Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía

Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana
de la vía Notch en prominencias faciales de embriones de
pollo (Gallus gallus)
Belfran Alcides Carbonell Medina
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología
Maestría en Odontología
Bogotá – Colombia
2012
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana
de la vía Notch en prominencias faciales de embriones de
pollo (Gallus gallus)
Belfran Alcides Carbonell Medina
Tesis presentada como requisito para optar título de:
Magister en Odontología
Director:
Humberto Arboleda Granados MD, MSc
Codirectora:
Carolina Parada Borja DD, PhD
Asesora Científica
Zayra Garavito Aguilar MSc, PhD
Línea de Investigación:
Crecimiento y Desarrollo Craneofacial
Grupo de Investigación:
Crecimiento y Desarrollo Craneofacial
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología
Maestría en Odontología
Bogotá – Colombia
2012
Dedicatoria
A Dios todo poderoso, por darme fuerzas e iluminarme cada día.
A mis padres y hermanos, por cada palabra de aliento y creer en mí.
A mi novia Yesica, por su todo su amor y su compañía.
IV
Agradecimientos
Agradezco de manera especial a la Dra Zayra Garavito, por el acompañamiento durante
la realización de esta investigación y por todas sus enseñanzas que me ayudaron a
construir un nuevo conocimiento.
Un agradecimiento especial a mi compañera de trabajo y amiga, Francy Bayona, por su
amistad e incondicional apoyo.
Quiero agradecer a la Dra Carolina Parada por enseñarme que la investigación en
Odontología puede ser posible cuando existen ganas y deseos de crear nuevo
conocimiento.
Al profesor Humberto Arboleda, por su apoyo, confianza y conciencia que la investigación
se construye día a día.
Agradezco a la profesora Clementina Infante por enseñarme que el ser constante, nos
permite llegar más rápido al éxito.
Agradezco al profesor Fernando Giráldez, Profesor del departamento de Biologia del
Desarrollo, Ciències Experimentals i de la Salut (CEXS),Universitat Pompeu Fabra,
Barcelona, at the Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona (PRBB),por la donación de los
cDNA para la construcción de las sondas utilizadas en este estudio.
Finalmente a mis padres por su inagotable amor y lucha por ayudarme a salir adelante.
V
Resumen
La vía de señalización Notch desempeña un papel fundamental en diferentes etapas del
desarrollo embrionario y está involucrada en diversos procesos celulares como apoptosis,
proliferación, diferenciación, decisión de destino celular y mantenimiento de células
indiferenciadas. Mutaciones en varios genes componentes de la vía Notch, como Notch1,
Jagged2 (Serrate2) y Hes1 producen alteraciones en el desarrollo de estructuras
craneofaciales como paladar, bóveda craneal y maxilares.
El objetivo del presente estudio fue determinar los patrones de expresión de los genes
Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 durante el desarrollo de prominencias maxilares,
mandibulares y frontonasal durante los estadios de desarrollo HH19, HH21, HH23 y HH25
en un modelo animal de pollo. Los resultados muestran expresión de Notch1, Serrate2 y
Hey1, en el epitelio nasal al igual que en el mesénquima y epitelio que recubre las
prominencias maxilar y mandibular. Adicionalmente, Notch1 y Hey1 también se expresan
en el ectodermo frontonasal en HH21 y en condensaciones mesénquimales en la
prominencia mandibular en HH25. La expresión de Hes1 está restringida al epitelio
maxilar y mandibular en HH19 y HH21. En conjunto los resultados sugieren un potencial
papel de la vía Notch durante el desarrollo de las prominencias faciales. Por lo tanto, se
sugieren futuros estudios de pérdida y ganancia de función para identificar el rol
específico de esta vía de señalización durante la morfogénesis facial.
Palabras claves: desarrollo craneofacial, vía Notch, prominencias faciales, pollo
VI
Abstract
The Notch signaling pathway plays an essential role during embryonic development and
has been implicated in diverse cellular processes such as apoptosis, proliferation,
differentiation, and cell fate decision maintenance of undifferentiated cells. Mutations in
several Notch pathway component genes, including Notch1, Jagged2 (Serrate2) and Hes1
lead to alterations in craniofacial structures, palate, maxillary and cranial vault.
The aim of this study was to analyze the Notch1, Serrate2, Hes1 and Hey1 gene
expression patterns during development of maxillary, mandibular and frontonasal
prominences during developmental stages HH19, HH21, HH23 and HH25 in chick embryo
animal model. The results show notch1, serrate2 and hey1 expression in the nasal
epithelium as well as in the ectoderm-derived epithelium and lateral mesenchyme of
maxillary and mandibular prominences. Additionally, Notch1 and Hey1 are also expressed
in the frontonasal ectoderm at HH21 and the mesenchymal condensations of the
mandibular prominence at HH25. Hes1 expression was restricted to the maxillary and
mandibular ectoderm at HH19 and HH21. Overall the results suggest a potential role of the
Notch pathway in the development of facial prominences. Therefore, future studies of loss
and gain of function are suggested to identify the specific roles of this signaling pathway
during facial morphogenesis.
Keys Words: craniofacial development, Notch pathway, facial prominences, chick.
Contenido
Contenido
VII
Pág
RESUMEN ................................................................................................................................................. V
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................ IX
LISTA DE TABLAS ................................................................................................................................... X
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS .......................................................................................... XI
CAPITULO1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 4
1.1 DESARROLLO FACIAL EN VERTEBRADOS................................................................................................. 4
1.2 GENERALIDADES Y COMPONENTES DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN NOTCH ........................................... 10
1.2.1 Componentes de la vía de señalización Notch ...................................................................... 11
1.3 ACTIVACIÓN DE LA VÍA NOTCH ............................................................................................................. 14
1.4 IMPLICACIONES DE LA VÍA NOTCH EN EL DESARROLLO DE ESTRUCTURAS CRANEOFACIALES ............ 16
CAPITULO2. PATRONES DE EXPRESIÓN DE NOTCH1, SERRATE2 Y GENES DIANA DE LA
VÍA NOTCH EN PROMINENCIAS FACIALES DE EMBRIONES DE POLLO (GALLUS GALLUS)
.................................................................................................................................................................. 19
2.1 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................................... 19
2.1.2 Obtención y Procesamiento de Embriones ............................................................................. 19
2.1.3 Hibridización In situ ..................................................................................................................... 19
2.3.4 Procesamiento y obtención de secciones histológicas ......................................................... 20
2.3.5 Análisis de Patrones de Expresión ........................................................................................... 20
2.2 RESULTADOS ......................................................................................................................................... 21
2.2.1 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el estadio HH19 ............... 22
2.4.2 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el estadio HH21 ............... 23
2.4.3 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el estadio HH23 ............... 25
2.4.4 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el estadio HH25 ............... 27
2.5 DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 30
2.5.1 La relación temporo-espacial de los patrones de expresión entre Notch1, Serrate2, Hes1
y Hey1 sugieren un potencial papel de la vía Notch en el desarrollo temprano de las
prominencias maxilar y mandibular .................................................................................................... 31
2.5.2 Vía Notch en el desarrollo del epitelio nasal y su papel potencial en el establecimiento
del FEZ ................................................................................................................................................... 32
CAPITULO3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................ 36
3.1 CONCLUSIONES ..................................................................................................................................... 36
3.2 RECOMENDACIONES.............................................................................................................................. 37
ANEXOS .................................................................................................................................................. 38
ANEXO A - OBTENCIÓN, FIJACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE EMBRIONES DE POLLO EN ESTADIOS HH19HH25. .......................................................................................................................................................... 38
VIII
ANEXO B - OBTENCIÓN DE BACTERIAS COMPETENTES E.COLI TOP 10...................................................... 38
ANEXO C - RECUPERACIÓN DE PLÁSMIDOS ............................................................................................... 39
ANEXO D - TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS E.COLI TOP 10 .................................................................. 39
ANEXO E - PURIFICACIÓN DE DNA PLASMÍDICO ......................................................................................... 40
ANEXO F - CONSTRUCCIÓN Y MARCAJE DE SONDAS DE RNA NO RADIOACTIVAS DIG-UTP ..................... 41
ANEXO G - HIBRIDACIÓN IN SITU TOTAL Y EN SECCIONES HISTOLÓGICAS ...................................................................... 43
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................................ 45
IX
Lista de figuras
Figura1. Tejidos y señales implicadas en la inducción de las células
de la cresta neural……..……………………………………………………….............5
Figura2. Orígenes y mapas de migración de las CCNC……….…………………….............6
Figura3. Etapas del desarrollo facial en embriones de pollo……………………………..…..8
Figura4. Estructura del receptor Notch y ligandos de
la vía Notch…………...…………………………….………..…………………….…...12
Figura5. Activación de la vía Notch…………………………………………………….………15
Figura6. Especificidad de las sondas utilizadas para evaluar la expresión
de los genes Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en embriones de pollo…………...23
Figura7. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en prominencias
faciales durante el estadio HH19…………………………………………………….25
Figura8. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en prominencias
faciales durante el estadio HH21…………………………………………………….28
Figura9. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en prominencias
faciales durante el estadio HH23…………………………………………………….30
Figura10. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en prominencias
faciales durante el estadio HH25………………….……………………………….31
Figura11. Resumen temporo-espacial de la expresión de Notch1, Serrate2, Hey1
y Hes1 en las prominencias maxilar y mandibular desde HH19
hasta HH25……………………………………………………………………………35
Figura12. Resumen temporo-espacial de la expresión de Notch1, Serrate2, Hey1
y Hes1 en las prominencia frontonasal y epitelio nasal desde HH19
hasta HH25……………………………………………………………………………37
Lista de tablas
X
Lista de tablas
Tabla 1. Equivalencia en estadios de desarrollo facial embrionario entre
Humanos, Ratón y Pollos……………………………………………………………...7
Tabla 2. Componentes de la vía de señalización Notch…………………………………….18
Tabla 3. Distribución temporo-espacial de los patrones de expresión de
Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en prominencias faciales……………………..22
XI
Lista de símbolos y abreviaturas
BMP: Bone Morphogenetic Protein (Proteína morfogéneticas ósea)
b HLH: basic Helix Loop Helix
CCN: Células de la Cresta Neural
CCNC: Células de la Cresta Neural Craneal
DIG: Digoxigenina
Dll : Delta like
DSL: Delta Serrate Lag
EGF: Epidermal Grow Factor (Factor de crecimiento epidermal)
en: epitelio nasal
ep: epitelio
FEZ: Frontonasal Ectodermal Zone (Zona ectodérmica frontonasal)
FGF: Fibroblast Growth Factor (Factor de crecimiento Fibroblástico)
FGFr: Fibroblast Growth Factor receptor (receptor del Factor de crecimiento Fibroblástico)
fn: fosita nasal
HD: Heterodimerization Domain (Dominio de heterodimerización)
Jag: Jagged
LPH: Labio y paladar hendido
m: mesénquima
mmV : Componente maxilo-mandibular del trigémino
Mn: prominencia mandibular
Mx: prominencia maxilar
NICD: Notch Intracellular Domain (Dominio intracelular de Notch)
NECD: Notch Extracellular Domain (Dominio extracelular de Notch)
NRR: Negative Regulatory Region ( Region regulatoria negativa)
XII
ofV: Componente oftálmico del trigémino
PDGF: Platelet- derived growth factor (Factor de crecimiento derivado de las plaquetas)
pfn: prominencia frontonasal
Shh: Sonic Hedgehog
SMM: Surco maxilo-mandibular
UTP: uridina trifosfato
Wnt: Wingless
Introducción
El desarrollo y la evolución de la región facial ha sido una fuerza impulsora importante en
la expansión de diversos linajes de vertebrados. Es así, que a pesar que la cara crece en
la etapa posnatal, la base del patrón facial se genera durante la embriogénesis por un
conjunto complejo de interacciones moleculares y tisulares(1, 2).
La morfogénesis facial en los vertebrados se caracteriza por el desarrollo de pequeños
engrosamientos de mesénquima cubiertos por epitelio derivado del ectodermo, llamadas
prominencias faciales(3). La mayoría del mesénquima en las prominencias faciales es
derivado de las células de la cresta neural craneal (CCNC), con una contribución más
pequeña de células del mesodermo paraxial cefálico(4, 5). Las CCNC darán lugar
entonces a las estructuras esqueléticas del viscerocráneo y de la base anterior del
cráneo, neuronas de los ganglios craneales, cartílago y tejido conectivo facial, mientras el
mesodermo paraxial, contribuirá a la formación del endotelio vascular y la musculatura
facial(6). Alrededor del estadio 12 en humanos (26 días de gestación) y HH19 en pollos
(72 horas de incubación), la boca primitiva estará rodeada por cinco prominencias
faciales: dos prominencias maxilares (mx), dos prominencias mandibulares (md) y un
único proceso o prominencia frontonasal (pfn)(3, 7).
El desarrollo de las estructuras faciales requiere la interacción de diferentes tipos de
tejidos embrionarios como lo son el epitelio derivado del ectodermo oral, endodermo,
mesodermo de los arcos faríngeos y mesénquima derivado de CCNC(8-11). Estas
interacciones celulares, son mediadas por diferentes moléculas que regulan el desarrollo
embrionario general, las cuales también contribuyen con el desarrollo craneofacial
promoviendo proliferación, diferenciación y muerte celular programada entre otras
funciones celulares. Estas moléculas reguladoras hacen parte de las diferentes vías de
señalización entre las que se encuentran WNT, SHH, FGF, BMP, y la vía NOTCH entre
otras (12-16). Alteraciones en alguna de estas vías de señalización molecular generan
anomalías craneofaciales como labio y paladar hendido (LPH). Cabe anotar que el LPH
se presenta con una incidencia que va desde 1/500 hasta 1/2500 nacidos vivos de
acuerdo con la etnia y la ubicación geográfica. En el caso de la población colombiana este
índice es de 1/1015 nacidos vivos(17).
