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Revisión bibliográfica (parte I): actualidad en los estudios del canal BK
Los canales de potasio BK, conocidos por su alta conductancia como
Maxi-K, presentan en diversos tejidos diferencias notables en valores de
conductancia unitaria, como en la cinética de bloqueo, sensibilidad al calcio y
respuesta farmacológica. Son transcritos por empalme alternativo a partir del
gen slowpoke, identificado por primera vez en el fenotipo slowpoke de
Drosophila, lo que les confiere gran parte de la diversidad en comportamiento
electrofisiológico, además de la regulación celular interna via fosforilación de
zonas del canal.
Estos canales se pueden presentar formados sólo por subunidades, o
con la presencia adicional de las varias subunidades ss (Nimigeana, C.M. y
cols, 2000).
El canal presentaría dos estados uno abierto y otro cerrado, donde en
ambos podría presentarse unido el calcio aunque su union favorece la abertura
del canal (Piskorowski R. y Aldrich, R.W., 2002. Nature. 2002 Dec;420(6915):
499-502; Nimigeana, C.M. y cols, 2000; Miguel A. Valverde y cols, 1999).
El canal está conformado por una subunidad alfa formadora del poro
(segmentos S5 y S6) y una subunidad beta reguladora. La subunidad alfa es
un homotetrámero formado por seis segmentos transmembrana en cada uno
de los casos, con el segmento S4 como sensible a voltaje como en los demás
canales de potasio, pero con un sitio adicional obligatorio de unión a calcio en
cada unidad integradora del tetrámero. En la región S4 los residuos Arg-210
y Arg-213 estarían implicados en el bloqueo del canal (Diaz, 1998).
Existen descritas cuatro subunidades beta, siendo la de los canales BK
de músculo liso humano codificada por el gen hKCNMB1, que transcribe una
cadena de 191 residuos de aa de extensión.
Caracteriza al canal la presencia de las subunidades beta (de allí el
nombre de BK channel), que le confieren al canal sensibilidad a calcio, en
grado variable dependiendo del tipo de tejido donde se exprese, siendo ello la
segunda causa de la diversidad de características electrofisiológicas del canal,
campo de extensos estudios actuales que pretenden esclarecer, todos los
mecanismos y efectos del empalme de las subunidades en el funcionamiento
del canal.
Los canales BK exhiben una relación 1:1 en presencia de subunidades,
donde las subunidades beta1 como beta2 determinan una sensibilidad mayor
al calcio, influyendo en su apertura frente a valores de calcio presentes.
Se discute cuales serían las implicancias funcionales de que existan
canales sin esa relación de 1:1, lo que se considera igualmente probable
(Ying-Wei Wang, 2002. The Journal of Neuroscience, March 1, 2002,
22(5):1550-1561)
La apertura de los canales BK está mediada por el voltaje de
despolarización de la membrana y es estimulada por micromoles de calcio
intracelular, lo cual varía de acuerdo al tejido donde se exprese, provocando la
exportación de potasio desde el interior, hiperpolarizando la membrana (Cox,
http://www.nemc.org/mcri/Coxlab/ coxlab.htm).
Los canales pueden eso si
abrirse en ausencia total de calcio, pero se estima que el calcio juega un rol
importante en condiciones fisiológicas, de promover su apertura por un
mecanismo aun no descrito (Piskorowski R. y Aldrich, R.W., 2002. Nature.
2002 Dec;420(6915): 499-502).
La activación de los canales BK produce la exportación de potasio y la
hiperpolarización de la membana, lo que lleva al músculo liso al estado de
reposo debido a que ello ocasiona a su vez, el cierre de los canales de calcio
(Nimigeana, C.M. y cols, 2000).
A diferencia de otros canales-k dependientes de potencial, el extermo
COOH ocupa más de la mitad de la secuencia del canal BK y presenta al
menos una zona de atascamiento de calcio, mientras el extremo NH2 presenta
un séptimo segmento de transmembrana, que se considera regulador de la
subunidad ss (L. Toro y cols, 1998. News in Physiological Sciences, Vol. 13,
No. 3, 112-117, June 1998; Nimigeana, C.M. y cols, 2000).
Efecto del calcio en el canal
Un modelo de la intrincada relación del calcio con el canal, es el
resultado de un experimento (Christopher J. Lingle, ), del que se midió que en
ausencia de calcio, la apertura del canal, de acuerdo al parámetro de velocidad
de apertura de la mitad de los canales (Po 0,5), ocurre con un potencial de
membrana de 180 mV; mientras que en presencia de 70 micromoles de calcio,
la apertura ocurre en sólo 15 mV de voltaje de membrana. Esto significa que
la presencia de calcio representa una disminución en 165 mV de voltaje,
permitiendo así abrirse en un nivel más negativo de voltaje de membrana, o
bien facilitando su apertura en menos tiempo.
