DSpace de la Universidad Catolica de Cuenca

UNIVERSIDAD
CATÓLICA DE CUENCA
UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA,
BIOFARMACIA, INDUSTRIAS Y PRODUCCIÓN
FACULTAD DE BIOFARMACIA
Informe del Curso de Graduación previo a la obtención del Título de
Químico Farmaceuta
MONOGRAFÍA DE PRODUCCIÓN DE INSULINA
RECOMBINANTE MEDIANTE INGENIERÍA GENÉTICA
Autora: JIMENA MORENO ORTIZ.
Director: Ing. Willian Peralta Izquierdo.
CUENCA – ECUADOR
2012
Jimena Moreno O.
i
AGRADECIMIENTO:
Expreso mis más sinceros agradecimientos:
Ante todo y sin lugar a duda, primero a Dios, por
darme refugio entre sus manos y brindarme la
sabiduría e inteligencia para lograr uno de mis sueños.
A mis padres “GONZALO MORENO Y TERESA
ORTIZ” quienes con amor, paciencia y consejos me
supieron guiar por el camino del éxito, de igual
manera
a
mis
hermanos
Santiago,
Gonzalo,
Francisco y de manera muy especial, gracias
infinitas a mi hermana MARÍA EUGENIA, quién
ha sido mi pilar fundamental a lo largo de mi
formación profesional, estoy segura que sin su
comprensión
y
apoyo
incondicional
no
hubiera
culminado esta etapa de mi vida.
Dejo constancia de mi agradecimiento al Ing. Santiago
Gómez, Decano de la Facultad y a todas sus
Autoridades por haberme dado la oportunidad de
pertenecer a tan noble Institución; a sus distinguidos
catedráticos, Dr. Diego Andrade por compartirme sus
sabios
conocimientos
con
los
cuales
podré
desempeñarme como una profesional competente, al
Ing. René Sarmiento, quien siempre ha apoyado al
bienestar y progreso de cada estudiante, a mi querido
Director de Monografía Ing. William Peralta por sus
consejos como catedrático pero sobre todo como amigo.
Jimena Moreno O.
ii
DEDICATORIA:
Dedico todos estos años que llevaron consigo
mi sacrificio y trabajo, a mi Hermana MARÍA
EUGENIA MORENO ORTIZ, a quién quiero con
toda mi alma, porque ha sido mi compañera y
amiga
inseparable,
la
incondicional
que
siempre creyó en mí y más aún en esos
momentos difíciles de mi Vida.
También dedico a mis PADRES que me
alentaron plenamente en el transcurso de mi
época de estudio, quienes hoy tienen la
satisfacción de un deber cumplido.
Jimena Moreno O.
iii
INTRODUCCIÓN
Actualmente la Biotecnología y las novedosas Técnicas de Recombinación
Genética, ocupan el primer lugar en la elaboración de productos farmacéuticos.
Esta metodología incluye la manipulación y ordenamiento de segmentos de
ácidos nucleicos, con el objetivo de producir sustancias destinadas al
diagnóstico, prevención y tratamiento de patologías que afectan a los seres
vivos.
Es importante señalar que en muchos casos la obtención de estas sustancias
por vía natural se hace muy difícil en función de la fuente empleada para su
extracción, pudiendo resultar arriesgado e insuficiente para los requerimientos
mundiales, puesto que todo organismo, aún el más simple, contiene una
enorme cantidad de información, la cual esta almacenada en macromoléculas
de ADN. Este ADN está dividido en gran cantidad genes que llevan la
información necesaria para que la célula sintetice una proteína, controlando
todos los aspectos de la vida de cada organismo, incluyendo metabolismo,
forma, desarrollo y reproducción; siendo así, el genoma el responsable de las
características del individuo.
Propiedades importantes del ADN, hacen posible la evolución ya que se divide
y fusiona con el ADN de otro individuo de la misma especie, para lograr
descendencia diversificada. No importa lo diferente que sean dos especies, el
ADN que contengan será de la misma naturaleza.
Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta muchas percepciones hacen
posible que el gen de una especie pueda funcionar y manifestarse en otra
completamente distinta, como es el caso de la producción de Insulina
Recombinante mediante Escherichia coli.
Las perspectivas que se establecen de nuevos descubrimientos varían desde un
mundo maravilloso sin enfermedades, con un increíble rendimiento agrícola y
ganadero, todo tipo de nuevos fármacos, hasta un mundo catastrófico; pero la
realidad es y ha sido diferente puesto que el ser humano ya, se está
beneficiando con las diversas aplicaciones de la Ingeniería Genética.
Es por esto que el objetivo de esta monografía es la creación de una fuente
práctica de conceptos básicos a cerca del tema, con el fin de hacer una
herramienta útil para comprensión del estudiante y el logro para la obtención
del título de Químico Farmacéutico.
Jimena Moreno O.
iv
CONTENIDO
CAPÍTULO I ................................................................................................................................. 1
1.1.- ¿Qué es la ingeniería genética? ................................................................................................... 1
1.2.- Técnicas biotecnológicas ............................................................................................................ 1
1.3.- Tecnología del adn recombinante ............................................................................................... 2
1.4.- Proteínas recombinantes ............................................................................................................. 5
1.5.- Características generales de replicación ..................................................................................... 7
CAPÍTULO II.............................................................................................................................. 10
2.1.- ¿Qué es la insulina? .................................................................................................................. 10
2.2.- Estructura de la insulina ............................................................................................................ 11
2.3.- Producción de la insulina en el ser humano .............................................................................. 12
2.4.- Papel que desempeña la insulina en el organismo humano ...................................................... 13
CAPÍTULO III ............................................................................................................................ 15
3.1.- Código genético ........................................................................................................................ 15
3.2.- Metodología .............................................................................................................................. 17
3.4.- ¿Qué es un codón? .................................................................................................................... 20
3.5.- Asignación de codones a aminoácidos concretos ..................................................................... 22
3.6.- ¿Qué es un vector? .................................................................................................................... 23
Tipos de vectores........................................................................................................................... 24
a)
Vector de clonación............................................................................................................... 24
b)
Vector lanzadera .................................................................................................................... 24
c)
Vector de expresión............................................................................................................... 24
d)
Vector de reposición.............................................................................................................. 24
3.7.- Transformación en un huésped de escherichia coli................................................................... 26
3.8.- Producción de la insulina recombinante ................................................................................... 30
CAPÍTULO IV ............................................................................................................................ 35
4.1.- La insulina a nivel industrial ..................................................................................................... 35
4.2.- Producción de hormonas en otras bacterias .............................................................................. 39
4.3.- La biotecnología para diagnosticar y rastrear enfermedades genéticas .................................... 40
4.4.- Influencia de su producción en la sociedad. ............................................................................. 44
CONCLUSIONES . ......................................................................................................................... 48
BIBLIOGRAFÍA . ........................................................................................................................... 49
Jimena Moreno O.
v
Capítulo I
Ingeniería Genética
1.1.- ¿QUÉ ES LA INGENIERÍA GENÉTICA?
La ingeniería genética puede definirse como:
“La manipulación deliberada de la información genética, con miras al análisis genético
o al mejoramiento de la especie”.
Más concretamente es:
Un conjunto de metodologías, nacidas de la Biología Molecular que permite transferir
genes de un organismo a otro y expresarlos en organismos diferentes al de su origen; es
decir, es la producción intencionada de nuevos genes y alteración de genomas, mediante
la sustitución o adición de material genético nuevo.
De esta manera, organismos relativamente simples tales como las bacterias o levaduras
pueden ser inducidos a fabricar grandes cantidades de proteínas humanas, incluyendo los
interferones y las interleuquinas.
Este campo de la ciencia se dedica a investigar la posibilidad de recombinar artificialmente
genes o grupos de genes para producir nuevas combinaciones que no aparecen
biológicamente. Por ejemplo, es posible aislar genes que especifican dos proteínas
diferentes a partir de dos especies distintas de organismos, y unirlos entre sí para dar lugar a
una nueva combinación.
La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el genoma
de un individuo que carece de ellos, esto se realiza a través de las enzimas de restricción
que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos; denominándose ADN
recombinante, el que se ha formado cuando se intercala un segmento de ADN extraño en un
ADN receptor.
Ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.
1.2.- TÉCNICAS BIOTECNOLÓGICAS
Ingeniería genética:
Es la más conocida de las técnicas biotecnológicas, persigue la modificación del
patrimonio hereditario de un organismo introduciendo o seleccionando en su haber génico
uno o varios genes pertenecientes a un organismo de una especie distinta, para dotarlo de
Jimena Moreno O.
1
capacidades que antes no tenía, con el fin de que al reproducirse produzca sustratos
modificados útiles para un determinado uso o función.
El proceso puede emplearse en bacterias o en células eucariotas vegetales o animales.
Existen varias técnicas para la ingeniería genética, como la electroforesis en gel, sondas,
amplificación del gen, vectores, y, la más conocida de ellas, la técnica ADN recombinante.
La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que
destacan:



La tecnología del ADN recombinante;
La secuenciación del ADN;
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Fusión de materiales celulares:
Consiste en extraer plásmidos (inclusión intracelular que se considera tiene una
función genética, especialmente una molécula de ADN procedente del cromosoma
bacteriano que determina rasgos no fundamentales para la viabilidad del organismo, aunque
de algún modo cambia la capacidad del organismo para adaptarse) con características
interesantes de diferentes células e incorporarlos, sin modificación, en un microorganismo
que reúne, entonces, las características de los organismos originales.
