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NOTA CLÍNICA
Hemoglobinopatía Newcastle: utilidad
de la cromatografía y descripción del primer
caso en España
226.633
María del Mar Mañú Pereiraa, María Teresa Coll Sibinab,
Estefanía García Mateosa y Joan Lluís Vives Corronsa
a
Unidad de Eritropatología. CDB-IDIBAPS. Hospital Clínic i Provincial. Barcelona.
Servicio de Pediatría. Hospital de Granollers. Granollers. Barcelona. España.
b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: Las hemoglobinopatías inestables presentan sustituciones de aminoácidos en lugares críticos de la molécula que disminuyen su solubilidad y facilitan su desnaturalización y precipitación. Se describe aquí el primer caso de hemoglobina (Hb) Newcastle en España.
CASO CLÍNICO: Niña de 5 años que consultó por fiebre de 4 días. En la exploración física destacaban palidez cutánea y mucosa, subictericia y esplenomegalia. En la analítica sanguínea destacaban: Hb de 79 g/l, hematocrito del 27%, volumen corpuscular medio de 93,4 fl y reticulocitos del 3%. En el frotis de sangre periférica destacaban anisocitosis y policromasia.
RESULTADOS: La prueba de estabilidad térmica fue positiva. La electroforesis mostró una banda
difusa entre HbA2 y HbA. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mostró una Hb no
identificada, que correspondía al 12% del total. El estudio molecular demostró la mutación
CD92 His → Pro, Hb Newcastle en estado heterocigoto, patrón que se repitió en la madre.
CONCLUSIONES: La Hb Newcastle se ha descrito anteriormente en 3 pacientes de origen inglés,
ruso y chino. Su expresividad clínica es de anemia hemolítica crónica con crisis de agudización
tras la ingesta de fármacos oxidantes o infecciones. A diferencia de la electroforesis, la HPLC
permite el diagnóstico diferencial entre la Hb Newcastle y otras Hb inestables como la Hb
Köln.
Palabras clave: Hemoglobinopatías. Hemoglobina Newcastle. HPLC.
Hemoglobinopathy Newcastle: use of chromatography and first case reported
in Spain
BACKGROUND AND OBJECTIVE: Unstable hemoglobins (Hb) show amino acid substitutions in critical
places that produce a decrease of molecular solubility facilitating its denaturalization and precipitation. We describe the first case of Hb Newcastle in Spain.
CASE REPORT: 5 year-old girl who came to visit due to fever over 4 days. Physical examination
disclosed pale skin with subicteral mucosaes and splenomegaly. Lab analysis disclosed: Hb, 79
g/l; haematocrit, 0.27 l/l, mean corpuscular volume 93.4 fl, and reticulocyte count of 3%,
along with anysocytosis and polychromasia.
RESULTS: Hemoglobin heat stability test was positive. Hemoglobin electrophoresis showed a low
band at HbA2. High performance liquid chromatography (HPLC) showed an Hb peak corresponding to the 12% of total Hb. Beta globin gene sequentiation showed the CD92 His → Pro mutation Hb Newcastle in heterocygote condition in patient and her mother.
CONCLUSIONS: Hb Newcastle has been described in 3 patients of English, Russian and Chinese
origin. Clinical manifestation is chronic hemolytic anemia with severe crisis after oxidant drugs
ingestion or infections. By using the electrophoretic method, a diffuse pattern of Hb bands between HbA and HbA2 is observed, difficulting the precise identification of the abnormal Hb. This
inconvenience is overcomed by using HPLC that allows the clear identification of the abnormal
Hb Newcastle.
Key words: Haemoglobinopathies. Hemoglobin Newcastle. HPLC.
Correspondencia: Dra. M.M. Mañú Pereira.
Unitat d’Eritropatologia. CDB-IDIBAPS. Hospital Clínic. Universitat de Barcelona.
Villarroel, 170. 08036 Barcelona. España.
Correo electrónico: [email protected]
Recibido el 16-10-2007; aceptado para su publicación el 30-11-2007.
Las hemoglobinopatías inestables (HI)
obedecen a sustituciones de aminoácidos en lugares críticos de la molécula
de hemoglobina que disminuyen su solubilidad y facilitan la aparición de precipitados intraeritrocitarios (cuerpos de
Heinz). Hasta la actualidad se han descrito unas 150 HI, la mayoría de las
cuales cursan con anemia hemolítica
crónica de intensidad variable y crisis de
agudización tras la ingesta de medicamentos oxidantes1. Una característica
de este grupo de hemoglobinopatías es
la elevada frecuencia de mutaciones espontáneas y su transmisión hereditaria
de carácter autosómico dominante, lo
que explica que no haya formas homocigotas, muy probablemente incompatibles con la vida.