En cuanto a la zona del canal donde el calcio ejercería su principal
influencia activadora, durante algún tiempo se planteó que era el extremo
citoplasmático COOH terminal (dominio RCK y 'tazón fuente de calcio), pero un
estudio reciente señala que en ausencia de esa zona, el canal conserva la
sensibilidad al calcio comparada con aquella de los canales de tipo salvaje.
Este estudio concluye que esos dominios "no son necesarios para la apertura
calcio-activada de estos canales" (Piskorowski R. y Aldrich, R.W., 2002.
Nature. 2002 Dec 5;420(6915):499-502).
Actualmente se postula debe existir algún acomplamiento
configuracional, que haga transitar el canal entre un estado cerrado ('c' de
close) a un estado abierto ('o' de open), en el cual estaría implicado el sensor
de voltaje S4 del canal y en el cual el calcio realizaría su principal efecto
agonista, facilitando la apertura del canal (Horrigan FT, Aldrich RW., J Gen
Physiol. 2002 Sep;120(3):267-305;
http://www.jgp.org/cgi/content/full/120/3/261).
El calcio cambia la relación entre el estado bloqueado y el estado
conductor del canal, por tanto su efecto debiera necesariamente hacerse sentir
en el sensor de voltaje. Sin embargo este efecto es muy pequeño si el canal
se encuentra cerrado, así como de poca significación en el bloqueo rápido del
canal.
Los datos actuales señalan que el calcio facilita la apertura
del canal, en valores muy negativos de voltaje como -80 mV, en presencia de
70 microM de calcio, evaluado de acuerdo al incremento de la probabilidad de
apertura del canal que aumenta más de mil veces, demostrando que el calcio
opera donde el sensor de voltaje no puede hacerlo, debido a que no está
activado (Horrigan FT, Aldrich RW., J Gen Physiol. 2002 Sep;120(3):267305).
De lo anterior se deriva que es la energía de transición entre los estados
(c) y (o) la afectada en presencia de calcio, por una parte. También se
destaca que esta transición es compleja, considerando su voltaje-dependencia
y por tanto, el cambio configuracional dependería de una disminución de la
energía requerida para su realiello, la cual sería favorecida en presencia de
calcio por un gradiente que es complejo de establecer aun (Horrigan FT,
Aldrich RW., J Gen Physiol. 2002 Sep;120(3):267-305).
Otro valor de activación de V1/2, en presencia y ausencia de calcio (es
decir que involucran o no a la subunidad beta1), realizado en canales BK de
células lisas coronarias humanas, indica que en 18 microM de calcio ese valor
de activación ocurre alrededor de -85mV de membrana, mientras es un valor
muy bajo el que lo consigue a 0 mV de potencial.
También confirma la existencia e importancia de la subunidad beta para
esas células, como regulador del tono arterial y modulador del flujo de sangre
arterial (Tanaka y Meera, 1997; Journal of Physiology, vol. 502, edición 3 545557).
Subunidades beta
Las subunidades beta se localizan en las siguientes células: músculo liso
(beta1), donde aumentan la sensibilidad al calcio; células de tejidos del
ovario, útero, adrenal y cerebro (beta2 ), donde además del incremento de
sensibilidad al calcio, participa en la inactivation del canal; en vejiga (beta3),
participando en la inactivación rápida; en neuronas, modulando la sensibilidad
al calcio presente en concentraciones superiores (fig. nº 1).
Los genes que
dan origen a estas subunidades son: hKCNMB1 (beta1), hKCNMB2 (beta2),
hKCNMB3 (beta3), hKCNMB4 (beta4) (Brenner, sitio web).
En la subunidad beta2, si se emplea tripsina por el lado intracelular o
bien, se eliminan 19 residuos de aa de la zona N terminal, se suprime la
inactivación ocasionada por la bola y cadena.
También se han agregado esa
serie de residuos a la subunidad beta1, generando inactivación del canal, lo
que confirma el carácter de inactivación del extremo N terminal, en el caso de
la subunidad beta2 (Wallner, M. y cols, 1998. Journal of Physiology, Vol. 96,
Issue 7, 4137-4142, March 30, 1999). La acción global del gen hKCNMB2
puede ser descrita como retardar el bloqueo del canal y cambiar a valores más
negativos la voltaje dependencia del canal, como lo observado en células
cromafines de la glándula suprarrenal.