Aunque se han realizado numerosos estudios epidemiológicos y genéticos, la etiología del
LPH no está completamente clara. Esto se debe, en parte, a que no se conocen en detalle
todos los eventos celulares y moleculares necesarios durante el desarrollo craneofacial
normal. Por ejemplo, a pesar que existen evidencias de malformaciones del complejo
craneofacial cuando la función de algunos genes componentes de la vía Notch se pierden,
se desconoce si estos componentes son expresados en sus tejidos y estructuras
precursoras faciales. La vía de señalización Notch actúa como un mecanismo de
comunicación intercelular que se compone de varios receptores, ligandos, genes diana y
otras moléculas represoras y activadoras de la vía, que la hacen de vital importancia
durante la embriogénesis(18). Es así como la vía de señalización Notch participa en la
2
diferenciación, proliferación celular, regulación del destino celular y definición de patrones
de formación en distintas especies(19-22). La activación de los receptores Notch por
unión con sus ligandos causan que el dominio intracelular de este receptor se trasloque al
núcleo y actué como un regulador transcripcional de sus genes diana entre los que están
incluidos Hes y Hey (23). Varios son los estudios que demuestran que la vía Notch está
implicada en el desarrollo de estructuras craneofaciales. Ratones con mutaciones
inducidas en el ligando Jagged2 presentan anomalías craneofaciales como paladar
hendido (24). De igual forma, ratones con mutaciones en el gen Hes1, presentan además
de paladar hendido, defectos en la formación de la base craneal, agenesia del hueso
frontal y otras alteraciones en derivados de las CCNC(25). Adicionalmente, mutaciones
compuestas en el ligando Delta like-3 y el receptor Notch1 muestran alteraciones en el
tamaño mandibular y del paladar(26). Otros estudios también han evidenciado el papel
que esta vía tiene en el desarrollo de otras estructuras como el oído interno(27, 28). Sin
embargo, a pesar de estos estudios funcionales, se conoce muy poco sobre los patrones
de expresión de los genes de la vía Notch y de sus genes diana en el desarrollo de las
prominencias faciales. Esto hace que aun permanezca un vacío sobre el papel que esta
vía pueda tener en la morfogénesis facial. Específicamente, en estadios tempranos del
desarrollo de las prominencias faciales no se sabe si Notch1, Serrate2 y los genes diana
Hes1 y Hey1 se expresan durante el desarrollo del complejo craneofacial en las
prominencias faciales.
De este modo, el objetivo de este trabajo fue identificar, describir y analizar los patrones
de expresión de algunos genes componentes de la vía de señalización NOTCH como lo
son los genes que codifican para el receptor Notch1, el ligando Serrate2 y los genes
blanco de la vía Notch, Hes1 y Hey1 durante el desarrollo de prominencias faciales
utilizando como modelo animal el embrión de pollo (Gallus gallus) en los estadios HH19 HH25.
Varios modelos animales han sido empleados con el objetivo de comprender los
mecanismos celulares y moleculares involucrados en el desarrollo normal y patológico del
complejo craneofacial; dentro de estos modelos animales, los más utilizados han sido el
Ratón, el Pez Cebra y el Pollo(15). Previamente, el modelo animal de pollo ha sido
utilizado para estudiar varias vías de señalización durante el desarrollo de estructuras
craneofaciales(12, 29). Por lo tanto, se escogió el modelo animal de embrión de pollo
teniendo en cuenta las ventajas de este modelo para el estudio del desarrollo facial de
vertebrados. Dentro de estas ventajas, podemos mencionar la alta accesibilidad, bajos
costos y el fácil manejo.
Conocer los patrones de expresión es el primer paso para establecer donde, cuando y
como la vía Notch podría participar en la formación del complejo craneofacial. Aquí se
muestra como Notch1, Serrate2 y Hey1, se expresan en el epitelio nasal al igual que en el
mesénquima y epitelio lateral que recubre las prominencias maxilar y mandibular.
Adicionalmente, Notch1 y Hey1 también se expresan en el ectodermo frontonasal en
HH21. La expresión de Hes1 estuvo restringida al epitetio maxilar y mandibular en HH19 y
HH21. Estos resultados sugieren que la vía Notch potencialmente podría estar
contribuyendo a la morfogénesis facial y a la regulación de mecanismos del desarrollo
como proliferación, diferenciación y decisión de destino celular. Por lo tanto, se
recomiendan realizar estudios de pérdida y ganancia de función que nos permitan
entender el papel de esta vía durante el desarrollo facial.
Introducción
3
Adicionalmente, este trabajo sentará las bases para futuros estudios enfocados en el
desarrollo de estructuras craneofaciales, en un modelo animal más accesible de ser
manejado técnica y económicamente, para comprender la complejidad del desarrollo
normal y de las malformaciones del complejo craneofacial humano.
Capitulo1. Marco Teórico
1.1 Desarrollo facial en vertebrados
El desarrollo de la región craneofacial requiere una variedad de interacciones celulares y
moleculares entre los diversos tejidos embrionarios que la originan(30). Es un proceso
complejo, puesto que la región craneofacial de los vertebrados no sólo aloja y protege el
cerebro sino que además provee las estructuras sobre las cuales se localizan los órganos
sensitivos y sensoriales(31).
Los tejidos que dan origen a las estructuras de la cabeza en los vertebrados, son
derivados de todas las capas germinales, dentro de estas: ectodermo, mesodermo,
endodermo y adicionalmente tiene una contribución fundamental de las células
provenientes de la Cresta Neural Craneal (CNC)(32). El ectodermo da origen a la
epidermis que cubre la región craneofacial, el sistema nervioso y a algunos componentes
de los órganos de los sentidos como el cristalino(33). El endodermo cubre la faringe y
contribuye con el desarrollo de glándulas como la tiroides, la paratiroides y el timo(34).
Durante la embriogénesis, señales provenientes del ectodermo y el endodermo
contribuyen recíprocamente para regular procesos celulares como proliferación,
supervivencia, migración y diferenciación del mesénquima facial(35). Este mesénquima se
origina a partir de células mesodermales y células de la cresta neural craneal (CCNC). El
mesodermo da origen a la musculatura voluntaria facial y células endoteliales, mientras el
mesénquima derivado de la cresta neural da origen al tejido conectivo craneofacial,
dentina, pulpa dental, cartílago, huesos del viscerocráneo y región anterior de la base
craneal(32, 35, 36).
A pesar que la cara crece y experimenta algunos cambios en la etapa posnatal, la base
del patrón facial se genera durante la embriogénesis(2). A nivel general, el desarrollo de
las estructuras faciales puede resumirse en cinco etapas específicas. En primer lugar,
encontramos la inducción de las células de la cresta neural en el límite entre el
ectodermo y el neuroectodermo(37), segundo, migración de las células de la cresta
neural hacia diferentes regiones de los arcos faríngeos(6, 38), tercero, formación de
prominencias faciales, las cuales resultan de la proliferación de células del mesénquima
derivado de la cresta neural en los arcos faríngeos(32, 39, 40), cuarto, fusión de
prominencias faciales, la cual da forma y estructura a la cara(3, 39) y por último,
diferenciación de las CCNC para dar origen a tejidos como cartílago y huesos que
conforman el esqueleto facial(32).
La inducción de las células de la cresta neural se lleva a cabo en múltiples pasos, que
inician en el estadio de gástrula y finalizan con el cierre del tubo neural(41). Está
inducción toma lugar en un área de expresión génica diferencial llamada “ectomera” que
se encuentra flanqueada por neuroectodermo y ectodermo no neural. (37, 41). Varias
señales han sido implicadas en la inducción de la cresta neural, dentro de estas, BMP
(bone morphogenetic proteins), Wnts (Wingless), FGF (fibroblast growth factors), y más
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
5
recientemente la vía Notch/Delta en diferentes modelos animales como Pollo, Ratón,
Xenopus y pez Cebra(41, 42)(Figura1).
Figura5.Tejidos y señales implicadas en la inducción de las células de la cresta neural. A) El
área de inducción de las CCN llamada también ectomera (banda amarilla), está flanqueada por
ectodermo no neural y neuroectodermo, y además por mesodermo paraxial en la región más
inferior. B) Varias señales como Wnt, Fgf, Notch, Bmp y antagonistas de Bmp son requeridas para
inducir la formación de CCN. Señales de Wnt y Fgf son requeridas desde el mesodermo paraxial,
de igual forma Wnt también en necesaria en el ectodermo no neural. Antagonistas de Bmp inhiben
las señales de Bmp en la placa neural desde el mesodermo paraxial favoreciendo así la inducción
de CCN. Notch/Delta son expresados en precursores de la cresta neural regulando los niveles de
Bmp. Tomado de (41).
La migración de las CCN sucede posterior al proceso de inducción. Las CCN delaminan
desde el neuroepitelio e inician su migración rostrocaudal a lo largo del embrión(43, 44).
Las CCN que se originan en el diencéfalo, mesencéfalo anterior, mesencéfalo posterior y
rombomeros son llamadas Células de la Cresa Neural Craneal (CCNC), las cuales
contribuyen a la formación del mesénquima de los arcos faríngeos y prominencias faciales
y por consiguiente, al desarrollo de la mayoría de estructuras craneofaciales(45)(ver
Figura2).
Antes que CCNC migren hacia la región craneal, ya se han formado en la región faríngea
varios engrosamientos pareados, los arcos faríngeos(33). Los arcos faríngeos, están
formados inicialmente por una cubierta epitelial de origen ectodérmico en la superficie
más externa, un núcleo mesénquimal de origen mesodérmico y hacia la región faríngea,
están recubiertos de una capa epitelial de origen endodérmico(33). Una vez inicia la
migración de CCNC, el núcleo mesénquimal es invadido por estas células dando lugar
así, al mesénquima facial derivado de la cresta neural. Este proceso se completa
aproximadamente en el estadio HH14 en pollos (de acuerdo con la clasificación de
Hamilton y Hamburger)(7), cuando cesa la migración de CCNC(46). En ratones las CCNC
han poblado los arcos faríngeos y la mayoría de la región facial aproximadamente en
E9.5(47). Finalmente en humanos la migración de las CCNC se completa en el estadio
10(48) acorde al sistema Carnegie(49), que coincide aproximadamente con la cuarta
semana de vida intrauterina(3, 50).
Marco Teórico
6
Figura6. Orígenes y mapas de migración de las CCNC. A) Vista dorsal de un embrión de
pollo. Las diferentes regiones coloreadas del tubo neural representan el lugar de origen de las
CCNC.B) Vista lateral de un embrión de pollo. Rutas de migración de las CCNC hacia los arcos
faríngeos y prominencia frontonasal. En diferentes colores se ilustran las áreas de origen y con
flechas negras se indica el destino final de las CCNC.A, anterior; BA1, arco branquial1; Di,
diencéfalo; Mes, mesencéfalo; r1, rombomero1; r1 NC, Cresta Neural del robomero1; P, posterior.
Tomado de(6).
La formación de las prominencias faciales se puede subdividir en 5 estadios de
desarrollo. A continuación se describirán los eventos más significativos en cada una de
ellos incluyendo las particularidades del proceso para algunos modelos animales y para
humanos, haciendo énfasis en el modelo de pollo, el cual fue utilizado en el presente
estudio. La clasificación de los estadios descritos está basada en nomenclatura de
Hamilton y Hamburger para Pollos, sistema Carnegie para Humanos y Theiler para
ratones(7, 49), cuya equivalencia se resume en la Tabla1.
En el estadio HH19g en pollos, de igual forma que en el estadio equivalente en humanos
y ratón, el primordio facial está conformado por cinco prominencias que rodean el
estomodeo (3, 51). En la región más rostral al estomodeo, se sitúa una prominencia
simétrica e impar, la prominencia frontonasal, la cual está en íntima relación con el
prosencéfalo. Lateralmente, el estomodeo está limitado por un par de procesos maxilares,
y caudalmente por otro par de protuberancias, las prominencias mandibulares(3, 52)(Fig
3A). Adicionalmente, se pueden observar dos pequeñas depresiones situadas
lateralmente en la prominencia frontonasal, llamadas las fositas nasales, las cuales han
sido ampliamente implicadas en la especificación del esqueleto nasal lateral. La
prominencia frontonasal se puede distinguir desde el estadio HH16, mientras que la
prominencia maxilar solo es distinguible entre los estadios HH18/HH19(7). Al igual que la
prominencia mandibular, la prominencia maxilar es derivada del primer arco faríngeo, sin
embargo, dado la distinción tardía de esta última, el proceso mandibular se puede
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
7
apreciar más temprano como una representación mayoritaria del primer arco faríngeo
desde HH14(7, 53).
Tabla1. Equivalencia en estadios de desarrollo facial embrionario entre Humanos, Ratón y
Pollos.
Humanos
(Estadios
Carnegie)
Ratón
Pollo
(Días poscoito, E)
(Estadios Hamilton
y Hamburger)
12
E9.0
HH19
13
E9.5
HH21
14
E10
HH23
15
E10.5
HH25
16
E11
HH28
Fuente: Adaptado de (3)
En el estadio de desarrollo HH21, la prominencia frontonasal aumenta de tamaño a
medida que el cerebro anterior da origen a un par de vesículas telencefálicas (primordios
de los hemisferios cerebrales), mientras que los bordes mediales de las prominencias
mandibulares gradualmente se unen en dirección caudo-rostral para formar el primordio
completo de la mandíbula(54). En esta etapa de desarrollo las prominencias maxilares
alcanzan a tener el mismo tamaño que las prominencias mandibulares(7).
