reacciones de identificación y propiedades de los lípidos

Prácticas de Bioquímica I
Práctica:. Reacciones de identificación y propiedades de los lípidos. TLC.
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN Y
PROPIEDADES DE LOS LÍPIDOS.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
Objetivos
Al finalizar el trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de:
-
Verificar la presencia de los productos de la saponificación: Jabones y glicerol.
-
Conocer la reacción general de la saponificación de un lípido.
-
Conocer los componentes químicos de las emulsiones y su estabilidad.
-
Identificar la presencia de colesterol y glicerol en una muestra biológica.
-
Separar e identificar fracciones lipídicas mediante cromatografía en capa fina.
Introducción
Los lípidos son un grupo heterogéneo de biomoléculas relativamente insolubles
en agua y solubles en solvente no polares como el éter, cloroformo y benceno. Esta
heterogeneidad se refiere tanto a la estructura química como a sus funciones
biológicas. A este grupo de biomoléculas pertenecen los aceites, ceras y compuestos
relacionados. Los triacilglicéridos (grasas) son compuestos que están conformados
químicamente por una molécula de glicerol esterificada a tres ácidos grasos. La
función principal de éstos es de reserva energética.
Otro grupo de lípidos emparentados químicamente con los triacilglicéridos son
los fosfolípidos, que también contienen ácidos grasos esterificados al glicerol, pero
presentan adicionalmente un grupo fosfato. La presencia de dicho radical en su
estructura les confiere la condición de moléculas bipolares o anfipáticas, es decir, que
poseen una cabeza polar (hidrofílica) y una cola apolar (hidrofóbica) constituida por
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dos cadenas alifáticas sin carga. Estos compuestos son los constituyentes principales
de las membranas biológicas.
Además de los lípidos ya mencionados, existen los esteroles. Este grupo de
compuestos poseen en común un esqueleto carbonado conocido como isopreno y su
precursor es el ciclopentanoperhidrofenantreno. De éstos el más conocido es el
colesterol, el cual además de ser precursor de varias hormonas es constituyente de la
estructura de la membrana plasmática.
La diversidad de estructuras químicas presentes en los lípidos le permite al
bioquímico aprovechar dichas diferencias en el aislamiento e identificación de los
mismos utilizando métodos como los cromatográficos.
Saponificación
La saponificación es un procedimiento muy empleado en el estudio e
identificación del material lipídico, ya que representa una propiedad química que
permite clasificarlos basados en la capacidad de ser hidrolizados en presencia de una
base fuerte (KOH ó NaOH) liberándose el glicerol y la sal de ácido graso
correspondiente. Dichas sales se conocen como jabones, las cuales son muy miscibles
con el agua debido a la polaridad del anión carboxilato (COO-). Los jabones en general
adoptan en el medio acuoso estructuras miscelares esféricas cuyo interior corresponde
a grasas neutras, lo que determina el poder detergente de los jabones.
La reacción general del proceso de saponificación lo podemos representar
mediante la siguiente ecuación:
O
CH2 O C R1
O
CH O C
R2
CH2 OH
+
3-RCOOK
3KOH
jabones
O
CH2 O
C
+
CH OH
CH2 OH
glicerol
R3
triacilglicérido
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Emulsiones y emulsificación
Las emulsiones son sistemas dispersos que forman dos o mas líquidos
inmiscibles entre sí, es decir, que normalmente no se disuelven unos con otros. La
estabilidad de una emulsión depende de sustancias conocidas como “emulsionantes o
emulsificantes”, estos son compuestos que estabilizan la emulsión, evitando la
separación de las fases. Las proteínas son emulsionantes bastante efectivos, debido a
su naturaleza anfipática. La leche es un buen ejemplo de una emulsión estabilizada por
proteínas. Otros compuestos que poseen actividad emulsificadora son los fosfolípidos,
debido a la presencia de una cabeza polar (hidrofílica) y una porción o colas no
polares (hidrofóbicas). En ambos casos, la porción polar del agente emulsificante se
une al agua o líquidos polares de la emulsión y las colas alifáticas se unen a la porción
no polar, para estabilizar la solución disolviendo los compuestos no polares en el seno
del agua que es polar. La estabilidad de la emulsión puede ser estudiada agregando a
uno de los líquidos a dispersar, un colorante de tal manera que se observa la formación
de gotículas que se dispersan en el líquido presente en mayor cantidad, así el tiempo
que dura la emulsión puede ser observado a simple vista.
Cromatografía en capa fina.
La complejidad de las mezclas de lípidos que se encuentran en los productos
naturales hace imposible la caracterización de sus componentes por análisis cualitativo
(índice de rancidez, saponificación, cristalización, etc.), siendo estos métodos
generalmente complicados y muy laboriosos. Con el desarrollo de las técnicas
cromatográficas, en los últimos años se han obtenido de forma rápida y sencilla
fracciones lipídicas de productos naturales. Entre estas técnicas destaca la
cromatografía en capa fina, la cual presenta la ventaja de obtener mejor separación en
cortos períodos de tiempo.
