utilizaron anticuerpos policlonales anti
PFK de T. cruzi (cepa CL Brener) obtenidos en ratón, como control positivo de los
ensayos de inmunofluorescencia, encontrándose con este anticuerpo el patrón de
localización glicosomal esperado para la proteína PFK (Fig. 24, páneles G y H). En T.
cruzi este patrón consiste en la formación de gránulos fluorescentes dispersos en el
citoplasma del parásito (Ferella y col., 2006).
La utilización del marcador de ácidos nucleicos DAPI permitió el marcaje del núcleo y
el kinetoplasto de los parásitos, con lo cual fue posible analizar comparativamente los
estadios epimastigote y tripomastigote metacíclico, ya que la localización del núcleo
con respeto al kinetoplasto del parásito es la principal diferencia morfológica entre
ambos estadios (Fig 25, páneles A y D).
Este ensayo de inmunofluorescencia
confirmó el patrón de localización celular observado en el estadio epimastigote. Pero
el hallazgo más importante de este experimento fue que el antígeno reconocido por
estos anticuerpos en epimastigotes, no se expresa en el estadio metacíclico del
parásito, o al menos no en estas formas obtenidas mediante metaciclogénesis en
cultivo (Fig 25, páneles E y F). En efecto, el nivel de detección observado para el
estadio metacíclico, es similar al obtenido en el control negativo del ensayo, donde
77
no se colocó el anticuerpo primario durante el inmunomarcaje (Fig. 25, páneles K y
L).
Finalmente, al agotarse los anticuerpos producidos en ratón, se realizó un ensayo
adicional de inmunodetección en el estadio epimastigote empleando anticuerpos
policlonales anti-RE1 obtenidos en conejo. Aunque en general el marcaje con estos
anticuerpos fue más difuso, este ensayo permitió confirmar la localización intracelular
de la proteína DGF-1, ya que no se observó fluorescencia en los parásitos que no se
permeabilizaron durante el proceso de inmunomarcaje. Sólo las proteínas localizadas
en la superficie de la membrana plasmática pueden ser visualizadas mediante
análisis de inmunofluorescencia en células no permeabilizadas. Si los parásitos no
son permeabilizados, los anticuerpos no tienen acceso a los antígenos intracelulares.
Este efecto se observa en los parásitos no permeabilizados marcados con los
anticuerpos anti-RE1 y anti PFK (Figura 26, paneles B y H).
Con respecto a la localización intracelular de la proteína DGF-1 y su ausencia de
expresión en tripomastigotes metacíclicos, es importante mencionar que además de
las evidencias experimentales presentadas en este trabajo, la inoculación de ratones
con la proteína recombinante RE1 no generó protección en los mismos contra la
infección con tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi, desarrollando estos ratones
niveles de parasitemia similares a los del control negativo (datos no mostrados).
Estos experimentos fueron realizados en colaboración con el Centro de
Investigaciones Parasitológicas “J.F. Torrealba” de la Universidad de los Andes
(ULA) y constituyen una evidencia adicional de que la proteína DGF-1 no se expresa
en este estadio infectivo del parásito y no se localiza en la membrana plasmática de
T. cruzi, o al menos no expone ninguno de los epítopes presentes en la región RE1
en los estadios que se desarrollan en el hospedador vertebrado.
Todas estas observaciones experimentales sugieren que el gen DGF-1 (BAC D6C)
localizado en la región subtelomérica del genoma de T. cruzi, codifica para una
proteína intracelular que se expresa en el estadio epimastigote y no en el estadio
78
tripomastigote metacíclico. Por lo tanto, es posible que la función de esta proteína no
esté asociada al mecanismo de infección celular de T. cruzi.
Posible función de la proteína DGF-1 en el estadio epimastigote de T. cruzi.
El ambiente del gen DGF-1 en la región subtelomérica
Para sugerir una posible función de la proteína DGF-1 (BAC D6C) en T. cruzi es
necesario tener en cuenta varias observaciones experimentales. La primera de ellas
es el ambiente génico donde reposa la secuencia DGF-1 que codifica a esta
proteína, en la región subtelomérica de un telómero tipo II de T. cruzi (Kim y col.,
2005). Las secuencias presentes en esta región subtelomérica, además del gen
DGF-1, son básicamente pseudogenes de la familia rhs y gp85, así como varias
secuencias (SAS) asociadas a elementos SIRE (short interspersed repetitive
element): SZ23, SZ10 y SZ31 (Fig. 2, Kim y col., 2005). Estos autores proponen que
la presencia del marco abierto de lectura de DGF-1 flanqueado por secuencias no
codificantes pudiera adjudicarse a que esta secuencia ha estado sometida a una
fuerte presión selectiva en el parásito.
Adicionalmente debe tenerse en cuenta que el gen DGF-1 clonado en el
recombinante BAC D6C pertenece a una familia de genes para la cual se han
reportado 565 copias en el genoma de T. cruzi, estando presente algunas copias
teloméricas en al menos 15 de las 20 bandas cromosomales separadas por
electroforesis de campo pulsado de T. cruzi (El-Sayed y col., 2005; Kim y col.,
2005). Como se mencionó en el marco teórico, las secuencias teloméricas de DGF-1
pudieran ser las copias ancestrales que dieron origen al resto de los miembros de
esta familia de genes, mediante mecanismos de recombinación y transposición, pero
también pudieran tener funciones regulatorias, tal y como ha sido descrito para el
gen Makorin1 en ratón que es regulado por su pseudogen Makorin1-p1 (Hirotsune y
col., 2003). Las pocas evidencias experimentales que existen sobre la expresión de
79
miembros de la familia DGF-1 en T. cruzi, incluyendo los resultados de este trabajo,
convergen en la observación de bajos niveles de expresión para esta proteína
(Atwood y col., 2005; 2006), lo cual sugiere que dicha expresión está controlada por
estrictos mecanismos de regulación.
Finalmente, es importante destacar que el reconocimiento específico de la proteína
DGF-1 (BAC D6C) por parte de los anticuerpos anti-RE1 representa la primera
evidencia experimental de la expresión de un gen localizado en la región
subtelomérica de T. cruzi.
Por lo tanto, es importante la confirmación de este
resultado mediante la purificación e identificación del antígeno que es reconocido por
estos anticuerpos en los extractos proteicos del parásito.
DGF-1 en acidocalcisomas
La evidencia experimental de cinco péptidos correspondientes a la proteína putativa
DGF-1 (BAC D6C) encontrados en el proteoma de los acidocalcisomas de T. cruzi
(Roberto Docampo, comunicación personal, 2007) promovió realizar una revisión
sobre la función de estas organelas en T. cruzi y las características de las principales
proteínas descritas en estos compartimientos subcelulares.
Los acidocalcisomas son organelas acídicas muy densas, que presentan una alta
concentración de calcio y de fósforo en forma de pirofosfato y polifosfato acoplados a
varios iones, los cuales han sido descritos en bacterias y varios eucariotas
unicelulares tales como Chlamydomonas reinhardtii, Dictyostelium discoideum, L.
major, Leishmania donovani, T. brucei y más detalladamente en T. cruzi (Scott y
Docampo, 2000; Rohloff y col., 2004; Fang y col., 2007a; Rohloff y Docampo, 2008).
En organismos vertebrados el único reporte de acidocalcisomas corresponde a unas
estructuras morfológica y bioquímicamente similares a estas organelas que han sido
descritas en plaquetas humanas (Ruiz y col., 2004). Varios estudios han evidenciado
el papel de los acidocalcisomas en el proceso de osmoregulación de T. cruzi hasta
80
llegar a proponer un mecanismo que involucra la fusión de los acidocalcisomas a la
vacuola contráctil, una organela localizada cerca del bolsillo flagelar del parásito,
cuya función principal es la expulsión de agua de la célula en condiciones de estrés
hipo-osmótico (Scott y Docampo, 2000; Rohloff y col., 2004; Fang y col., 2007b;
Rohloff y Docampo, 2008).
Varias proteínas localizadas en los acidocalcisomas de T. cruzi han sido descritas
hasta el momento. La bomba de protones pirofosfatasa tipo vacuolar (V-H+-PPasa)
presente en la membrana de estas organelas es el principal marcador utilizado en
ensayos
de
co-localización
con
ácidocalcisomas
mediante
inmunoblot,
inmunofluorescencia y microscopía inmunoelectrónica (Montalvetti y col., 2004;
Farella y col., 2006, Fang y col., 2007b). En estos compartimientos subcelulares
también ha sido descrita una bomba tipo vacuolar de protones ATPasa (V-H+ATPasa), una exopolifosfatasa (TcPPX) y un canal de agua o acuaporina (TcAQP)
que es translocada desde los acidocalcisomas hacia la vacuola contráctil y juega un
papel fundamental en el proceso de disminución regularoria del volumen (Regulatory
Volume Decrease, RVD) en condiciones de estrés hipo-osmótico (Montalvetti y col.,
2004; Rohloff y col., 2004; Fang y col., 2007b; Rohloff y Docampo, 2008).