Para el estadio 14 en humanos y E10 en ratones, la fosita nasal ha experimentado una
mayor invaginación y expansión lateromedial, de tal manera que la prominencia
frontonasal es dividida por la fosita nasal en dos procesos nasales laterales y dos
procesos nasales medios (3, 50, 55). La embriogénesis facial en pollos es algo diferente
que en mamíferos. En el estadio HH23, el desarrollo de la fosita nasal en pollos divide la
masa frontonasal en dos procesos nasales laterales y un único proceso frontonasal
medio, también llamado prominencia frontonasal(7, 51). Al igual que en humanos, ratón y
pollo, en este estadio de desarrollo la prominencia maxilar alcanza a tener un tamaño
mayor que la prominencia mandibular(3, 7, 51).
En el estadio HH25, un rápido crecimiento del mesénquima maxilar superior desplaza la
fosita nasal medialmente, mientras el proceso nasal medial crece ventro-lateralmente
convirtiendo la fosita nasal en una depresión semiredondeada. En este momento del
desarrollo, las estructuras precursoras del labio superior ya están formadas (procesos
maxilares y nasal medial)(3)(Fig 3C). Morfológicamente, el desarrollo facial en el pollo
muestra una configuración cuadrada(3, 51)(ver Fig 3D).
Marco Teórico
8
Figura7. Etapas del desarrollo facial en embriones de pollo. Micrografía electrónica de
prominencias faciales de pollo. (A-D), vista frontal. A) Embrión HH19, se distinguen las
prominencias maxilar, mandibular, frontonasal y fosita nasal. B) Embrión HH23, en esta etapa del
desarrollo la prominencia maxilar ha adquirido un mayor tamaño comparada con la prominencia
mandibular y se distingue el proceso nasal lateral. C) Embrión HH25, se observa como la
prominencia maxilar se encuentra más próxima a la prominencia frontonasal, sin embargo, aún no
están en contacto D) Embrión HH28, se puede apreciar como la prominencia frontonasal y maxilar
están en intimo contacto. Está etapa se caracteriza por el inicio del proceso de fusión entre las
prominencias faciales. MAND, prominencia mandibular; MAX, prominencia mandibular; PFN,
prominencia frontonasal; NL, proceso nasal lateral; fn; fosita nasal; SMM, surco maxilo-mandibular.
Tomado de(51).
.
La fusión de las prominencias faciales, es caracterizada por un contacto directo y
desintegración del epitelio ectodérmico que las recubre mediado por procesos de
apoptosis y transformación epitelio mesénquimal(3). Durante los estadios HH27/28 en
pollos, un crecimiento rápido del proceso maxilar y nasal medio desplazan lateralmente al
proceso nasal lateral, lo que genera un contacto directo de los bordes distales del proceso
maxilar con el nasal medio y una reducción significativa del tamaño del estomodeo(3,
51)(Fig 3D). Estudios de microscopia electrónica en pollos han mostrado un estado activo
de fusión entre el proceso nasal lateral y la prominencia frontonasal(51, 56). De igual
manera, estudios de microscopia electrónica de barrido en ratones E11, muestran que
hay una fusión entre los epitelios de los procesos nasales medios y laterales y entre el
proceso nasal medio y el maxilar, tal como se ha descrito en el desarrollo facial de
embriones humanos(2, 3, 57).
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
9
En humanos y ratones, la fusión epitelial entre el proceso maxilar con el proceso nasal
lateral y medial sigue ocurriendo entre los estadios 16-18 y E11.5-E12.5, respectivamente.
Por otro lado, el proceso maxilar sigue creciendo rápidamente y desplaza la fosita nasal
junto con el proceso nasal medio a una posición más medial y frontal(3, 54). Así de esta
forma, después de completarse la desintegración epitelial y la confluencia del
mesénquima entre las prominencias maxilares con los procesos nasales medios y
laterales, la formación del labio superior y paladar primario es finalizada(3, 54). En pollos,
la formación del paladar primario es finalizada aproximadamente entre HH28 y HH30(51).
Fallas de fusión entre el proceso maxilar y el nasal medial, unilateral o bilateralmente dan
lugar a fisuras labiales laterales o bilaterales, respectivamente(2, 58). De igual manera,
fisuras faciales que se extienden hasta la nariz, indican fallas no solo en la fusión del
proceso maxilar con el nasal medio, si no también, fallas de fusión entre el proceso
maxilar y el nasal lateral(3).
La morfogénesis facial es el resultado armónico entre el crecimiento, fusión y procesos
de diferenciación de las CCNC en las prominencias faciales(3, 32). Estos procesos
ocurren simultáneamente durante el desarrollo facial, de tal manera que mientras las
prominencias faciales van aumentando de tamaño para finalmente entrar en contacto y
fusionarse, células del mesénquima derivado de la cresta neural craneal van
diferenciándose en diferentes tipos celulares como condrocitos y osteoblastos para dar
origen a las estructuras esqueléticas del viscerocráneo.
Varios estudios han reportado eventos de proliferación celular en el mesénquima de las
prominencias faciales(40, 53). Estos estudios han mostrado que los mayores eventos de
proliferación se encuentran entre los estadios HH18 – HH21 (estadios tempranos del
desarrollo facial en pollos) tanto en las prominencias maxilares como en la frontonasal y
nasal lateral(40, 53). Sin embargo, un declive en estos eventos proliferativos es marcado
a medida que avanza el desarrollo durante la etapa media de desarrollo facial (HH22 –
HH24) y tardía (HH25 – HH28), atribuidos principalmente a la formación de
condensaciones mesénquimales y estadios iniciales de diferenciación(40, 53).
Entre los estadios HH18-HH20 cada prominencia facial es capaz de formar un único
grupo de derivados esqueléticos que pueden ser reconocidos del resto de estructuras
esqueléticas de la cabeza(50). La prominencia frontonasal, en humanos, da origen a la
frente, centro de la nariz, filtrum del labio superior y paladar primario, incluyendo dientes
incisivos superiores; mientras que el proceso nasal lateral, forma el ala de la nariz(37).De
igual manera en otros mamíferos como el ratón esta prominencia da origen a los huesos
premaxilar, nasal, lacrimal, órbitoesfenoidal, etmoides y frontal(5). La prominencia
frontonasal en pollos, forma la premaxila, cartílago prenasal y otros elementos
esqueléticos del tercio medio y el proceso nasal lateral, forma los cornetes nasales(32).
Las prominencias maxilares en humanos dan origen a los extremos laterales del labio
superior, paladar secundario, hueso maxilar superior y dientes caninos, premolares y
molares. En ratones las prominencias maxilares dan origen a la maxila, huesos palatinos,
paladar secundario, hueso yugal y dientes superiores. Las estructuras originadas de los
procesos maxilares en pollo incluyen: hueso palatino, maxilar, yugal y hueso
queratoyugal(5, 59). La prominencia mandibular en humanos, da origen entonces al
cartílago de Meckel, mandíbula y dientes inferiores, al igual que en ratones(60). Mientras
que los derivados esqueléticos del proceso mandibular en pollos, incluyen los siguientes
Marco Teórico
10
seis huesos: angular, suprangular, articular, esplénico, dentario y mentomandibular (5, 59,
61).
La región del primordio mandibular experimenta varios eventos celulares que son claves
para la formación del cartílago de Meckel y de otros derivados esqueléticos. Entre los
estadios HH15-H16, las CCNC han poblado la región mandibular, y a partir de estos
estadios las interacciones entre el epitelio y el mesénquima son llevadas a cabo para
controlar la proliferación del mesénquima, que como se mencionó anteriormente es más
intensa hasta el estadio HH21(40, 53).En el estadio HH22, han sido identificadas células
precondrógenicas en la región del mesénquima mandibular, quienes posteriormente
contribuirán a la formación del cartílago de Meckel(62). A partir de HH24, los procesos de
condrogénesis y osteogénesis toman lugar de manera dependiente de las interacciones
epitelio mesénquima. Para el estadio HH25, el epitelio controla la diferenciación de células
mesénquimales a pre osteoblastos(63). El cartílago de Meckel es formado en HH26 y en
esta etapa de desarrollo las condensaciones preosteoblásticas empiezan a expandirse
como preparando el escenario para su posterior diferenciación a osteoblastos y
osteocitos(63, 64). A medida que avanza el desarrollo, las células mesénquimales dan
origen a hueso intramembranoso por osteogénesis directa hacia el estadio HH31 (7-7.5
días de incubación) y para el estadio HH40 (14 días) el hueso intramembranoso rodea el
cartílago de Meckel en toda su longitud(64).
1.2 Generalidades y componentes de la vía de señalización
Notch
La vía de señalización Notch es un mecanismo de señalización célula-célula conservado
evolutivamente, el cual participa en una variedad de procesos celulares como:
especificación de destino celular, proliferación, apoptosis, adhesión, transformación
epitelio- mesénquimal, migración , angiogénesis, mantenimiento de células madre y
homeostasis de tejidos adultos(65, 66).
El receptor de la vía Notch es una proteína transmembranal que recibe señales de
ligandos transmembranales que son expresados en células vecinas. Las señales que son
transducidas por estos receptores tienen un papel central en diversas etapas del
desarrollo embrionario(67). De manera significativa, tanto las deficiencias y anormales
aumentos de señalización Notch se han asociado con anomalías de desarrollo y cáncer
(68-70).
El gen Notch fue descubierto hace 90 años por Morgan y sus colegas, quienes
observaron que la pérdida parcial de función de este gen resultaba en muescas
(Notches) en el margen del ala de moscas de fruta (Drosophila Melanogaster) razón por la
cual el gen recibió recibe el nombre de Notch(71). Décadas más tarde, en experimentos
de pérdida de función, se encontró que Notch causaba un fenotipo "neurogénico", donde
las células destinadas a convertirse en epidermis cambiaban su destino para dar lugar a
tejido nervioso(72, 73). Posteriormente, los genes Notch fueron identificados en C.
elegans (LIN-12) y más tarde varios genes homólogos de la vía Notch han sido
identificados en aves, ratones y seres humanos, en donde cumplen funciones que al
parecer son conservadas evolutivamente durante el transcurso del desarrollo embrionario.
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
11
1.2.1 Componentes de la vía de señalización Notch
La vía de señalización Notch está integrada por diversos componentes, entre los cuales
podemos citar: receptores Notch, ligandos (DSL) y genes blanco (genes de la familia
bHLH) (Tabla 2).
1.2.1.1 Receptores Notch
El receptor Notch, es una glicoproteína transmembranal tipo I que aparece en la superficie
celular como un heterodímero unido no covalentemente. El receptor Notch está
compuesto de un dominio extracelular y un dominio intracelular (Fig4). El dominio
extracelular de este receptor Notch contiene 36 repeticiones parecidas a los factores de
crecimiento epidérmico (EGF-like) las cuales son esenciales para la unión del ligando y la
activación de la vía(18, 20). Especialmente las EGF-like 10 y 12 son esenciales para la
unión del ligando(74). Las EGF-like son seguidas por la región regulatoria negativa del
dominio extracelular o región NRR (Negative regulatory region) que está compuesta a su
vez por tres repeticiones ricas en cisteína, LNR (LIN12/Notch repeats) y un dominio HD
(Heterodimerization domain) que contiene el sitio del segundo clivaje(18, 75)(Fig4). La
región NRR es la encargada de mantener protegida la activación del receptor en ausencia
del ligando, gracias a un estado conformacional plegado que evita el clivaje del receptor
por la metaloproteasa ADAM/TACE(del inglés, Adesintegrin and metallopeptidase/tumour
necrosis factor a converting enzyme)(75).
El dominio intracelular está involucrado en la señalización celular y contiene múltiples
dominios de la proteína conservada(76). Esta región Intracitoplasmática del receptor
Notch posee los siguientes componentes: 1) un dominio RAM23 (del inglés, RBP-Jk
association module (RAM)Domain); 2) seis repeticiones de ankirinas (ANK) que están
flanqueadas por señales de localización nuclear que muchas veces también son
encontradas en el domio RAM23; 3) un dominio de trans-activación (TAD) y 4) una región
PEST rica en prolina (P), glutamina (E), serina (S) y treonina (T)(20, 77, 78)(Fig4). El
dominio RAM23 junto con las repeticiones ANK son las responsables de mediar la unión
del dominio intracelular de Notch (NICD, del inglés Notch Intracellular Domain) a el factor
de transcripción RBP-jk (Recombining binding protein–Kappa J), que también es llamado
CBF-1( Creb Bonding Factor-1) en mamíferos. Por otro lado, los dominios TAD y PEST
son sitios susceptibles de fosforilación por diferentes quinasas, necesarios para promover
la ubiquinación y degradación de NICD(18, 79)(Fig4).
Los receptores de la Vía Notch son una familia de proteínas conservadas en varias
especies. En Drosophila hay reportado un solo receptor Notch, mientras que en C.
Elegans se han reportado dos receptores (LIN-12 y GLP-1) y en mamíferos cuatro
receptores (Notch1 – 4). Por último, en aves como el pollo, han sido encontrados dos
receptores (Notch1 y 2)(18, 19)(ver tabla 2). La diferencia entre los receptores de estas
especies radica en el número de repeticiones EGF, siendo los receptores de mamíferos y
de Drosophila los que poseen la mayor cantidad de estas repeticiones(18, 80).
Marco Teórico
12
Figura4. Estructura del receptor y ligandos de la vía Notch. Adaptado de(20)
1.2.1.2 Ligandos canónicos de la Vía Notch
Las proteínas que hacen parte del grupo de ligandos de la Vía Notch son las
responsables de activar los eventos de señalización a través del contacto entre células
vecinas. Durante el estudio de la activación de la vía Notch, se ha encontrado que esta
puede ser activada tanto por ligandos canónicos como por ligandos no canónicos(81). Los
ligandos canónicos con dominios DSL (Delta, Serrate, Lag2), son los responsables de la
mayoría de efectos de la señalización Notch. Estos ligandos son proteínas de superficie
celular tipo I, que al igual que el receptor Notch poseen múltiples repeticiones parecidas al
factor de crecimiento epidermal (EGF, Epidermal Growth Factor) en su dominio
extracelular (ECD, extracelular Domain), y seguidamente un dominio DSL y en algunos
casos, dependiendo el tipo de ligando, una región rica en cisteína(20). La región DSL
junto con el modulo N- terminal y las dos primeras repeticiones EGF, son las
responsables de la unión al receptor Notch y propiciar su activación(81)(Fig4).