Fermentación:
Aquí los microorganismos naturales o alterados genéticamente se cultivan en cubas
de fermentación. Gracias a los productos fermentados, la biotecnología proporciona una
alimentación más rica en vitaminas, fácil de digerir y sabrosa.
Ingeniería enzimática:
Investiga y desarrolla mejores condiciones para incrementar el rendimiento de la
fermentación.
1.3.- TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
La tecnología del ADN recombinante constituye una suma de técnicas siendo las más
importantes:
 La rotura específica del ADN mediante nucleasas de restricción, que facilita el
aislamiento y la manipulación de los genes individuales.
 La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de
ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos
que codifica.
 La hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas
de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.
Jimena Moreno O.
2
 La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de
ADN se integre en un elemento génico auto-replicante (plásmido o virus) que habita
en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser
producida generando muchos miles de millones de copias idénticas.
 La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN
produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a
células u organismos.
El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con la identificación desde
un organismo de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro
organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto proteico de esa secuencia
de ADN. Así se pueden producir cantidades ilimitadas de la proteína codificada por el
dicho gen.
En términos simples, el procedimiento consiste en:




Localización de genes y sus funciones.
Clonación del ADN, y su posterior almacenamiento en genotecas.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Utilización de vectores de expresión.
Una molécula de ADN contiene miles de genes, para aislar el gen se debe partir de su
producto. El más inmediato es el ácido ribonucleico mensajero (ARNm), con este fin se
seleccionan aquellas células en que el gen se exprese en mayor cantidad y de ellas se aísla
el correspondiente ARNm.
Se convierte la información almacenada en el ARNm en un segmento de ADN, utilizando
las transcriptasas inversas de los virus. Una vez conseguido esto, se emplean las enzimas
ADN polimerasas para convertir el filamento simple de ADN en un segmento de doble
hélice, a este se le denomina ADN complementario (ADNc).
http://biotecnologiagrupo3.blogspot.com/2011/05/marco-teorico.html
Una vez conseguido el ADNc correspondiente, se introduce en un plásmido o plasmidio,
contiguo se utilizan enzimas de restricción, cada una con capacidad para reconocer una
secuencia específica de bases en el ADN.
Jimena Moreno O.
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Estas enzimas cortan el ADN en diversos fragmentos y pueden dejar extremos colgantes
(de cadena simple) que tienden a asociarse nuevamente con nucleótidos complementarios,
por lo que se les llama extremos pegajosos.
http://biotecnologiagrupo3.blogspot.com/2011/05/marco-teorico.html
La acción posterior de una enzima llamada ligasa hace posible la unión del ADNc con el
plásmido y logra que la molécula recombinante sea estable.
http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/Recombinant_DNA_Technology/05t.html
El plásmido recombinante se introduce en un hospedador, ya sean vegetales, animales o
una bacteria, Una vez en el interior del hospedador, el plásmido se reproduce, y con él, el
ADNc. Cuando la bacteria se divide, lega copias a las dos bacterias hijas, aunque también
es posible que sólo una se quede con todas las copias.
De entre todas las bacterias, se identifica
cuáles portan plásmido recombinante,
mediante un marcador.
http://cristinagccmc.blogspot.com/2011/03/tema-4-cmcavances-de-la-genetica.html
Jimena Moreno O.
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1.4.- PROTEÍNAS RECOMBINANTES
En ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante, se utilizan enzimas para cortar
y aislar un gen determinado que tiene información para fabricar una proteína particular e
introducirlo en las células de un organismo distinto del inicial.
En consecuencia, este organismo tendrá ADN recombinante a partir del cual fabricará una
nueva proteína, a la cual se la denomina proteína recombinante
Tenemos:
a) Endonucleasas de restricción:
Enzimas bacterianas que reconocen secuencias específicas del ADN, y cortan la cadena
cada vez que esta secuencia aparece; es una Enzima de restricción que puede reconocer
una secuencia característica de nucleótidos de una molécula de ADN y cortar el ADN
en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy
lejano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y
12 pares de bases, con las que son reconocidos.
La importancia de estas enzimas radica en su gran especificidad de reconocimiento de una
secuencia corta de ADN dúplex y la consiguiente hidrólisis de un enlace fosfodiéster en
cada hebra, en secuencias concretas para iniciar la clonación.
http://proyectogrupo4sesion2011.wikispaces.com/Definici%C3%B3n+de+T%C3%A9rminos+-+Transg%C3%A9nicos
Estas enzimas se agrupan en tres familias de acuerdo a sus propiedades:
Tipo I = Endonucleasa y metilasa en una misma proteína (en distintas subunidades)
Tipo II = Endonucleasa (metilasa en una proteína independiente)
Tipo III = Endonucleasa y metilasa en una misma proteína (en distintas subunidades)
El mecanismo de corte de ADN se realiza a través de la ruptura de dos enlace fosfodiéster
en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de ADN. Éstos pueden ser romos (cuando
los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados, estos últimos tienen tendencia a
Jimena Moreno O.
5
volver a unirse de modo espontáneo ya que los extremos se pueden unir a otros extremos
coincidentes que pueda haber en la cercanía. Los fragmentos de ADN obtenidos de este
modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.
Extremos cohesivos.
Extremos romos.
http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n
b) ADN ligasas:
Enzimas que “pegan” fragmentos nuevos y antiguos de ADN, que forma enlaces
covalentes entre el extremo 5’ de una cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de
otra cadena polinucleotídica. También se denomina enzima de unión de
polinucleótidos.
Esta enzima cataliza la formación de puentes fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3'
OH y 5' fosfato en el ADN. Para la actividad la enzima requiere iones Mg++ y una unión
covalente derivada del ATP en el caso de la ADN ligasa necesita del bacteriófago T4, este
puede unir covalentemente moléculas de ADN con extremos cohesivos compatibles y
también fragmentos de ADN con extremos sin punta.
http://proyectogrupo4sesion2011.wikispaces.com/Definici%C3%B3n+de+T%C3%A9rminos+-+Transg%C3%A9nicos
c) Transcriptasas inversas:
Enzimas virales que puede invertir la dirección normal de la transferencia de
información. Normalmente, la información genética contenida en el ADN se
transcribe a una molécula de ARN y luego se traduce a una proteína. La
transcriptasa inversa sintetiza ADN a partir del ARN.
Conocida como ADN polimerasa
dependiente de ARN ya que transcribe
una sola cadena de ARN en una sola
cadena de ADN y ayuda a la formación de
una doble hélice de ADN una vez que el
ARN ha experimentado una transcripción
inversa en una sola cadena de ADNc.
Jimena Moreno O.
http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema1.htm
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1.5.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DE REPLICACIÓN
Las propiedades de la replicación son básicamente iguales en todos los seres vivos, y
siendo así que la mayoría de los estudios se han realizado en Escherichia coli, se describirá
el proceso a nivel del organismo bacteriano; y a continuación, se indicarán algunas
características propias de organismos eucariotas.
1) La replicación es un proceso semi-conservador.
Cada cadena de la molécula de ADN parental actúa de molde para la síntesis de una nueva
cadena produciéndose dos nuevas moléculas de ADN, cada molécula nueva posee una
cadena vieja y una nueva.
2) La replicación comienza en un punto del ADN.
Las dos cadenas de ADN se replican al mismo tiempo y comienzan en un punto
denominado origen. En dicho punto el ADN parental se desenrolla y forma una estructura
de lazo cuyos extremos se denominan horquillas de replicación. En el caso del
cromosoma circular bacteriano, el punto inicial de la replicación es un gen denominado
oriC.
http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema3.htm
3) La replicación es bidireccional.
Comenzada en un punto de la molécula de ADN el proceso se desarrolla hacia los dos
extremos de la cadena; en cada lazo, los extremos u horquillas de replicación avanzan en el
proceso de síntesis hasta completar la copia.
4) La síntesis de ADN se desarrolla en dirección 5' → 3'.
La dirección en que actúan las enzimas es fija y única de 5' a 3'. Esto determina que la
cadena molde ha de tener la dirección 3' → 5', para que la nueva cadena en formación,
complementaria y anti-paralela tenga la dirección 5' → 3' coincidente con el sistema de
trabajo de la enzima.
Jimena Moreno O.
7
Al ser la horquilla de replicación bidireccional, el sistema descrito implicaría que la otra
cadena parental 5' → 3' debería estar siendo copiada en dirección 3' → 5', situación
imposible debido a la limitación de las enzimas sintéticas, este problema es obviado debido
a que, la síntesis de ADN es semi-discontinua.
http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema3.htm
En una cadena, la inicialmente comentada en el punto anterior, la replicación es continua y
en la segunda la síntesis es discontinua, ya que se formaba una cadena nueva continua
(también denominada conductora) en la que la síntesis se desarrolla en la misma dirección
de la enzima o de la horquilla de replicación; mientras que la otra cadena nueva era
discontinua (también denominada cadena rezagada o retrasada) ya que su síntesis se
realizaba en contra de la dirección de la horquilla mediante fragmentos de Okazaki, que
son secuencias formadas por unos centenares o miles de nucleótidos dependiendo de la
célula.
Fases de la replicación
1) Fase de inicio
El origen de la replicación es una porción de ADN que contiene una secuencia
característica de bases. Este segmento es reconocido por una proteína denominada ADN-A.
2) Fase de elongación
La elongación consiste en la formación del cebador y la síntesis de la cadena de ADN. El
proceso se caracteriza por no desarrollarse de forma idéntica en ambas hebras. La síntesis
en la cadena conductora o continua requiere únicamente que actúe la primasa formando un
cebador de ARN de unos 10 a 60 nucleótidos, para a continuación penetrar la ADN
polimerasa III y realizar la polimerización de desoxirribonucleótidos.