La localización celular de los antígenos reconocidos por los anticuerpos anti-RE1 y
anti-RE2 en epimastigotes de T. cruzi (Fig. 24, páneles C, D, E y F; Fig. 25B y Fig.
26E) presenta un patrón bastante similar al de las proteínas de acidocalcisomas VH+-PPasa y TcAQP reportado por Montalvetti y col. (2004) durante la caracterización
de la TcAQP de T. cruzi (Fig. 27, páneles J y K). Para el inmunomarcaje de estas
proteínas los autores emplearon anticuerpos policlonales anti-pirofosfatasa de T.
cruzi obtenidos en ratón, y anticuerpos policlonales anti-acuaporina de T. cruzi
obtenidos en conejo. La semejanza entre el patrón de localización celular que
presentan los antígenos reconocidos por los anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 con el
patrón de localización observado en las proteínas de acidocalcisomas, respalda la
idea de que la proteína DGF-1 (BAC D6C) se localice en los acidocalcisomas de T.
cruzi.
81
En este trabajo se comparó la localización celular de DGF-1 con la localización de
una proteína glicosomal (PFK) y con el núcleo y kinetoplasto del parásito marcado
con DAPI. Es necesario entonces realizar ensayos de co-localización de DGF-1 con
marcadores de acidocalcisomas como la V-H+-PPasa y con marcadores moleculares
de otras organelas (por ejemplo, cruzipaína para reservosomas, la chaperona BiP
para retículo endoplasmático y el fluoróforo Mitotracker para mitocondria) para
establecer una localización celular más precisa de DGF-1.
Figura 27. Distribución de la acuaporina en epimastigotes de T. cruzi (cepa Y). La figura
muestra la co-localización de GFP-TcAQP (B y F) o TcAQP endógena (K) con V-H+-PPasa
(C y J) y el conjugado concanavalina A-TRITC (G). D,H y L muestran el solapamiento de B y
C, F y G, y J y K, respectivamente, e indican la co-localización de la acuaporina en los
acidocalcisomas con la V-H+-PPasa (D y L) y la ausencia de co-localización en el citostoma
con concanavalina-A (H). A, E, I son imágenes de campo claro de los mismos parásitos
mostrados en la microscopia de fluorescencia. Las flechas en D, H y L señalan el marcaje de
la vacuola contráctil. Los anticuerpos secundarios empleados fueron Alexa 488
(fluorescencia verde) y Alexa 546 (fluorescencia roja). Escala: 10 µm (Tomado de Montalvetti
y col., 2004).
82
La posible localización celular de DGF-1 en los acidocalcisomas de T. cruzi y su
estructura deducida permiten sugerir la hipótesis de que esta proteína cumple una
función relacionada con los mecanismos de osmoregulación. La presencia de 10
hélices transmembranales en la secuencia DGF-1 putativa (Anexo 1) pudiera
corresponder a la estructura de una proteína presente en la membrana de los
acidocalcisomas que funcione como una especie de poro, bomba o canal de iones u
otro osmolito (aminoácidos, protones, pirofosfato, glicerol u otras moléculas no
cargadas) que participe activamente en el proceso de osmoregulación llevado a cabo
por el complejo acidocalcisomas-vacuola contráctil de T. cruzi.
Papel de DGF-1 en el ciclo de vida de T. cruzi
A lo largo de su ciclo de vida, T. cruzi debe adaptarse a cambios ambientales
abruptos y superar diversas barreras fisiológicas para su supervivencia (Giordano y
col., 1999). Uno de los factores de estrés al que se ha adaptado este parásito es a
las fluctuaciones extremas de osmolaridad que ocurren dentro del tracto intestinal del
insecto vector y cuando el parásito se transloca desde el ambiente acídico del
fagolisosoma hacia el citosol de la célula hospedadora (Montalvetti y col., 2004). Por
otra parte, los tripomastigotes metacíclicos son expulsados en las deyecciones
altamente concentradas del vector y rápidamente pasan al fluido intersticial del
hospedador vertebrado donde la osmolaridad es mucho menor (Rohloff y Docampo,
2008). Como consecuencia, este parásito ha desarrollado mecanismos muy
complejos de osmoregulación que le permiten sobrevivir a las condiciones de estrés
hiper e hipo-osmótico al que se ve sometido durante su ciclo de vida (Montalvetti y
col., 2004; Rohloff y col., 2004; Rohloff y Docampo, 2008).
Si la proteína DGF-1 participa en el proceso de osmoregulación, es de esperarse que
se exprese en todos los estadios del ciclo de vida del parásito, como ocurre con la
acuaporina de T. cruzi (Montalvetti y col., 2004). Sin embargo, en este trabajo los
anticuerpos anti-RE1 no detectaron ningún antígeno en el estadio tripomastigote
metacíclico. Es posible que una o varias copias del gen DGF-1 diferentes a la copia
83
estudiada en este trabajo (la secuencia DGF-1 presente en BAC D6C) se exprese en
este estadio infectivo.
Una interrogante que es necesario abordar es la existencia de un número tan grande
de genes DGF-1 dispersos en el genoma de T. cruzi. Un estudio in silico de la
volatilidad de esta familia de genes reveló un patrón bastante robusto ante la
ocurrencia de mutaciones aleatorias en el genoma (Azuaje y col., 2007). Esto
significa que a pesar de su alto número de copias, esta familia presenta secuencias
poco susceptibles a modificaciones estructurales funcionalmente significativas. Bajo
esta premisa, sería interesante utilizar anticuerpos contra una región conservada de
estas proteínas (por ejemplo, anti-RE2) y realizar ensayos de inmuoblot contra la
fracción subcelular de acidocalcisomas, analizada en geles bidimensionales, para
determinar el número de proteínas DGF-1 que efectivamente se expresan en los
diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi.
Consideraciones finales
Las diferentes evidencias experimentales analizadas permiten sugerir la realización
de algunos experimentos adicionales para dilucidar la función de la proteína DGF-1
en el ciclo de vida de T. cruzi. Luego de confirmar la localización de esta proteína en
los acidocalcisomas del parásito, sería necesario realizar experimentos que
involucren la inducción de estrés hipo-osmótico en los distintos estadios, con el
objeto de evaluar el comportamiento de DGF-1 en estas condiciones, y su papel en
los mecanismos de osmoregulación del parásito.
La obtención de tres líneas transfectantes de T. cruzi con las cuales sea posible: a)
inducir la sobreexpresión de la proteína DGF-1, b) interrumpir o silenciar la copia del
gen DGF-1 presente en el recombinante BAC D6C, y c) fusionar la secuencia DGF-1
a un gen reportero como el de la proteína de fluorescencia verde (Green Fluorescent
Protein, GFP); sería una herramienta de mucha utilidad en el diseño de metodologías
84
que permitan establecer la función de esta proteína. Sin embargo, la longitud del
marco abierto de lectura de DGF-1 dificulta la realización de su clonamiento completo
en los vectores de expresión hasta ahora desarrollados para tripanosomatídeos. Por
este motivo, el estudio de la función de esta proteína requiere la utilización de
estrategias moleculares no convencionales que deben ser diseñadas con
rigurosidad, tomando en cuenta las particularidades que presenta esta secuencia y
su abundancia en el genoma de T. cruzi.
85
CONCLUSIONES
1. La amplificación y clonamiento de dos segmentos internos del gen DGF-1
(RE1 y RE2) en el vector de expresión pGEX-5X-2 generó la construcción de
dos plásmidos recombinantes denominados pGEX-5X-2/RE1 y pGEX-5X2/RE2. Los insertos de estas construcciones moleculares conservan la fase de
traducción con respecto al marco abierto de lectura del gen GST presente en
el vector, dando origen a la secuencia que codifica para las proteínas
recombinantes de fusión GST-RE1 y GST-RE2.
2. Se obtuvieron dos cepas recombinantes de E. coli inducibles con IPTG para la
expresión de las proteínas recombinantes GST-RE1 y GST-RE2.
3. Las proteínas recombinantes de fusión GST-RE1 y GST-RE2 se expresaron
en E. coli y se purificaron a partir de la fracción insoluble de los extractos
proteicos de las cepas transformadas e inducidas.
4. Mediante la inmunización de ratones con las proteínas recombinantes de
fusión GST-RE1 y GST-RE2 se produjeron anticuerpos policlonales anti-RE1 y
anti-RE2 que reconocieron a sus antígenos de manera específica en ensayos
de inmunodetección en membranas.
5. Se produjeron anticuerpos policlonales anti-RE1 en conejo que reconocieron a
su antígeno de manera específica en ensayos de inmunoblot.