En Drosophila hay reportados dos tipos de ligandos conocidos como Serrate y dDelta. En
mamíferos, cinco homólogos de estos ligandos han sido reportados: tres ligandos Deltalike (DLL1, DLL3 y DLL4) y dos homólogos de Serrate, conocidos como Jagged1 (Jag1) y
Jagged2. En vertebrados como las aves hay reportados dos ligandos homólogos a
Serrate conocidos como Serrate1 y Serrate2. Con respecto a los homólogos de Delta en
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
13
vertebrados no mamíferos, tres tipos han sido descritos (delta-like1, x- delta-2 (Xenopus)
y Delta-Like4)(18, 82)(ver tabla2). De estos homólogos Delta, solo Delta-like1 y Deltalike4 han sido hallados en el pollo(19, 83, 84). En C. elegans cuatro ligandos pueden ser
encontrados (LAG-2, APX-1, ARG-1 y DSL-1).
Tabla.2 Componentes de la vía de señalización Notch. La vía de señalización Notch es
conservada evolutivamente entre Vertebrados e invertebrados con algunas diferencias en los
números de ligandos, receptores y genes diana.
Vertebrados(Pollo)
Mamíferos
Drosophila
M.
C.Elegans
Receptores
Notch1
Notch2
Notch1
Notch2
Notch3
Notch4
Notch
LIN-12
GLP-1
Ligandos
Serrate 1
Serrate2
Delta1
Delta4
Jagged1
Jagged2
Delta1
Delta3
Delta4
Hes1- 7
Serrate
APX-1
LAG-2
ARG-1
DSL-1
Componentes
Genes blanco
Hairy1 (Hes1)
Hairy2 (Hes2)
Hairy5 ( Hes5)
Hey1
Hey 2
HeyL
Delta
E(spl)bHLH
REF-1
Hey1
Hey2
HeyL
Adaptado de(18).
1.2.1.3 Hes y Hey: genes blancos de la Vía Notch
La activación de la vía Notch promueve la trascripción de varios genes blancos dentro de
estos, los genes Hes y Hey, pertenecientes a la familia bHLH (basic-Helix-Loop-Helix).
Hes y Hey son dos grupos de genes homólogos de Drosophila Hairy and Enhancer of
Split y Drosophila Hey, respectivamente(85, 86). La familia de genes Hes está integrada
por siete miembros que van desde Hes1 hasta Hes7(87) (Ver Tabla2). Los genes Hes
fueron descritos por primera vez como genes neurogénicos en Drosophila, ya que
embriones que carecían de la función de este gen mostraron un incremento en el número
de neuroblastos a expensas de precursores epidermales(88). A excepción de los genes
Hes2 y Hes3, el resto son considerados como genes blanco directos de las señales
canonícas de la vía Notch(89). Hes1,-3 y 5 mantienen células precursoras en un estado
indiferenciado durante el desarrollo y la vida adulta en varios tejidos como sistema
nervioso, páncreas y gliogénesis(90, 91). Por otro lado, Hes7 desempeña un papel
importante en la segmentación somítica y regula la expresión de varios genes durante el
Marco Teórico
14
desarrollo del ratón. Hes6 a diferencia de los otros genes, tiene la capacidad de inhibir la
actividad de Hes1 durante el desarrollo neural(87).
La familia de genes Hey está conformada por tres miembros llamados Hey1, Hey2 y HeyL, los cuales son requeridos de manera muy significativa durante el desarrollo vascular y
son conservados evolutivamente en diversas especies(85, 87)(ver tabla 2). Varias líneas
de evidencia han sugerido que los genes Hes y Hey son blancos directos de la vía Notch:
a) los promotores de Hes1, -5 y -7 al igual que de Hey1, Hey2 y HeyL, pueden ser
activados por la activación constitutiva de Notch(92), b) expresiones endógenas de Hey1
y Hey2 muestran una sobreregulación por NICD en distintas líneas celulares como
C2C12, 10T1/2, 293T y U2OS, c) en experimentos de co-cultivos con células que
expresan ligandos Notch, estos genes son regulados de manera positiva(72, 93) y d) al
adicionar DAPT, un inhibidor de la gamma secretasa a una línea celular de leucemia que
regularmente presenta una activación del receptor Notch, se comprobó por medio de
microarreglos que la expresión de genes Hes y Hey fue regulada negativamente(94).
1.3 Activación de la vía Notch
La activación de la vía de señalización Notch, depende sustancialmente de la interacción
entre dos células vecinas a través del contacto entre el ligando de una célula que envía
una señal, llamada célula señalizadora y el receptor de una segunda célula donde se
activará la expresión de los genes blanco de la vía Notch, llamada célula señalizada(95)
(Fig5). La activación del receptor Notch y su previo estado de maduración están
constantemente sometidos a diversos clivajes proteolíticos en distintos sitios de la
proteína, desde S1 (sitio de clivaje1) hasta S4(18-20, 95).
Inicialmente, después que la proteína precursora Notch se ha trasladado del retículo
endoplásmico al trans-Golgi, esta es reconocida por una Furina Convertasa en el S1
localizado en la NRR e inmediatamente es modifcada por una Nacetilglucosaminotransferasa, llamada Fringe. De esta forma se genera un receptor Notch
heterodimerico funcional el cual es trasladado a la superficie celular y quedando habilitado
para entrar en contacto con el ligando de la célula vecina(19, 96). La interacción directa
entre el ligado y el receptor Notch generan un cambio conformacional en este último que
resulta en la exposición del S2 ubicado en la NRR, el cual es reconocido y clivado por una
metaloproteasa identificada como ADAM/TACE17 (Fig5). Este clivaje da como resultado
la separación del dominio extracelular de Notch del resto de la proteína y la consecuente
internalización del NECD unido al ligando en la célula señalizadora por medio de un
proceso llamado trans-endocitosis(75, 97, 98)(Fig5). Este último evento ha sido
identificado como un proceso clave en el cambio conformacional y la activación del
receptor(98). Seguido a este segundo clivaje, el NICD que aún se encuentra unido a la
membrana es sometido a un tercer y cuarto clivaje en el S3/S4 localizados en el dominio
RAM, esta vez llevado a cabo por el complejo gamma-secretasa integrado por
presenilina1, NCT( Niscatrin), PEN2(presenilin enhacer2) y APH1(Anterior pharynx
defective 1)(20, 95). Este clivaje induce la traslocación del NICD al núcleo donde actuará
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
15
como factor de transcripción y activará varios genes blancos, dentro de estos los genes
Hes y Hey(20, 23)(Fig5).
Figura5. Activación canónica de la Vía Notch. La unión entre el ligando y el receptor de dos
células vecinas activa varios eventos de clivajes. El clivaje inmediato a la unión del ligando con el
receptor es mediado en S2 por una metaloproteasa ADAM/TACE que genera una separación entre
el dominio extracelular y el dominio intracelular del receptor Notch. El segundo y tercer clivaje
toman lugar en S2 y S3 mediados por el complejo Gamma Secretasa quien permite que el dominio
intracelular de Notch (NICD) se trasloque al núcleo donde genera el cambio de un complejo
correpresor a un complejo activador y se da lugar a la transcripción de los genes de la familia bHLH
(Hes y Hey). Adaptado de (20).
La regulación transcripcional de los genes Hes y Hey por la vía Notch requiere del cambio
de estado de un complejo co-represor a un complejo activador(19, 20). En ausencia de
NICD, un complejo co-represor es formado por el factor de transcripción de unión al ADN
CSL(CBF-1 en mamíferos, además conocido como RBP-j en Drosophila) que se une al
ADN y se asocia con una proteína co-represora que recluta una deacetilasa de
Histonas(HDAC) reprimiendo así la transcripción de los genes Hes y Hey(99). Cuando
NICD entra al núcleo, su unión a CSL parece producir un cambio alosterico que facilita el
desplazamiento de la proteína co-represora y posteriormente, la unión CSL/NICD, es
Marco Teórico
16
reconocida por Mastrmind Like (MAML), una proteína co-activadora(100, 101). De esta
forma, se pasa de un complejo co-represor a un complejo activador y la consecuente
remodelación de la cromatina(95). La activación transcripcional mediada por CSL parece
también depender de otras proteínas co-activadoras como P300 ó la proteína de unión a
CREB (CBP)(101).
La duración de la actividad transcripcional en la vía Notch, es mediada por MAML, quien
se encarga de reclutar una quinasa CDK8, que fosfarila a NICD en su dominio PEST,
haciéndola susceptible de ser ubiquitinada por Fbw7/Sel10 e inducir su degradación(19,
20, 95).
1.4 Implicaciones de la vía Notch en el desarrollo de
estructuras craneofaciales
Diversos estudios han mostrado que la vía de señalización Notch juega un papel
importante en el desarrollo de estructuras craneofaciales. Aunque, mutaciones en Jag2,
no han sido asociadas con enfermedades humanas que manifiesten alteraciones
craneofaciales, ratones con mutaciones homocigotas en jagged2 muestran defectos
craneofaciales como paladar fisurado y fusiones ectópicas entre el epitelio lingual y el
epitelio de los procesos palatinos(24). Varios autores han demostrado, que la expresión
epitelial de Jag2 durante el desarrollo del paladar en ratones, es necesaria para la
activación de Notch1 durante la diferenciación del epitelio oral(102). Normalmente, la
doble capa de células cuboides del epitelio oral se diferencia y genera una capa
superficial de células aplanadas o periderma. La señalización de Notch1 medida por jag2
es necesaria para la diferenciación de las células del periderma que cubren la lengua en
desarrollo y en las superficies lateral-orales de los procesos maxilares y
mandibulares(102). De esta forma, la presencia del periderma previene las adhesiones
prematuras entre los bordes de los procesos palatinos y otros tejidos orales y se facilita la
posterior elevación y adhesión normal entre los procesos palatinos(102). Jag2 también ha
sido asociado con otras vías de señalización como IRF6 en los procesos de diferenciación
y mantenimiento del periderma oral durante el desarrollo del paladar(103). Mutantes
compuestos Irf6+/R84C; Jag2+/∆DSL ,presentan paladar hendido y fusiones ectópicas entre los
procesos palatinos y el epitelio oral de la lengua y de los procesos maxilares, atribuidas
principalmente a una interrupción en el proceso de diferenciación del periderma oral(103).
Por otro lado, ratones con mutaciones heterocigotas compuestas Notch1/Dll3 presentan
anormalidades en el desarrollo de estructuras craneofaciales. Estas malformaciones
incluyen: disminución anteroposterior del paladar duro con reducción de la longitud y
altura mandibular, acompañadas por defectos de segmentación vertebral parecidas a las
encontradas en el síndrome de espondilocostosis. Adicionalmente, en estos mutantes se
han observado reducciones significativas en la expresión de genes importantes en el
desarrollo craneofacial como Id4 y Barx1(26).
Otros componentes de la vía Notch como Jag1 y Notch2, son involucrados en el síndrome
humano conocido como el síndrome de Alagille(104, 105). El síndrome de Alagille, es
causado por una haploinsuficiencia del gen JAG1(105), sin embargo, mutaciones en
NOTCH2 han sido identificadas en un subgrupo de pacientes con este síndrome(104). El
Patrones de expresión de Notch1, Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
17
síndrome de Alagille se caracteriza por alteraciones multiorgánicas y craneofaciales que
incluyen: frente ancha, barbilla puntiaguda, punta de la nariz bulbosa, apariencia facial de
triangulo invertido y craneosisnostosis ocasional(104, 106, 107).Varios modelos animales
como ratón y zebrafish han sido utilizados para modular las características del síndrome
de Alagille, dentro de estas las craneofaciales(108, 109).
El desarrollo de la cara en vertebrados también es dependiente de la regionalización de
las CCNC que aportan señales para establecer la identidad de los derivados esqueléticos
a los largo del eje dorso/ventral facial. En Zebrafish, Jag1b es expresado en la región
dorsal del arco hiodeo y mandibular, donde actúa a través del receptor Notch2 para
activar la expresión de gen diana hey1. De esta forma la señalización Notch2/Jag1b
promueve la identidad dorsal de los derivados esqueléticos del arco mandibular y Hiodeo
por represión de la expresión de genes de predominio ventral como dlx3b y dlx5a en la
región dorsal de los arcos faríngeos(110).
Con respecto al desarrollo de la bóveda craneal, jagg1 ha sido implicado en el
mantenimiento indiferenciado de células pre ontogénicas inmaduras durante el desarrollo
de las suturas craneales, garantizando así un desarrollo armonioso entre el crecimiento
del cerebro y el cierre de las suturas(111). Estos estudios han evidenciado que jagg1
funciona como un gen blanco del factor de transcripción Twist1 para regular la expresión
de genes como 𝜷-catenina, Smad 1/3/8, PrK1/2 implicados en la diferenciación de
osteoblastos de la bóveda craneal(111). De esta forma, jag1 mantiene indiferenciadas las
células precursoras osteoblásticas y por consiguiente la permanencia de las suturas
craneales. Mutaciones en jagg1 resultan entonces en un cierre prematuro de las suturas
coronales generando así un fenotipo de craneosinostosis como el ob(111).
El gen Hes1, uno de efectores más comunes de la vía Notch, también ha sido implicado
en el desarrollo de estructuras craneofaciales como hueso frontal, cartílago de Meckel,
duramadre, base de cráneo y paladar secundario. Mutaciones en este gen generan
ausencia del hueso frontal, reducción del tamaño mandibular por acortamiento del
cartílago de Meckel en formación, fisura palatina, y malformaciones del cerebro anterior,
así como también defectos en la formación del hueso pre esfenoides y una calcificación
deficiente de la base anterior y posterior del cráneo. Estos resultados indican que Hes1
controla procesos de diferenciación en precursores osteoblásticos derivados tanto de
células de la cresta neural craneal como del mesodermo(25).
