Regeneración de plantas de Aloysia polysctachya por cultivo in vitro

Regeneración de plantas de Aloysia polysctachya por cultivo in vitro
de lámina foliar y segmentos de entrenudos.
Contreras, Marcos - Luna, Claudia - Tarragó, José - Sansberro, Pedro - Mroginski, Luis
Instituto de Botánica del Nordeste - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE.
Sargento Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina.
E-mail: [email protected]
INTRODUCCION
El interés que presenta en la actualidad la industria farmacéutica por la obtención de formulaciones a
partir de compuestos de origen natural, hace que el cultivo de las plantas medicinales como fuentes de agentes
farmacológicos activos, constituya una alternativa de producción.
En tal sentido, Aloysia polystachya (Gris.) Mold. (Verbenaceae) adquiere un marcado interés económico
debido a que sus hojas contienen derivados terpénicos (2), los cuales hacen que las infusiones de las mismas
posean propiedades tónicas carminativas y especialmente digestivas (4).
Pese a su amplia distribución geográfica (1, 2), la explotación extractiva a partir de comunidades
espontáneas presenta el inconveniente de la heterogeneidad tanto en la composición química como en la
productividad del material (R.A. Malizia, comunicación personal) y no asegura un continuo abastecimiento del
producto. Debido a ello, y con el objeto de promover el cultivo intensivo de Aloysia polystachya, es necesario
contar con individuos genéticamente uniformes y con métodos que permitan la multiplicación rápida y masiva de
esta especie.
Con el presente trabajo, se informa acerca de un método que permite la obtención de plantas de Aloysia
polystachya a partir del cultivo in vitro de porciones de lámina foliar y entrenudos.
MATERIAL Y METODOS
Se trabajó con plantas de Aloysia polystachya (Gris.) Mold. (“burrito”) que crecieron en macetas y en
condiciones de invernadero. El material vegetal fue gentilmente cedido por el Establecimiento Las Marías
S.A.C.I.F.A., Gdor. V. Virasoro (Ctes.).
Los explantes (segmentos de tallos con 2 a 3 yemas axilares) fueron previamente desinfectados en una
solución de NaOCl al 1.2 % durante 15 minutos y, finalmente enjuagados varias veces con agua destilada estéril.
Posteriormente, éstos fueron cultivados en el medio basal publicado por Sansberro y Mroginski (1995)
desarrollado para A. polystachya, consistente de las sales minerales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962),
diluido 4 veces (MS/4), semisólido (agar 0.65 %) y adicionado con 5 gr.l-1de sacarosa. Al cabo de 35 días de
cultivo, se extrajeron porciones de hojas y segmentos de entrenudos, los cuales fueron subcultivados en un
medio basal de igual composición, con o sin el agregado de ácido naftalenacético (ANA: 0, 0.1, 0.5, 1 mg.l-1) y
6-bencilaminopurina (BAP: 0, 0.1, 0.5, 1 mg.l-1). Posteriormente, los brotes regenerados a partir de ambos
explantes fueron transferidos a un medio libre de reguladores del crecimiento a fin de promover el alargamiento
de los tallos.
Se ensayaron diferentes procedimientos para inducir el enraizamiento de los vástagos obtenidos in vitro;
el que brindó los mejores resultados, consistió en el tratamiento de los vástagos con ANA 100 mg.l-1 durante 2 h,
seguido por el cultivo in vitro en MS/4 con 5 gr.l-1de sacarosa.
Los cultivos fueron incubados a 27±1°C y 14 hs de fotoperíodo (116 µmol.m-2.seg-1 radiación PAR)
Se cultivaron 10 explantes por tratamiento, realizándose 3 repeticiones. Los resultados fueron sometidos
al análisis de la variancia (ANOVA) y las comparaciones de las medias fueron realizadas con diferencias
significativas menor al 5 % de probabilidad (Tukey, Test de Comparaciones Múltiples). En todas las figuras, la
barra indica el error estándar de la media (SEM).