En cambio hKCNMB3 presenta
una activación leve del canal, mientras hKCNMB4 retarda la cinética
bloqueadora y modula la acción de calcio sólo cuando se presenta en alta
concentración, lo que corresponde con su localizacion extremo neuronal, en
zonas donde el calcio se incrementa para la liberación de vesículas con
neurotransmisores (Brenner, R., 2000. Jour Biol Chem, vol. 275, edición 9,
6453-6461; ). De esta forma la subunidad beta4, define el comienzo del
retorno al estado de reposo de la membrana neuronal, operando como un
"detector de umbral de calcio", reduciendo las aperturas del canal en presencia
de bajas concentraciones de calcio y aumentándolas en valores altos
(Brenner, R., sitio web oficial).
Cuando la subunidad beta1 (hKCNMB1) ha sido quitada en ratones
knock-out, ellos han expresado aumento en el tono vascular y en la presión
arterial, demostrando la importancia de esta subunidad en su control
(Brenner, R., sitio web).
Subunidad beta1
Los efectos de esta subunidad sobre el canal, pueden ser resumidos en
tres puntos: incremento de la sensibilidad al calcio; retarda la cinética de
activación en baja concentración de calcio exclusivamente; afecta la cinética
farmacológica.
De las cuatro subunidades beta mencionadas antes, beta1 y beta2
presentan las secuencias más conservadas entre sí, como también mayor
semejanza en su efecto fisiológico; mientras beta3 y beta4 son las más
distantes tanto con beta1 y beta2, como también entre ellas en secuencia y en
actividad biológica (Brenner, R. y cols, 2000. Biol Chem de J, el vol. 275, la
edición 9, 6453-6461, 2000; Cox DH, Aldrich RW, 2000, J Gen Physiol. 2000
Sep;116(3):411-32).
En la secuencia de beta1 existen dos segmentos de transmembrana
propuestos, de acuerdo al análisis de hidrofobicidad; cuatro residuos de
cisteína, en la región extracelular supuesta para formar puentes disulfuros,
siendo también la zona de afinidad para charybdotoxin, junto con un residuo
de lisina (K69 en bóvidos y K107 en subunidades beta2 humanas), región
conservada en todas las subunidades beta.
En esta región existen
residuos de L90, Y91, T93 y Q94.
Existe además un sitio de glicosilación
de alta conservación, en residuo nº 80.
Actualmente se sugiere que la modulación entre las subunidades beta y
la subunidad alfa, es dependiente de las variantes genéticas de esta última
(Brenner, R. y cols, 2000. Biol Chem de J, el vol. 275, la edición 9, 64536461, 2000).
Subunidad ss1
Se han descrito tres subunidades ss: ss1, ss2 y ss3, las cuales tendrían
una estructura de dos dominios transmembrana vinculados entre sí, por un
segmento extenso extracelular, S0 en caso de ss1. Su acción afecta el
bloqueo de subunidades de forma distinta. Ss1 aumentaría la sensibilidad al
calcio, alcanzándose valores de Po con menos calcio presente; ss3
ocasionaría el tipo de bloqueo que se observa en los canales BK presentes en
células cromafines;
La cinética del canal BK de acuerdo al modelo de Monod-wymanchangeux para proteinas tetraméricas ligando inducidas, predice la existencia
de dos estados en el canal: un estado abierto y un estado cerrado, en
ausencia de calcio. Sin embargo los datos que provienen de los estudios de
esta subunidad, refieren la existencia de múltiples estados como ser:
dos a tres estados abiertos por los que el canal transita y unos tres a cinco
estados cerrados, siendo un tema complejo de abordar actualmente
(Nimigeana, C.M. y cols, 2000. Journal of Physiology, v 115 nº 6, 719-736,
junio 1 del 2000).
La subunidad ss1 aumentaría la sensibilidad al calcio directamente, en
un valor de un 20% del parámetro Po ante un aumento de concentración de
calcio, mientras el aumento independiente del efecto directo del calcio, sería
de un 80% de Po. En relación a esto se sugiere por Nimigeana y cols (2000),
que el efecto principal de la subunidad ss1 está en modificar "las barreras de
la energía de las transiciones independientes de calcio", ocasionando una
estabilización los estados activos del canal, entre un rango de potenciales de
membrana de +30 a +199 mV (Nimigeana, C.M. y cols, 2000).
El efecto del calcio expresado en términos de las subunidades ss, se
puede referir como efecto interruptor que aproxima a la subunidad ss1 con las
otras subunidades, permitiendo que el valor de Po se obtenga en presencia de
menores valores de calcio.