Además de la implicación de la vía Notch en el desarrollo de estructuras como paladar,
suturas craneales y desarrollo de maxilares, varios componentes de esta vía de
señalización han sido identificados durante el desarrollo dental de ratones. Varios
estudios han evidenciado que los componentes de la vía de señalización Notch se
expresan durante el desarrollo dental de ratones. La expresión de Notch1, Notch2,
Notch3(112), Dll1(113), Jag1 (114) y Jag2(115, 116) prefiguran en el desarrollo dental en
la subdivisión de regiones ameloblásticas y no ameloblásticas en las etapas iniciales del
desarrollo dental. Esto se hace evidente durante la etapa de citodiferenciación, en la que
varios receptores Notch y varios de sus ligandos muestran patrones de expresión
complementarios: la expresión de Notch1 se limita al estrato intermedio, mientras que Dll1
Marco Teórico
18
y Jag2 están expresados en la capa adyacente al epitelio dental interno(113, 115, 116).
Del mismo modo, en el mesénquima dental, Dll1 se expresa en odontoblastos en proceso
de diferenciación, mientras que los genes Notch se expresan predominantemente en la
capa sub-odontoblástica(113). Estos resultados sugieren que los receptores y ligandos de
la vía Notch participan en los procesos de diferenciación celular durante el desarrollo
dental. Recientes estudios han analizado la expresión, regulación y función del gen Jag2
en desarrollo dental de ratones. Estos estudios han mostrado que Jag2 se expresa en las
células epiteliales que darán lugar a la producción de esmalte (ameloblastos) durante las
primeras etapas del desarrollo dental. Así mismo, en experimentos de recombinación
tisular se evidenció que la expresión de jag2 en el epitelio está regulada por señales
derivadas del mesénquima. Cultivos in vitro de explantes de epitelio dental muestran
como la aplicación local FGF estimula la expresión de Jag2, mientras que la aplicación de
BMP genera un efecto contrario. Ratones mutantes homocigotos Jag2 presentan una
variedad de anomalías dentales. En molares, la morfología de la corona es deforme, con
cúspides adicionales y en incisivos la citodiferenciación y la deposición de matriz de
esmalte es inhibida. Estos resultados demuestran que la vía Notch mediada por Jag2 es
indispensable para una correcta odontogénesis(117-119).
Los anteriores estudios muestran como la vía de señalización Notch tiene un rol
importante en el desarrollo de estructuras craneofaciales como paladar, derivados
esqueléticos maxilares, huesos de la bóveda craneal y estructuras dentales, sin embargo,
los patrones de expresión durante el desarrollo temprano de las prominencias faciales aun
son desconocidos.
19
Capitulo2. Patrones de expresión de Notch1,
Serrate2 y genes diana de la vía Notch en
prominencias faciales de embriones de pollo
(Gallus gallus)
2.1 Materiales y métodos
2.1.2 Obtención y Procesamiento de Embriones
Huevos de gallina fertilizados de la especies Gallus gallus fueron incubados a 38 °C entre
3, 3.5, 4 y 5 días para obtener embriones en estadios HH19, HH21, HH23 y HH25,
respectivamente. Los embriones fueron clasificados en los estadios mencionados de
acuerdo con los criterios definidos por Hamilton y Hamburger(7). Los embriones fueron
extraídos de los huevos y colocados en buffer salino de fosfato (PBS) fresco para su
limpieza previo a la fijación. La fijación se realizó por inmersión en paraformaldehido al 4%
en PBS entre 7-12 horas de acuerdo al estadio embrionario. Posteriormente los
embriones fueron deshidratados en una serie de lavados con concentraciones crecientes
de metanol en PBT (25%, 50%, 75% y 100%) y almacenados a -20 °C en metanol 100%
hasta su procesamiento para hibridización in situ.
2.1.3 Hibridización In situ
Se realizó hibridización in situ sobre embriones completos por triplicado para cada estadio
evaluado. Se utilizaron sondas de RNA antisentido marcadas con Digoxigenina-AP para
los genes Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1, previamente utilizadas(120-126)(Los plásmidos
que contienen los cDNA molde para la síntesis de las sondas fueron generosamente
donados por el Dr Fernando Giraldez del Grupo de investigación de Biología de Desarrollo
de la Universidad Pompeu Fabra – Parc Recerca Biomédica de Barcelona). Durante el
primer día los embriones fueron rehidratados en una serie de lavados con
concentraciones decrecientes de metanol en PBT (100, 75, 50%). Una vez rehidratados
los embriones fueron lavados 3 veces con PBT. Con el fin de facilitar la penetración de la
sonda a evaluar, los embriones fueron pretratados con Proteinasa K 10µg/ml a
temperatura ambiente por tiempos de 8, 15 y 25 min para los estadios de desarrollo
HH19, HH21, HH23 y HH25 respectivamente. Posteriormente los embriones fueron
lavados en PBT, posfijados en paraformaldehído al 4% fresco, lavados nuevamente en
PBT, luego preincubados en solución de hibridación por 10 min a 60°C e incubados toda
20
la noche con sondas antisentido a 60°C. Al segundo día, se realizaron 3 lavados
poshibridación con solución I (Formamida 50%, SSC 5X y SDS 1%) y solución II
(Formamida 50% y SSC 2X) por 30 min cada uno, seguido de lavados con TBST.
Finalmente, se realizó bloqueo de inespecificidad con solución de bloqueo (suero de oveja
+ Albumina sérica en TBST) por 3 horas a temperatura ambiente e incubación con
anticuerpo Anti-Dig (1: 5000 en Solución de bloqueo), toda la noche a 4°C. Con el objetivo
de eliminar los excesos de anticuerpo, en el tercer día, se realizaron 6 lavados con TBST
por 30 min y se dejaron los embriones toda la noche con agitación en TBST. Finalmente,
al cuarto día se realizaron 3 lavados con NTMT por 15 min cada uno y posteriormente la
visualización de los sitios de hibridación fue realizada a través de un sistema de detección
NBT (nitro-blue tetrazolium chloride) y BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate ptoluidine salt).Para mayor ampliación de los detalles metodológicos ver (Anexo A-G).
2.3.4 Procesamiento y obtención de secciones histológicas
Posterior al proceso de hibridación in situ, los embriones fueron sobrerevelados e
incluidos para crioseccionamiento. Previo a la inclusión en OCT (Optimal Cutting
Temperatura), los embriones fueron colocados en sucrosa al 5% por 30 min y
posteriormente lavados por 30 min con mezclas de sucrosa al 5% y 20%, con
proporciones 2:1, 1:1 y 1:2, respectivamente para cada concentración. Posteriormente, se
hicieron lavados en mezclas de sucrosa al 20% y OCT 100% con proporciones 2:1, 1:1 y
1:2, respectivamente. Finalmente, se realizó inclusión de los embriones en la tercera
mezcla (1:2, sacarosa 20% y OCT 100%) en hielo seco y almacenados a -70 °C para el
posterior crioseccionamiento. Se realizaron criosecciones semiseriadas de 16µm con
Criostato Leica CM1900 a -21° en los planos sagital y coronal.
2.3.5 Análisis de Patrones de Expresión
Se realizaron registros fotográficos panorámicos de embriones completos en
estereoscopio Zeeis Stemi 2000C con cámara AxioCam ERCs5 y de secciones
histológicas en microscopio Zeeis Axio Imager.D2m con cámara Axiocam Hmr3 para
identificar áreas de expresión de manera global y detallada por tejidos (Ectodermo Oral,
mesénquima derivado de células de la cresta neural y endodermo faríngeo). Se realizó
ajustes de brillo y contraste de imágenes con el programa Adobe Photoshop CS5.
21
2.2 Resultados
Se evaluaron los patrones de expresión para los genes Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1
durante el desarrollo de las prominencias faciales en embriones de pollo en los estadios
HH19, HH21, HH23 y HH25. La especificidad de las sondas sintetizadas en nuestro
laboratorio fue confirmada evaluando áreas de expresión previamente reportadas como
controles positivos en nuestras muestras. Así, la especificidad de la sonda para el gen
Notch1 fue establecida teniendo en cuenta la expresión del gen reportada previamente en
la vesícula ótica en HH14(120) (Fig6A, 6E). La expresión de Serrate2 por su parte, se ha
reportado en regiones intersomitícas de embriones de pollo en HH24/25(127) (Fig6B, 6F).
De igual manera, la expresión de Hes1 también se ha reportado en la región intersomitíca
en HH19(128) (Fig 6D y 6H). Finalmente, los transcritos de Hey1, fueron encontrados en
la vesícula ótica en HH19, tal y como lo han reportado previamente otros autores(121)
(fig6C, 6G). Estos resultados confirman la especifidad de las sondas utilizadas para este
trabajo.
Figura6. Especificidad de las sondas utilizadas para evaluar la expresión de los genes
Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en embriones de pollo. (A-D) patrones de expresión de Notch1,
Serrate2, Hey1 y Hes1 previamente reportados, (E-H), patrones de expresión obtenidos para los
mismos genes en el presente estudio. A y E, expresión de Notch1 en vesícula ótica en HH14. B y
F, expresión de Serrate2 en región intersomitíca en HH24. C y G, secciones coronales a nivel de
vesícula ótica. Se observa la expresión de Hey1 en el epitelio de la vesícula ótica. D y H, se
observa la expresión de Hes1 en región intersomitíca caudal en HH19.
22
2.2.1 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el
estadio HH19
En el estadio HH19, la región facial en embriones de pollo se caracteriza por la presencia
de tres prominencias faciales: prominencia maxilar (mx), prominencia mandibular (md),
prominencia frontonasal (pfn) y adicionalmente se evidencia la presencia de la fosita nasal
(fn). Se detectó expresión de todos los genes evaluados en estas tres prominencias,
excepto para Hes1 para el cual no se observó expresión alguna en la prominencia
frontonasal.
Específicamente, la expresión del gen Notch1, se detectó de manera generalizada en la
prominencia frontonasal, región ventral de prominencia maxilar, región ventral y dorsal de
la prominencia mandibular y la región ventral del segundo arco faríngeo (Fig7E).
Adicionalmente, también se observó expresión del gen en la región del telencéfalo,
mesencéfalo, bordes del romboencéfalo, región periocular y vesícula ótica (Fig7E) como
ha sido reportado previamente(127). Las secciones histológicas confirman la expresión de
Notch1 en las zonas descritas y además permiten determinar su localización específica en
el epitelio y mesénquima lateral adyacente de las prominencias maxilar y mandibular
(Fig7I).En la prominencia frontonasal, la expresión está restringida al epitelio que cubre el
proceso frontonasal y al epitelio de la fosita nasal (Fig7M).
La expresión del gen Serrate2, se detectó de manera generalizada en las prominencias
maxilar y frontonasal, región ventral de la prominencia mandibular y al igual que Notch1,
se detectó expresión en la región ventral del segundo arco faríngeo (Fig7F).La expresión
de Serrate2 también fue localizada en prosencéfalo, mesencéfalo, romboencéfalo y
vesícula ótica (Fig7B) como ha sido reportada previamente(127). De manera similar a
Notch1, los cortes histológicos muestran expresión de Serrate2 en el epitelio y
mesénquima de las prominencias maxilar y mandibular (Fig7J). De igual manera, en la
prominencia frotonasal los transcritos de Serrate2 fueron detectados en el epitelio nasal y
epitelio que cubre el proceso frontonasal, tal como se observó para Notch1 en este
estadio de desarrollo (Fig7N).
El gen Hey1, uno de los genes blancos directos de la Vía Notch, se expresa de manera
puntual en el borde ventral de la prominencia maxilar, región circunscrita de primera
hendidura faríngea, área más proximal de la prominencia mandibular, fosita nasal y región
ventral del segundo arco faríngeo(Fig7G). Adicionalmente, se puede observar la
expresión característica en el ganglio trigémino (Fig7G) como se ha reportado
previamente(129). Las secciones histológicas muestran que la expresión de Hey1 está
localizada específicamente en el ectodermo que recubre las prominencias maxilar y
mandibular (Fig7K). A nivel frontonasal, la expresión de Hey1 es evidente en células del
epitelio nasal (Fig7O). Este patrón de expresión se sobrelapa con el patrón observado
para los genes Notch1 y Serrate2 en este mismo estadio de desarrollo.
23
El gen Hes1, otro de los genes diana de la Vía Notch, también se expresa durante el
desarrollo facial temprano. La expresión de Hes1 se observa en el borde caudal de la
prominencia maxilar y borde cefálico de la prominencia mandibular, que confrontan uno al
otro (Fig7H). No se observa expresión de este gen en la prominencia frontonasal y fosita
nasal. Sin embargo, es evidente la expresión de este gen en la segunda hendidura
faríngea (Fig7H). Los cortes coronales a nivel de las prominencias maxilar y mandibular
muestran expresión del gen Hes1 en el epitelio que recubre ambas prominencias
(Fig7L).Secciones sagitales a nivel de la prominencia frontonasal y fosita nasal no
evidencian expresión de Hes1 (Fig7P).
2.4.2 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el
estadio HH21
En el estadio de desarrollo HH21 las prominencias faciales, han experimentado un
aumento en su tamaño y además han adquirido una mayor definición morfológica.
