iii-131 - Ingeniero Ambiental

XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental
III-131 - AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
HIDROCARBUROLÍTICAS PROVENIENTES DE UN SUELO SOMETIDO A
BIORREMEDIACIÓN
María Gabriela Altamirano(1)
Licenciada en Ciencias Biológicas. Becaria de Pefeccionamiento (UNC) y ASD de la
Cátedra de Microbiología. Insituto Universitario en Ciencias de la Salud de la
Universidad Nacional del Comahue.
María Graciela Pozzo Ardizzi
Lic. en Química. Ms S. en Ciencias del Suelo.
FOTOGRAFIA
NÃO
DISPONÍVEL
Dirección(1): Buenos Aires 1400 - Neuquén - CP 8300 - Provincia de Neuqén - Argentina
- Tel: (54) 99-4490376 - e-mail: [email protected]
RESUMEN
En el presente trabajo se identificaron seis especies bacterianas: Pseudomonas vesicularis, Sphingomonas
paucimobilis, Micrococcus sp., M. varians, M. roseus y M. sedentarius mediante el empleo del sistema
informático Apilab Plus (Biomerieux). Asimismo se determinó la capacidad de desarrollarse en presencia de
diversos hidrocarburos aromáticos como única fuente de carbono y energía.
Las cepas mencionadas fueron aisladas a partir de muestras de suelo provenientes de un predio de 8 hectáreas
sometido a biorremediación durante un año; este sitio había sido empleado durante años a la disposición del agua de
producción, residuo generado por la industria hidrocarburífera, en las cercanías de la localidad de Catriel (Río
Negro) en la Patagonia Argentina. Dicho residuo lleva como contaminantes alto contenido de hidrocarburos de
petróleo y sales. Las especies mencionadas han sido aisladas previamente por otros autores a partir de sitios
contaminados y reportadas por su capacidad de degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos.
PALABRAS-CLAVE: Biorremediación, Bacterias Hidrocarburolíticas, Pseudomonas Sp., Micrococcus Sp.,
Sphingomonas Sp.
INTRODUCCIÓN
Como resultado de las diferentes actividades humanas se han introducido al ambiente gran cantidad de
residuos orgánicos de origen domiciliario e industrial. Particularmente estos últimos presentan distinto grado
de toxicidad según sea su complejidad química o su unión con distintos metales. Gran parte de ellos,
especialmente los relacionados estructuralmente con compuestos naturales son degradados por los
microorganismos del suelo y del agua. Sin embargo una importante proporción de moléculas contaminantes,
sobre todo aquellas con estructuras nuevas o con sustituyentes que se encuentran raramente en la naturaleza
son catabolizados lentamente y así se acumulan y persisten en el ecosistema.
Surge así el concepto de biorremediación, que consiste básicamente en estimular las capacidades
degradativas de los microorganismos indígenas (bacterias y hongos) a fin de mineralizar los contaminantes o
bien convertirlos en especies químicas menos tóxicas y así menos nocivas.
El objetivo del presente trabajo es identificar bacterias con capacidad de degradar hidrocarburos, aisladas a
partir de muestras de suelo provenientes del biotratamiento de 8 hectáreas contaminadas con aguas de
producción. Este tratamiento se llevó a cabo en un yacimiento petrolífero situado en las proximidades de la
ciudad de Catriel, provincia de Río Negro, en la Patagonia Argentina (27). El predio al que se hace
referencia fue durante años sitio de disposición del agua que acompaña al petróleo en su extracción, por lo
que además de hidrocarburos contiene alta concentración de sales.
La estrategia para realizar el biotratamiento se basó en el laboreo agronómico para proveer oxígeno y
aumentar la biodisponibilidad del contaminante; asimismo se aseguró un grado adecuado de humedad
mediante el riego, no siendo necesario el empleo de la bioaumentación.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de cultivo
Se empleó Medio Mínimo para Microorganismos Hidrocarburolíticos (Pozzo Ardizzi, G.; comunicación
personal) que consiste básicamente en una solución salina mineral con el agregado de micronutrientes y rojo
fenol como indicador de pH.