En la cadena retrasada se forma un conjunto proteico en el que se localizan siete proteínas
distintas además de la primasa (primosoma). Este grupo se desplaza a lo largo del molde de
la hebra retrasada en dirección 5' →3' sintetizando a intervalos un corto cebador de ARN, al
que se unirá ADN formado por la ADN polimerasa III. El hecho de que las direcciones de
trabajo de la primasa y la polimerasa sean contrarias a la dirección de crecimiento de la
hebra, y de que el proceso sea uniforme en ambas hebras, viene justificado por el hecho de
Jimena Moreno O.
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que la ADN polimerasa III es una proteína dimérica. Esta enzima obliga a la cadena molde
de la hebra retrasada a formar un bucle sobre la misma, de esta forma, la dirección de
síntesis es la misma en ambas hebras.
Al ir desarrollándose la polimerización el bucle aumenta hasta contactar con el fragmento
de Okazaki previo, forzando a la polimerasa a separarse o disociarse y a recomenzar de
nuevo el proceso dónde se ha formado el nuevo cebador y ella creará el nuevo bucle.
En una fase posterior se eliminan los segmentos de ARN cebador, por acción de la
actividad exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I, quien también se encarga de rellenar
los trozos ocupados por el cebador. Por último, la ADN ligasa une los segmentos
catalizando la formación de un enlace fosfodiéster.
3) Fase de terminación
En el caso de Escherichia coli con un cromosoma circular, las dos horquillas de la
replicación se encuentran en el extremo contrario al origen terminando así la replicación y
necesitando, únicamente, la presencia de una topoisomerasa para la separación de las dos
moléculas.
http://enfermeraeninmunologaygentica.blogspot.com/2011/04/fases-del-proceso-de-la-replicacion.html
Jimena Moreno O.
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Capítulo II
La Insulina
2.1.- ¿QUÉ ES LA INSULINA?
Es una hormona polipeptídica formada por 51aminoácidos, producida y secretada por las
células Beta de los Islotes de Langerhans del páncreas, en forma de precursor inactivo
(proinsulina), el cual es procesado en el Aparato de Golgi donde es modificada, generando
la forma activa, Insulina.
http://diabetesdm.blogspot.com/2009/03/insulina.html
La insulina ayuda al cuerpo a usar y a
almacenar glucosa,la cual se produce
durante la digestión de los alimentos, para
luego secretarla hacia la sangre en cada
comida, y así permitir al cuerpo usar la
glucosa como energía para las funciones
diarias básicas, como moverse y respirar.
http://diabetesdm.blogspot.com/2009/03/insulina.html
Gran número de estudios demuestran que la insulina es una alternativa segura, efectiva,
bien tolerada y aceptada para el tratamiento a largo plazo de la diabetes tipo I y II, incluso
desde el primer día del diagnóstico.
Jimena Moreno O.
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2.2.- ESTRUCTURA DE LA INSULINA
La insulina es una hormona de naturaleza proteica con un peso molecular aproximado de
6000 Daltones, formada por 2 cadenas polipeptídicas que en total tienen 51 aminoácidos.
La cadena A tiene 21 aminoácidos y la cadena B 30 aminoácidos. Ambas cadenas se
encuentran unidas por 2 puentes de disulfuro ubicados entre los aminoácidos A-7/ B-7, y
A-20/ B-19. Además la cadena A, tiene también un puente interno de disulfuro entre los
aminoácidos A-6/ A-11.
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Genenzima/Genenzima.htm
La integridad de la molécula es indispensable para ejercer las acciones farmacológicas. Las
cadenas A o B, separadas luego de la destrucción enzimática de los puentes de disulfuro,
carecen completamente de acciones farmacológicas. Los aminoácidos de las posiciones B22 y B-30, son indispensables para el mantenimiento de las acciones metabólicas de la
insulina. Las acciones de crecimiento, se relacionan con los aminoácidos A-4; A- 20, A-21,
B-10, B-13, y B-26.
http://masbiologia2bct.blogspot.com/2010/11/insulina.html
Estructura primaria de la Insulina: consta de dos cadenas de aminoácidos enlazadas por
puentes disulfuro entre las cisteínas
Jimena Moreno O.
11
2.3.- PRODUCCIÓN DE LA INSULINA EN EL SER HUMANO
Un páncreas funcionando normalmente puede fabricar y liberar diariamente de 40 a 50
unidades de insulina. Además, tiene varios cientos de unidades almacenadas y disponibles
para ser segregadas cuando se necesitan.
La insulina se produce en el Páncreas en los “Islotes de Langerhans”, mediante unas células
llamadas Beta, cuyo gen responsable de la síntesis está en el brazo corto del cromosoma 11.
Las células beta fabrican insulina en diferentes etapas.
La primera es que la insulina se sintetiza en los ribosomas del retículo endoplásmico
rugoso de las células beta de los islotes, como pre-pro-insulina, que tiene 109
aminoácidos. Este precursor pierde enzimáticamente algunos aminoácidos, y se
transforma en proinsulina de 83 aminoácidos de cadena única en espiral.
La segunda es que la proinsulina, se transforma en insulina en el aparato de Golgi
de las células beta, por un proceso enzimático que genera cantidades equimolares,
de insulina y un péptido conector o péptido C. Este péptido C está formado de 32
aminoácidos distribuidos en dos cadenas polipeptídicas A y B, una de 21
aminoácidos y otra de 30, unidas por dos puentes de disulfuro.
http://www.gimolimpo.com/Paginas/LA%20INSULINA.htm
Adicionalmente, existe captación de zinc, formándose moléculas de zinc-insulina.
Siguiente el péptido C se acumula en gránulos secretorios ligados al aparato Golgi,
en el citoplasma celular, la progresión de estos gránulos hacia la membrana
plasmática, se hace a través de microtúbulos impulsados por filamentos ciliares
contráctiles y gradientes de potencial electroquímico.
Para que finalmente los gránulos se fusionan a la membrana celular y son secretados
por exocitosis con participación del calcio como activador de los microtúbulos, K, y
Zn. La insulina en forma de monómeros, junto al péptido C, estos son difundidos
hacia los capilares en forma equimolar.
Jimena Moreno O.
12
La insulina se almacena en las células Beta en gránulos secretorios, que se preparan
para liberarla en la circulación sanguínea, en respuesta al estímulo de una
concentración creciente de glucosa en sangre. También existe una pequeña
secreción de proinsulina (10% de la insulina).
http://diabetesmellituskarinapacheco.blogspot.com/2011/12/adn-recombinate-insulina-humana-versus.html
El péptido C no tiene ninguna función conocida. Sin embargo, se segrega en las mismas
cantidades que la insulina y, de hecho, circula en la sangre más tiempo que la insulina, por
lo que es un preciso marcador cuantitativo del funcionamiento de las células Beta. Así,
unos niveles normales de péptidos C indican una secreción relativamente normal del
páncreas.
2.4.- PAPEL QUE DESEMPEÑA LA INSULINA EN EL ORGANISMO
HUMANO
En general, la insulina es una hormona que estimula los procesos anabólicos e inhibe los
catabólicos.
Aunque las más conocidas se relacionan con el metabolismo de los carbohidratos, no son
de menor importancia las que ejerce sobre el metabolismo lipídico o el de las proteínas, ya
que a corto plazo aumenta la oferta de sustratos en el interior celular para el
almacenamiento de energía y a medio plazo provoca un incremento de las actividades
enzimáticas relacionadas con la formación de reservas energéticas.
Las funciones de la insulina son muy variadas.
Jimena Moreno O.
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a) Sobre el metabolismo de los hidratos de carbono, la insulina aumenta el transporte de
glucosa a través de la membrana plasmática de las células en la mayoría de los tejidos,
excepto en el cerebro, los túbulos renales, la mucosa intestinal, las propias células B
pancreáticas y los eritrocitos.
b) En el hígado, la insulina estimula la síntesis de glucógeno inhibiendo la gluconeogénesis y la
glucogenolisis, por lo tanto una hormona hipoglucemiante.
c) La insulina favorece el transporte de los ácidos grasos y su captación por la célula adiposa
para ser almacenados. Estos ácidos grasos proceden de los quilomicrones y lipoproteínas
liberados por el hígado, en el que tiene lugar una alta actividad lipogénica por efecto de esta
hormona. Así, los ácidos grasos libres que entran al hígado se derivan hacia la esterificación,
provocando un efecto anticetogénico y, por otro lado, se sintetizan de nuevo ácidos grasos
libres y colesterol a partir del acetil-CoA. Tiene también una importante acción inhibidora
sobre la lipasa del tejido adiposo sensible a esta hormona, impidiendo que se liberen ácidos
grasos a la sangre y sean transportados a otros tejidos.
d) El efecto de la insulina sobre la síntesis de proteínas ocurre en un plazo de horas o días, ya
que la síntesis aumenta por efecto directo de la insulina sobre la maquinaria ribosómica.
Claramente su efecto sobre la síntesis proteica se observa en el hígado y en el páncreas,
donde la insulina aumenta la síntesis de albúmina y amilasa, respectivamente. En el músculo
estimula el transporte de ciertos aminoácidos a través de la membrana celular. Al mismo
tiempo, favorece la síntesis de enzimas relacionados con el almacenamiento de glúcidos,
lípidos y proteínas; e inhibe las enzimas proteolíticas y la salida de aminoácidos de la célula.