La HI más frecuente y primeramente
descrita es la hemoglobina (Hb) Köln
(␤98 Val → Met), distribuida por toda la
geografía mundial pero con elevada incidencia en España, donde la primera descripción fue realizada por nuestro grupo
en 19752. Le siguen en frecuencia la Hb
Hammersmith (␤42 Phe → Ser) y la
Hb Génova (␤28 Leu → Pro), con un cuadro clínico de hemólisis y anemia intensas, y la Hb Zúrich (␣2 142 Stop → His),
prácticamente asintomática. En nuestro
país, el primer caso de HI sin identificar
fue publicado por Espinós3 en 1972, y la
primera caracterización molecular por
Outeiriño et al4, en 1974, con el nombre
de Hb Madrid (␤115 Ala → Pro). A partir de 1975 se han identificado otras HI,
algunas ya descritas como la Hb Indianápolis5, y otras inéditas como la Hb Castilla
(␤32 Leu → Arg)6, Hb Las Palmas (␣2
␤2 [49][CD8] Ser → Phe)7 y Hb Extremadura (␣2 ␤ 2133 [H11] Val → Leu)8.
Aunque para la identificación de este tipo
de hemoglobinopatías se ha venido empleando la electroforesis en diferentes soportes y valores de pH, este procedimiento presenta 2 inconvenientes: por un
lado, sólo es útil cuando la HI posee una
carga superficial diferente de la de la
HbA, y por otro, la propia inestabilidad
molecular de la HI genera la aparición de
más de un fragmento o banda de Hb
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MAÑÚ PEREIRA MM ET AL. HEMOGLOBINOPATÍA NEWCASTLE: UTILIDAD DE LA CROMATOGRAFÍA Y DESCRIPCIÓN DEL PRIMER CASO EN ESPAÑA
TABLA 1
Secuencia de oligonucleótidos
utilizados para secuenciar el gen
de la cadena betaglobina
Exón
Oligonucleótido
1
A 5’CATCTATTGCTTACATTTGCTTCT3’
B 5’GTCTCCACATGCCCAGTTTCTAT 3’
C 5’CTCTTGGGTTCGATAGGCACTG3’
D 5’AAGAAGGGGAAAGAAAACATCAAG3’
E 5’ AAGGCTGGATTATTCTGA 3’
F 5’ TGCACTGACCTCCCACAT 3’
2
3
desnaturalizada, que da lugar a una imagen difusa o mal definida, situada entre
las fracciones normales HbA y HbA2, que
a veces puede pasar inadvertida9.
En 1975 Finney et al10 realizaron la primera descripción de Hb Newcastle, y
desde entonces sólo aparecen en la literatura médica 2 nuevos casos, publicados por Molchanova et al11 en 1999 y
Wing y Edmond12 en 2005, lo que demuestra su escasa incidencia o las dificultades inherentes al procedimiento
diagnóstico empleado. Mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
en una paciente afectada de síndrome
hemolítico crónico se ha identificado el
primer caso de Hb Newcastle (␤92 His
→ Pro) en España, lo que, además de
demostrar que esta hemoglobinopatía
también puede hallarse en nuestro país,
ha permitido analizar la eficacia de la
HPLC en el diagnóstico diferencial de
las HI.
Caso clínico
Niña de 5 años de edad, natural de Cataluña, que
ingresó por fiebre de 4 días de evolución. En la exploración física se observaban palidez cutánea y
mucosa, subictericia generalizada y esplenomegalia
de 7 cm. El examen de sangre evidenció anemia
normocítica (Hb, 82 g/l; volumen corpuscular medio, 93,4 fl) e intensamente regenerativa (reticulocitos; 246,2 ⫻ 109/l), con leucocitos y plaquetas normales, y sinalteraciones morfológicas que hicieran
sospechar un defecto de membrana eritrocitaria.
Como antecedente de interés destacaba que la madre tenía historia de episodios ictéricos de repetición desde la infancia y esplenomegalia, y a los 22
años se le diagnosticó de HI con motivo de una crisis de eritroblastopenia después de un proceso febril. Una vez establecido el diagnóstico se le realizó
una esplenectomía.
Exámenes hematológicos generales
Empleando sangre con heparina y ácido edético se
llevó a cabo un perfil hematológico básico y un estudio de Hb en la paciente y sus padres mediante
electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino y
ácido, y mediante HPLC (BioRad, Hercules, California, EE.UU.). Para las pruebas de la antiglobulina
directa (Coombs), estabilidad térmica de la Hb y actividades de enzimas eritrocitarias, practicadas únicamente en la paciente, se emplearon métodos
convencionales9.