El valor de Po aumenta en forma poco
significativa, en presencia de concentraciones de calcio dentro del rango
0,0002 a 0,004, en cambio el aumento de veinte veces de Po que ocurre con
valores de calcio de 0,02 a 0,04 tiene mayor importancia fisiológica.
La subunidad ss1 cambia de lugar el parámetro Po en la curva contra
concentración de calcio, hacia la izquierda, lo que se asocia a un incremento
en la sensibilidad a calcio o bien, que menos concentración de calcio ejerce
igual efecto reflejado en el valor de Po.
Ahora, los valores de calcio donde la subunidad ss1 afecta el bloqueo del
canal, son superiores a 0,1 microM (Nimigeana, C.M. y cols, 2000).
Una pregunta que queda por resolver aun, es si el efecto de la subunidad ss1
en ausencia de calcio, es dependiente o no del voltaje.
Una animación virtual de apertura del canal (ADO De Cox, Cui J, Aldrich
RW, GEN Physiol, 110:257-281, 1997 De J), se encuentra aquí:
http://www.iii21.sk/Animation1.html
Mutaciones en el canal BK
En presencia de despolarizaciones prolongadas, la inactivación lenta
conocida como tipo-C ó tipo-P (de poro) permite a los canales iónicos ser no
conductores, estando ella asociada a un cambio configuracional de las
subunidades del canal, relacionado al cambio ocurrido desde el lado externo
del poro.
Se le considera asociada a los residuos S5, P y S6, siendo
una interpretación biofísica de él, un cambio operado a nivel de la dependencia
del voltaje del movimiento de cargas (hacia valores más negativos); señalada
también como inmovilización de la carga o bien, conversión de la carga.
El
cambio operaría a nivel de la conformación de la proteina (Olcese, R. y cols,
2000).
La inactivación rápida tipo-N del canal se suprimió al eliminar los
residuos D 6-46 del extremo N terminal en Sh-sh-IR, ocasionando una
inactivación ahora lenta durante depolarizaciones prolongadas (Olcese, R. y
cols, 2000).
Las mutaciones T449V-I470C a su vez generan un canal que no inactiva
(mutante Sh-IR-T449V-I470C), al eliminar la inactivación lenta, aunque
continua como conductor existiendo además datos, que sugieren que
mantiene cambios configuracionales propios de la inactivación lenta,
expresada durante ella. Al suprimirse la inactivación rápida del canal, se
expresó inactivación lenta en despolarizaciones largas.
Además existe la sospecha de que en este mutante Sh-IR-T449VI470C ha surgido un nuevo estado abierto, que se expresa en
despolarizaciones prolongadas, que podría corresponder a un anterior estado
de inactivación lenta del canal Sh-sh-IR, que llegó a ser conductor en el doble
mutante (Olcese, R. y cols, 2000;
http://www.jgp.org/cgi/content/full/117/2/149).
El efecto de la mutación doble T449V-I470C podría operar a nivel de la
cinética de apertura y cierre del canal, aunque se observa en una
depolarización larga, una estabilización del canal en menor nivel de
conductancia, estimada para Sh-sh-IR en 17 picosegundos y para T449v-i470c
en 9 picosegundos.
En depolarizaciones breves sin embargo, no se observa diferencia en la
cinética y voltaje dependencia entre el canal Sh-sh-IR y el mutante Sh-IRT449V-I470C; en cambio en un valor de 130mV, el mutante presentó una más
reducida probabilidad de abertura, comprando con Sh-sh-IR.
El análisis de POLI entrega la probabilidad de que un canal permanezca
en estado abierto durante cierto tiempo, después de haberlo estado en el
momento de referencia.
La constante del tiempo del decaimiento del POLI
en Sh-IR-T449VI470C aumenta al incrementar el tiempo de la referencia, en
contraste con los cambios menores que presenta Sh-sh-IR, que posee sólo un
estado abierto durante la activación y que presenta inactivación lenta.
Una explicación tentativa para el resultado anterior en el doble mutante,
sería que junto con la presencia de un nuevo estado abierto se presentaría
otro estado de bloqueo del canal.
Estos autores sugieren que así como el canal Sh-sh-IR expresa una
inactivación lenta, el doble mutante expresa al menos un nuevo estado abierto
que se haría presente en 245 mV.
Expuestos globalmente, los resultados de este diverso estudio
demuestran cómo un estado originalmente no conductor del canal Sh-sh-IR,
se transforma en otro estado ahora conductor, lo cual se ajustó a los
resultados obtenidos mediante simulación (Olcese, R. y cols, 2000).
Temas pendiente: sensor de voltaje; subunidad beta1; subunidades ss; efecto
de 17-estradiol.