Además, es importante el papel de la insulina y los péptidos estructuralmente relacionados
con ella sobre el crecimiento del cartílago y hueso potenciando la captación de aminoácidos
distintos en cada caso, por lo que se consideran sinergistas.
e) La insulina tiene otros efectos importantes como la estimulación de la captación de fosfato,
potasio y magnesio por las células desde el espacio extracelular. Es también esencial su
papel en la reabsorción de sodio, potasio y fosfato por los túbulos renales.
f) Finalmente, la insulina potencia la termogénesis inducida por el alimento.
http://www.uned.es/pea-nutricion-y-dietetica-I/guia/enfermedades/diabetes/manual_el_indice_glucemi.htm
Jimena Moreno O.
14
Capítulo III
Insulina Recombinante
3.1.- CÓDIGO GENÉTICO
Es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la información contenida en al
ARNm y en definitiva en el ADN para la síntesis de proteínas; describe la correlación entre
dos lenguajes informativos que son: la secuencia de los nucleótidos en el ARNm y la
secuencia de aminoácidos en el polipéptido.
http://eluniversobajoelmicroscopio.blogspot.com/2012/01/codigo-genetico.html
Es decir el código genético establece correspondencia entre los 64 posibles tripletes de
bases del ARNm y los 20 aminoácidos de las proteínas.
4 nucleótidos
20 aminoácidos
Código
Jimena Moreno O.
15
Esta información se transmite de una
generación a otra mediante la producción
de réplicas exactas del código.
http://quimica4m.blogspot.com/2009/05/sintesis-de-unaproteina-y-codigo.html
Características:
 Es casi universal, pues lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo existen
algunas excepciones en unos pocos tripletes en bacterias, protozoarios, micoplasmas y
las mitocondrias.
 No es confuso, pues cada triplete tiene su propio significado
 Todos los tripletes tienen sentido, bien codifican un aminoácido o bien indican
terminación de lectura.
 Está degenerado, pues hay varios tripletes para un mismo aminoácido, es decir codones
sinónimos, como es el caso del Triptófano y Metionina que están codificados por un
único codón.
 Es unidireccional, pues los tripletes se leen en el sentido 5´-3´.
 La correspondencia entre nucleótidos y aminoácidos se hace mediante codones.
 Carece de solapamiento, es decir los tripletes no comparten bases nitrogenadas.
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Codigo/Codigo%20genetico.htm
Jimena Moreno O.
16
Gracias a la genética molecular, se han
distinguido 22 códigos genéticos, que se
diferencian del llamado código genético
estándar por el significado de uno o más
codones.
http://quimica4m.blogspot.com/2009/05/sintesis-de-unaproteina-y-codigo.html
3.2.- METODOLOGÍA
Ya que el código genético es un conjunto de normas por las que la información codificada
en el material genético se traduce en proteínas en las células vivas, también define la
relación entre secuencias de tres nucleótidos, llamadas codones, y los aminoácidos. Un
codón se corresponde con un aminoácido específico. El ARN se basa en transportar un
mensaje del ADN a la molécula correspondiente
La secuencia del material genético se compone de cuatro bases nitrogenadas distintas, que
tienen una función equivalente a letras en el código genético:
En el ADN
Adenina (A)
Timina (T)
Guanina (G)
Citosina (C)
En el ARN
Adenina (A)
Uracilo (U)
Guanina (G)
Citosina (C)
http://smcg.ccg.unam.mx/enp-unam/01-IntrodYEvolucion/structfuncDNA.pdf
La Transferencia de información en el genoma de un organismo se encuentra en el ADN
o, en el caso de algunos virus, en el ARN. La porción de genoma que codifica varias
proteínas se conoce como gen. Esos genes que codifican proteínas están compuestos por
Jimena Moreno O.
17
unidades de trinucleótidos llamadas Codones, cada uno de los cuales codifica un
aminoácido.
http://www.fedaes.org/quees/ataxiafriedreich/XXPORTU.htm
Cada subunidad nucleotídica está formada por un fosfato, una desoxirribosa y una de las
cuatro posibles bases nitrogenadas. Las bases purínicas Adenina (A) y Guanina (G) son
más grandes y tienen dos anillos aromáticos. Las bases pirimidínicas Citosina (C) y Timina
(T) son más pequeñas y sólo tienen un anillo aromático.
En la configuración en doble hélice, dos cadenas de ADN están unidas entre sí por puentes
de hidrógeno en una asociación conocida como emparejamiento de bases, además estos
puentes siempre se forman entre una (A) de una cadena y una (T) de la otra y entre una (C)
de una cadena y una (G) de la otra. Esto quiere decir que el número de residuos A y T será
el mismo en una doble hélice y lo mismo pasará con el número de residuos de G y C.
En el ARN, la (T) se sustituye por (U), y la desoxirribosa por una ribosa.
Cada gen codificante de una proteína se transcribe en una molécula plantilla, que se conoce
como ARN mensajero (ARNm), que a su vez se traduce en ribosoma, en una cadena
polipeptídica.
http://www.hartnell.edu/tutorials/biology/translation.html
En el proceso de traducción se necesita un ARN de transferencia (ARNt) específico para
cada aminoácido, al cual se une covalentemente guanosina trifosfato como fuente de
energía y ciertos factores de traducción.
http://www.hartnell.edu/tutorials/biology/translation.html
Jimena Moreno O.
18
Los ARNt tienen anti-codones complementarios a los codones del ARNm y se pueden
“cargar” covalentemente en su extremo 3' terminal CCA con aminoácidos. Los ARNt
individuales se cargan con aminoácidos específicos por las enzimas llamadas
aminoacilARNtsintetasas, que tienen alta especificidad tanto por aminoácidos como por
ARNt.
http://www.hartnell.edu/tutorials/biology/translation.html
La alta especificidad de estas enzimas es motivo fundamental del mantenimiento de la
fidelidad de la traducción de proteínas.
Síntesis Proteica
1
2
3
4
http://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/6299/1/4.2%20C%C3%B3digo%20gen%C3%A9tico%20y%20s%C3%ADntesis
%20de%20prote%C3%ADnas%20PRISCILA.pdf
Jimena Moreno O.
19
Hoy en día es relativamente fácil conocer la correspondencia entre aminoácidos de una
proteína y tripletes de nucleótidos de ARNm que los codifican, mediante una simple
comparación entre ambos. La información obtenida previamente en la que se basa el
conocimiento del Código Genético es por un lado; lo referente al ARNt, el cual a pesar de
no ser elemento propiamente dicho del Código, es esencial para entender la
correspondencia entre el ARNm y la proteína. Por otro lado es el ribosoma, donde se da la
síntesis proteica.
3.4.- ¿QUÉ ES UN CODÓN?
Es un Triplete de bases de ADN o ARNm que codifica para un aminoácido especifico en la
cadena polipeptídica durante la síntesis de proteínas o determina el cese de dicha síntesis.
http://www.sesbe.org/evosite/evo101/IIIC2ReviewDNA.shtml.html
¿Los codones del código son tripletes?
Para poder codificar los 20 aminoácidos naturales se necesita que cada aminoácido venga
especificado por una secuencia de 3 nucleótidos llamada Tripletes o Codón.
El triplete es la característica que define la naturaleza general del código. Hay 64
combinaciones diferentes de codones que sean posibles con tripletes de tres nucleótidos: los
64 codones están asignados a aminoácidos o a señales de parada en la traducción.
Ejemplo.- Tenemos una secuencia de ARN, UUUAAACCC, la lectura del fragmento
empezaría en la primera U (convenio 5' a 3'), por lo que nos daría tres codones que serían
UUU, AAA y CCC, cada uno de los cuales específica un aminoácido. Esta secuencia de
ARN se traducirá en una secuencia aminoacídica de tres aminoácidos de longitud. Debido a
que el Código Genético es redundante se puede hasta 6 codones diferentes codificar para el
mismo aminoácido.
Adaptadores
La lectura de la secuencia de codones es dada por el ARNm, el cual ejerce un papel de
adaptador de la información genética a la secuencia de las proteínas. Este mecanismo lo
hace como estructuras activas especializadas, es decir formando los aminoacil-tARNs, que
dirige los aminoácidos hacia el ARNm que está situado en el ribosoma. En este orgánulo
se da la interacción del triplete de bases del anti-codón con el codón determinado durante la
traducción; por lo que: “un codón determina a un aminoácido”.
Jimena Moreno O.
20
Emparejamientos codón-anti-codón
http://www.monografias.com/trabajos82/codigo-genetico/codigo-genetico2.shtml
Hipótesis
Los tripletes no se solapan
Una de las propuestas iniciales para la distribución de los codones en el ARNm fue que
tripletes contiguos compartieran nucleótidos.
En una hipótesis solapante, la secuencia del primer triplete restringe las posibles secuencias
del segundo y estas a su vez del tercero, así sucesivamente, por lo que la secuencia de
aminoácidos de las proteínas estaría condicionada y no podría ser cualquiera.
JÓSE LUQUE/ÁNGEL HERRÁEZ. Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética, Publicación ELSEVIER SCIENCE, MadridEspaña 2002.Capítulo 3 Expresión Génica.
Bajo esta hipótesis la alteración de una base afecta a varios codones, lo que produciría
alteraciones en más de un aminoácido; en la realidad esto no se cumple y se demuestra que
Jimena Moreno O.
21
la hipótesis solapante es incorrecta, ya que los tripletes nunca comparten nucleótidos, no
se solapan; siendo así para el Código Genético de todos los seres vivos.
3.5.- ASIGNACIÓN DE CODONES A AMINOÁCIDOS CONCRETOS
Durante la traducción, el ribosoma añade un aminoácido al polipéptido en formación por
cada tres bases del ARN mensajero (un codón). Esta asignación se hace mediante el
reconocimiento codón / anti-codón, donde una molécula de ARN transferente, portadora de
un aminoácido concreto, se asigna a cada codón del ARN mensajero.