86
6. Posibles miembros de la familia DGF-1 fueron detectados por inmunoblot en el
extracto proteico total de epimastigotes de la cepa CL Brener y en la fracción
de organelas/citosol en los estadios epimastigote y tripomastigotes obtenidos
mediante infección de cultivo celular (TCT) del aislado YBM.
7. Los anticuerpos policlonales anti-RE1 obtenidos en conejo detectaron en
membranas tres bandas específicas cuya masas moleculares son 220, 120160, y 160 KDa aproximadamente en extractos proteicos totales de
epimastigotes de la cepa CL Brener.
8. En epimastigotes de T. cruzi se observó que los antígenos reconocidos por los
anticuerpos anti-RE1 y anti-RE2 se localizan en un compartimiento subcelular
alrededor del núcleo. Estos antígenos pudieran corresponder a miembros de
la familia DGF-1 y el compartimiento subcelular donde se localizan
probablemente corresponda a los acidocalcisomas del parásito.
9. En tripomastigotes metacíclicos los anticuerpos anti-RE1 no detectaron ningún
antígeno al ser utilizados en ensayos de inmunocitoquímica.
10. La localización subcelular del antígeno reconocido por el anticuerpo anti-RE1
es intracelular, ya que no se detecta en parásitos no permeabilizados.
11. Es necesario realizar ensayos de co-localización con marcadores específicos
de varias organelas del parásito con el fin de establecer una localización más
precisa de esta proteína.
12. Este estudio representa el primer reporte de inmunodetección de posibles
miembros de la familia DGF-1 en T. cruzi.
87
13. En este trabajo se evidenció por primera vez la expresión de un gen localizado
en la región subtelomérica de T. cruzi, mediante el reconocimiento específico
de la proteína DGF-1 (BAC D6C) por parte de los anticuerpos anti-RE1.
88
REFERENCIAS
1. Acosta-Serrano A, Almeida I, Freitas-Junior L, Yoshida N, Schenkman S. 2001.
The mucin-like glycoprotein super-family of Trypanosoma cruzi: structure and
biological roles. Mol Biochem Parasitol. 114(2):143-50.
2. Añez-Rojas N, García-Lugo P, Crisante G, Rojas A, Añez N. 2006. Isolation,
purification and characterization of GPI-anchored membrane proteins from
Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi. Acta Trop. 97(2):140-5.
3. Atwood J, Minning T, Ludolf F, Nuccio A, Weatherly D, Alvarez-Manilla G,
Tarleton R, Orlando R. 2006. Glycoproteomics of Trypanosoma cruzi
trypomastigotes using subcellular fractionation, lectin affinity, and stable isotope
labeling. J Proteome Res. 5(12):3376-84.
4. Atwood J, Weatherly D, Minning T, Bundy B, Cavola C, Opperdoes F, Orlando R,
Tarleton R. 2005. The Trypanosoma cruzi proteome. Science. 309(5733):473-6.
5. Azuaje F, Ramirez J, Da Silveira J. 2007. An exploration of the genetic robustness
landscape of surface protein families in the human protozoan parasite Trypanosoma
cruzi. IEEE Trans Nanobioscience. 6(3):223-8.
6. Baida R, Santos M, Carmo M, Yoshida N, Ferreira D, Ferreira A, El Sayed N,
Andersson B, da Silveira J. 2006. Molecular characterization of serine-, alanine-,
and proline-rich proteins of Trypanosoma cruzi and their possible role in host cell
infection. Infect Immun. 74(3):1537-46.
7. Barry J, Ginger M, Burton P, McCulloch R. 2003. Why are parasite contingency
genes often associated with telomeres? Int J Parasitol. 33(1): 29-45.
8. Barry J, Marcello L, Morrison L, Read A, Lythgoe K, Jones N, Carrington M,
Blandin G, Bohme U, Caler E, Hertz-Fowler C, Renauld H, El-Sayed N, Berriman
M. 2005. What the genome sequence is revealing about trypanosome antigenic
variation. Biochem Soc Trans. 33(5):986-9.
9. Beals T, Boothroyd J. 1992. Genomic organization and context of a trypanosome
variant surface glycoprotein gene family. J Mol Biol. 225(4):961-71.
10. Blackburn E. 2001. Switching and signaling at the telomere. Cell. 106(6): 661-73.
11. Blackburn E, Greider C. 1995. Telomeres. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
New York. 396 pp.
89
12. Bodley A, Chakraborty A, Xie S, Burri C, Shapiro T. 2003. An unusual type IB
topoisomerase from African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci. 100(13):7539-44.
13. Boguski M, Lowe T, Tolstoshev C. 1993. dbEST: database for "expressed
sequence tags". Nat Genet. 4(4):332-3.
14. Camandaroba E, Pinheiro Lima C, Andrade S. 2002. Oral transmission of Chagas
disease: Importance of Trypanosoma cruzi biodeme in the intragastric experimental
infection. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 44(2):97-103.
15. Campbell D, Sturm N, Yu M. 2000. Transcription of the kinetoplastid spliced leader
RNA gene. Parasitol Today. 16(2): 78-82.
16. Catálogo en línea de Invitrogen™. 2007. http://www.invitrogen.com/
17. CDC. 2007. Centers for Disease Control and Prevention National Center for Infectious
Diseases. Division of Parasitic Diseases. http://www.cdc.gov/ncidod/dpd/
18. Chiurillo M, Cano I, Da Silveira J, Ramirez J. 1999. Organization of telomeric and
sub-telomeric regions of chromosomes from the protozoan parasite Trypanosoma
cruzi. Mol Biochem Parasitol. 100(2):173-83.
19. Chiurillo M, Santos M, Franco Da Silveira J, Ramirez J. 2002. An improved general
approach for cloning and characterizing telomeres: the protozoan parasite
Trypanosoma cruzi as model organism. Gene. 294(1-2):197-204.
20. Colli W. 1993. Trans-sialidase: a unique enzyme activity discovered in the protozoan
Trypanosoma cruzi. FASEB J. 7(13):1257-64.
21. Deitsch K, Moxon E, Wellems T. 1997. Shared themes of antigenic variation and
virulence in bacterial, protozoal, and fungal infections. Microbiol Mol Biol Rev.
61(3):281-93.
22. Dias J, Silveira A, Schofield C. 2002. The impact of Chagas disease control in Latin
America: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 97(5):603-12.
23. Dzikowski R, Deitsch K. 2006. Antigenic variation by protozoan parasites: insights
from Babesia bovis. Mol Microbiol. 59(2):364-6.
24. El-Sayed N, Myler P, Bartholomeu D, Nilsson D, Aggarwal G, Tran A, Ghedin E,
Worthey E, Delcher A, Blandin G, Westenberger S, Caler E, Cerqueira G,
Branche C, Haas B, Anupama A, Arner E, Aslund L, Attipoe P, Bontempi E,
Bringaud F, Burton P, Cadag E, Campbell D, Carrington M, Crabtree J, Darban
H, da Silveira J, de Jong P, Edwards K, Englund P, Fazelina G, Feldblyum T,
Ferella M, Frasch A, Gull K, Horn D, Hou L, Huang Y, Kindlund E, Klingbeil M,
Kluge S, Koo H, Lacerda D, Levin M, Lorenzi H, Louie T, Machado C, McCulloch
R, McKenna A, Mizuno Y, Mottram J, Nelson S, Ochaya S, Osoegawa K, Pai G,
Parsons M, Pentony M, Pettersson U, Pop M, Ramirez J, Rinta J, Robertson L,
Salzberg S, Sanchez D, Seyler A, Sharma R, Shetty J, Simpson A, Sisk E, Tammi
M, Tarleton R, Teixeira S, Van Aken S, Vogt C, Ward P, Wickstead B, Wortman J,
90
White O, Fraser C, Stuart K, Andersson B. 2005. The genome sequence of
Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease. Science. 309(5733):409-15.
25. Fang J, Rohloff P, Miranda K, Docampo R. 2007. Ablation of a small
transmembrane protein of Trypanosoma brucei (TbVTC1) involved in the synthesis of
polyphosphate alters acidocalcisome biogenesis and function, and leads to a
cytokinesis defect. Biochem J. 407(2):161-70.
26. Fang J, Ruiz F, Docampo M, Luo S, Rodrigues J, Motta L, Rohloff P, Docampo R.
2007. Overexpression of a Zn2+-sensitive soluble exopolyphosphatase from
Trypanosoma cruzi depletes polyphosphate and affects osmoregulation. J Biol Chem.
282(44):32501-10.
27. Ferella M, Montalvetti A, Rohloff P, Miranda K, Fang J, Reina S, Kawamukai M,
Búa J, Nilsson D, Pravia C, Katzin A, Cassera M, Aslund L, Andersson B,
Docampo R, Bontempi E. 2006. A solanesyl-diphosphate synthase localizes in
glycosomes of Trypanosoma cruzi. J Biol Chem. 281(51):39339-48.