Glosario de términos electrofisiológicos
Extraído de: Manual de Neurociencia, Delgado, 1998
Activación: transición desde el estado cerrado al estado abierto en un canal.
Bloqueo de un canal: oclusión del poro de un canal que produce una
reducción de la conductancia, sin afectar necesariamente la probabilidad de
apertura.
Canal iónico:
proteína intrínseca de membrana que permite el flujo de
iones entre el exterior y el interior de la célula..
Canal iónico activado por voltaje: canal iónico cuya probabilidad de apertura
está regulada por el potencial de membrana.
Canal de reposo o pasivo: canal iónico que se encuentra permanentemente
abierto.
Conductancia (g): es la inversa de la resistencia y representa una medida de
la facilidad con que los iones fluyen a través de un canal. Es una relación de
proporcionalidad entre la corriente iónica que ataviesa un canal y la magnitud
de la fuerza electromotriz. Su unidad es el Siemens.
Corriente (f): flujo neto de carga por unidad de tiempo.
Corriente capacitiva (Ic): corriente transmitida por iones que cambian la
carga eléctrica neta, acumulada en la membrana celular.
Corriente iónica (Ii): corriente transmitida por iones que fluyen a través de
los canales iónicos. También llamada corriente resistiva.
Corriente de pérdida (leakage) (If): corriente constante que fluye a través de
los canales iónicos de reposo. También se denomina 'de fuga'.
Desensibilización: reducción progresiva de la corriente iónica en un canal
activado por ligando, causada por la unión del propio agonista. Es un
proceso análogo a la inactivación de los canales dependientes de voltaje.
Despolarización:
disminución del potencial de membrana de una célula.
Estados de subconductancia: cada uno de los niveles de conductancia de un
canal que presenta múltiples estados abiertos.
Filtro de selectividad: región interna de los canales ionicos, que determina la
selectividad iónica del canal.
Flujo neto: suma de los flujos de entrada y salida de todos los iones
permeantes.
La entrada de aniones es equivalente, en términos eléctricos, a la salida de
cationes. Al potencial de reversión el flujo neto es cero.
Fuerza motriz: diferencia neta entre el potencial de la membrana y el
potencial de equilibrio del ion permeante.
Gradiente electroquímico: diferencia de concentración y potencial entre el
interior y el exterior de la célula.
Hiperpolarización: incremento del potencial de membrana de la célula.
Inactivación: transición hacia un estado no conductivo, en presencia de las
condiciones que favorecen la activación del canal.
Ion: un átomo o una molécula que tiene carga. Los principales iones que se
encuentran en el interior o el exterior de la célula son el potasio, el sodio, el
cloro, el calcio y el magnesio, además de iones orgánicos tales como los
aminoácidos.
Ligando: sustancia que se une a un receptor. Generalmente se refiere a una
hormona o aun neurotransmisor.
Potencial de membrana en reposo (Vm): en este potencial la célula está en
un equilibrio dinámico en el que la energía metabólica es utilizada, por la
bomba sodio-potasio para mantener los gradientes de los iones, en el interior
y exterior de la membrana celular.
Potencial de equilibrio de un ion: valor del potencial de membrana que
equilibra exactamente el flujo iónico debido a la diferencia de concentración de
un ion.
Se calcula a partir de la ecuación de Nerst.
Potencial de reversión: valor del potencial de membrana al cual las corrientes
de entrada y salida son de la misma magnitud, de modo que el flujo neto es
cero.
Resistencia (R): la inversa de la conductancia.
Su unidad es el ohmio.
Selectividad: proceso por el cual los canales seleccionan el ion que dejan
pasar por el poro.
Sensor de voltaje: región de los canales dependientes de voltaje, que sensa
los cambios de potencial de membrana y los transduce en cambios
conformacionales del canal.
El sensor de voltaje debe estar sometido a la
diferencia de potencial entre el interior y el exterior de la célula y, por tanto,
situarse en la membrana.
Técnica del Patch-clamp (fijación de membrana): método para registrar la
actividad eléctrica celular o de pequeños segmentos de membrana, tras
formar un apretado sello entre el electrodo y la membrana.
Técnica de voltaje-clamp (fijación de voltaje): un artificio experimental para
evitar la influencia del potencial de membrana, en la apertura y cierre de los
canales activados por voltaje.
Con esta técnica puede obtenerse una
medida directa de la corriente de membrana, registrando la corriente que tiene
que generar el estabilizador de voltaje (clamp), para impedir que cambie el
potencial de membrana.
Vestíbulo del canal: región que flanquea el poro del canal y que puede
contribuir a la selectividad iónica.