Durante este estadio, los componentes de la vía Notch se siguen expresando. El marcaje
observado para Notch1 fue menos intenso que en los estadios anteriores en las
prominencias maxilar, mandibular, prominencia frontonasal, fosita nasal y segundo arco
faríngeo. Sin embargo, se mantuvo el mismo patrón de expresión observado en HH19
(Fig8E, 8M). Mediante secciones histológicas se determinó que la expresión en la
prominencia maxilar se localiza tanto en epitelio como en mesénquima lateral adyacente,
similar al patrón observado en HH19 (Fig8Q). En la prominencia mandibular, aunque el
marcaje es menos intenso que en HH19, la señal se observa en el epitelio y mesénquima
lateral adyacente (Fig8Q).Las secciones sagitales de la prominencia frontonasal,
muestran un marcaje intenso en todo el epitelio que recubre la prominencia frontonasal y
en células del epitelio nasal (Fig8I).
La expresión de Serrate2, se observó en el borde ventral de la prominencia maxilar, fosita
nasal, prominencia mandibular y segundo arco faríngeo (Fig8F).Las secciones
histológicas muestran que la expresión de Serrate2 está localizada específicamente en el
epitelio nasal, y en el epitelio y mesénquima lateral adyacente de las prominencias
maxilares y mandibulares (Fig8J, 8R). En comparación con HH19, en HH21 las células
mesénquimales dela prominencia maxilar muestran relativamente mayores niveles de
expresión deSerrate2.
A medida que avanza el desarrollo, Hey1 se expresa en toda la prominencia maxilar. En
la prominencia mandibular, la expresión antes circunscrita a la primera hendidura faríngea
en HH19, ahora se puede observar hacia la región más dorsal (Fig8G). La expresión de
este gen en la fosita nasal es semejante a la observada en HH19. Adicionalmente se
puede observar que Hey1 en este estadio también se expresa en la masa frontonasal
(Fig8G, 8O) y región más caudal del segundo arco faríngeo (Fig8G). Los cortes
histológicos confirmaron que los transcritos de Hey1 están localizados específicamente en
el epitelio lateral de la prominencia maxilar y en el mesénquima y epitelio lateral de la
prominencia mandibular (Fig8S). Al igual que Notch1, las secciones sagitales a nivel de la
24
prominencia frontonasal, evidencian la expresión de Hey1en epitelio nasal y ectodermo
que recubre la prominencia frontonasal (Fig8K).
Figura7. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en prominencias faciales
durante el estadio HH19. Hibridación in situ sobre embriones completos. (A-D)Vista lateral
panorámica. (E-H) Ampliación de A-D muestra detalle de las prominencias y arcos branquiales
como muestra el recuadro en A. (I-L) Criosección coronal a nivel de las prominencias maxilar y
mandibular. (M-P) Criosección sagital a nivel de la prominencia frontonasal y fosita nasal. (A, E, I,
M) Patrón de expresión Notch1. (B, F, J, N) Patrón de expresión Serrate2. (C, G, K, O) Patrón de
expresión Hey1. (D, H, L, P) Patrón de expresión Hes1. Epitelio (ep), mesénquima (m),
mesencéfalo (MS), procencefalo (PS), prominencia frontonasal (pfn), fosita nasal (fn), epitelio de la
fosita nasal (efn) prominencia maxilar (mx), prominencia mandibular(md), romboencéfalo (RE)
segundo arco faríngeo(II), ganglio trigémino (tg). Las flechas señalan las zonas de expresión del
marcador evaluado y las cabezas de flecha marcan expresión exclusiva del mesénquima .Barra en
100µm
25
La expresión de Hes1 fue evidente en la fosita nasal y en el borde ventral de las
prominencias maxilar, mandibular y segundo arco faríngeo (Fig8H, 8P). Las secciones
histológicas mostraron que estas señales están localizadas específicamente en el epitelio
nasal y en el epitelio que recubre la prominencias maxilar y mandibular (Fig8L ,8T).
2.4.3 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el
estadio HH23
En este estadio de desarrollo, de los cuatro genes componentes de la vía Notch
evaluados, solo Notch1, Serrate2 y Hey1 se expresaron en las prominencias faciales. La
expresión de Notch1, conserva un patrón semejante al descrito para el estadio HH21. Es
decir, su expresión se observa en toda la prominencia frontonasal, proceso nasal lateral,
fosita nasal, región ventral de la prominencia maxilar, prominencia mandibular y segundo
arco faríngeo (Fig9E, 9M). Sin embargo, a diferencia de HH21, las criosecciones
coronales a nivel de las prominencias maxilar y mandibular muestran restricción de la
expresión de Notch1 al mesénquima maxilar y mandibular. El marcaje en estas zonas es
más intenso hacia la región más lateral y como se mencionó anteriormente está excluido
del epitelio en ambas prominencias (Fig9Q). En la prominencia frontonasal, los transcritos
siguen ubicándose en el ectodermo que recubre la masa frontonasal y en el epitelio nasal
(Fig9I). Adicionalmente, se detectó expresión de Notch1 en otras estructuras como se ha
descrito previamente en el telencéfalo, mesencéfalo, bordes romboencefálicos, bordes
apicales de los esbozos de extremidades superiores e inferiores(127) y en todo el tubo
neural(130)(Fig9A).Serrate2, se expresa en la fosita nasal, borde ventral de la
prominencia maxilar y prominencia mandibular. Aunque el marcaje es de menor
intensidad también se observa expresión de Serrate2 en el segundo arco faríngeo (Fig9F,
9N).Las criosecciones muestran que la expresión de Serrate2 está localizada en el
epitelio nasal y en el mesénquima más lateral de las prominencias maxilar y mandibular
(Fig9J y 9R).
Los transcritos de Hey1 fueron detectados en toda la prominencia maxilar, fosita nasal, en
un área específica localizada en la región dorsal de la prominencia mandibular y en la
región ventral de la misma prominencia. Además se detectó expresión de Hey1 en el
segundo arco faríngeo (Fig9G y 9O). En este estadio de desarrollo, las señales de Hey1
al igual que Serrate2 y Notch1 están localizadas en el epitelio nasal (Fig9K).Por otro lado,
en la prominencia maxilar los trascritos de Hey1, se localizan en el epitelio lateral y
mesénquima lateral en contacto, al igual que en la prominencia mandibular (Fig9S).
Hes1, no fue detectado en las prominencias frontonasal, maxilar y mandibular (Fig9H, 9L,
9P y 9T), pero si se observó expresión en la zona caudal del segundo arco faríngeo
(Fig9D). La expresión de Hes1 también se observó en las extremidades inferiores y
regiones intersomitícas (Fig9D).
26
Figura8. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en prominencias faciales
durante el estadio HH21. Hibridación in situ sobre embriones completos. (A-D)Vista lateral
panorámica. (E-H) Ampliación de A-D muestra detalle de las prominencias y arcos branquiales
como muestra el recuadro en A. (I-L) Criosección sagital a nivel de la prominencia frontonasal y
fosita nasal. (M-P)Detalle vista frontal. (Q-T)Criosecciones coronales a nivel de la prominencia
maxilar y mandibular. (A, E, I, M, Q) Patrón de expresión Notch1. (B, F, J, N, R) Patrón de
expresión Serrate2. (C, G, K, O, S) Patrón de expresión Hey1. (D, H, L, P, T) Patrón de expresión
Hes1. Epitelio (ep), mesénquima (m), mesencéfalo (MS), prominencia frontonasal (pfn), fosita nasal
(fn), prominencia maxilar (mx), prominencia mandibular(md), romboencéfalo (RE) segundo arco
faríngeo(II). Las flechas señalan las zonas de expresión del marcador evaluado y las cabezas de
flecha marcan expresión exclusiva del mesénquima. Barra en 25µm para whole mount y 100µm
para secciones coronales y sagitales.
27
2.4.4 Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en el
estadio HH25
El estadio HH25, se caracteriza por la presencia de condensaciones de células
mesénquimales precursoras de tejidos condrogénicos, como aquellas que darán lugar al
cartílago de Meckel(4, 131). Al igual que en HH23, Notch1, Serrate2 y Hey1 continúan
expresándose en las prominencias faciales con patrones semejantes. La expresión de
Notch1, se observa en la fosita nasal, proceso nasal lateral, prominencia maxilar y
mandibular (Fig10E y 10M). Los cortes sagitales a nivel de la fosita nasal muestran la
presencia de transcritos de Notch1 en las células del epitelio nasal (Fig10I).Los cortes
coronales a nivel de las prominencias maxilar y mandibular permiten identificar expresión
de Notch1 en el epitelio lateral y mesénquima de las prominencias maxilar y mandibular
(Fig10Q).
Los transcritos de Serrate2, se localizan en la región dorsal de la prominencia mandibular
(Fig10F, 10N). Específicamente, las secciones coronales muestran que esta señal está
localizada en el mesénquima lateral de la prominencia mandibular (Fig10R). A diferencia
de HH23, no se observa expresión de Serrate2 en la prominencia maxilar, prominencia
frontonasal ni en la fosita nasal (Fig10J, 10R).
A pesar que Hey1 presenta un patrón de expresión semejante al observado entre HH21 y
HH23, el marcaje parece ser más intenso en este estadio de desarrollo. Este fenómeno se
observa en la fosita nasal y en la región dorsal del proceso mandibular (Fig10G, 10O). Sin
embargo, a diferencia de HH21 y HH23, en este estadio no se detectó expresión de Hey1
en la prominencia maxilar. Las secciones sagitales a nivel de la fosita nasal muestran que
la expresión está restringida al epitelio de la fosita nasal (Fig10K). En los cortes coronales
a nivel de las prominencias maxilar y mandibular, los transcritos se localizan
específicamente en mesénquima lateral inmediatamente adyacente de la prominencia
mandibular. Adicionalmente, en esta misma prominencia la expresión de Hey1 se observa
en condensaciones mesénquimales que parecen sobrelaparse con las señales
observadas para Notch1 en este mismo estadio de desarrollo (Fig10S). En este estadio
de desarrollo no se observa expresión de Hes1 en las prominencias maxilar, mandibular,
frontosal, ni fosita nasal (Fig10H, 10L, 10P y 10T).
Con el objetivo de resumir los patrones de expresión encontrados para cada gen evaluado
durante el desarrollo de las prominencias maxilar, mandibular, frontonasal y fosita nasal,
se muestra la distribución temporo-espacial de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en la
Tabla3.
28
.Figura9. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en prominencias faciales
durante el estadio HH23. Hibridación in situ sobre embriones completos. (A-D)Vista lateral
panorámica. (E-H) Ampliación de A-D muestra detalle de las prominencias y arcos branquiales
como muestra el recuadro en A. (I-L) Criosección sagital a nivel de la prominencia frontonasal y
fosita nasal; se observa esquema que ilustra el nivel de las secciones. (M-P)Detalle vista frontal.
(Q-T)Criosecciones coronales a nivel de la prominencia maxilar y mandibular; se observa esquema
que ilustra el nivel de las secciones. (A, E, I, M, Q) Patrón de expresión Notch1. (B, F, J, N, R)
Patrón de expresión Serrate2. (C, G, K, O, S) Patrón de expresión Hey1. (D, H, L, P, T) Patrón de
expresión Hes1. Epitelio (ep), mesénquima (m), prominencia frontonasal (pfn), fosita nasal (fn),
prominencia maxilar (mx), prominencia mandibular (md) segundo arco faríngeo (II). Las flechas
señalan las zonas de expresión del marcador evaluado y las cabezas de flecha marcan expresión
exclusiva del mesénquima. Barra en 25µm para whole mount y 100µm para secciones coronales y
sagitales.
29
Figura10. Patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en prominencias faciales
durante el estadio HH25. Hibridación in situ sobre embriones completos. (A-D)Vista lateral
panorámica. (E-H) Ampliación de A-D muestra detalle de las prominencias y arcos branquiales
como muestra el recuadro en A. (I-L) Criosección sagital a nivel de la prominencia frontonasal y
fosita nasal; se observa esquema que ilustra el nivel de las secciones. (M-P)Detalle vista frontal.
(Q-T)Criosecciones coronales a nivel de la prominencia maxilar y mandibular; se observa esquema
que ilustra el nivel de las secciones. (A, E, I, M, Q) Patrón de expresión Notch1. (B, F, J, N, R)
Patrón de expresión Serrate2. (C, G, K, O, S) Patrón de expresión Hey1. (D, H, L, P, T) Patrón de
expresión Hes1. Epitelio (ep),epitelio de la fosita nasal (efn), mesénquima (m), prominencia
frontonasal (pfn), fosita nasal (fn), prominencia maxilar (mx), prominencia mandibular (md) segundo
arco faríngeo (II). Las flechas señalan las zonas de expresión del marcador evaluado y las cabezas
de flecha marcan expresión exclusiva del mesénquima. El asterisco, indica área de condensación
mesénquimal. Barra en 25µm para whole mount y 100µm para secciones coronales y sagitales.
30
Tabla 3. Consolidación temporo-espacial de los patrones de expresión de Notch1, Serrate2,
Hey1 y Hes1 en prominencias faciales. Las cruces (+) marcan la presencia del marcador en la
estructura señalada para cada gen evaluado. Epitelio de la fosita nasal (efn), epitelio (ep), fosita
nasal (fn), estadios de desarrollo según Hamilton y Hamburguer (HH), mesénquima (m),
prominencia maxilar (Mx), prominencia mandibular (Md), prominencia frontonasal (Pfn).
Genes
Md
Pfn
Serrate2
Hey1
Hes1
Estadio HH
Estadio HH
Estadio HH
Estadio HH
19
21
ep
+
+
m
+
+
ep
+
+
m
+
+
+
ep
+
+
+
+
+
+
Estructuras
Mx
Notch1
23
+
25
19
21
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
23
25
19
21
23
+
+
+
+
19
21
+
+
+
+
23
25
+
+
+
25
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
m
fn
efn
+
+
+
+
+
+
+
2.5 Discusión
El desarrollo adecuado de las estructuras faciales en vertebrados, es el resultado de la
interacción de varias vías de señalización, dentro de las cuales se destacan WNT, SHH,
FGF y BMP, entre otras(32, 132). Sin embargo, la red de interacciones necesarias para el
desarrollo craneofacial aún está incompleta. Por esta razón, este estudio tuvo como
objetivo determinar la contribución de la vía NOTCH durante el desarrollo facial mediante
el análisis de los patrones de expresión de algunos genes componentes de la vía.