28. Figarella K, Uzcategui N, Zhou Y, LeFurgey A, Ouellette M, Bhattacharjee H,
Mukhopadhyay R. 2007. Biochemical characterization of Leishmania major
aquaglyceroporin LmAQP1: possible role in volume regulation and osmotaxis. Mol
Microbiol. 65(4):1006-17.
29. Giordano R, Fouts D, Tewari D, Colli W, Manning J, Alves M. 1999. Cloning of a
surface membrane glycoprotein specific for the infective form of Trypanosoma cruzi
having adhesive properties to laminin. J Biol Chem. 274(6):3461-8.
30. Hirotsune S, Yoshida N, Chen A, Garrett L, Sugiyama F, Takahashi S, Yagami K,
Wynshaw-Boris A, Yoshiki A. 2003. An expressed pseudogene regulates the
messenger-RNA stability of its homologous coding gene. Nature. 423(6935):91-6.
31. Hoft D, Farrar P, Kratz-Owens K, Shaffer D. 1996. Gastric invasion by
Trypanosoma cruzi and induction of protective mucosal immune responses. Infect
Immun. 64(9):3800-10.
32. Hull R, Cherry W, Tritch O. 1962. Growth characteristics of monkey kidney cell
strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus
research. J Exp Med. 115:903-18.
33. Kim D, Chiurillo M, El-Sayed N, Jones K, Santos M, Porcile P, Andersson B,
Myler P, da Silveira J, Ramírez J. 2005. Telomere and subtelomere of Trypanosoma
cruzi chromosomes are enriched in (pseudo)genes of retrotransposon hot spot and
trans-sialidase-like gene families: the origins of T. cruzi telomeres. Gene. 346:153-61.
34. Kipling D. 1995. The Telomere. Oxford University Press. New York. 208 pp.
35. Lewin B. 2004. Genes VIII. Pearson Prentice Hall. New Jersey. 1027 pp.
36. Machado C, Augusto-Pinto L, McCulloch R, Teixeira S. 2006. DNA metabolism
and genetic diversity in Trypanosomes. Mutat Res. 612(1):40-57.
91
37. Martin D, Tarleton R. 2004. Generation, specificity, and function of CD8+ T cells in
Trypanosoma cruzi infection. Immunol Rev. 201:304-17.
38. Miles M, Souza A, Povoa M, Shaw J, Lainson R, Toye P. 1978. Isozymic
heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first autochthonous patients with Chagas'
disease in Amazonian Brazil. Nature. 272(5656):819-21.
39. Montalvetti A, Rohloff P, Docampo R. 2004. A functional aquaporin co-localizes
with the vacuolar proton pyrophosphatase to acidocalcisomes and the contractile
vacuole complex of Trypanosoma cruzi. J Biol Chem. 279(37):38673-82.
40. NCBI Home Page. 2008.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
National
Center
for
Biotechnology
Information.
41. Nelson D, Cox M. 2005. Lehninger: Principles of Biochemestry. Cuarta Edición. W.H.
Freeman and Company, New York. 1119 pp.
42. Pereira-Chioccola V, Acosta-Serrano A, Correia de Almeida I, Ferguson M,
Souto-Padron T, Rodrigues M, Travassos L, Schenkman S. 2000. Mucin-like
molecules form a negatively charged coat that protects Trypanosoma cruzi
trypomastigotes from killing by human anti-alpha-galactosyl antibodies. J Cell Sci. 113
(7):1299-307.
43. Ralph S, Scheidig-Benatar C, Scherf A. 2005. Antigenic variation in Plasmodium
falciparum is associated with movement of var loci between subnuclear locations.
Proc Natl Acad Sci. 102(15):5414-9.
44. Riviera I, Moreno E, González N, Lugo A. 2000. Caracterización de aislados de
Trypanosoma cruzi del Occidente de Venezuela. Rev Ecol Lat Am. 7(3):1-10.
45. Rodrigues M, Boscardin S, Vasconcelos J, Hiyane M, Salay G, Soares I. 2003.
Importance of CD8 T cell-mediated immune response during intracellular parasitic
infections and its implications for the development of effective vaccines. An Acad Bras
Cienc. 75(4):443-68.
46. Rohloff P, Docampo R. 2008. A contractile vacuole complex is involved in
osmoregulation in Trypanosoma cruzi. Exp Parasitol. 118(1):17-24.
47. Rohloff P, Montalvetti A, Docampo R. 2004. Acidocalcisomes and the contractile
vacuole complex are involved in osmoregulation in Trypanosoma cruzi. J Biol Chem.
279(50):52270-81.
48. Ruiz F, Lea C, Oldfield E, Docampo R. 2004. Human platelet dense granules
contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular
eukaryotes. J Biol Chem. 279(43):44250-7.
49. Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. New York.
50. Scott D, Docampo R. 2000. Characterization of isolated acidocalcisomes of
Trypanosoma cruzi. J Biol Chem. 275(31):24215-21.
92
51. Tibayrenc, M. 2003. Genetic subdivisions within Trypanosoma cruzi (Discrete Typing
Units) and their relevance for molecular epidemiology and experimental evaluation.
Kinetoplast. Biol. Dis. 2(1): 12.
52. Turner C. 1999. Antigenic variation in Trypanosoma brucei infections: an holistic
view. J Cell Sci. 112 (19):3187-92.
53. Villaverde A, Carrió M. 2003. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological
role of inclusion bodies. Biotechnol Lett. 25(17):1385-95.
54. Westenberger S, Barnabé C, Campbell D, Sturm N. 2005. Two hybridization events
define the population structure of Trypanosoma cruzi. Genetics. 171(2):527-43.
55. WHO Technical Report Series. 2002. Control of Chagas disease. Report of a WHO
Expert Committee. Geneva, World Health Organization Technical Report Series 905.
56. Wincker P, Murto-Dovales A, Goldenberg, S. 1992. Nucleotide sequence of a
representative member of a Trypanosoma cruzi dispersed gene family. Mol Biochem
Parasitol. 55(1-2): 217-20.
57. Yoshida N. 2006. Molecular basis of mammalian cell invasion by Trypanosoma cruzi.
An Acad Bras Cienc. 78(1):87-111.
93
ANEXOS
Anexo 1. Topología de la proteína DGF-1 putativa. La flecha señala un segmento de casi 3000 aminoácidos inmediatamente después de la
primera hélice transmembranal. (Modelo de Isea, 2004).
95
Anexo 2. Secuencia del gen DGF-1 (10425 pb) presente en el recombinante BAC D6C
(número de acceso en GenBank™ AY551440). Las regiones sombreadas corresponden a
los segmentos RE1 (896 bp) y RE2 (862 bp) que fueron utilizados para expresión en E.
coli y producción de anticuerpos policlonales.