RESULTADOS
Transcurridos 45 días del subcultivo, prácticamente en todos los medios ensayados se formaron brotes a
partir de ambos explantes (Figs. 1 y 2), lográndose los mejores resultados cuando se cultivaron trozos de lámina
foliar en medios de cultivo suplementados con ANA (0.1 mg.l-1) y BAP (0.1 mg.l-1). La capacidad de
regeneración de los entrenudos fue menor en todos los tratamientos ensayados y si bien, el número de brotes
Explantes que brindan brotes
en %
regenerados por explante fue mayor en ausencia de reguladores del crecimiento o bien, en presencia de bajas
dosis de ANA (0.1 mg.l-1), éstos presentaron un crecimiento anómalo, caracterizado por una excesiva
vitrificación.
100
80
ð
a
ANA 1 mg.l -1
60
b
b
0
0.1
0.5
a
ð
a
40
b
20
Explantes que brindan brotes
en %
0
100
80
1.0
ANA 0.5 mg.l -1
ab
60
b
40
20
Explantes que brindan brotes
en %
0
0
0.1
a
100
80
a
0.5
ð
1
ANA 0.1 mg.l -1
ab
60
40
b
20
Explantes que brindan brotes
en %
0
0
0.1
100
80
0.5
1.0
Sin ANA
a
ab
60
b
40
b
20
0
0
0.1
0.5
B AP
(mg.l-1)
Hojas
Entrenudos
1.0
Fig. 1: Efecto que ejerce la
interacción de ANA y BAP
sobre la regeneración de brotes
adventicios por medio del
cultivo in vitro de trozos de
lámina foliar y porciones de
entrenudos. Letras iguales
indican que las diferencias no
son significativas (P>005)
respecto al tratamiento control
(Tukey, Test de Comparaciones
Múltiples). Únicamente se
detallan las comparaciones
estadísticas realizadas cuando
se emplearon trozos de lámina
foliar. En todos los casos, la
barra indica el error estándar de
la media (SEM).
Fig. 2: Efecto que ejerce la
interacción de ANA y BAP sobre el
número de brotes adventicios
regenerados mediante el cultivo in
vitro de trozos de lámina foliar y
porciones de entrenudos. En todos
los casos, la barra indica el error
estándar de la media (SEM).
Brotes/explante
10
8
ð
ANA 1 mg.l -1
6
4
2
0
0
0 .1
Brotes/explante
10
0 .5
ð
1 .0
ANA 0.5 mg.l -1
8
6
4
2
0
0
0.1
Brotes/explante
10
0.5
ð
8
1.0
ANA 0.1 mg.l -1
6
4
2
0
0
0.1
0.5
1.0
Brotes/explante
10
8
Sin ANA
6
4
2
0
0
0 .1
0 .5
1 .0
BAP
(mg.l- 1)
Hojas
Entrenudos
El 80 ± 10 % de los vástagos brindaron raíces adventicias, las cuales se generaron a través de
organogénesis directa (3), es decir que se diferenciaron directamente desde el vástago, sin la formación
intermedia de callos.
CONCLUSIONES
Los resultados de este trabajo, muestran que es factible regenerar plantas de Aloysia polystachya mediante
el cultivo de trozos de lámina foliar extraídos de brotes jóvenes provenientes del establecimiento in vitro de
segmentos plurinodales.
Un aspecto llamativo de este sistema desarrollado para Aloysia polystachya es la alta capacidad de
regeneración de los explantes estudiados, aún en ausencia de reguladores del crecimiento vegetal, siendo
necesarios mayores estudios que permitan esclarecer los mecanismos fisiológicos involucrados en dicho proceso
morfogénico.
BIBLIOGRAFIA CITADA
1.
Botta SM (1979). Darwiniana 22: 67-107.
2.
Fester G, Martinuzzi EA, Retamar JA, Ricciardi AI (1961). Academia Nacional de Córdoba: 38-40.
3.
Hicks GH (1987). Can. J. Bot. 65: 1913-1920.
4.
Martínez Crovetto R (1981). Fundación Miguel Lillo, Tucumán. Misc. 69: 89.
5.
Murashige T, Skoog FA (1962). Physiol. Plant. 15: 473-497.
6.
Sansberro PA, Mroginski LA (1995). AgriScientia 12: 83-93.