Ejemplo.- Al codón "AUG" se le acopla el anti-codón "UAC" del ARNt, y de esta forma se
añade la metionina a la nueva proteína. Luego el ARNt vuelve al citoplasma para buscar
unirse a otra metionina.
Cada nucleótido tiene un solo complemento, "A" y "U" son complementos, y también "G"
y "C". De esta forma cada codón tiene un solo anti-codón, y cada anti-codón tiene un solo
codón. Sin embargo, algunos aminoácidos tienen varios codones y por lo tanto anticodones asociados.
El codón AUG codifica para metionina, y además sirve como sitio de iniciación; el primer
AUG en un ARNm codifica el sitio donde se inicia la traducción de proteínas.
Codón de Inicio.- Generalmente el codón AUG, el que codifica a la metionina es el
responsable de la incorporación del aminoácido correspondiente al polipéptido, al mismo
tiempo actúa fe forma específica como codón de inicio en la mayoría de los cosas; es decir
que en la síntesis de la mayoría de proteínas comienza en un codón AUG, explicando así
que la metionina siempre ocupa la posición inicial o N-terminal de cualquier polipéptido
recién sintetizado.
Codón de terminación.- Los codones UAA, UAG y UGA no codifican aminoácido
alguno, sino que causan la finalización de la síntesis proteica, por lo tanto se los denomina
codones de terminación, de paro, de stop, o también codones sin sentido.
La presencia de 3 codones de terminación en un total de 64 indicaría, que estadísticamente
la síntesis no se alargaría más allá de unos 20 aminoácidos. Sin embargo la región
estructural de los genes para proteínas contiene una frecuencia mucho menor de codones de
terminación.
La región del ADN comprendida entre un codón de inicio y uno de terminación se llama
“marco abierto de lectura”.
Jimena Moreno O.
22
3.6.- ¿QUÉ ES UN VECTOR?
Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan
insertados que denominamos inserto.
Para que un vector sirva, debe ser una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el
fragmento de ADN que transporta y tener secuencias de reconocimiento que permitan la
inserción del fragmento de ADN a clonar. Los vectores que transportan un fragmento
insertado se denominan vectores recombinantes.
http://www.arrakis.es/~ibrabida/viginsercion.htmlhttp://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf
Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, la cual se
mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/Recombinant_DNA_Technology/05t.html
Características generales de los plásmidos como vectores de clonado
Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped,
como es:
* El tamaño de los insertos que pueden transportar
* El número de copias que producen
* El número y tipo de genes marcadores que contienen.
Jimena Moreno O.
23
Sitios de restricción únicos
Marcadores genéticos
pBR322
4361 bp
(Permiten selección
de transformantes)
Origen de replicación
Tamaño pequeño
(Mayor eficiencia de transformación)
http://lnx.futuremedicos.com/Revista_future/Articulos&Trabajos/Basicas/bq/clonacion_DNA.htm
Tipos de vectores
A) Vector de clonación
Molécula de ADN originada en un virus, en un plásmido, o en la célula de un organismo
superior en el que se puede integrar otro fragmento de ADN sin que pierda la capacidad de
auto-replicación.
B) Vector lanzadera
Pequeño plásmido capaz de producir transfección en células de dos especies diferentes.
Poseen dos orígenes de replicación, cada uno adecuado a un tipo celular; y los genes
requeridos para la replicación que no les proporcionan las células hospedadoras.
C) Vector de expresión
Pequeño plásmido que contiene un lugar de clonaje múltiple flanqueado por una o dos
secuencias promotoras, los cuales se requieren para transcribir los fragmentos de ADN
insertados en el lugar de clonaje múltiple.
D) Vector de reposición
Vector de clonaje que tiene un par de lugares ruptura flanqueando una secuencia
dispensable; durante el clonaje esta secuencia se reemplaza por una de ADN exógeno.
Jimena Moreno O.
24
Ejemplos de vectores
 Plásmidos.- Son moléculas de ADN circular o lineal que se replican y transmiten
independientemente del cromosoma, su tamaño va de 1 kb a 250 kb y contienen de 2
hasta 30 genes.
Fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados, proceden
de moléculas de ADN de doble cadena extra cromosómicas que se encuentran de manera
natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.
http://genemol.org/biomolespa/plasmidos/plasmidos-01.html
Episoma: Si el plásmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le
denomina episoma. Dentro de este grupo de plásmidos se encuentran los factores de
fertilidad o plásmidos F, que regulan el proceso de conjugación bacteriana.
pUC18
Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy
beneficiosas:
- Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente
grandes (de unos 10.000 pares de bases).
- Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos
de ADN insertado por célula.
- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para
enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o
sitio múltiple de clonación.
- Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene
un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se
inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a
colonias de color blanco.
 Bacteriófago lambda (λ).- Para ser utilizado de vector, el tercio central de su
cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad
del fago de infectar células y formar calvas.
Jimena Moreno O.
25
Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una
enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN
de interés y los unimos con una ADN ligasa.
Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del
fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores
se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de
ADN de interés en la clonación.
Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb (kilo bases).
 Cósmidos.- Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de
lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el
empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica.
Contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a
antibióticos y pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.
 YAC.- Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en
sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están
unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para
insertar ADN exógeno.
Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100
a 1000 kb.
 BAC.- Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de
fertilidad (factor F) de bacterias.
El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información
genética durante la conjugación bacteriana.
Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.
3.7.- TRANSFORMACIÓN EN UN HUÉSPED DE ESCHERICHIA COLI
La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos
permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o súper enrollada
en casi cualquier tipo de bacteria. El método más utilizado para transformar E. coli, por su
simplicidad.
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimicabiolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%2
0CON%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
Jimena Moreno O.
26
El proceso por el cual un vector plasmídico es introducido y mantenido de forma estable en
una bacteria se denomina transformación. Para detectar la transformación, el ADN
introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado.
En la bacteria E. coli este proceso no ocurre de forma natural y ha de inducirse en el
laboratorio. Para facilitar este proceso, se tratan las bacterias con calcio incubando en frío
(a unos 4º C) lo cual estimula la apertura de poros que facilitan la entrada de ADN
exógeno. A estas bacterias susceptibles de incorporar ADN exógeno las denominamos
bacterias competentes y por último se usa un vector plasmídico.
Clonación de ADN en Escherichia coli.
Para replicar el ADN clonado se pueden utilizar distintos tipos de célula huésped. Uno de
los huéspedes más utilizados es la cepa de laboratorio K12 de E. coli, esta y otras cepas de
E. coli se utilizan como huésped ya que están bien caracterizadas genéticamente y pueden
aceptar un amplio espectro de vectores, incluyendo los plásmidos, los fagos y los cósmidos.
Huéspedes de expresión microbiano – E. coli
Ventajas
 Gran cantidad de vectores a usar
 Altísima eficiencia de transformación
 Fermentaciones muy bien conocidas
 Recuperación y lisis celular muy sencilla
Desventajas
 Problemas de contaminaciones con pirógenos
 A veces baja expresión
 No glicosila las proteínas
 Proteínas no se exportan
PROCEDIMIENTO
Si se utiliza un plásmido como vector, el procedimiento precisan varios pasos:
1) El ADN que se va a clonar se aísla y se trata con una enzima de restricción para
crear fragmentos que acaben en secuencias específicas.
2) Estos fragmentos se ligan a moléculas de plásmido que han sido cortadas con la
misma enzima de restricción, obteniéndose un vector recombinante.
3) El vector recombinante se transfiere a células huésped bacterianas, generalmente
por transformación, un proceso en el que las moléculas de DNA cruzan la
membrana de la célula huésped transfiriéndose a su interior.
4) La célula huésped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formará colonias.
Puesto que las células de cada una de las colonias provienen de una sola célula
Jimena Moreno O.
27
inicial, todas las células de la colonia, y los plásmidos que contienen, son
genéticamente idénticas, o clones. Se rastrean las colonias para identificar las que
han incorporado el plásmido recombinante.
Los vectores plasmídicos penetran en las células de E. coli mediante un proceso de
transformación inducido por cloruro cálcico o mediante electroporación a 3-24 kV /cm, que
es eficaz en bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNA-recombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf
Resumen:
 Los vectores plasmídicos se aíslan y se cortan con una enzima de restricción.
 El ADN a clonar se corta con la misma enzima de restricción, produciendo una
colección de fragmentos.
 Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se transfieren a huéspedes
bacterianos para su replicación.
 Las células bacterianas que contienen plásmidos pueden identificarse por
crecimiento en un medio selectivo, y pueden aislarse.
 El ADN clonado puede recuperarse del huésped bacteriano para nuevos análisis.
Jimena Moreno O.
28
Ejemplo de transformación con el Plásmido pBluescript (pBL).
La introducción de ADN exógeno en las bacterias competentes es un proceso muy ineficaz,
y por ello es necesario utilizar un método que nos permita identificar al reducido número de
bacterias que han incorporado y mantenido de forma estable el plásmido con el que las
hemos transformado.
Con este objetivo a los plásmidos se les ha dotado de un sistema de selección, que en el
caso de pBL consiste en un gen de resistencia a la ampicilina. Este gen confiere a las
bacterias transformadas con el plásmido un fenotipo fácilmente diferenciable: sólo las
bacterias que han incorporado el plásmido serán capaces de crecer en presencia del
antibiótico ampicilina cuando son sembradas en una placa Petri conteniendo medio de
cultivo con el mencionado antibiótico.
http://www.genomics.agilent.com/files/manual/212205_a01.pdf
Este esquema del vector plasmídico p Bluescript II sk (-) indica;
-
El origen de replicación (pUC ori)
El gen que confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina
El origen de replicación del bacteriófago filamentoso f1 (f1 (-) ori)
El promotor del gen lac (P lac)
El gen lacZ que codifica para la b-Galactosidasa (lacZ)
El sitio de clonaje múltiple (MCS), que aparece descrito con mayor detalle debajo
del esquema del vector.