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
3121
3181
ATGTGTTTGT
GTGCGGCGCA
GCGGTGGCGG
GTGGACAGAG
ATCACGAACG
ATTGAACTGA
GGCGAGCCGG
TGCTCGCTTG
ACGATTGTGA
GCGTCGCCGC
ACTGTGCTGA
CTGCTGTCGA
GCGTTCGCGA
TCAGTGACGA
GCGGTGTCCG
GTGCGCTGCG
GCGGTGGGCG
GTGTCGATTG
AGCGGCGCCG
GAATATCGCT
GCGCTGGCGT
GCCGGCGGTG
GGTGGTGGCG
GGCGGCGGGC
GCGGTGGACC
TGCGTGCTTG
CCGATGCCTC
CTGCAGGGCA
ACGGTTGGTG
CCCGCGCTTG
ACGCTGGTGT
AACCTGTCCA
TACGCTTTTG
TCGTGGAGTG
GTGGATGGTG
CTCACGGCAG
TTCCGCACCG
AGTGTGTGGT
CACATGACAA
AACGAGGCAA
GTGAGGGTGC
AGCAGCATCA
CCAGCTGCGG
GTCCGCTGCG
GGTCTGTGCT
GACGCATCAC
GTCAGGGGGA
GCTTTGGAGT
ATTTTGACGA
ACGCTGCTGC
ACTGTTGTTG
GAAGAGGATT
GGCTACCTTA
GACACCACTG
GTCTGTGGAT
GGGCCATTGC
CGTGGATGCC
CCATCACGGT
GCGTGGCTGT
GGAACTGCGT
CGAGTGACCG
TGTTTGTGCA
CGCCGGGACC
TTGTGCTGCA
GGTCGTTGCA
GCGCGGTGGT
TGCATGTGGC
ACGTGTCGGT
ACTCAGTACT
ACGGTGGGAC
CGGCGTCGTC
CGCGCTGCAC
TGTCGGTGCA
TGGCCGGTTT
GCTTCGATGC
TGGGCGAGGC
GTGCGCAGGG
GGGCGACGGC
TGCGCTCGAT
CGGGCGGTGC
ACGCCCTCGT
CGATGCCGCC
GGTCGCAGTA
TTCTGGACGG
GTGGCGGGGG
GCGTCTTCTA
CGTCGGACCT
CGCCGAGCAT
GCAGCGTGCT
CCACGTTGAC
CCTACGTTGT
CGATACTTGA
GCAACTGGTC
TGGGCTCTCC
TGGACTGCGG
TTGGCTGTGA
TTCCGGACGG
TGCACGGTGG
TTGTCAACGT
AACAGACACT
GTGGTGCGCG
TTGAGGGTGA
CGTCGGTCCA
TACTTGACAA
TCGTTGATGG
ACGGTGTGGA
ACGTTGAGAA
TGAGCTCCGC
GTGGTCTTTT
GGCTGTGCGT
CGCGGTGCAT
TGGCCGCGCC
GGTGTTCGAC
GTGCGACGGC
GAGCCTGGAG
CAACCTGCCG
GATGCGCTAC
CGCGACGTCG
CGCGGGCGGG
GCTTGACGGC
GTCCTCGTCG
AGTGAGCAGC
GCGCTTCGTG
AGTCGGTGGC
AGTGGCGTCG
TGCCACTGGC
GTGCAACCGT
GCCCTCCGTG
GCTGACTGCG
ATGCCTGCCG
CTGCGTGAGT
GTGCTTCGAC
GGACGCGTTC
GCAGCTGCGG
CAACATGACG
GAACTCGAGT
CGTGCCGACG
CGTCCGGCTT
CTCGTGCGCT
CATGGACAAC
GCGTGTCAGC
TGGCTTCTAC
GCAGATTGTG
TGTGACTGGC
GTACGTGGTC
CAACAACTTC
ACCACCATCC
TGTGACGAAT
TGCGTGCACT
GTGTGTGTGC
CCTTGGGCCG
CAGCGTCAGC
GACCTTCACT
CAACATCACG
CGTGCATGTG
TTTTGGCGTG
CACCATTGGC
CTACATTGAA
TGGCGGGATC
ATCATCTGTT
CAACAAGATG
GGGGCTGCTG
GTGGGTGCGT
GCGGCGCTGG
GCGGTGGTGT
GTGGACACGG
GTTGCGGCGA
GGTGCGCAGC
GTGAGCGTGA
GCACACACGA
TCGCAGCTGA
CTGTTGCAGA
TCGGCGGTTC
GTGTTGCTGG
CGTCTCAGTC
GGCGGTGGCA
GGCGTCGAGG
GGCGGGTGGC
CTGTCGGGGG
GCGACGCTTG
GCTGGTGGCC
AGCGTGGTGC
TCGTTCTCTG
TTCGACGTGC
GGCGTGACGC
TCGGTGGTGC
GCTGACGCGC
ATTGGCGGCC
AATGTGACGT
GTGCTGCTGG
ACACCTGGCC
CTGTCGACGC
GCTATCGTCG
TGTGCTGTCG
GGCGGCTCCG
GAAGGCGCGT
TTCAGCACGT
GGCGGCTGGC
AACGAGAACG
ACGTATGGCT
GACACGCGCC
TACGGAGTCG
GTGGACGCCG
GCAGCTGGTG
CTCCCGCTCT
TCCGTGTACG
GCCGCGATTT
CTGCTGCAGT
AACGTGACAT
AGCTCCCAGA
TTCCTGGACT
GGAAGTAGTT
ATTGTGAAGG
TATGTTTACT
AGAGCCGTTA
CGAGTGGCGG
GTCCGCGCAG
TCGTTGTGTT
TGCGACTGCG
TGCTGATGGA
TGCTTCCCGG
TCTACGTGCG
GCGGGCTGTC
ACGTGTCGGT
GCGGGCTGAC
CGCAGCTGCG
ACGTTGGCGG
AGGCGTCGGG
TGCGGAGCCA
TTGTGCTTGG
GGTCTGTCGC
TGGACCTGCA
TGACGCTGAG
TCTCCGAGCC
GGGTGCTGCA
CGTGCGACGG
ACTGCGCGTG
CGCCTGCGAG
TGACGGAGTC
TCAGCGGGCC
TGAACGTGAC
TCAGCGAGAG
CGCTGGAGGG
CGAACTCAAC
ACGAGGAATC
GTTTTGTTAT
TGGAGCGCGG
TGTCGCAGAT
TGTTCTCCAT
GTGTGTTTGA
TCCGTCTTGG
TGGTGCACCG
GAGTGGCGTT
CGTACTCGTC
CGATCATCTA
ACCTCAATAT
TGTGCTTCGC
GCCACGGTGA
CCGATGCGGA
ATCCTGATCC
TGCTGGACCT
GCGTCCTCAT
CCTCGTTCCT
TACTGGTGGC
TTTACCCTGG
TCGCGGTCTG
GAAATACGCT
CTGTTGCCGT
ATGGCGTTTA
ACTGCACCTT
CCGGCACCGT
GGCGCTGGTT
GGGCGGTACG
CGGCGTGTCC
CACACTGCGC
GGGCTACAGC
CGGCGGCTAC
CCGTGACTCG
GGACGCGGTG
TGTGAGCAGC
CGGCGTGGAC
TGGTCCGACC
CTCGGTGTTC
CGGGCGCCTC
GTCGTCGCTG
CGACGTGTGG
CGGCGGCGCC
GGCGATCACG
GAGCAGCGGC
CTGTGCGGCT
CAGCTGCCGT
GGTCGGTGGC
GGTGACGGTT
GATCACTGTG
GCTGCGCCAC
CACGGCGCGC
CACGATTGTG
GCTGCGCGCG
CCGGTACGGC
GACGCGGTCT
CTTTGTTGTG
GCACGTGATG
ACAGAACAGC
GGACGTTGCG
CTTCGCCATG
CAACAACGAG
CCACGATCGG
AACCATCGCA
CGGCATGTGC
TGGAGCCCCC
AGCGAGGACG
CGCGTGTCTG
CGACACGGAG
CGGTGTGCGT
GTGGAGCTTC
GGGCTTGTCG
GGATTCTGGA
GGGCAGTGCA
GGTGAACTCG
TTTTTCCAAT
GAGGGCAACG
GAAGAACAGC
TTTTTATGGG
TGTTGAAAGC
96
3241
3301
3361
3421
3481
3541
3601
3661
3721
3781
3841
3901
3961
4021
4081
4141
4201
4261
4321
4381
4441
4501
4561
4621
4681
4741
4801
4861
4921
4981
5041
5101
5161
5221
5281
5341
5401
5461
5521
5581
5641
5701
5761
5821
5881
5941
6001
6061
6121
6181
6241
6301
6361
6421
6481
6541
6601
6661
6721
6781
6841
ACGGAAGTTT
GCGCAGTGGC
GCCCACCAGA
CAGGTGGACT
TCCGCGCAGT
CTGTTTTCGG
TACATGCCCG
TGGCATGGCG
GAGAGAGCCG
CTGAACATGT
GCGTTGACGT
GGGTGCACAT
TCAGCGGGCG
GCACTCGCCC
TCCGCGGTGC
GTCGTGCTGA
GGCGGGTTTG
GCGCGTTACT
CGTGACCACT
TATCAGCAGC
GGTTCCGTCT
CTGGATTGGC
TTTGTGAGCA
GGGTTGTCGG
CTGACGGTCG
AACGTGACGA
CTGACGACGG
TGCGTCCCGG
CCACCGCCGC
GTGGGCAGCG
AGCCTGACGG
TGCACGTGGA