La cromatografía sobre capa fina es un método de separación de mezclas, en el
cual sus componentes se distribuyen entre un adsorbente sólido (fase estacionaria) y
una mezcla de solventes (fase móvil), la cual fluye a través de la fase estacionaria. Los
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componentes de la mezcla se distribuyen entre ambas fases dependiendo de la afinidad
por una u otra.
La cromatografía en capa fina (TLC) fue desarrollada inicialmente para separar
solamente lípidos. Actualmente, la TLC ha sido utilizada para separar otros
compuestos y tiene una amplia variedad de usos en el laboratorio.
Las ventajas de la TLC sobre la cromatografía de papel son: mayor poder de
resolución, menor tiempo para lograr la separación y la amplia gama de distintos
adsorbentes que pueden ser utilizados. El gran poder de resolución y la velocidad de
separación se deben básicamente a lo fino del tamaño de las partículas del absorbente
(menos de 0,1 mm), por esta razón va a tener una mayor superficie de separación.
MATERIALES Y EQUIPOS:
- Cámara de vidrio con tapa esmerilada
- Cromatoplaca
- Frasco nebulizador
- Bomba aspirante-impelente
- Estufa
- Micropipetas capilares
- Tubos de centrífuga
- Tubos de ensayo
- Centrífuga
- Baño de María
REACTIVOS:
- Mezcla de solventes: hexano, éter etílico, HCl (70: 29: 1)
- H2SO4 al 50%
- Estándares de colesterol (C), glicerol (G), triacilglicéridos (TG) y fosfolípidos
(FL), disueltos al 0,5% en cloroformo.
- HCl concentrado
- Aceite o grasa a saponificar
- NaOH ó KOH al 10%
- NaCl
- H2SO4 concentrado.
- Bisulfato de potasio puro (KHSO4)
- Anhídrido acético.
- Aceite de girasol.
- Clara de huevo o albúmina
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Solución de proteína: para su preparación se puede utilizar suero o la clara de
tres huevos. Posteriormente, se mezcla con 700 mL de agua destilada y 300
mL de una solución saturada de cloruro de sodio. Finalmente, se filtra a través
de varias capas de gasa.
Solución de jabón al 1%.
Bicarbonato sódico al 1%.
Lecitina: se prepara mezclando la mitad de una yema de huevo con 20 mL de
alcohol caliente y se agita con una varilla de vidrio. Luego se deja enfriar la
mezcla y se filtra, a través de papel Whatman # 1.
PARTE EXPERIMENTAL
Experimento Nº 1: saponificación de un aceite o grasa
La saponificación es un procedimiento analítico muy empleado para el estudio e
identificación de materiales lipídicos. Se basa en la reacción de los acil-ésteres con
una base fuerte (KOH ó NaOH) liberando glicerol y la sal correspondiente del ácido
graso o jabón.
Procedimiento:
1.- Mezclar 2 mL de aceite o grasa a saponificar en un tubo con tapa de baquelita, con
5 mL de KOH al 10% en agua.
2.- Mantener la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 1 hora, con agitación
periódica (cada 10 minutos).
3.- La saponificación puede darse por terminada cuando al dejar la mezcla en reposo,
no se separa en dos fases.
4.- Añadir, todavía caliente, un exceso de cloruro de sodio finamente pulverizado,
mezclar bien para disolver.
5.- El jabón se separa flotando en la superficie, en donde al enfriarse se separa en
forma de una pasta semisólida.
6.- Tomar una muestra de aproximadamente 1 g de este jabón y disolver en 10 mL de
agua. Agitar con varilla de vidrio, calentar ligeramente 40-50°C.
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7.- Cuando este bien disuelto, se añaden 5 mL de HCL concentrado, agitando bien y
mantener la mezcla en caliente. Los ácidos grasos liberados flotan en la superficie
originando una capa oleosa. Observe y discuta el fenómeno observado tomando como
base los principios teóricos observados en clase.
Experimento Nº 2: emulsificación de grasas
A continuación siga las instrucciones:
Tome cinco tubos de ensayo y rotúlelos del 1 al 5. Coloque en cada tubo lo que se
señala en el cuadro siguiente:
Reactivos
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Aceite
10 gotas
10 gotas
10 gotas
10 gotas
10 gotas
Agua
1 mL
1 mL
___
___
___
NaHCO3
___
___
1 mL
___
___
Lecitina
___
0,5 mL
___
___
___
Solución de Proteína
___
___
___
1 mL
___
Solución de jabón
___
___
___
___
1 mL
Observe los tubos y anote los resultados obtenidos en cada tubo.
Discuta cada resultado y de la justificación química de cada uno.
Experimento Nº 3: reacción para determinar el glicerol
Cuando el glicerol es calentado en presencia de bisulfato de potasio se
deshidrata y se produce el aldehído acroleína, el cual presenta un olor característico a
pimienta. La reacción da resultado positivo tanto con el glicerol libre como con ésteres
del mismo.
