Detección y caracterización molecular de microorganismos

Detección y caracterización molecular de
microorganismos
Aplicaciones de las técnicas moleculares
Detección e identificación (cuantitativa) del microorganismo
(especialmente útil en aquellos de crecimiento “fastidioso” o
que se encuentren en pequeñas cantidades en la muestra).
• Gran estabilidad del ADN
• Posibilidad de determinar la presencia/ ausencia de gran número
de microorganismos (simultáneamente).
• Muy rádido. Muy eficaz. Alta sensibilidad. Alta especificidad.
PCR CUANTITATIVA
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A GG T A C T G
94ºC
TC CATGAC
AG GTACTG
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A G G T A C T G
56ºC
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
AG C C G
Q
F
CAT G CA AT CA
TC CAT
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A G G T A C T G
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
AG C C G
Q
F
CAT G CA AT CA
TC CAT
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A G G T A C T G
72ºC
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
AG C C G T
P
Q
F
CAT G CA AT CA
P
G TC CAT
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A G G T A C T G
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
AG C C G TA AA G C G G TA C
P
F
Q
CAT
G C A A T C A A A A G TC C A T
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A G G T A C T G
P
A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C
A G C C G T A A A G C G G T A C G T T A G T T T T C A G G TA
F
Q
CAT G CA AT CA
T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G TC C A T
T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A G G T A C T G
CURVAS PATRÓN Y REAL TIME C. COLI (FAM)
PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490
Well Identifier
Ct
A01
A02
A03
A04
A05
A06
B01
B02
B03
B04
B05
B06
C01
C02
C03
C04
C05
C06
D01
D02
D03
D04
D05
D06
E01
E02
E03
F01
F02
F03
G01
G02
G03
H01
H02
H03
1
muestra 1 +
10-1
muestra 2+
10-2
muestra 3+
10-3
muestra NEGATIVA
10-4
10-5
10-6
blanco
23,4
22,9
22,8
24,4
24,6
24,1
26,6
26,5
26,9
19,2
19,2
19,4
30
30,7
30,4
31,6
31,6
31,3
34
33,6
33,3
N/A
N/A
N/A
37,3
37
37,2
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
Blanco
muestra 1 +
muestra 2 +
muestra 3 +
muestra NEGATIVA
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
Permite la identificación del microorganismo.
Permite diferenciar cepas. Aplicación en estudios de distribución,
epidemiología, etc.
Permite conocer las características del microorganismo (virulencia,
resistencia a antibióticos, etc).
•
•
•
•
Serotipificación por PCR
MLST (multi locus sequence typing)
VNTRs (variable number tandem repeats)
microarrays
SEROTIPIFICACIÓN MOLECULAR DE SALMONELLA (antígeno O)
ANTIGENO O SALMONELLA MULTIPLEX PCR
D1 + sdf
D1 + sdf
E1
D1
E1
C1
C1
C1 341 pb
D1/A 624 pb
sdf 293 pb
E1/4 283 pb
B 561 pb
C2 397 pb
C1
B
C1 C2
1. marcador
2. C1
3. D1 + sdf
4. D1 + sdf
5. C1
6. E1/4
7. D1 + sdf enteriti
8. B typhimurium
9. E1/4 meleagridis
10. C1 Mbandaka
11. C2 Hadar
12. D1 panama
13. C1 virchow
14. C1 infantis
MLST: comparación de secuencias de genes conservados (housekeeping)
VNTRs (variable number tandem repeats)
CEPA 1
TTCTGTTACGCGTAATGGTCATGGTCATGGTCATGGTCATGGTCGATCCATTGCATT
CEPA 2
TTCTGTTACGCGTAATGGTCATGGTCATGGTCGATCCATTGCATT
MICROARRAYS
TTGTTCATG
AACAAGTAC
GEN VIR1
GEN VIR2
ADN bacteria crecida en medio no estresante
AATTGGCGGC
TTAACCGCCG
ADN bacteria crecida en medio estresante
GEN VIR3
GEN VIR4
GEN VIR5
GEN VIR6