TCGCTGAACA
GGGTTTCCAC
ATCCCTCGGA
ATCAGCAACG
TCAAGCGCCA
GTGGTGGGCA
TCTAGCGATT
CTTGTGTCGA
CAGTCAGCGG
ACTTTTTCCT
GAATCCCCAT
GTGTCTGTGT
TACTCAGGAC
GGCGAGGAGG
AGCGACCCAT
GATGGCTGCG
GTCCCCGAGC
GTGGAGGTGA
GCGGATGTCG
AACTGCACGT
GCTGGCGAGC
ATGGTGGCGA
GCGGAGAATC
GTGGTGCACA
GCTGTGTTCC
GGTGCGCTGT
GAGGGCGGCG
CTGTGCAAGC
TTTGTGCGGA
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GTGTGGAGGG
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TGAGGGCTTC
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GGACAGAGTC
CGTCGTGTCT
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GGAAGACGCA
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TCCGTGAGGG
TCCTGATCCG
TCCCACAGCA
AGCTTTTGGA
GTGCGTCGAC
GTTTGTACTC
GCAGCCTCGA
CTGTTCTTGC
AGGACTTCAG
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GCGACAACGA
TTGACAGCAG
GACCTCTGCG
CGGGACGTGT
CGATTGCTGC
CGGTCATTGA
CGCCTGTGCC
CGGTTGGTGA
GGCTGTCGTG
TGCTGATTGG
GGGACGGTGC
TCGTCGTCAC
CGCACACGAA
CGGGTTTGGG
ACTCCGCGGT
TCCACGTCGT
ACACGTTTCA
CCTTGTCGCT
GTCAGGTGCA
TTGTGTTTCA
CCTACATCTA
CGGATGCGTT
CCGGCAACCG
CCAGCGATCT
AAGCGAACTA
GCACCCTCTT
CGTGCACATG
CACCGAGCAC
GCGCCGGTTT
TGGTGGACAT
TTTTGGGCAG
GCGTCGATGT
ACCAATTTCC
GTTTTGCGTA
AGGTGAATCT
GTGACGCTGT
ACGTGGACGG
TTGCGGCCAG
ATGCGGTGAC
GCGACTTTGC
GCTGGTGCAT
CAACAACGTG
GTCGGGCAGC
CTTTGTCAAT
GTGCAACCTG
TGTGTTTGGG
GGTGGACCGC
TCCCTTCGAG
CACGAGCTGC
CCACTGCTAC
CAGTATGCCG
TGCCGCGCTG
CGTGAGCCAG
CTGCGACATC
CACTAGGATC
GCTGTTGGTC
GACCGGGACG
TGGATACACA
GCTGCTCAAC
CGTGTCGGAA
CTTTGCAGAA
CGTGGGATTG
CAGCGTGGTG
ATCTCTGGTA
GGTGACGACG
GTGCGGGGAG
CTGCAATTGC
TGCTGGTCCA
GTGCATCAGC
GCTGTGCTAC
GGCGATGACG
CGTGCTGGTG
CGGCAACACG
CATCACGATC
CCTTGACAGT
GGTGCTCAGT
TGATTCTGCG
TATGGACGGC
GAGTGTACTG
GTACGTCATT
GGGCAACGAC
CTACCACTCC
TGCTGTTTTG
ATTCATGTCC
CACAAACGGA
CGTTATTCCG
GGCGTCGTGC
CGCTGAGGGC
CGACGGCGCC
CGGGACGTCG
GGAGTCGATG
GGCGAGCCTG
GTTGATCAGC
GCCGGGCTCG
CCGCGGCGCC
GACTGGGAGT
TGGCGTGTTG
GCTGTTGGTC
CGGCGGCTCC
TGTGCGTGGG
GTCGGCGGAG
CTGGATGGCT
AGTGCACTCT
GGCACCACCG
ATTTTCCCAT
CAGGACGATG
TGCGGCACAT
GGCTCGTGCT
GTGCCCAACA
GTGGTGAACC
GTGGGTGTGA
CTGCATCTCC
CAGTTTGTTG
ACGGTGATGC
GCCGTCACGG
AACATGCTTA
AGCAACGTCA
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CACCTGTTCC
AATACGATGG
CACAGCGTGT
GGCTCGTGGA
GGAGCGATTT
ACGCTGACGG
GAGGCCAGCT
GCGGCGGAGC
TGCACGAAGG
CAGTGCGCCG
CCGCCGCCAC
GACATGGTGT
CGCAACGTGA
GGCGACGTGG
CTGTTGGGCA
TTCCGTGACG
AGCGGGAACC
CCGTCATGTG
GGTAATGTGT
CTGAGGGTTT
GGTGACACTA
AACAACTCTG
TTTTTTCGTT
ATGCAGAGAA
TGGCTGCAGT
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GGCAAGGACA
GTGATTTTGG
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TTCCCCGCGT
GGCCACGGCG
GACTGGTGCG
GTGGCGTGCT
TCGGGGAGCG
TACGTTGTTG
GGGCTTGAGT
CGTGTCACTG
TACGGCCTTG
GTGCTGACCA
TTTGTTGGCG
CAGACGGCGC
GTGGTGGCGT
GCTGTGAGCG
GACTACGCGG
CTGTGACACT
CAATACTAAG
TGGCGCTTGC
CGAGCATTGT
AGGAGGTGTC
GCAACGATGA
CGTGCAGCTG
CTGTTGTGCC
AGACGCTGAC
CATTCAGCGG
CCATCAACAT
GGGGTGCTGA
GGTCCTCTGT
AGGTTGACGC
GCGTAGTGAT
AGGCGCATGC
TAGGTGGCAG
AATTAAATAT
CCTCCGGGAC
TGCGCGTGGT
CCGTCCAGCA
TCAAGGTATG
GCTGCAAGAT
ACCTGTTCGT
TGGAGCTGAA
AGGGCGACTG
CTGGAGGGCA
CGCCACCGCC
ACCCCGAGGT
CGTTCAGCGG
CGAACATCAC
ACGCGCACGC
CGCTGCTCAG
GCTTCACTGT
TTGCGATGAA
TTCAGACCGT
CGTGGAGCTC
CGCTGATAAA
CCGTGGTGAT
GGGCCCTAAG
GTGTGGCTGT
TGGGCGGCAA
TGAATCTCCG
CGCCAAAAGC
CTGCGTGCAA
ATGCCACCAT
ACACGACGAC
ATGCGTGCCT
TGCGGGACGT
ACGTTGGTGT
TGCGCAACGT
GGTGGCGGTC
CGCGCTCCGG
TGGTGGACTC
GCGACGCGTC
TCGCGCGCAC
GCGTGGCGCT
TGGGGCTGTG
TTGTTGACAG
TGTCGGGCTC
TGGCGTTTGA
CGAGGGTGGT
TATAGCACAT
ACACAACCGT
CGTGACGTCA
GTACGACGAT
TGCGGCGTGC
CAAGGACGGA
GCCCGTGGCG
GAAAGTTACA
CGTGGGTGCT
CACGCTCAGT
GGTGGCCGAG
CGTTATTTTT
GGTGCAGTCT
GCTGGACGAC
ATCGAGGCGC
CTCTCTTTAC
CCTCAGTGTC
AAGCCTCCTG
GGGGAACAGC
GTCAAGCTGG
GGATTCCGCC
GGGCTCGACG
TGCTGGGTGC
CGGCATCACC
CTTCGCTCCG
CGGCGATGTG
ACCACCGCCG
TGCGCAGGCT
GGGCGGCATG
GTTCGATGGA
CGCTGTGGAG
CCCGGAGGGT
CACGAGGCTG
TGGACTGGTG
GACGGCATCG
CCTGTTTGCG
TCTTGAAGGG
CCGAGGCAAT
TGTGGAGTCT
GTTTTATTCA
CCTCTGCCGT
TGACTCCACG
TCTATGGATA
CACTGTGAAC
CCTGACCTGC
GGCCCCGAGT
GCCCGTTGCT
GCGTGTGGGT
GACCTTTGCG
GACGCTGGCG
CGACCCGCCT
CGGCGGCGTG
GGTGCTGATT
CGCGTGTCTC
GCACGTGGCG
GTCGTCGCGC
CGTGTCGGTG
CGACTTCCTG
CGTTGTGGCG
TTCGACGGTG
97
6901
6961
7021
7081
7141
7201
7261
7321
7381
7441
7501
7561
7621
7681
7741
7801
7861
7921
7981
8041
8101
8161
8221
8281
8341
8401
8461
8521
8581
8641
8701
8761
8821
8881
8941
9001
9061
9121
9181
9241
9301
9361
9421
9481
9541
9601
9661
9721