En las muestras de suelo tomadas se realizó, previamente al aislamiento, el recuento de los microorganismos
heterotrofos mesófilos aerobios totales e hidrocarburolíticos en medio líquido (Altamirano, M.G., en
redacción), utilizando la técnica del Número mas Probable (NMP) (7, 11). Para ello se tomó un gramo de
suelo y se lo suspendió en un tubo de ensayo conteniendo 9 ml de agua destilada estéril. A partir del
sobrenadante se realizaron diluciones sucesivas desde 10-1 hasta 10-10 con cuyas alícuotas se sembraron los
tubos de ensayo conteniendo Medio Mínimo con kerosén como única fuente de carbono y energía. De los
tubos que arrojaron resultados positivos (turbidez y viraje del indicador del rojo al amarillo) se realizaron los
aislamientos en Medio Mínimo agarizado (1.5 %) en placa de petri. En este caso el hidrocarburo estéril se
incorpora asépticamente en sendos papeles de filtro, que previamente han sido colocados en la tapa de la caja
antes de su esterilización. Una vez aisladas, las cepas se mantienen en agar nutritivo.
Una alternativa a la mencionada es sembrar 10 g de suelo en 100 ml de Medio Mínimo con 5 ml kerosen
estéril como única fuente de carbono y energía; se incuba a temperatura ambiente hasta que el cultivo haya
desarrollado turbidez y el indicador haya virado color rojo al amarillo. Posteriormente se realizan diluciones
en tubos con Medio Mínimo y aislamientos en Medio Mínimo agarizado en placa.
Pruebas Bioquímicas
A las cepas aisladas se les realizó la tinción de Gram; luego se estudió morfología y agrupación. Según los
resultados obtenidos se seleccionaron las tiras API (Biomerieux) para la caracterización bioquímica. También
se realizaron las pruebas de catalasa, oxidasa y movilidad. Para el análisis de los perfiles bioquímicos se
contó con la asistencia del programa informático Apilab Plus (Biomerieux) que consiste en una base de datos
para identificar bacterias. Además del género o especie correspondiente a cada perfil de resultados, el sistema
asigna para cada caso, un porcentaje de identificación (% Id) y una calificación que varía desde perfil
inaceptable hasta muy buena identificación, así como también sugiere pruebas bioquímicas
complementarias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente trabajo se considera a las bacterias degradadoras de hidrocarburos como sinónimo de
bacterias hidrocarburolíticas. Algunos autores emplean en forma genérica los términos petroleolítico (26) e
hidrocarbonoclástico (23) para señalar la capacidad de los microorganismos de crecer a expensas de uno o
varios hidrocarburos. Análogamente se llama degradadoras de hidrocarburos a aquellas poblaciones
microbianas que son capaces de desarrollarse en medios de cultivo con diversos hidrocarburos como única
fuente de carbono y energía. El sustrato suplementado puede ser el petróleo crudo (28, 4), o bien algún
producto de su destilación como el combustible jet fuel JP48 (2), diversos PAH en forma individual (29) o nhexadecano (13). En ningún caso se afirma que tales microorganismos puedan emplear todos los
hidrocarburos presentes en los sustratos mencionados cuando se trata de mezclas.
La fuente de carbono empleada en el presente trabajo para realizar los aislamientos, el kerosén, es una
compleja combinación de hidrocarburos desde C9 a C16 cuya temperatura de destilación va desde los 150 a
los 290 °C. El kerosén esta compuesto por 68.6 % de alcanos saturados y 19.4 % de hidrocarburos
aromáticos. Esto implica que los microorganismos que han sido capaces de crecer con kerosén como única
fuente de carbono y energía, denominados en conjunto hidrocarburolíticos o degradadores de hidrocarburos,
serían asimismo capaces de emplear al menos una fracción de los hidrocarburos que componen la mezcla
contaminante presente en el suelo de la Laguna de Evaporación.
Los resultados obtenidos a partir de las pruebas bioquímicas se expresan en las tablas a continuación. La
Tabla 1 agrupa a los cocos Gram positivos y la Tabla 2 a los bacilos Gram negativos.
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Tabla 1.- Características e identificación de cocos gram positivos.