Específicamente, se analizaron el gen que codifica para el receptor Notch1, el ligando
Serrate2 y los genes diana de la vía NOTCH, Hes1 y Hey1, durante el desarrollo las
prominencias faciales en embriones de pollo en estadios desde HH19 hasta HH25. La
evaluación de los patrones de expresión de los diferentes componentes de la vía, permite
conocer dónde y en qué momento del desarrollo facial, la vía NOTCH puede ser relevante
para el proceso. Así mismo, el establecimiento de la relación temporo-espacial de la
expresión de los componentes de vía NOTCH pueden sugerir las interacciones
especificas entre receptores, ligandos y genes blanco de la misma vía. Es importante
aclarar que en el presente estudio solo se evaluaron un número limitado de componentes
31
de la vía NOTCH, de tal manera que los hallazgos descritos solo muestran un panorama
parcial de la vía en el desarrollo facial. La evaluación de los patrones de expresión de
otros componentes de la vía NOTCH que complementarán este estudio están en progreso
dentro de la línea de investigación en Crecimiento y Desarrollo Craneofacial de la
Maestría en Odontología en la Universidad Nacional de Colombia.
2.5.1 La relación temporo-espacial de los patrones de expresión entre
Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 sugieren un potencial papel de la vía
Notch en el desarrollo temprano de las prominencias maxilar y
mandibular
Durante el desarrollo de las prominencias maxilar y mandibular, altos niveles de
proliferación mesénquimal han sido identificados en los estadios de desarrollo desde
HH19 hasta HH21, mediados por interacciones epitelio-mesénquima(40, 53). Sin
embargo, a medida que avanza el desarrollo, estos niveles de proliferación van
descendiendo como consecuencia del inicio de procesos de diferenciación de las células
del mesénquima maxilar y mandibular, que darán origen al esqueleto facial derivado de
estas prominencias(40). Durante los estadios HH21 y HH22 células pre-condrogénicas
han sido identificadas en el mesénquima mandibular(63). Estas células posteriormente se
diferencian a condrocitos pre-hipertróficos aproximadamente entre HH23 y HH25.
Finalmente estas células se diferenciarán a condrocitos hipertróficos dando origen al
cartílago de Meckel hacia el estadio HH26(64). El proceso de condrogénesis al igual que
los eventos de proliferación celular va a depender de las interacciones entre el epitelio y
el mesénquima lateral adyacente (133). En el presente estudio se identificó co-expresión
entre los genes Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en el epitelio que recubre las
prominencias maxilar y mandibular durante los estadios de desarrollo HH19 y HH21
(Fig11A, 11B, Tabla 3). Por otro lado, la expresión de Notch1 y Serrate2 también se
sobrelapa en el mesénquima maxilar y mandibular en estos mismos estadios de
desarrollo, con la particularidad que en HH21, la expresión de Hey1 empieza a
sobrelaparse con Notch1 y Serrate2. Estos hallazgos coinciden con los mayores eventos
de proliferación mesénquimal de las prominencias maxilar y mandibular(40), sugiriendo
una probable participación de la vía Notch en este proceso. De esta forma, una probable
interacción entre el receptor Notch1 y el ligando Serrate2 podrían estar activando la
transcripción de los genes Hey1 y Hes1 en el epitelio maxilar y mandibular. Por otro lado,
desde el mismo mesénquima la interacción entre el receptor Notch1 y el ligando Serrate2
puede estar mediando la proliferación del mesénquima mediante la activación de otros
genes blanco de la vía NOTCH no evaluados en este estudio. De la misma manera, la
expresión simultanea de Notch1 y Serrate2 y la ausencia de expresión de Hes1 y Hey1
en el mesénquima maxilar en el estadio HH19 y HH21, sugieren la activación de otros
genes blanco que podrían estar involucrados en la estimulación de la proliferación en el
mesénquima maxilar durante estos estadios. Acorde con los resultados obtenidos, en el
modelo de ratón, se ha reportado la expresión de Jagged2 en todo el ectodermo de las
prominencias maxilares y mandibulares en los estadios de desarrollo E9.5- E10.5
correspondiente con los estadios de desarrollo HH19 y HH21, evaluados en el presente
estudio en el modelo de pollo (24). Otros estudios en el modelo animal de ratón han
detectado a través de Hibridación In situ la co-expresión de notch1 y serrate2 en células
ectodérmicas laterales que recubren la prominencia maxilar, prominencia mandibular,
procesos palatinos y lengua durante el desarrollo del paladar en los estadios desde E12.5
- E14.5(102). Aunque estos estadios de desarrollo no corresponden con los evaluados en
32
el presente estudio, en estos estadios más tardíos del desarrollo facial, se demostró que
el ligando Serrate2 es necesario para la activación del receptor Notch1 en los procesos de
proliferación y diferenciación del periderma oral, previniendo así, la fusión de los procesos
palatinos con la lengua y de los procesos maxilares con los mandibulares(102).
Por otro lado, a partir de HH21 hasta HH25 se observó co-expresión de Notch1, Serrate2
y Hey1 en el mesénquima mandibular lateral (Fig11B, 11C, 11D y Tabla 3). Estos
resultados se correlacionan con el inicio del proceso de condrogénesis en la prominencia
mandibular, sugiriendo la probable participación de la vía Notch en este proceso celular a
través de la interacción entre el receptor Notch1 y el ligando Serrate2 en la activación
transcripcional de gen diana Hey1 en el mesénquima mandibular. Sin embargo, la
ausencia de expresión de Serrate2 en las condensaciones mesénquimales claramente
demarcadas por la expresión de Notch1 y Hey1 en HH25 (Fig11D) en la prominencia
mandibular, sugieren la participación de otro ligando de la vía NOTCH, no evaluado en
este estudio. Acorde con estos hallazgos, estudios previos han descrito la expresión de
Notch1 en el mesénquima lateral del proceso mandibular en embriones de ratón, durante
el estadio de desarrollo E10.5 (correspondiente al estadio HH25 en pollo), cuando sucede
la condrogénesis(134). Adicionalmente, en estudios In Vitro de células de cresta neural
mesencefálica murina que pueblan el mesénquima mandibular, se ha determinado que
Notch1 posee funciones opuestas durante las fases de condrogénesis. Inicialmente,
Notch1 es necesario para inducir la especificación de condrocitos pre-hipertróficos a partir
de CCN mesencefálica, pero posteriormente inhibe la diferenciación de condrocitos prehipertróficos a condrocitos hipertróficos(134). Estudios adicionales han demostrado la
participación de Notch1 durante la condrogénesis en cartílago murino, cartílago de
extremidades aviar y células de medula ósea humana(135-137). Por otro lado, se ha
evidenciado que Hey1 es necesario para iniciar el proceso de condrogénesis temprana
en células de médula ósea humana y favorecer la formación de condrocitos hipertróficos
en modelos de ratón(138, 139). Además, en células de medula ósea humana se ha
mostrado como Notch1 y Hey1 favorecen conjuntamente la formación de condensaciones
celulares condrogénicas(137). La correlación entre el periodo de condrogénesis
mandibular y los patrones de expresión observados para Notch1, Serrate2 y Hey1 en el
mesénquima mandibular desde HH21 hasta HH25, en conjunto con los reportes que
evidencian la participación de la vía Notch en este proceso celular, sugiere alguna
participación de estos componentes evaluados en la condrogénesis mandibular.
2.5.2 Vía Notch en el desarrollo del epitelio nasal y su papel potencial
en el establecimiento del FEZ
El desarrollo de la prominencia frontonasal está regulado por un grupo de señales
provenientes de dos centros de señalización localizados en el epitelio nasal y la FEZ
(Zona ectodermal frontonasal)(29, 55, 140, 141). Es en estos centros de señalización
donde se concentran la secreción de varias moléculas como FGF8, BMP y SHH,
involucradas en mediar procesos de proliferación y apoptosis del mesénquima nasal
33
Figura11. Resumen temporo-espacial de la expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en
las prominencias maxilar y mandibular desde HH19 hasta HH25. (A-D) Esquemas de cortes
coronales a nivel de las prominencias maxilar y mandibular en los estadios indicados. A, Observe
la expresión simultanea de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en epitelio de las prominencias maxilar
y mandibular. Además se evidencia co-expresión de Notch1 y Serrate2 en el mesénquima maxilar
y mandibular en HH19 B, Observe el mismo patrón de expresión que en HH19, con la diferencia
que Hey1 empieza a expresarse en el mesénquima mandibular lateral en HH21. C, Observe
expresión simultanea de Notch1, Serrate2 y Hey1 en el mesénquima maxilar y mandibular.
Adicionalmente solo se puede apreciar expresión de Hey1 en el epitelio maxilar y mandibular en
HH23. D, Observa expresión simultanea de Notch1, Serrate2 y Hey1 en el mesénquima mandibular
lateral. Note la expresión simultánea de Notch1 y Hey1 en condensaciones mesénquimales en la
prominencia mandibular. Observe la expresión de Notch1 tanto en epitelio como en mesénquima
maxilar en HH25. Epitelio (ep), mesenquima (m), prominencia maxilar (Mx), prominencia
mandibular (Md).
34
lateral(29, 55). En el presente estudio, Notch1, Serrate2 y Hey1 se expresan
simultaneamente en el epitelio nasal desde HH19 hasta HH25, exceptuando Serrate2 en
este ultimo estadio de desarrollo (Fig12A, 12B, 12C, 12D). La expresión de los
marcadores evaluados en estas etapas de desarrollo se correlacionan con procesos de
diferenciación de celulas del epitelio nasal y con el papel del epitelio nasal en el desarrollo
del mesenquima nasal lateral (29). Los resultados obtenidos proveen información
suficiente para hipotetizar que la vía Notch a través de la interacción entre el receptor
Notch1 y el ligando Serrate2 activan la transcripción de Hey1 en el epitelio nasal dónde
puede tener dos posibles roles:1) Participar en el desarrollo del nervio olfatorio mediando
los procesos de determinación de destino celular de células epiteliales a neuronas
olfatorias y células gliales olfatorias y 2) regular señales provenientes del epitelio nasal
participando indirectamente en el patronamiento de derivados esqueléticos del proceso
nasal lateral.
Por otro lado, transcritos de Notch1 y Hey1 fueron detectados en el epitelio frontonasal
durante el estadio de desarrollo HH21 (Fig12B). Estos patrones de expresión coinciden
con las etapas en que se establece la FEZ en las aves(141). En pollos, la FEZ se
establece entre los estadios HH20-HH22. Este centro de señalización es conservado
entre aves y mamíferos y está involucrado en controlar la polaridad dorso-ventral y la
extensión próximo-distal de la masa frontonasal(141). Los resultados obtenidos, permiten
sugerir que Notch1 y Hey1 participan durante el establecimiento de la FEZ. Dada la
ausencia de expresión del gen Serrate2 en este centro de señalización, se sugiere la
posible participación de otros ligandos componentes de la vía Notch no evaluados.
35
Figura12. Esquema resumen de los patrones de expresión de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1
en la prominencia frontonasal y epitelio nasal durante los estadios desde HH19 hasta HH25.
(A-D) Esquemas de cortes sagitales a nivel de la prominencia frontonasal y fosita nasal. A, observe
expresión simultanea de Notch1, Serrate2 y Hey1 en el epitelio nasal en el estadio HH19.
Adicionalmente Notch1 y Serrate2 se expresan simultáneamente en el epitelio que recubre la
prominencia frontonasal. B, Expresión simultanea de Notch1, Serrate2, Hey1 y Hes1 en epitelio
nasal. Notese la expresión de Notch1 y Hey1 en el epitelio de la prominencia frontonasal que
conforma el centro de señalización FEZ en el estadio HH21. C, Se mantiene la expresión
simultanea de Notch1, Serrate2, Hey1 en el epitelio nasal en el estadio HH23. D, Expresión de
Notch1 y Hey1 en en epitelio nasal en HH25. Epitelio nasal (en), epitelio (ep), zona ectodermal
frontonasal (FEZ) prominencia frontonasal (Pfn), prominencia maxilar (Mx).
36
Capitulo3. Conclusiones y recomendaciones
3.1 Conclusiones
El desarrollo de las prominencias faciales es dirigido por la participación de diversas vías
de señalización celular que en conjunto orquestan la morfogénesis facial. En la presente
investigación se han identificado patrones de expresión de varios componentes de la vía
Notch durante el desarrollo de las prominencias faciales, que nos han permitido llegar a
las siguientes conclusiones:
1. Los genes Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 se expresan durante el desarrollo
temprano en las prominencias maxilar, mandibular y frontonasal, sugiriendo un rol
potencial de estos componentes en la morfogénesis facial.
2. La expresión simultanea de Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1, en células epiteliales
que recubren las prominencias maxilar y mandibular en los estadios de desarrollo
HH19 y HH21, como también la co-expresión de Notch1, Serrate2 y Hey1 en el
mesénquima mandibular y el epitelio nasal desde HH21-HH25, sugieren que la
activación de la vía Notch se hace a través de la interacción receptor Notch1ligando Serrate2 que produce la activación transcripcional de los genes Hes1 y
Hey1 en estos tejidos.
3. El establecimiento del uso del modelo embrionario de pollo dentro del grupo de
investigación en Crecimiento y Desarrollo Craneofacial de la Maestría en
Odontología constituye una herramienta fundamental y favorable para el desarrollo
y fortalecimiento de la línea y grupo de investigación por su fácil manejo y
accesibilidad económica. Estudios adicionales en este modelo animal permitirán
comprender los procesos involucrados en la génesis de las malformaciones
craneofaciales humanas.