9781
9841
9901
9961
10021
10081
10141
10201
10261
10321
10381
AGCCTGGCCG
GAGATGCTCT
AACCGAGCGC
TTGAGGGTGG
GCGGCTGGTT
GACACGTACT
TGCGCGTGCG
CCGCCTGCCG
GTGTTCGTTG
GTGAGTCCGG
AACGTGTCGC
GCGGTGGCGG
GCGCTGAACG
ACGGACTCCC
TCCTCGCCGT
GTTGTGTCCG
GGCGCCGTCC
GACTATGCGT
TCGGGGAGCC
GCATCCGCCG
CTGCGGGGGT
AGCGGCAGGC
CTGACGCTCC
GGAGGTGACG
CCGATGGAAT
TGCGACGCCG
TGCCGCTGTG
GACGGGTGCA
ACGCGCAGCC
CCGACGCAGT
ACGCGGACCC
ACGCTCGCCG
GGTGGAAGCG
AGCGACCCGC
GGGTTCGGGG
AATCCGTCCA
GACGAGACGA
CTGCTTGGGT
GCGATCACCG
GGCTCCATCC
CAGGAGCGTG
CCGCTGTGGA
GGTGTGACGG
ATGCGCTTCC
GGCTCGGTGC
GTTGGTGTGC
ACGGGCGCGA
CTGTACCCCG
ACGAACATGA
GTGTGCCTGA
ATGGCGGCTG
GCCTTCGTGA
AGCGCGGCCA
CTGCTGCTGA
GAGGACCGCC
CGCGATGACG
TACGCCTCAG
GCCGGTGACA
AGCATTAATT
GTGGGTCGAT
ACGCGGCTGG
TGCTGCCGCG
CGTGCAACGA
TTGGCGACGC
GCTACGCGCC
GCAGCGGCGG
TGGGCACTGC
TACCTGCCGG
TGCTCCACGT
TGCTGAACGG
CGGGGAGCGA
GTGCGCTTGT
TGCTGGTTGC
ACGCACCGCT
GCGTGGCTCT
TGGAGCTTGT
TGTACGCGAG
AGGTGTACGC
TCGTAGTGAA
CGGCGTCGTT
TTTTGTCGGT
ACGGGAACGC
GCCGAAGGTT
ACAGGTCTGC
ACGTGCACTG
CTGAGGGCGG
ACCGCACGCA
CGACGCCAAC
ACGGGTCGAC
CGACAGCGTC
TGACGACGAC
CCGTCCCGAC
AGCTCGGCAC
GTCCGTGGGG
CCGTCCTGGA
TAGTCATTCG
CCTTCACGAT
GCGTTGTTGC
TGGAGTTGCA
CGAGCACCGT
TGGTGGTGGG
CCGCCTTCCA
CGAGTCTGAC
TCGCACTGGC
TGTACGGTGT
GCTTCACGAG
TCGGGTATTG
GGGGCAGTTA
TTGCGGCTGT
TGCTGCTTGC
CGGTGATGCA
ACCATCTTGC
CCGCTGTGCT
ACTGGCAGGA
AGGGGAGCGA
GCACCACCGT
CCCGCTCAGA
ATGCTCCTCT
GCTGCTGGCG
CGCTGTGACC
GATGCTGTCG
CGCTGGTGGA
TGGGAGCATC
CGGGACTGCG
GTACGGCGAG
GTCGAGTGTG
TGCGAGCGAG
GCCGTGGATG
CGCTGTGCTG
CGAGAGCGGG
GCTGACCGGC
CGCGAGGCCG
GCTTGTGCTG
CGTGACCGTG
CGGTGGCGGT
TGCGCGCGTG
TGCGCACGGG
CGACAACGCC
TGCGTCCGGT
GCCGTCGTAC
CGGTAGTGGG
CGTCGTGGGG
CGGCATCATC
CTTTGGTGCT
GTACGGGCGC
CGCCATACCG
GTGGACGCCG
GGAAACACTG
GGTGAGCAGC
GGCGGCTGGT
ACGGCTGATG
GCACCTGAGC
AGCGATGCTG
GCTGGCTGTC
CTGCGACGCT
CAGGTCGAAC
GGGTGCGGCG
GGCGCTCGGC
TGCGCTGCCG
CAACGCGCTG
GCGGTGGCGC
GTACGTCGTG
GATGCCCGGC
GGCGTTCCCT
GTACTGGCAG
GCACCCCGCG
CGTGTACTGG
GCAGTCGCCC
GGGTGCGGGC
GACTGCGAGC
GCCGAGCGAC
GCTTGCGGTC
GCTGCGCGAG
CGAGGACGCG
TGCGTCGTCG
CACTCTGAGC
GGACAGGTGG
AAGGGCAACG
GCTGTTGGGA
CTGAGCCTCT
CGTGTTCTGT
GACGTTGTTG
TCGGCGGGCA
GCGTGCGTGG
TTTGTCCGCG
GTGACGCTGC
GCGCGGGACG
TACGTGATGG
CCGGTGGAGC
ACGTTCCCTG
ACGCCGCTTG
TCGGGCCTGC
GTGACTGGTG
GTTGCGCTGG
GTTGCGTCAG
TTGGTGTTCG
GGTGCGCTGA
TCGTGGCTGT
CCGCGCAGTG
TCCGTCGTGA
TGCCTGACGC
GGGGAATTCC
GCGACGAGGG
GACTGCCTGC
CCGCTGAGCC
AAACCGAGTC
CAGGTGACGG
ACGCTGTGGT
GGGAGCCTGA
GTGGCGCTGC
TTCGTGCCGG
CGCAACGCGA
CCCGTGCACT
GTGGCTGTGT
ACACTGCCCG
GCTGTTGCTG
GTGTTTGCGA
TACTTCCTGT
CTCGCCGCCG
GGCGTGGACG
GCGCACGCGA
GCCCGCGTGC
GCTGGCGTGT
TTTTCGAGGA
GCGCAGCAGC
TGCGTGTTCC
GTGGGAGGCT
GTGGTTGCCT
TTTGTGCTCC
GGCGGTGCGA
ACTGTGTACA
CCGCGGCGTG
CAGAAGCCGC
TACCGACCAC
TTGTTCGACC
AGATCCTCCG
TGCACGACGG
GCACGCTGAG
CGCTCGCGGC
CGACGGCGGA
GGTGCGACGC
TGAGGAACGG
CTGTGGGAGC
AGGGCGTGCC
GCCACGTTGT
GCGTGCGGAT
GCGGTGGAGC
TGTCGGTGTG
CGGGGTCTGT
TGTATCTTCC
GGCTCGTGCG
GGCGGACGGT
ACGCGGCTGT
GGGGCGCTGT
AGAGCGGGGT
CCGATGGCGC
CGGTGCGCGG
CGGAATTTGC
TGGACGGCAC
TTAACGGGCA
GCCCCGTGGC
CGATGTCGGG
CGGTGTACCT
ACACGGCGAC
TGAGCACGGC
AGACGGTGGT
GGAGCGACGT
CGCAGAACGA
CGCCGCCGTT
TGTCGACGGC
CGTGGGTGCG
GCGGTTACTT
TTGGCGGCTG
CCGCAGCCAG
TGGTGGTGAC
GGATGCCATG
CGGTGTTCGC
TGTTCGGCTG
CGGCAAGTGC
TGCACCTCGG
AGCACCGCGT
GCTACTTGAT
AGCCGCTGCA
GGATGTACGG
AGCTGTCGGT
GCCACGTCCA
TCACGAACAT
TTGCGGCGCT
GAGCGTACGT
GCGTCGTTGT
GAGGGCTGGA
ACGACATGAC
CCGCACAGCT
GTGCACCCGA
CTTGA
CGTCTCGAGG
CTTTGTGCGC
TGGGGCGCAT
GGAGTACGCA
CTGCGACAGG
TGTGTGCGTG
TCCCGCGCTG
GTTGCAGTCG
GCTGGACGGC
CGTTGTGCAG
GTTGCGCGGT
CGATGTGGAG
GCTGACGGTG
CGGCTCGCAG
GTCCGTGCTG
GGTGGTGGAC
GCTCGGTGGC
GCTGCGCGTG
GGCGGCCAAC
GCTGCTGGTG
CAACAGCATC
GCAGAGCACG
CGTTGCGCTC
GGCGCTGCGG
GTGTGGCGTG
GTCGTGCGGC
GCCGCACGTG
GCTGACGGAG
GCACTACAGT
GCTGCCGTCC
GGCGTGCCCG
CATCCGCGGC
TCGGTGGGCA
GCAGCCGCGC
CAACGCGATG
CATTGCTGCC
CAGGGGTGTG
CGTCCTCTCG
CGGCGGGCTG
CGCCTCGGCA
TGCCCTTGAC
CGTGCACTGC
GTGGGCGGCG
CATCTTCTTC
GATTGGCGTT
TGCTCGCCAC
CGAGCGCCTG
TGGCATGCTG
GCTGTGTGTG
GTACTTCTGC
GATGCGCTCG
GTGCCTGATC
GGCGATCGTG
GTGGTACGCG
GACGCTGCTG
GTCAGTGTCG
GCAGCCCATG
TGCGAACTGC
98
Anexo 3. Secuencia de la proteína putativa DGF-1 (3474 aa, número de acceso en
GenBank™ AAT77681.1) deducida a partir del gen DGF-1 presente en el recombinante
BAC D6C. Las regiones sombreadas corresponden a los segmentos RE1 (298 aa) y RE2
(286 aa) que fueron expresados en E. coli y utilizados para la obtención de anticuerpos
policlonales.