Micrococcus sp Micrococcus roseus Micrococcus sedentarius Micrococcus varians
roja
rojo-rosado
amarilla
amarilla
COLONIA
cocos
cocos
coco/cocobac
cocos
FORMA
positivo
positivo
positivo
positivo
GRAM
+
++
+
++
MOVILIDAD
+
+ fuertemente
+fuertemente
+ fuertemente
CATALASA
negativo
negativo
negativo
negativo
OXIDASA
negativo
positivo
negativo
positivo
GLU
negativo
positivo
negativo
positivo
FRU
negativo
negativo
negativo
positivo
MNE
negativo
negativo
negativo
positivo
MAL
negativo
negativo
negativo
positivo
LAC
negativo
negativo
negativo
positivo
TRE
negativo
negativo
negativo
positivo
MAN
negativo
negativo
negativo
positivo
XLT
negativo
negativo
negativo
negativo
MEL
negativo
positivo
negativo
positivo
NIT
negativo
negativo
negativo
positivo
PAL
positivo
positivo
positivo
positivo
VP
negativo
negativo
negativo
negativo
RAF
negativo
positivo
negativo
positivo
XYL
negativo
negativo
negativo
positivo
SAC
negativo
negativo
negativo
negativo
MDG
negativo
negativo
negativo
positivo
NAG
negativo
negativo
negativo
positivo
ADH
negativo
negativo
negativo
negativo
URE
Muy Buena
Buena
Muy Buena
Muy Buena
Calificación
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Tabla 2.- Características e identificación de bacilos gram negativos.
Sphingomonas
Pseudomonas
paucimobilis
vesicularis
naranja
amarilla
COLONIA
bacilos
bacilos
FORMA
negativo
negativo
GRAM
+
+
MOVILIDAD
+
+ fuertemente
CATALASA
negativo
negativo
OXIDASA
negativo
positivo
NO3
negativo
negativo
TRP
negativo
negativo
GLU
negativo
negativo
ADH
negativo
negativo
URE
positivo
positivo
ESC
positivo
negativo
GEL
positivo
positivo
PNPG
positivo
negativo
GLU
positivo
negativo
ARA
positivo
negativo
MNE
negativo
negativo
MAN
negativo
negativo
NAG
negativo
negativo
MAL
negativo
negativo
GNT
negativo
negativo
CAP
negativo
negativo
ADI
negativo
negativo
MLT
negativo
negativo
CIT
negativo
negativo
PAC
Buena
Buena
Calificación
Las especies identificadas corresponden a tres géneros diferentes: Micrococcus sp., Sphingomonas sp. y
Pseudomonas sp. que son conspicuos en ambientes naturales tanto en suelo como en agua.
Las bacterias pertenecientes al género Pseudomonas son bacilos rectos o curvos, gram negativos, no
esporulados, cuyo tamaño oscila entre 0.5 y 1 µm de ancho por 1.5 y 4 µm de largo, no poseen vainas ni
apéndices. Su metabolismo es respiratorio, nunca fermentativo. Algunas especies son litotróficas pudiendo
emplear H2, entre otros, como único dador de electrones. Asimismo pueden emplear el NO3- como aceptor de
electrones en anaerobiosis. La prueba de oxidasa es generalmente positiva y catalasa lo es siempre (9).
Son muy numerosas las publicaciones en las que se hace referencia a distintas Pseudomonas sp. capaces de
sobrevivir e incluso degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos, como pesticidas, diversos
compuestos halogenados, e hidrocarburos derivados del petróleo (14, 22, 3, 21, 24, 10, 29, 19, 20, 25, 8, 17,
18).
El género Sphingomonas, comparado con Pseudomonas putida, P. fluorescens y P. aeruginosa, presenta
mayor especificidad y velocidad de degradación frente a diferentes hidrocarburos aromáticos polinucleares,
así como también se ha detectado su capacidad de producir bioemulsificantes (12).
La cepa aislada en el presente trabajo e identificada como Sphingomonas paucimobilis, citada previamente
como Pseudomonas paucimobilis, ha sido reportada por su capacidad de mineralizar el fenantreno,
fluorantreno, xileno, tolueno, bifenilos, salicilato y hasta pesticidas como el lindano (15, 1, 5).
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Respecto de Pseudomonas vesicularis ha sido aislada por Zanardini y col. (30) a partir de superficies de
mármol expuestas al exterior durante años, e identificada con la misma metodología empleada en el presente
trabajo; se demostró asimismo que esta especie es capaz de crecer en concentraciones altas de plomo (hasta
1500 ppm de Pb3O4).