CH2 OH
CH OH
CH2 OH
Calor
CH2
CH
KHSO4
CHO
Acroleína
Glicerol
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Prueba del Glicerol
Tome dos tubos de ensayo y coloque una capa de KHSO4 de medio centímetro
de espesor en cada tubo. Agregue cinco gotas de estándar de glicerol en un tubo y
cinco gotas (o la cantidad equivalente si es sólido) de muestra problema. Caliente
lentamente y observe. Notará el olor característico de la acroleína.
Experimento Nº 4: reacción de Liebermann Burchard para la caracterización del
colesterol
El anhídrido acético puede reaccionar, en presencia de ácidos fuertes y en ausencia de
agua, con el colesterol y otros esteroles relacionados para formar un complejo
coloreado verde-azul. Este complejo coloreado se forma al reaccionar el anhídrido
acético con el grupo hidroxilo en la posición C3 del anillo del colesterol.
CH3
C8H17
CH3
O
+
HO
Colesterol
H3C C O
O
Ácidos fuertes
Complejo de
Color verde-azul
C CH3
Anhídrido acético
Prueba del colesterol
1.- Tome dos tubos de ensayo bien limpios y rotúlelos S y M.
2.- En el tubo "S" coloque 1 mL del estándar de colesterol y en el tubo "M", 1 mL del
extracto orgánico.
3.- Agregue 15 gotas de anhídrido acético a cada tubo y mezcle suavemente.
4.- Cuidadosamente añada a ambos tubos 1 mL de ácido sulfúrico concentrado,
inclinando el tubo.
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5.- La positividad de la prueba para el colesterol es determinada por el desarrollo de
un cromógeno de color verde azul. En contraste al colesterol, el ergosterol desarrolla
un color rojo a esta prueba.
Experimento Nº 5: cromatografía en capa fina
Aplicación de las muestras: tome un capilar e introdúzcalo en la muestra a aplicar. A 1
cm del borde inferior de la placa hacer "toques" rápidos y continuos sobre la capa de
silica gel, teniendo cuidado de no romper dicha capa. Desechar el capilar. Repetir el
paso anterior, colocando en las columnas identificadas, la muestra correspondiente.
Desarrollo de la cromatoplaca: colocar la cromatoplaca, con el borde mas cercano a
las muestras hacia abajo, en la cámara cromatográfica. Tapar inmediatamente para
evitar la evaporación del solvente. Cuando el frente del solvente llegue a 1 cm del
borde superior de la placa, retire las placas y llévela a la estufa a 100o C durante 3
minutos.
Revelado de las manchas: llevar las cromatoplacas a la campana y nebulizar las mismas
con H2SO4 al 50%. Debe evitarse la nebulización excesiva. Seguidamente coloque
las cromatoplacas en la estufa a 200oC por 10 minutos.
Cálculo de los valores de Rf.: En el cuadro que se le presenta a continuación dibuje la
ubicación de las manchas con respecto al origen y al frente del solvente.
Posteriormente, mida en milímetro (mm) la distancia recorrida por cada una de ellas y
por el solvente. Registre las medidas en el cuadro.
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TG
FL
C
MP
Para el cálculo del Rf de cada mancha se usa la siguiente expresión:
Distancia recorrida por la muestra (mm)
Rf =
Distancia recorrida por el solvente (mm)
En el caso de la muestra problema (MP) se calcularán tantos valores de Rf como
fracciones lipídicas la compongan, es decir, uno para cada mancha en la mezcla
desconocida.
Una vez calculados los Rf, proceda a identificar los lípidos presentes en la muestra
problema (MP) comparando los Rf con los valores obtenidos para los estándares
analizados.
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AUTOEVALUACIÓN:
1. Existen otros tipos de cromatografía utilizados para la separación de los lípidos.
Cite algunos ejemplos y señale, en cada caso, el basamento químico.
2. La fase móvil de la TLC está constituida por una mezcla de solventes de diferentes
polaridades. ¿Explique porque?
3. ¿Cuál es el principio químico de la TLC?
4. Una muestra de lípidos extraídos de tejido hepático fue analizada por TLC. Los Rf
de la MP fueron:
-
MP1= 0,58
- MP2= 0,9
- MP3= 0,03
En base a los valores de Rf de los compuestos que se presentan en la lista anexa, diga
que lípidos conforman la muestra problema (MP).
Triacilglicéridos
Rf= 0,89
Colesterol
Rf= 0,40
Fosfatidilcolina
Rf= 0,03
Lecitina
Rf= 0,09
Ergosterol
Rf= 0,35
Estradiol
Rf= 0,56
5. La hidrólisis de los triacilglicéridos puede realizarse en medio ácido, pero esta
reacción es irreversible. Investigue porqué.
BIBLIOGRAFÍA
Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory
techniques. Saunders editores. 1976.
Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981.
Rawn, D. J. Bioquímica. Tomo I. Edit Interamericana. Mac Graw Hill. España 1989.
Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.
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