Estudio molecular
En la paciente y su madre el ADN se extrajo a partir
de sangre tratada con ácido edético mediante 100 µl
de Chelex® (Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.).
Mediante procedimientos previamente descritos9 se
descartó la posible coexistencia de las mutaciones al-
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Fig. 1. Electroforesis en agarosa, pH de 8,6. Carril 1: control hemoglobina (Hb) S y HbA. Carril 2: madre del
probando. Carril 3: probando. Carril 4: Hb Köln.
TABLA 2
Valores hematológicos
Hb (g/l)
Hematocrito (%)
VCM (fl)
88
114
135
31
40
41
90,7
111,5
87,3
Paciente
Madre
Padre
CHCM (g/l) Reticulocitos (%)
287
284
327
7,3
3,2
1
HbF (%)
12
2,3
< 0,5
HbA2 (%)
Hb NC (%)
3,4
0,5
3,2
12,2
7,1
–
CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media; Hb: hemoglobina; VCM: volumen corpuscular medio.
fatalasemia –3,7 kb y delta-betatalasemia «Spanish»,
y la secuenciación del gen de la betaglobina se realizó en los 3 exones mediante los cebadores que se citan en la tabla 1. Las técnicas de reacción en cadena
de la polimerasa se llevaron a cabo a partir de un volumen reactivo final de 25 µl (10 µl de ADN, 0,65
pmol/µl de cada uno de los cebadores específicos
para cada exón, Ecotaq® tampón 1,5 mM MgCl, 0,25
mM dNTP, 2,5 U al 10% y Ecotaq®) y 35 ciclos (45 s
a 94 oC, 45 s a 57 oC y 45 s a 72 oC). Los productos
de la reacción en cadena de la polimerasa, fraccionados y visualizados en gel de agarosa al 1,2%, se purificaron y secuenciaron con el secuenciador automático ABI PRISM 377 DNA Sequencer.
ye entre la HbS y la HbC. Además se observaba también un 11,2% de Hb fetal.
En la madre se observó idéntico patrón
de Hb, excepto la Hb fetal, que fue de un
2,3%.
La secuenciación del gen de la betaglobina, realizada en la paciente y su madre,
mostró en ambas la presencia de una
mutación ␤ 92 A → C (His → Pro) en estado heterocigoto correspondiente a la
Hb Newcastle (fig. 3).
Discusión
Resultados
Los estudios hematológicos generales y
de Hb practicados a la paciente y ambos
padres se resumen en la tabla 2. La
prueba de la estabilidad térmica de la Hb
realizada a la paciente resultó positiva, al
igual que la prueba de la formación espontánea de cuerpos de Heinz después
de incubación de los eritrocitos mediante
azul de cresilo brillante. El estudio de las
enzimas eritrocitarias mostró un moderado aumento de algunas de ellas debido a
la reticulocitosis, mientras que el análisis
de Hb mediante electroforesis a pH alcalino evidenció, en la paciente, un arrastre
muy difuso y tenue, apenas perceptible,
entre las fracciones normales HbA y
HbA2 (fig. 1). Mediante HPLC el cromatograma de la paciente mostró un tiempo
de retención diferente del observado en
las Hb normales y en la Hb Köln (fig. 2).
El cromatograma de la paciente se caracterizaba por presentar un pico correspondiente a un 12% del total de Hb que elu-
Las HI son una causa poco frecuente de
anemia hemolítica hereditaria. Su distribución geográfica es muy amplia y, a
pesar de su rareza, en nuestro medio
no constituyen un hallazgo excepcional.
Desde 1972, cuando se describió por vez
primera una HI en España, se han identificado otras varias, muchas de ellas ya
identificadas con anterioridad pero cuya
incidencia en España era desconocida.
Su existencia muchas veces pasa inadvertida porque la anemia hemolítica no
suele ser muy intensa, excepto cuando el
paciente entra en contacto con un medicamento de acción oxidante potente (sulfamidas, ácido acetilsalicílico, entre otros)
o tiene un proceso febril, o durante el
embarazo en el caso de las mujeres. Por
ello el diagnóstico no suele realizarse
hasta que la hemólisis se hace evidente
después del contacto con el factor desencadenante. Al igual que en el déficit
de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
aparece una crisis de hemólisis aguda,
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MAÑÚ PEREIRA MM ET AL. HEMOGLOBINOPATÍA NEWCASTLE: UTILIDAD DE LA CROMATOGRAFÍA Y DESCRIPCIÓN DEL PRIMER CASO EN ESPAÑA
generalmente intensa, que suele acompañarse de hemoglobinuria (orinas oscuras). Más rara vez el diagnóstico de HI se
ha establecido después de una crisis de
eritroblastopenia aguda inducida por parvovirus humano B19, aunque no parece
que esta incidencia sea superior a la observada para otras formas de anemia hemolítica crónica1. Por las razones indicadas, quienes presentan HI no requieren
tratamiento, pero, al igual que en el déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
deben evitar en lo posible el contacto con
agentes oxidantes y situaciones de estrés. En caso de anemia hemolítica crónica muy intensa y necesidad de transfusiones, es aconsejable la práctica de una
esplenectomía, que mejora el cuadro clínico en aproximadamente un 50% de los
casos.