Los microorganismos pertenecientes al género Micrococcus poseen células esféricas, que pueden agruparse
de a pares, tetradas o en forma irregular. Las colonias son pigmentadas. Son aerobios estrictos, su
metabolismo es respiratorio con escasa o nula producción de ácido, y crecen bien en medios simples. La
prueba de la catalasa es positiva, la de la oxidasa frecuentemente lo es aunque débilmente. En el caso de M.
roseus, M. sedentarrius y M. varians, la prueba de la oxidasa es negativa (6). Son relativamente resistentes
a un reducido potencial agua, toleran bien la desecación y la presencia de alto contenido en sales (hasta 7.5
%), característica que comparten con el género Pseudomonas (3, 9). Estas características son coincidentes
con las del suelo del ambiente patagónico del que han sido aisladas las cepas identificadas en el presente
trabajo.
El género Micrococcus fue previamente aislado a partir de suelos contaminados con petróleo (21), a partir de
muestras de suelo provenientes de una refinería y reportado por su capacidad de degradar hidrocarburos
aromáticos policíclicos (3). Asimismo se ha descripto la capacidad de este género de vivir en altas
concentraciones de petróleo (8) así como la de degradar otros compuestos orgánicos como malatión y
clorpirifos (20).
CONCLUSIONES
En el presente trabajo se identificaron seis especies bacterianas: Pseudomonas paucimobilis, Sphingomonas
vesicularis, Micrococcus sp., M. sedentarius, M. varians y M.roseus. El sistema informático Apilab Plus
empleado probó ser una herramienta útil para la rápida identificación de las cepas mencionas. Dichas
especies fueron aisladas a partir de muestras de suelo provenientes de un sitio que había sido destinado
durante años a la disposición de agua de producción proveniente de la industria hidrocarburífera, y
actualmente sometido a rehabilitación por biotratamiento.
Los géneros mencionados son pobladores frecuentes de suelos y aguas sin contaminar. No obstante ello han
sido reportados por su capacidad de degradar hidrocarburos así como también fueron aislados, como en este
caso, de sitios contaminados con diferentes compuestos orgánicos presentes en los residuos de petróleo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Adhya TK, Apte SK, Raghu K, Sethunathan N and Murthy NB (1996) Novel polypeptides induced for
its biodegradation by a Sphingomonas paucimobilis strain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 221 (3):
755-61.
Aislabie, J., Mc.Leod, M. and Fraser, R. 1998. Potential for biodegradation of hydrocarbons in soil
from the Ross dependency, Antarctica. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:210-214.
Ashok BT, Saxena S and Musarrat J (1995) Isolation and characterization of four polycyclic aromatic
hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil refinery. Lett. Appl. Microbiol. 21 (4): 246-8.
Atlas, R. M. and Bartha, R. 1992. Biodegradation of petroleum in seawater at low temperatures. Can.
J. Microbiol. 18: 1851-1855.
Barkay T, Navon Venezia S, Ron EZ and Rosenberg E (1999) Enhancement of solubilization and
biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier Alasan. Appl. Environ. Microbiol. 65
(6): 2697-2702.
Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (1994) Ninth Edition. Holt, Krieg, Sneath, Staley and
Williams (Eds). Williams and Wilkins.
Boonchan, S., Britz, M. and Stanley, G. 2000. Degradation and mineralization of high-molecularweight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures. Appl. Environ.
Microbiol. 66 (3): 1007-1019.
.Bieszkiewics E, Horoch M, Boszczyk Maleszak H and Mycielski R (1998) An attempt to use selected
strains of bacteria adapted to high concentrations of petroleum oil to increase the effective removal of
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5
XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental
petroleum products in excess activated sludge in laboratory conditions. Acta Microbiol. Pol. 47 (3): 30512.
9.
Brock TD y Madigan MT (1993) Microbiología. Sexta Edición. Prentice Hall Hispanoamericana S.A
10.
Chablain PA, Philippe G, Groboillot A, Truffaut N and Guespin Michel JF (1997) Res. Microbiol. 148
(2): 153-61.
11.
Collins, C.H., Lyne, P.M., and Grange, J.M. 1989. Microbiological Methods, 6th. Ed. Butterworths.
London, U.K.
12.
Dagher F, Diezel E, Lirette P, Pauqette G, Bisaillon JG and Villemur R (1997) Comparative study of
five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils. Can.
J. Microbiol. 43 (4): 368-77.
13.