Jimena Moreno O.
29
3.8.- PRODUCCIÓN DE LA INSULINA RECOMBINANTE
La producción de insulina humana en E. coli a partir de 1980 y su aprobación para uso
clínico en 1982 revolucionaron la biotecnología.
La insulina es el primer caso de proteína producida por ingeniería genética, esto fue posible
por el desarrollo de técnicas que permitieron transferir información genética de un
organismo a otro y expresar esa información en el organismo huésped.
Biología Molecular
Método tradicional
http://www.fq.edu.uy/~microbio/MGral/T2008/IngGen2008color.pdf
La biotecnología está presente en la vida cotidiana, y ofrece sus beneficios. La salud
humana es uno de los aspectos que se ha visto favorecido a partir de los avances científicos
logrados en las últimas décadas.
En la actualidad, varios laboratorios farmacéuticos producen insulina humana, tanto a partir
de levaduras, como de bacterias (Escherichia coli); y sin ningún riesgo para la salud, es
decir que la vida de millones de diabéticos en el mundo depende de la insulina humana
recombinante.
Jimena Moreno O.
30
En 1978 se logró la clonación en donde se produjeron una gran cantidad de copias idénticas
de bacterias capaces de producir insulina, introduciendo el gen para la insulina en células
distintas a donde es producida su naturaleza propia.
http://www.publicaciones.ujat.mx/publicaciones/kuxulkab/ediciones/27/05_Producci%C3%B3n%20de%20insulina%20a%20partir%
20de%20organismos%20bacterianos.pdf
http://www.educa2.madrid.org/cms_tools/files/6046b373-a0b6-4737-8f6b-4553dfefcd53/11.-%20Genetica%20bacteriana.pdf
Jimena Moreno O.
31
La estrategia seguida para la producción de insulina humana recombinante, es en primer
lugar; sintetizar químicamente las cadenas de ADN con las secuencias correspondientes a
las cadenas de glicocola y fenilalanina, siendo necesarias 63 nucleótidos para la primera y
90 para la segunda, más un triplete para señalar el fin de la traducción.
Además, para facilitar la separación de los productos sintetizados, se añadió a cada gen el
triplete correspondiente a la metionina
http://www.iqb.es/d_mellitus/historia/historia07.htm
Los genes sintéticos A y B se insertaron por separado en el gen bacteriano responsable de la
b-galactosidasa presente en un plásmido. Los plásmidos recombinantes se introdujeron en
E. coli donde se multiplicaron, fabricando un ARNm que tradujo una proteína quimérica,
en la que una parte de la secuencia de la b-galactosidasa estaba unida por una metionina a
la cadenas de glicocola o de fenilalanina de la insulina. Como ninguna de las cadenas de
insulina contiene metionina, esto se aprovechó para separar las cadenas de la insulina del
resto de proteína quimérica rompiéndola con bromuro de cianógeno un producto químico
que separa la proteína de fusión de la β-galactosidasa; es decir destruye la metionina.
Una vez purificadas las dos cadenas, se unen mediante una reacción que forma puentes
disulfuro y se obtiene insulina humana pura, siendo el producto final, insulina humana
biosintética idéntica en todos los aspectos a la insulina purificada del páncreas humano.
Si bien estos son los pasos a seguir para la obtención de insulina recombinante, si se inserta
en el plásmido bacteriano el gen entero de la insulina, se obtendría como resultado la preproinsulina, por lo que para evitar estas dificultades se sintetizan químicamente las
secuencias de ADN correspondiente a las cadenas polipeptídicas A y B que se insertan
separadamente en un gen bacteriano.
Jimena Moreno O.
32
En una explicación más detallada se ve que en el proceso bacteriano original, se
construyeron genes sintéticos de las subunidades mediante síntesis de oligonucleótidos, con
63 nucleótidos para A y 90 para B. Cada oligonucleótido sintético se insertó en un vector
en una posición adyacente al gen que codifica la forma bacteriana de la enzima βgalactosidasa.
Cuando se transferían a un huésped bacteriano, el gen lacZ y el oligonucleótido sintético
adyacente se transcribían y se traducían como una unidad denominada polipéptido de
fusión, contenían la secuencia aminoacídica de una de las subunidades de la insulina.
Las proteínas de fusión se purificaban de los extremos bacterianos y se trataban con
bromuro de cianógeno. Cuando se mezclan las dos subunidades se unen espontáneamente,
formando una molécula de insulina intacta y activa.
KLUG WILLIAM S. Conceptos de Genética, 8ª ed. Pearson Educación, 2006. Capítulo 22 Aplicaciones y ética de la biotecnología.
Jimena Moreno O.
33
Después de asegurarse de que el gen transferido se expresa, se producen grandes cantidades
de la bacteria transformada, y la proteína humana se recupera y se purifica.
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=3&note=21
Jimena Moreno O.
34
Capítulo IV
Ingeniería Genética en la Industria y Sociedad
4.1.- LA INSULINA A NIVEL INDUSTRIAL
La primera proteína recombinante aprobada como medicamento fue justamente la insulina,
en 1982, para el tratamiento de pacientes con diabetes mellitus. Hasta ese entonces los
pacientes debían inyectarse insulina extraída del páncreas de vacas o cerdos.
Después de la comercialización de la insulina por la compañía Eli Lilly en Estados Unidos,
se han desarrollado distintos mecanismos de penetración de la insulina al organismo, de
modo de procurar una mejor calidad de vida a quienes necesitan del suministro exógeno de
la misma, evitando su introducción al organismo por inyección.
http://www.biopositivizate.com/docs/ASEBIO_BIOTECNOLOGIA_Y_SALUD.pdf
Algunas de estos avances consisten en el desarrollo de insulina cuya vía de entrada al
organismo es la inhalación, o preparaciones en cápsulas que contienen en su interior
insulina, protegiendo a la molécula de la acción de los jugos gástricos que habían impedido
históricamente su administración oral, lo cual fue desarrollada por científicos de la India en
el año 2004.
Hay que destacar que la insulina fue una de las primeras proteínas cristalizadas, y la
primera en ser secuenciada, es por eso que hoy varios laboratorios farmacéuticos producen
insulina humana, tanto a partir de bacterias como a partir de levaduras, de una manera más
simple y sin ningún riesgo para la salud.
La Biotecnología y la Industria Farmacéutica en nuestra vida cotidiana
Los medicamentos que se venden en la farmacia se producen de diversas maneras. Las
moléculas simples se producen por síntesis química, mientras que las moléculas complejas
Jimena Moreno O.
35
generalmente deben ser purificadas a partir de microbios, plantas o animales. Los
inconvenientes de esta estrategia son los bajos rendimientos de producción y el riesgo de
contaminación del fármaco con toxinas o patógenos, como los virus.
Es por eso que en el caso de medicamentos proteicos, la industria farmacéutica ha optado
por el camino de la ingeniería genética o metodología del ADN recombinante. Mediante
esta tecnología se pueden obtener grandes cantidades de una proteína, completamente
aislada de los componentes celulares del organismo de origen.
Esto se consigue por introducción de un gen en un organismo hospedador fácil de cultivar,
este organismo se denomina entonces "organismo genéticamente modificado" y la proteína
obtenida, "proteína recombinante".
Insulinas producidas por plantas
Otra manera de producción de insulinas mediante ingeniería genética es el uso de plantas o
animales como productor a gran escala. En tal sentido, la empresa canadiense de
biotecnología SemBioSys Genetics, ha desarrollado una planta transgénica que produce
insulina. La hormona se obtiene de cultivos de cártamo, una planta oleaginosa que se ha
modificado genéticamente con el gen humano productor de insulina.
Los primeros ensayos con animales han demostrado que la hormona fabricada a partir de
esta planta es equivalente, desde el punto de vista químico, estructural y funcional, a la
insulina humana farmacéutica.
Las pruebas también confirman que la insulina producida en cártamo es fisiológicamente
equivalente a la hormona humana, por lo que podría ser empleada para tratar a personas con
diabetes tipo 1.
Se estima que si los próximos ensayos son positivos, este tipo de insulina producida por
plantas transgénicas podría estar en el mercado en tres años; siendo el primer fármaco que
se obtiene de una planta modificada genéticamente; permitiendo reducir los costes de
producción de insulina en más de un 40% y acelerar su fabricación, ya que SemBioSys
Genetics cuenta con cultivos de este tipo en Canadá, Estados Unidos, México y Chile.
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Insulinas producidas por animales transgénicas
En 2007, Argentina se convirtió en el único país del mundo capaz de producir insulina
humana con vacas transgénicas. Nacieron cuatro terneras sin parangón: todas ellas tienen
en sus células el gen que les permite producir en su leche esta hormona que se utiliza para
tratar la diabetes. Si bien la insulina fabricada en vacas transgénicas no está aún en el
mercado, la dinastía Patagonia (el nombre con que se conoce a estas terneras), representa
un nuevo hito en el desarrollo de una plataforma tecnológica para la producción de
medicamentos: el llamado tambo farmacéutico.
