posibilidades diagnósticas de la citometría de flujo

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Info 04 / 2016
POSIBILIDADES DIAGNÓSTICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
MEDIANTE FACS
La técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia conocida como FACS
por sus siglas en inglés fluorescence activated cell sorting, es un tipo especial de citometría de flujo que permite medir y analizar células marcadas con fluorescencia.
El paso por un rayo láser de las células circulantes en una corriente de líquido, permite determinar el tamaño celular, su estructura interna y la intensidad relativa de la fluorescencia
emitida. Esta técnica se ha descrito en numerosos tipos de células, particularmente linfocitos. A día de hoy hay disponibles anticuerpos
marcados con fluorescencia que reconocen
el inmufenotipo del cúmulo de diferenciación
(CD, por sus siglas en inglés cluster of differentiation). Estos marcadores CD permiten
analizar las células e identificarlas. Así por
ejemplo los linfocitos T citotóxicos son CD3 y
CD8 positivos, y CD21 y CD4 negativos.
Este análisis se realiza de forma rutinaria en
nuestro departamento de hematología. Debido a que la muestra debe estar en su forma
líquida, las muestras de sangre son especialmente adecuadas. Para poder garantizar un
resultado significativo es importante que las
células estén intactas, por lo tanto el análisis
debe realizarse tan pronto como sea posible,
siendo el plazo máximo de 3 días.
En LABOKLIN el equipo de FACS es utilizado
para diferentes análisis, entre los que encontramos el análisis de anticuerpos antiplaquetarios, el estado inmunitario y la diferenciación
de leucemia (inmunofenotipo).
ANTICUERPOS ANTIPLAQUETARIOS
Como resultado del aumento de la presencia
de inmunoglobulinas (principalmente IgG) en
la superficie de las plaquetas, se produce la
fagocitosis de las plaquetas por los macrófagos dando lugar a una trombocitopenia. Esta
trombocitopenia inmunomediada (IMT) puede
ser primaria o secundaria. La forma primaria,
observada raramente, es causada por autoanticuerpos específicos contra los epítopos de
las plaquetas. La trombocitopenia inmunomediada secundaria, sin embargo, se asocia con
diversos fármacos, agentes infecciosos (bacterias, virus, protozoos o nematodos), neoplasias y otras enfermedades autoinmunes.
La forma primaria se observa principalmente
en perros, siendo dos veces más frecuente
en hembras. Animales de todas las edades
se pueden ver afectados pero es más común
en los de mediana edad. Algunas razas tales
como cocker spaniel, caniche miniatura, caniche enano, bobtail, golden retriever y pastor
alemán se han descrito como razas predispuestas.
En la forma primaria el recuento plaquetario
es por lo general menor a 30 G/L, significativamente menor que en la forma secundaria.
El diagnostico mediante FACS permite la
identificación de anticuerpos antiplaquetarios. Para ello se realiza una incubación doble
que permite detectar las IgG presentes en la
superficie de las plaquetas. Un nivel de anticuerpos menor al 15% se considera negativo,
mientras que un nivel mayor al 30% es considerado positivo a trombocitopenia inmunomediada.
Para que la inmunotinción sea evaluable, la
muestra necesaria (sangre entera en EDTA)
no debe tener más de tres días. El análisis
debe iniciarse antes del inicio de la terapia
inmunosupresora con el fin de evitar falsos
negativos. Otra posibilidad diagnóstica es el
tratamiento con cortisona y la identificación de
hiperplasia megacariocítica en médula ósea.
ESTADO INMUNITARIO
El análisis del estado inmunitario incluye un
hemograma completo así como el recuento
absoluto y relativo de los linfocitos periféricos:
LABOKLIN · LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLÍNICO VETERINARIO
Steubenstraße 4 · 97688 Bad Kissingen · Tel.: +34 644 030 557 • [email protected] • www.laboklin.es
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células B, células T total, CD4+ (T colaboradores) y células CD8+ (T citotóxicas).
El inmunofenotipaje se basa en la identificación selectiva de antígenos de superficie por
anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia usando citometría de flujo (FACS).