Ferrari, M.D., Neirotti, E., Albornoz, C., Mostazo, M.R and Cozzo, M. 1996. Biotreatment of
hydrocarbons from petroleum tank bottom sludges in soil slurries. Biotechnology Letters. 18 (11): 12411246.
14.
Fuenmayor SL and Rodríguez Lemoine V (1992) Characterization of polycyclic aromatic
hydrocarbons degradative soil Pseudomonas. Acta Cient. Venez. 43 (6): 349-54.
15.
Furukawa K, Simon JR and Chakrabarty AM (1983) Common induction and regulation of biphenyl,
xylene/toluene, and salicylate catabolism in Pseudomonas paucimobilis. J. Bacteriol. 154 (3): 1356-62.
16.
Guha A, Kumari B, Bora TC and Roy MK (1997) Possible involvement of plasmids in degradation of
malathion and chlorpyriphos by Micrococcus sp. Folia Microbiol. 42 (6): 574-6.
17.
Hubert C, Shen Y and Voordouw G (1999) Composition of toluene degrading microbial communities
from soil at different concentrations of toluene. Appl. Environ. Microbiol. 65 (7): 3064-70.
18.
Isken S, Derks A, Wolffs P and de Bont JA (1999) Effect of organic solvents on the yield of solvent
tolerant Pseudomonas putida S12. Appl. Environ. Microbiol. 65 (6): 2631-35.
19.
Kallastu A, Horak R and Kivisaar M (1998) Identification and characterization of SI1411, a new
insertion sequence which causes transcripcional activation of the phenol degradation genes in
Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 180 (20): 5306-12.
20.
Kumari B, Guha A, Pathak MG, Bora TC and Roy MK (1998) Experimental biofilm and its
application in malathion degradation. Folia Microbiol. 43 (1): 27-30.
21.
Lebkowska M, Karwowska E and Miaskiewicz E (1995) Isolation and identification of bacteria from
petroleum derivatives contaminated soil. Acta Mocrobiol. Pol. 44 (3-4): 297-303.
22.
Lee JY, Roh JR and Kim HS (1994) Metabolic engineering of Pseudomonas putida for the
simultaneous degradation of benzene, toluene and p-xylene mixture. Biotechnol Bioeng., 43: 1146-1152.
23.
Marty, P. and Martin, Y. 1993. Use of oleophilic fertilizer and selected bacterial communities to
enhance biodegradation of crude oil in seawater. J. Mar. Biotechnol. 1 (1): 27-32.
24.
Michalcewicz W (1995) The influence of diesel fuel oil on the number of bacteria, fungi,
actinimycetes and soil microbial biomass. Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 46 (1): 91-7.
25.
Mφller S, Sternebrg C, Andersen JB, Christiensen B, Ramos J, Givskov M and Soren M (1998) In situ
gene expresion in mixed-culture biofilms: evidence of metabolic interactions between community
members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2): 721-732.
26.
Murado, M. A., Mirón, J. y González, M.P. 1996. Tratamiento microbiológico de la contaminación
por petróleo en ambientes marinos. Estudios de su posible optimización. Instituto de Investigacións
Mariñas (CSIC). Vigo. Galicia.
27.
Pozzo Ardizzi, M.G., Manacorda, A.M., Altamirano, M.G., Barbieri, L., Sánchez, A., Cuadros, D.,
Sánchez, N., Díaz, G., Arias, C. y Fredes, M. 1998. Rehabilitación por biorremediación de Áreas
destinadas a la disposición de aguas de producción provenientes de la actividad petrolera. Ingeniería
Sanitaria y Ambiental (38): 52-61
28.
Siron, R., Pelletier, E. and Brochu, C. 1995. Environmental factors influencing the biodegradation of
petroleum hydrocarbons in cold seawater. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 28: 406-416.
29.
Whyte L, Bourbonniere L and Greer CW (1997) Biodegradation of petroleum hydrocarbons by
psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane (alk) and naphtalene (nah) catabolic
pathways. Appl. Environ. Microbiol. 63 (9): 3719-3723.
30. Zanardini E, Andreoni V, Borin S, Cappitelli F, Daffonchio D, Talotta P, Sorlini C, Ramalli G, Bruni
S and Cariati F (1997) Lead resistant microorganisms from red stains of marble of the certosa of Pavia,
Italy and use of nucleic acid-base techniques for their detection. International Biodeterioration and
Biodegradation, 40 (2-4): 171-182.
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