En el caso de la insulina obtenida en animales transgénicos, ha sido obtenida recientemente
empleando cabras y ganado vacuno; produciéndose en la leche de los mismos. Es de
destacar que la obtención de insulina humana en la leche de vaca ha sido desarrollada por el
laboratorio de Biosidus de la Argentina, y que sólo hay dos multinacionales farmacéuticas
que producen la insulina a partir de leche, empleando cabras. Este tipo de investigación y
de desarrollo biotecnológico posiciona a la Argentina en un nivel muy privilegiado en la
biotecnología a nivel internacional; estimándose que el medicamento podría estar en el
mercado en pocos años.
Estos animales transgénicos son portadores del gen de la insulina de manera inocua,
expresándose en el tejido mamario.
En caso del desarrollo biotecnológico de la empresa Biosidus, las terneras denominadas
Patagonia I, II, III y IV nacieron entre Febrero y Marzo de 2007. Son terneras de Raza
Jersey que poseen en su material genético el gen del precursor de Insulina humana. Una vez
que hayan alcanzado su madurez sexual serán estimuladas para estudiar los niveles de este
precursor en su leche. La leche con el precursor de insulina humana es sólo una etapa
intermedia del proceso de producción.
El paso siguiente a partir de la obtención de dicho precursor será la optimización del
proceso de aislamiento y purificación, a escala industrial, de la insulina humana a partir de
leche bovina.
Biorreactor
La glándula mamaria es un Biorreactor de alta productividad pues constituye un tejido
especializado para la eficiente producción de proteínas. Aprovechando esta capacidad,
mediante el uso de herramientas de biología molecular, es posible colocar la información
genética de una proteína humana para que sea producida en altas cantidades en la leche.
Para ello, el gen del precursor de insulina humana fue “programado” para que sólo se active
en las glándulas mamarias del animal.
Esta estrategia genética permite que un gen, que se encuentra presente en todas las células
de un organismo, se muestre activo o “encendido” solo en un tejido predeterminado y no en
otro. Para evitar los posibles efectos que la insulina pueda ocasionar sobre la fisiología de
los animales transgénicos, se diseñó un precursor modificado, inactivo en los bovinos, para
que luego de obtenido en la leche se pudiera recuperar su forma farmacéutica activa. A
partir del precursor de la insulina humana presente en la leche; el cual tiene un agregado de
Jimena Moreno O.
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un pequeño fragmento de proteína en la molécula, hace que cambie su estructura espacial y
la inactiva en el animal.
De esta manera, el proceso productivo consistirá en la obtención del precursor en la leche,
su procesamiento molecular para la obtención de la molécula activa y su purificación final
para la obtención del producto farmacéutico.
Es así como la glándula mamaria de estos animales se convierte en un verdadero
Biorreactor específico y de alta productividad.
Exhaustivas pruebas de seguridad y eficacia permitirán, durante ese período, cumplir con
todos los requisitos regulatorios indispensables para obtener la aprobación del producto por
la autoridad competente. Será entonces que se habrán logrado las condiciones necesarias
para llevar al mercado farmacéutico un nuevo producto de aplicación en medicina humana.
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Beneficios de la producción de insulina en plantas y animales transgénicos
El director ejecutivo de SemBioSys, Dr. Marcelo Criscuolo, explicó que el tratamiento con
insulina, al igual que otros basados en la acción de proteínas con baja actividad específica,
como la hormona de crecimiento humana o los anticuerpos monoclonales, requieren un
sistema de producción de alta escala para poder abastecer la demanda de los mismos a un
costo razonable.
Para ser efectivo, el tratamiento con insulina requiere su administración cotidiana, lo que
significa un muy elevado costo para el paciente y para todo el sistema de salud. Esta
estrategia de producción ofrece sustanciales mejoras en los rendimientos finales, sobre todo
cuando se la compara con aquellos sistemas desarrollados en bacterias o células en cultivo.
Tomando el ejemplo de Biosidus, la obtención de estos nuevos animales transgénicos
representa un gran avance en los planes de investigación y desarrollo de esta empresa
donde han trabajado más de 50 científicos en el proyecto, y resalta su alta capacidad
científica y tecnológica, ubicándola entre las mejores empresas innovadoras a nivel
mundial.
Este “tambo farmacéutico” permitirá “una alternativa tecnológica de alta productividad y
bajo costo para abastecer esta enorme y creciente demanda.
La obtención de insulina humana recombinante mediante métodos más eficientes como los
que aporta la tecnología de plantas y animales transgénicos permitirá abaratar los costos de
producción sin deterioro de la calidad del producto.
4.2.- PRODUCCIÓN DE HORMONAS EN OTRAS BACTERIAS
La Insulina, la Somatostatina, el interferón, la hormona del crecimiento, la FSH; no son
modelos de producción mediante Ingeniería Genética del ADN recombinante sino tenemos
también la producción de: Factores de crecimiento, interleukinas, receptores, vacunas,
anticuerpos monoclonales, enzimas, hemoglobina, etc. utilizando distintos vectores y según
la complejidad de la proteína a producir, se elegirá un organismo u otro como es las
levaduras, bacterias, insectos, células de mamíferos.
Proteínas recombinantes a partir de bacterias
Las proteínas sintetizadas a partir de bacterias son las más fáciles de aislar, puesto que es
más fácil cultivarlas que otros organismos.
Sin embargo, las bacterias no realizan splicing y tampoco glicosilan ni realizan todas las
modificaciones pos-traduccionales necesarias para la función de la proteína.
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Proteínas recombinantes a partir de levaduras
Las levaduras son organismos eucariotas con los que podemos trabajar fácilmente en un
ámbito industrial.
La levadura sí realiza glicosilación, pero de forma distinta a como la realizamos los
humanos. Debido a ello estas proteínas pueden ocasionar problemas de inmuno respuesta.
Proteínas recombinantes a partir de células de insectos
Otro de los sistemas utilizados son células de insecto. En este caso, podemos aceptar dos
variedades de producir estas proteínas:
 En primer lugar, podemos poner esas células en un medio especial e inocular con
báculo-virus, que no resultan malévolos para los humanos, es decir no los infectan.
 En segundo lugar podemos utilizar insectos completos para la producción de la
proteína. En estas alternativas, la glicosilación sigue siendo un problema, puesto que
suele ser distinta. Los humanos realizamos glicosilaciones complejas que no son
capaces de hacer los insectos y muchas veces, se buscan mutantes que sean capaces
de glicosilar de forma parecida a los humanos.
Proteínas recombinantes a partir de cultivos celulares
En este caso, se está utilizando cultivos en los que si la proteína se excreta, se purifica el
líquido y si es intracelular, rompemos las células y purificamos. Para el escalado, hay que
tener en cuenta que las células crecen por adhesión.
Si utilizamos células de mamífero, ya se acerca mucho a la glicosilación de los humanos,
será en este caso bastante complejo esas modificaciones post-traduccionales, pero no serán
idénticas en muchos casos.
Los inconvenientes es que suelen ser cultivos lentos, y además aumentando en gran medida
el riesgo de contaminación fúngica y bacteriana. Hay que saber que la glicosilación del
hombre y del mono es distinta al resto de mamíferos, de modo que no producimos el galalfa-1,3-gal como azúcar terminal. Y es que la glicosilación varía en cada tejido, son como
etiquetas que las células realizan para llevar sus proteínas de un lado a otro de la célula.
Además son marcadores y ayudan a determinar el plegamiento, estructura y función de la
proteína.
4.3.- LA BIOTECNOLOGÍA PARA DIAGNOSTICAR Y RASTREAR
ENFERMEDADES GENÉTICAS
Con el objetivo de estudiar y erradicar las enfermedades, la Biotecnología ha desarrollado
en las últimas décadas una serie de aplicaciones médicas en las que se destacan:
 Bilogía Molecular
Jimena Moreno O.
 Tecnologías Proteómicas
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



Aplicaciones Genómicas
Terapia Génica
Farmacología
Terapia Celular
 Metodología Bioinformática
 Bioingeniería
 Medicina Regenerativa
Las nuevas técnicas de Genómica, Proteómica y Bioinformática permiten detectar la
presencia de un gen o una proteína responsable de una patología
GENÓMICA.-Estudia los genes que conforman el ser humano como es su secuencia,
función y participación en el desarrollo de enfermedades mediante técnicas de PCR, Chips
de ADN y Kits de diagnóstico.
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PROTEÓMICA.- Estudia las proteínas que conforman el ser humano: su secuencia,
estructura, función y participación en el desarrollo de enfermedades
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BIOINFORMATICA.- Hace uso de bases de datos y procesos algorítmicos para
evaluaciones a gran velocidad como herramienta para estudiar enfermedades.
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TERAPIA GÉNICA.- Se basa en la modificación de genes de una célula o de un tejido
enfermo, con el propósito de aliviar o eliminar la enfermedad.
Consiste en la adición de genes terapéuticos a las células para la producción de una proteína
deficiente/alterada o dar nuevas propiedades a las células, por ejemplo inducir una
respuesta inmune.
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TERAPIA CELULAR.- Es un conjunto de técnicas que se basan en la sustitución de
células enfermas por células sanas.
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MEDICINA REGENERATIVA.- Busca la reparación o regeneración de órganos dañados
a través de métodos puramente biológicos. Se basa en el uso y manipulación de células
vivas, creando sustitutos biológicos para implantarlos en el cuerpo y así reparar, remplazar,
mantener o mejorar la función de un órgano o tejido.
Las técnicas de Medicina regenerativa esperan ofrecer esperanzas en el tratamiento de
enfermedades degenerativas, como el Alzheimer o el Parkinson, antes del 2025.