Para establecer el diagnóstico de HI se
requiere la prueba de la estabilidad térmica de la Hb inducida por el calor, que
consiste en incubar el hemolizado durante 2 h a 50 oC y demostrar que éste pierde transparencia debido a la formación
de un precipitado hemoglobínico. Esta
prueba puede complementarse con la
demostración de la formación de cuerpos
de Heinz espontáneos, únicamente visibles después de la esplenectomía. Cuando la Hb inestable se acompaña de una
alteración de carga superficial, puede a
veces ponerse de manifiesto mediante la
clásica electroforesis de Hb. No obstante,
al tratarse de Hb inestables, lo más común es que no se observe una fracción o
banda de migración bien definida, sino
arrastre difuminado por detrás de la HbA
normal, a veces imperceptible, lo que dificulta el diagnóstico9. Por ello, para una
identificación más precisa de estas hemoglobinopatías en la práctica clínica es
imprescindible recurrir a otros procedimientos. Durante los últimos años uno de
los procedimientos de uso más extendido
es la HPLC, cuya elevada sensibilidad y
especificidad permite identificar, en la
mayoría de los casos, el tipo de Hb inestable estudiada.
Además de las HI, la HPLC ofrece patrones de elución característicos que permiten identificar muchas otras Hb patológicas con sólo la comparación de aquéllos
entre sí. Prueba de ello es el resultado
del presente estudio, que ha servido para
definir el patrón cromatográfico característico de la Hb Newcastle, desconocido
hasta la actualidad. Este patrón no sólo
ha permitido identificar la Hb Newcastle
como causa de anemia hemolítica en
nuestra paciente, sino también establecer el diagnóstico diferencial con otras
hemoglobinopatías, especialmente inestables, también descritas en nuestro país,
como, por ejemplo, la Hb Köln.
La Hb Newcastle se debe a una mutación en el nucleótido 278 del gen de la
Reactivo ID
%
F
Desconocido 1
P3
Ao
A2
Desconocido 2
Tiempo
12.2
2.7
2.2
68.3
3.3
11.1
1.22
1.38
1.78
2.58
3.69
4.69
12.2%
Reactivo ID
%
F
Desconocido 1
P3
Ao
A2
Desconocido 2
C-Window
2048923
Área total
F
Área
257113
55482
45344
1402259
61045
227680
A2
3.3%
30%
A
F
Tiempo
1.3
2.5
2.6
75.9
3.6
4.6
9,7
Área total
1.3%
1.16
1.40
1.76
2.51
3.70
4.66
4.93
Área
36668
65818
69149
2017926
86078
121962
256865
2654466
A2
3.6%
B
30%
20%
20%
F
10%
10%
A2
A2
F
0
0
0
1
2
3
4
5
6
0
1
2
3
4
5
6
Fig. 2. Cromatografía líquida de alta resolución. A: probando; B: hemoglobina Köln.
Fig. 3. Secuenciación directa: CAC → CCC. A: probando; B: madre del probando.
cadena de la betaglobina por sustitución
A → C, cuya consecuencia es un cambio
del aminoácido histidina (His) por la prolina (Pro) en la región de contacto del
grupo hemo. Esto da lugar a la pérdida
de este grupo y a la desnaturalización espontánea de la Hb, que precipita en el
interior del eritrocito y da lugar a la formación de precipitados o cuerpos de
Heinz. Esta hemoglobinopatía se identificó por primera vez en un paciente de
origen anglosajón10; 22 años después
se identificó en un paciente de origen
ruso11, y recientemente, en 2005, en una
paciente de origen chino12, lo que hace
suponer que su distribución geográfica
es amplia.
El interés del presente estudio reside no
sólo en el hecho de haber detectado por
vez primera la presencia de Hb Newcastle en individuos del sur de Europa, sino
también en la posibilidad de definir su
perfil cromatográfico característico, lo
que permitirá su diagnóstico diferencial
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en la práctica clínica. Es muy probable
que con esta información se facilite también el hallazgo de nuevos casos de Hb
Newcastle sin necesidad de recurrir al
estudio molecular, y con ello se contribuya al mejor conocimiento de sus aspectos
clínicos y epidemiológicos.
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