Conclusiones y Recomendaciones
37
3.2 Recomendaciones
Los resultados obtenidos sugieren un potencial rol de los genes componentes de la vía de
señalización Notch, Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 durante el desarrollo de las
prominencias faciales y de cada uno de los procesos celulares que en ellas se
desarrollan. Por lo tanto se plantean las siguientes recomendaciones:
1. Evaluar mediante Hibridación In Situ los patrones de expresión de otros genes
componentes de la vía Notch. Se sugieren particularmente Notch2, Serrate1,
Delta1, Delta4 y Hes5 con el fin de establecer un mapa de los patrones expresión
de los gene componentes de la vía NOTCH durante el desarrollo facial.
2. Realizar estudios de pérdida y ganancia de función e identificar los roles de
Notch1, Serrate2, Hes1 y Hey1 en procesos celulares como proliferación,
apoptosis y diferenciación durante el desarrollo temprano y tardío de las
prominencias faciales.
3. Realizar estudios de pérdida y ganancia de función que permitan esclarecer la
potencial función de Notch1, Serrate2 y Hey1 durante el desarrollo de la
prominencia frontonasal y el epitelio nasal.
4. Evaluar la probable participación de mecanismos epigenéticos involucrados en la
regulación transcripcional de los genes componentes de la vía Notch evaluados
durante el desarrollo de las prominencias faciales
Anexos
Anexos
Anexo A - Obtención, fijación y almacenamiento de embriones de pollo
en estadios HH19- HH25.
Se incubaron huevos fértiles de la especie Gallus gallus a 38 º C y se obtuvieron
embriones en estadios HH19, HH21, HH23 y HH25. La clasificación de los estadios se
realizó basados en los criterios de Hamburger y Hamilton mediante visualización por
estereoscopio de luz(7). Los embriones son disecados de las membranas
extraembrionarias en solución salina de buffer de fosfato (PBS), fijados en
paraformaldehido al 4% (PFA) y se almacenan en metanol a -20 º C hasta su posterior
procesamiento (13, 142).
Protocolo:
1. Posterior a eliminar las membranas extra embrionarias con pinzas de disección, los
embriones se fijan en paraformaldehído/PBS 4% a 4 °C por un tiempo de 12 horas. El
PBS es preparado previamente con H2O/DEPC (dietilpirocarbonato) para evitar la
degradación del RNA histico por enzimas RNAasas (1 ml de DEPC para 1l de H2O)
2. Un lavado en PBT durante 5 minutos con agitación suave.
3. Deshidratación de los embriones en series de metanol en PBT (25%, 50%, 75%, 100%
de metanol) por 5 minutos en cada serie.
4. Hacer un lavado adicional en metanol al 100% (5 minutos). En este punto, los
embriones pueden ser almacenados por 1 mes (o más) a -20  C (utilizar viales de
centelleo de vidrio o de tubos de plástico con tapón de rosca)(143).
Anexo B - Obtención de bacterias competentes E.coli top 10.
Las bacterias E.coli Top 10 fueron donadas por el instituto de Genética de la Universidad
Nacional de Colombia previamente competentes, sin embargo se hizo necesario
replicarlas en medio LB y posteriormente inducir su competencia. Se obtuvieron células
bacterianas competentes con solución de Ca2Cl a 50 mM y almacenadas en medio de
glicerol para posteriormente ser transformadas con los plásmidos que contienen las
secuencias de DNA que codifican para los genes de interés.
Anexos
39
Preparación de bacterias competentes con método de cloruro de calcio
1. Transferir 40 ml de las células E. coli Top 10 a un tubo de centrifuga de polipropileno
estéril de 50 ml y recoger las células por centrifugación a 3000 rpm durante 8 minutos a 4
° C.
2. Después de centrifugar, decantar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un
volumen correspondiente a la mitad del volumen inicial (20 ml) de cloruro de calcio 50
mM, estéril a 4°C. Se incuba en un baño de agua helada durante 20 minutos, y
posteriormente se centrifuga de nuevo a las mismas condiciones antes mencionadas.
3. Decantar el sobrenadante y suavemente resuspender el pellet celular en el volumen de
una décima parte (4 ml) de cloruro de calcio a 50 mM frio para producir la suspensión final
de las células Top 10 competentes.
4. Transferir 166 ul de la suspensión de células competentes en tubos falcon esteriles y
agregar 34 ul de glicerol estéril al 100%.
6. Las células competentes a continuación pueden ser almacenada a -70 °C.
Anexo C - Recuperación de plásmidos
Se recuperaron los plásmidos del papel filtro Whatman que contienen el inserto de ADN
de los genes de interés: notch1, serrate2, hes1 y hey1.
Protocolo:
Cortar el área del papel de filtro que contiene el ADN y se coloca en un tubo eppendorf
de 1,5 ml con 100 ul de agua estéril, a temperatura ambiente. Se remueve con una punta
de pipeta y luego se almacenan a 4°C.
Anexo D - Transformación de bacterias E.Coli top 10
La transformación es un proceso por el cual las células bacterianas captan DNA libre
presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias,
pero la eficacia del proceso varía enormemente de una especie a otra. Para que la
transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de
competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la
40
bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la
entrada de ácidos nucleicos a la célula.
Protocolo:
1. Retirar las alícuotas bacterianas de E. coli Top 10 del congelador de -70  C y
descongelar en hielo durante 10-15 minutos; dar un breve golpe a el tubo para volver a
suspender las células bacterianas.
2. Alicuotar 50ul de células bacterianas previamente suspendidas en un tubo falcon de
1.5 ml pre-enfriado sobre hielo.
3. Añadir 10 ul de DNA plasmidico e incubar por 30 minutos en hielo.
4. Retire el tubo del hielo e inmediatamente comenzar el choque térmico en un baño
María con agua a 42  C durante 40-45 seg.
5. Después de choque térmico, inmediatamente adicionar 600ul de medio LB a
temperatura ambiente a las células bacterianas, a continuación se incuban las Top10 a
37°C en una incubadora que posea shaker por aproximadamente 1 hora.
6. Pre-caliente una placa de medio LB / agar con la selección deseada de antibióticos
(ampicilina 50 mg/ml) en la incubadora a 37  C simultáneamente durante la incubación
que se da en el paso 5.
7. Realizar el cultivo bacteriano en el medio LB agar de las bacterias transformadas y las
no transformadas (controles, que se les agrega agua estéril en lugar del plásmido) y dejar
las bacterias en el medio LB por 15 minutos a temperatura ambiente.
8. Invertir las placas y colocar en la incubadora a 37  C durante toda la noche.
9. Seleccionar del medio LB que contiene las bacterias transformadas una colonia
aislada y homogénea y poner a crecer en medio LB líquido para dar lugar a la replicación
del plásmido por 14- 16 horas.
Anexo E - Purificación de DNA plasmídico
Se realizó extracción de DNA plasmídico de bacterias Top10 transformadas con QIAprep
Miniprep Handbook de Qiagen.
Anexos
41
1. Cultivar por 14-16 horas 5 ml medio LB líquido a 37° C, al cual se le agrega el clon
del cultivo bacteriano seleccionado (colonia bacteriana aislada de las Top10
transformadas y cultivadas en medio con antibiótico).Agregar 5 µl de ampicilina (50
mg / ml) a 5 ml de medio LB.
2. Centrifugar por 15 min a 3000r/min.
3. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano en 250µl de buffer
P1( buffer de resustensión+ RNAasa + Buffer de lisis celular). Mezclar
vigorosamente y trasferir 250 µl aun ependorf de 1.5 ml esteril.
4. Adicionar 250µl de buffer P2 (buffer de lisis) e invertir el tubo 4-6 veces por 5 min
hasta obtener un azul homogéneo, sigo de la lisis bacteriana.
5. Adicionar 350µl de buffer N3 y mezclar inmediatamente invirtiendo el tubo por 4-5
veces, hasta obtener un color blanco homogéneo.
6. Centrifugar por 10 min a 13.000 rpm por 10 min.
7. Por pipeteo transferir el sobrenadante a la columna de purificación
8. Centrifugar por 1 min y descartar el sobrenadante.
9. Adicionar buffer PB (isopropanol) y centrifugar 1 min.
10. Adicionar 750µl de buffer PE( etanol) y centrifugar por 1 min a 13.000 rpm.
Descartar el volumen filtrado. Centrifugar nuevamente para eliminar residuos de
buffer PE.
11. Adicionar 50µl de agua estéril y centrifugar por 1 min. Almacenar el producto del
filtrado a 4°C (DNA plasmídico purificado).
Anexo F - Construcción y marcaje de sondas de RNA no radioactivas
Dig-UTP
A través del proceso de transcripción In Vitro se obtuvieron sondas de RNA marcadas con
digoxigenina de los genes de interés a partir del DNA purificado y linearizado, para lo cual
se utilizaron RNA polimerasa tipo T3/T7.
La linearización y transcripción in vitro de cada templete de DNA del gen de interés se
realizó con las siguientes enzimas de restricción y RNA polimerasas específicas para
cada plásmido:
El plásmido con el inserto del gen notch1 se linearizó con la enzima de restricción BamH1
y transcribió con la enzima T3 RNA polimerasa para generar sondas antisentido.
42
El plásmido con el inserto del gen Serrate2 se linearizó con la enzima de restricción
EcoR1 y se transcribió con T3 RNA polimerasa para la generación de sondas antisentido.
El plásmido con el inserto del gen hes1 se linearizó con la enzimas de restricción Himd3 y
transcribió por T7 RNA polimerasa para la generación de sondas antisentido.
El plásmido con el inserto del gen hey1 se linearizó con la enzimas de restricción BamH1
y transcrita por T3 RNA polimerasa.
Protocolo:
1.
En hielo, agregue los siguientes reactivos a un tubo de micro centrífuga, en el
orden indicado ( ver tabla 2)
Tabla 2. Reactivos de procedimiento de transcripción In Vitro
REACTIVO
Completar con H2O tratada con DEPC
DNA linearizado
10X Buffer de Transcripción que contiene DTT)
10X Nucleotidos marcados con DIG
Inhibidor de RNasa
RNA polimerasa
VOLUMEN
To 20 µL total
5.0 µL
2.0 µL
2.0 µL
1.0 µL
1.0 µL
2. incubar la reacción durante 2 horas a 37°C.
3. Adicionar 1µl de DNAasa a la reacción y incubar 15 min adicionales a 37°C para
digerir el DNA sobrante y obtener solo producto de RNA.
Anexos
43
Anexo G - Hibridación In Situ total y en secciones histológicas
Se realizó hibridación In Situ sobre embriones completos, a los cuales posteriormente se
les realizaron criosecciones de 16µm en los planos coronal y sagital.
La técnica de Hibridación In Situ consta principalmente de 3 pasos distribuidos en 4 días
de la siguiente manera:
a.
b.
c.
d.
Día 1: Prehibridación e Hibridación
Día 2: Lavados pos hibridación, bloqueo e incubación con anticuerpo
Día 3: Lavado post anticuerpo
Día 4: revelado(143).
Día 1: Pre hibridación e Hibridación
1.
Rehidratar las muestras en series de metanol/PBT (75%, 50%, 25% de metanol y
series PBT.
2.
Lavar 3 veces en PBT durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3.
Tratamiento con Proteinasa K:
Los embriones entre las etapas 18 y 24 de tratamiento serán tratados con proteinasa
K (10 g / ml) por los siguientes tiempos a temperatura ambiente :
HH 19 - 8 min
HH 21 - 15 min
HH 23 - 15 min
HH 25 - 25 min
4.
Lavar en PBT por 5 min.
5.
Pos fijación en paraformaldehido al 4% por 30 min a T° ambiente.
6.
2 lavados en PBT por 30 min cada uno.
7.
8.
Lavado en solución de Hibridación por 10 min a 60°C.
Reemplazar la solución de hibridación por una solución nueva que contiene la sonda
de RNA a una concentración de 1: 100 (1 μl de sonda / 100 μl de Solución de
hibridación) por toda una noche a 60 °C.
44
Día 2: Lavados pos hibridación, bloqueo e incubación con anticuerpo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Reciclar las sondas y colocarlas a -20 °C.
Precaliente la solución I a 60  C. Lave los embriones 3 veces durante 30 minutos
cada uno a 60  C con la solución precalentada.
Calentar la solución III a 60  C. Lave embriones 3 veces durante 30 minutos cada
un0 a 65  C con la solución precalentada III.
Lave 3 veces con solución TBST fresco durante 5 minutos cada embrion a
temperatura ambiente.
Bloquear con suero de oveja al 10% inactivado por calor en TBST y albumina sérica
(BSA) (1mg/ml) por 3 horas a T° ambiente.
Colocar el anticuerpo anti –Digoxigenina en suero de 1:5000, toda la noche a 4°C
Día 3: lavado Post-anticuerpo
1.
2.
3.
Reciclar el anticuerpo y colocarlo a 4° C.
Lavar 3 veces con TBST por 30 min a temperatura ambiente.
Dejar toda la noche los embriones en solución de TBST
Día 4: Revelado y visualización de áreas Hibridizadas
1. 6 lavados en TBST por 30 min c/uno a T° amb
2. 3 lavados con NTMT por 15 min c/uno a T° amb
3. Remover NTMT y adicionar BCIP/NBT (26.6 μl/2ml) de NTMT, se deja en agitador
envuelto en papel aluminio y se revisa c/5 min.
4. Un lavado en NTMT
5. 3 enjuagues en PBT
6. Posfijar en paraformaldehido al 4% y almacenar a 4°C envuelto en papel aluminio.
7. Toma de fotografías de embriones completos sometidos a Hibridación In Situ total
(Whole Mount).
8. Posteriormente los embriones serán sometidos a medio de inclusión OCT y su
posterior corte en criostato, obteniendo así cortes coronales de 16 µm en las regiones
de las prominencias faciales, mandibulares, maxilares y frontonasales.
.
45
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