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
3121
MCLCLWMWSF
VDRAITVGRA
GEPASDRSLE
ASPLVLHATS
AFAMHVASSS
VRCDGGTVGG
SGAVSVQCNR
AGGVGEACLP
AVDLRSMDAF
LQGTMPPNSS
TLVCGGGSCA
SWSAPSIGFY
FRTAYVVYVV
NEAMGSPVTN
PAAVPDGLGP
DASQQTLNIT
ILTTSVHTIG
EEDYGVESSV
TEVFESALVH
QVDLRASFVN
YMPGTESVDR
LNMWKTHHCY
SAGVLIRVSQ
VVLSASTLLV
RDHSVLALLN
LDWRDNDVGL
LTVAGRVVTT
CVPAPVPAGP
SLTVLIGAMT
GFPPHTNITI
SSAIHVVDSA
LVSSQVQYVI
ESPSDAFAVL
GEEEANYVIP
VPEPPSTDGA
NCTFLGRASL
AENRFAYRGA
GALYVDGLLV
FVRSDFASAE
NRALLPRMLS
DTYCYAPGTA
VFVVPAGASE
AVAAGSDESG
SSPYAPLLVL
DYALYASARV
LRGSASFASG
GGDGRRFVVG
CRCAEGGYGR
PTQYGSTETL
GGSAVPTRLM
NPSTVLELAV
AITGVVAGAA
PLWMVVGNAL
VGACPRSRHR
VDTVLMDGVS
VSVSGLSGGY
LLQTQLRVSS
RLSLRSHSVF
GGWLDLHDVW
AGGRVLQSSG
FDVPPARVGG
ADALNVTLRH
VLLANSTLRA
AIVVERGFVV
EGACVFEDVA
NENGVAFHDR
YGVDLNIGAP
LPLSDADDTE
LLQCVLMGLS
FLDFYPGVNS
YVYSVAVKNS
LDGSVTLEGG
IFPSSIVVTS
GSCSCSCKDG
VGVTFSGVGA
TVMRSSVVIF
SNVKAHASRR
NTMASGTSLL
GAIFKVWDSA
AAELELNGIT
PPPPPPPPPP
GDVANITFDG
SGNRFTVTRL
LRVSWSSLFA
FFRWALSVES
SLTVNLRDST
SVYNATILTC
DWCVRDVRVG
YVVGWRSDPP
YGLGDASACL
QTALGLCVSV
DYAVAFDSTV
LSLSLAAGAH
SAGMRNGVCV
VTLRHVVLDG
PVELSVCDVE
SGLRLVRSVL
VASGGAVLRV
SWLSVRGNSI
CLTLNGQALR
DCLPVYLPHV
QVTETVVLPS
VALPPPFRWA
PVHCGYFIAA
AVAVVVTGGL
LAAVFGCVHC
VRRRAIAAVR
ITNGVAVVFD
CSLVFVHNLP
TVLRSLHAGG
SVTNVSVVSS
AVGAASSVAS
EYRLAGLPSV
GGGGAQGCVS
CVLAGGAQLR
TVGGSQYVPT
NLSSVFYMDN
VDGGSVLQIV
SVWSILDNNF
VRVLDCGACT
VRCVHGGSVS
VRGSGARVHV
TLLLLDNYIE
GYLNVENNKM
AQWRVEGNNV
SAQFVVGCNL
WHGASCLPFE
ALTFFLNSMP
ALALPQHCDI
GGFGLYSTGT
YQQQDFSVSE
FVSIDSSSVV
NVTTIAACGE
PPPPVGECIS
CTWRDGAVLV
IPRTGLGLDS
VVGNTFHMDG
QSAVVFQGND
VSVSGNRFMS
SDPCTLLASC
VEVSAGFGTS
AGERVDVLIS
VVHKVNLTGS
EGGVAASGGS
SLAGGSMLLA
LRVACNDAGG
CACGSGGYGE
VSPVLHVPWM
ALNGALVLTG
VVSGVALVTV
SGSQVYAAHG
SGRLLSVPSY
PMEYRSAGII
DGCNRTHAIP
TRTPTASVSS
SDPQLGTHLS
DETIVIRCDA
GSILELQALG
GVTAAFQRWR
AALVVVLALV
VAAMLPGTLR
AHTNVSVRDS
SAVHVGGGVD
GGGIVLGGRL
LSGVTLSGGA
SVVPCDGCAA
GVTLTESVTV
IGGLSESTAR
TPGHEESRYG
CAVVSQMHVM
FSTFRLGFAM
TYGSYSSTIA
VDAVCFAART
SVYDPDPGVR
NVTSSFLDSG
GSSFAVCFSN
RAVNGVYFYG
SALSILSIAH
QDDEEVSYDD
VPNTVVPPVA
LHLPINITLS
AVTEVDAVQS
LMVVGGSSLY
HSVLRVVGNS
TLTGCKMGST
CTKEGDCFAP
DMVYPEVAQA
LLGNAHAAVE
PSCVAMNGLV
GDTTLINLEG
MQRSVAVFYS
GKDTPKALWI
FPAYTTTAPS
VACYVGVTFA
GLESRSGGGV
VLTIARTHVA
VVAFVDSDFL
KGNVHDGVSR
RVLSTAEEYA
ACVAVGAPAL
ARDGVRIVVQ
TFPAGSVLTV
VTGGRTVVVD
LVFESGVAAN
PRSAEFAQST
GEFRPVACGV
PLSHTATLTE
TLWWSDVACP
FVPVSTAQPR
VAVFGGCRGV
VFARMPCASA
GVDAASAWAA
AVAAWMPAVH
IELRNCVCDG
TIVTPGPMRY
LLSSAVVLDG
AVSDSVLRFV
VSIARCTATG
ALACFDALTA
GGGRATACFD
PMPHALVNMT
PALVLDGVRL
YAFASDLRVS
LTAATLTVTG
HMTSNWSPPS
SSIIGCECVC
GLCFVNVTFT
ALEFEGDFGV
TVVVVDGGGI
DTTVSSAGLL
AHQKIQLSGS
LFSEEVVVFG
ERAVDGDTSC
GCTFREGAAL
SAVQLLDTRI
ARYCSLDGYT
GSVSYAIFAE
GLSGPLRSLV
LTTAVIDCNC
VGSGLSWLCY
SLNIVVTGNT
ISNDSAVVLS
SSDSLSLSVL
TFSSYIYYHS
YSGPSDLTNG
DGCACTCAEG
ADVVVDMESM
MVANQFPPGS
AVFRDAVGVL
LCKHAVTVRG
EMLYAAGAVT
AAGFGDAGSI
PPAVGTASSV
NVSLLNGAVL
TDSLLVAARP
GAVLELVGGG
ASAVVVNDNA
LTLHGNAGSG
CDADVHCFGA
TRSPTPTWTP
TLAVTTTAAG
GFGGPWGAML
LLGSFTIRSN
QERASTVALP
MRFPSLTYVV
AVVLRLRGGT
GAQLYVRGYS
SQLSGLTDAV
VLLEASGGPT
GVEGSVASSL
ATLVSEPAIT
SFSDCACSCR
SVVLSGPITV
NVTSLEGTIV
LSTRFVMTRS
GGSVFSIQNS
GGWLVHRNNE
DTRPIIYGMC
AAGGHGDACL
AAILLDLWSF
SSQILVAGSA
IVKGNTLRAT
RVADCTFVES
GTTVALAHNR
CGTCNDDAAC
VVNQTLTKVT
QFVGGAEVAE
NMLSVVMLDD
HLFQLNILSV
GSWTVQQSSW
EASYLFVAGC
QCAAGGHGDV
RNVTFSGGGM
FRDALLSPEG
GNVFQTVTAS
NNSAVVIRGN
WLQLGGNLCR
VILAACNTVN
GHGDACLPVA
SGSVRNVTLA
RVTVVDSVLI
FVGGVALSSR
AVSVSGSVVA
AVGSTLSFVR
DVVGCDACDR
FVREGVPLQS
YVMGGGALRG
TPLVYLPGSQ
VALDAAVLGG
GALTDGALLV
SVVMDGTVAL
ATRAMSGSCG
KPSLSTAHYS
GSLTQNDIRG
RNATWVRNAM
TLPAAASVLS
YFLSVFAALD
AHAMHLGIFF
99
3181
3241
3301
3361
3421
GSVLALAMPG
LYPVGYWHPA
MAAVLLAGAG
LLLTAVLLAV
YASGTTVASS
ARVQHRVIGV
AQQRMYGGML
VVAFTNMMRS
TVYSVVVWYA
YRPPAQLQPM
VGVLYGVAFP
TNMRGSYVYW
AFVTVMQTAS
EDRHWQELRE
AGDTRSDTLS
AGVCYLIARH
CVFQLSVLCV
FVLLAALCLI
PRRGGLETLL
LFDRAPDANC
TGASFTRYWQ
VCLIAAVQSP
SAANHLAPSD
RDDEGSDEDA
SINYAPLDRW
FSRKPLHERL
VGGCHVQYFC
GGARAYVAIV
QKPHDMTSVS
RSSA