Este análisis se recomienda en casos de sospecha de inmunodeficiencia primaria o secundaria.
En perros, el análisis del sistema inmunitario
contribuye al diagnóstico de pioderma, demodicosis, lupus eritematoso sistémico, leishmaniosis e inmunodeficiencia congénita de
células T. Análisis de seguimiento se pueden
utilizar para el control de tratamientos farmacológicos o para ajustes de dosis.
En caballos, este análisis contribuye al diagnóstico de infecciones frecuentes y prolongadas.
En gatos, este análisis presenta una importancia especial en las infecciones causadas
por el virus de la inmunodeficiencia felina
(FIV) ya que permite determinar el estado inmunológico del animal. Esta enfermedad cursa de forma crónica, persistente y progresiva.
La infección de las células del sistema inmune
se produce de forma progresiva, resultando
gradualmente en el agotamiento del sistema
inmunitario. El virus muestra un tropismo claro por los linfocitos T y los macrófagos. Principalmente afecta a la función de los linfocitos
T, predominando las alteraciones cuantitativas y cualitativas de la población de células T
colaboradoras. En primer lugar se produce un
aumento de las células CD8+, que conduce a
una caída porcentual en el número de células
CD4+. El número de células CD8+ se mantiene alto durante el periodo asintomático de
la infección, y disminuye relativamente rápido
antes de que aparezcan síntomas clínicos. Al
inicio de la infección las células CD4+ se ven
principalmente infectadas, encontrándose en
este momento la mayor carga vírica. Cuando
la infección progresa, se produce una pérdida absoluta de células CD4+, resultando en
una disminución en el cociente CD4+/CD8+.
La respuesta inmune humoral se ve afectada
relativamente tarde en su función, viéndose
una disminución en el número de células B
generalmente sólo en la etapa final. La carga
vírica en sangre incrementa de nuevo de ma-
nera significativa pero sin respuesta de anticuerpos.
Por tanto, el análisis del estado inmunitario
puede proporcionar una estimación del pronóstico en casos de inmunodeficiencia primaria o secundaria.
DIFERENCIACIÓN DE LEUCEMIA: INMUNOFENOTIPIFICACIÓN
Tanto en una linfocitosis mayor a 30 G/l como
en el caso de una enfermedad linfoproliferativa
(leucemia, linfoma estadio V), con un recuento leucocitario mínimo mayor a 5 G/l y confirmada mediante la técnica de clonalidad (PCR
Antigen Receptor Rearrengement, PARR), es
posible llevar a cabo una diferenciación de la
enfermedad linfoproliferativa mediante FACS.
Mediante el uso de un marcador-CD es posible identificar las células y diferenciar entre
leucemia aguda o crónica (CD34: marcador
células madre), lo cual es importante para el
pronóstico y las opciones terapéuticas del animal. Además, es posible diferenciar las células neoplásicas en linfocitos B y T, así como
dividirlas en subtipos.
La diferenciación de leucemia mieloide por
FACS también es posible en LABOKLIN y
se puede aplicar particularmente en el caso
de que existan blastos y células monocíticas
atípicas. El diagnóstico de leucemia mieloide aguda se realiza también con el marcador
CD34. Al igual que la forma linfoide, la leucemia mieloide aguda presenta un mal pronóstico (supervivencia menor a seis meses).
Debido a que el análisis de PARR se limita a
trastornos linfoproliferativos, la diferenciación
de leucemia por FACS representa la única posibilidad poca invasiva para el diagnóstico en
sangre periférica de leucemias mieloides.
En el caso de que existan reacciones leucemioides, las cuales son aquellas cuyo recuento leucocitario es mayor a 50 G/l y en las
que se observa monocitosis, neutrofilia y desviación a la izquierda severa, se recomienda
realizar un examen clínico exhaustivo que
permita confirmar o descartar una infección
piógena (por ejemplo piotórax, piometra o
peritonitis), una enfermedad inmunomediada
(por ejemplo glomerulonefritis, o anemia hemolítica inmunomediada), una neoplasia, una
necrosis o hiperestrogenismo.