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INGENIERÍA GENÉTICA.- La Biotecnología participa en la creación de una nueva
generación de vacunas más seguras y eficaces. Vacunas elaboradas por medio de la
Ingeniería Genética con virus modificados por para que no generen reacciones adversas, o
elaboradas con proteínas obtenidas del virus, para evitar inyectar el virus entero; se usan
para el diagnóstico clínico de infecciones virales o tipos de tumores.
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Muchas enfermedades genéticas se pueden diagnosticar en estadios prenatales usando la
biotecnología. Los métodos más amplios para la detección de estas enfermedades son la
amniocentesis y la extracción de vellosidades coriónicas
En la amniocentesis, se utiliza una aguja para extraer fluido amniótico el cual es analizado
para detectar enfermedades cromosómicas y genéticas.
Jimena Moreno O.
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En la extracción de vellosidades coriónicas, se inserta un catéter en el útero, se extrae una
pequeña muestra de tejido del corión fetal; entonces se utiliza para realizar análisis
citogenéticos, bioquímicos y basados en AND recombinante.
SECTOR FARMACÉUTICO.- La biotecnología aporta un nuevo desarrollo de fármacos
más eficaces y específicos:
Sustitución de procesos físico-químicos por biológicos en la obtención de
fármacos, como síntesis de vitaminas por fermentación bacteriana, plantas y
animales como biofactorías.
Obtención efectiva de sustancias antitumorales, proteínas, factores de crecimiento,
anticuerpos monoclonales, vacunas
Diseño de fármacos especializados para tipos de pacientes determinados
permitiendo la asistencia individualizada.
Desarrollo de nuevas soluciones para enfermedades incurables gracias a los nuevos
descubrimientos en genómica y proteómica
Menor coste y tiempo de producción de los fármacos.
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4.4.- INFLUENCIA DE SU PRODUCCIÓN EN LA SOCIEDAD.
Pues aunque parezca increíble, hasta no hace mucho se usaban insulinas procedentes del
páncreas de ciertos animales.
Los primeros fueron los perros, de ellos se consiguió aislar y producir por primera vez
insulina, allá por el año 1920 y también en ellos fue probada su efectividad, esta insulina
obtenida de los perros era escasa y contenía demasiadas impurezas que provocaban graves
reacciones alérgicas.
Entonces llegó el turno a los bueyes (insulina bovina) y finalmente a los cerdos (insulina
porcina). Fue esta última la insulina de cerdo, la que estuvo en auge en todo el mundo hasta
la década de 1980, pues es prácticamente idéntica a la insulina humana solo se diferencian
en un aminoácido.
Jimena Moreno O.
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Gracias a ella se salvaron millones vidas de personas diabéticas. Aún hoy en día se sigue
comercializando en algunos países.
Pero la gran revolución en el proceso de fabricación de insulina artificial se produjo en la
década de 1980, gracias a la ingeniería genética y a la bacteria Escherichia coli que se
convirtió en una verdadera “fábrica” de insulina, y lo que es más importante, en grandes
cantidades.
También se obtiene, de forma similar, a partir de una levadura: Sacharomces cerevisae y
asa con ello se garantiza el consumo mundial de insulina.
Recientemente, en 2007, una empresa de biotecnología canadiense ha conseguido producir
insulina similar a la insulina humana a partir de una planta, el cártamo, modificada
genéticamente con un gen humano. Aseguran que con ella se podrían reducir un 40% los
costes de producción y acelerar su fabricación.
Usos de la biotecnología
Técnicas de identificación forense.- Consiste en someter el ADN de una célula a la acción
de enzimas de restricción, obteniéndose una colección de fragmentos de diferentes
tamaños. Una sonda (secuencia de ADN marcada radiactivamente) específica se unirá a
determinados fragmentos en determinadas posiciones. Si el procedimiento se lleva a cabo
en zonas del ADN que sean polimórficas, esto constituye una especie de “huella” de
identificación que es distinta a la de otro individuo, pues otro ADN, sometido a la acción
del mismo conjunto de enzimas de restricción, rendirá una serie de fragmentos diferente del
anterior, uniéndose la sonda entonces a otros, en diferentes posiciones. Esta huella genética
es de amplio uso en criminología y pruebas de paternidad siendo su fiabilidad altísima. Se
denomina análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción o PLFR.
Técnicas de diagnóstico/ Proyecto Genoma Humano (PGH).- El genoma es el contenido
del material genético de un organismo biológico en un juego completo de cromosomas.
La perspectiva del PGH en medicina se basa en el postulado de que todas las enfermedades,
excepto el trauma, tienen un componente genético. Las técnicas de diagnóstico consisten en
detectar anomalías genéticas incluso antes de que se manifieste el fenotipo de la
enfermedad. Es importante tener en cuenta, que mediante esta técnica se ha avanzado en el
diagnóstico y pronóstico de determinadas enfermedades genéticas, pero que esto no va
necesariamente de la mano del desarrollo de terapias eficaces para solucionar el problema
por lo que el conocimiento del riesgo de manifestar una determinada enfermedad genética
puede ser una carga innecesaria para el paciente.
Terapias génicas.- Es la administración de material genético en un paciente con la
intención de corregir un defecto genético específico. Se puede utilizar para curar
enfermedades hereditarias y adquiridas y se puede llevar a cabo en células somáticas o en
células de la línea germinal. En USA las enfermedades hereditarias para las cuales se
encuentra aprobado el uso de la terapia génica son enfisema pulmonar, fibrosis quística,
hipercolesterolemia familiar e inmunodeficiencia combinada severa (“niños burbuja”).
Jimena Moreno O.
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Entre las enfermedades adquiridas, son factibles de tratar en dicho país mediante terapia
génica SIDA y algunos tipos de cáncer.
Clonación y transferencia nuclear.- El clon es la “copia fiel” del original. Este
procedimiento lleva a cabo la partición de un embrión, o separación de blastómeros totipotentes (células toti-potenciales son aquellas capaz de dar origen a un individuo completo)
en embriones pre-implantatorios de 2-32 células. Esta técnica conlleva muchas
controversias y dudas de índole valórica.
Células madre embrionarias y de adultos.-Después de la fecundación, el embrión
unicelular tiene la capacidad de empezar a desarrollar un individuo humano completo; sin
embargo, durante las sucesivas divisiones celulares el ADN va sufriendo una serie de
plegamientos que hacen ilegible la información de numerosos genes. Estas células con
plegamientos de su ADN no dan lugar a un embrión completo sino a estirpes celulares
diferenciadas, denominándolas células pluripotenciales. Cuando estas células
pluripotenciales son capaces de multiplicarse y proporcionar así células con el fin de
reparar y renovar los tejidos donde pertenecen, se denominan células multipotenciales.
Estas células están presentes en la mayoría de los órganos de los seres humanos adultos y
su función es renovar las poblaciones de células que van envejeciendo.
Las células pluripotenciales y las multipotenciales se consideran células madre o
“stemcells”.
La utilización terapéutica de células madre intenta reparar tejidos dañados utilizando
mecanismos similares a los que de forma natural usa el organismo para este fin. El debate
ético es si utilizar células madre embrionarias o células madre de un individuo adulto. Hoy
en día existen estudios prometedores en relación a la utilización de células de médula ósea
para la recuperación del sistema inmunológico y hematopoyético en pacientes tratados con
quimioterapia como en pacientes con neoplasias hematológicas.
Técnicas reproductivas.- Se han utilizado en algunos animales con el fin de mejorar las
especies. El proyecto Proteoma Humano, consiste en analizar, desde todo punto de vista,
las proteínas que conforman el cuerpo del ser humano. Está sometido también a
cuestionamientos éticos y se encuentra aún en etapa de proyecto.
Aplicaciones de la ingeniería genética.- Actualmente, se presta mucha atención a los
posibles usos prácticos del ADN recombinado. En general, existe entre la población un
cierto "miedo" a los experimentos genéticos. Pero hay que decir que el clonado de genes y
su expresión en forma de productos proteicos por células de E. coli o de levaduras hace
posible la producción comercial de muchas proteínas de utilidad práctica que, de otro
modo, son muy difíciles de obtener en abundancia. Los genes de algunas proteínas
necesarias en medicina han sido clonados.
La insulina, que se obtenía a partir de páncreas de cerdo, se puede hoy obtener de cultivos
bacterianos que contienen el gen humano clonado, con lo cual proporcionan una insulina
con la misma secuencia de aminoácidos que la humana, cosa que no ocurría con la insulina
porcina, lo que hace a la insulina obtenida en E. coli utilizar actualmente en el tratamiento
de la diabetes mellitus, al igual como ocurre con la hormona de crecimiento
(somatotropina) que se administra a pacientes que padecen enanismo.
Jimena Moreno O.
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Los interferones, agentes antivirales naturales y potenciales anticancerígenos, pueden
aislarse a partir de leucocitos de la sangre, pero el rendimiento es de tan solo 1 microgramo
por litro, y por ello son productos muy caros. Los genes de los interferones pueden ser
clonados y expresados en bacterias, que crecen con facilidad y producen interferón en
grandes cantidades. También podrían producirse en gran cantidad varias proteínas de
utilidad en agricultura.
La incorporación de los genes de las enzimas y de otras proteínas, que participan en la
fijación de nitrógeno en los genomas de las plantas de cultivo que normalmente no fijan el
elemento, podría tener un éxito mundial absoluto.
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La Biotecnología lleva a una nueva concepción de
la Medicina, desde una Medicina orientada a los
síntomas; a una nueva Medicina personalizada
orientada a la respuesta terapéutica de cada
individuo y a la prevención de enfermedades.
Jimena Moreno O.
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CONCLUSIONES
GENERAL
He logrado crear un texto educativo detallado y de fácil comprensión, mediante la
investigación y recopilación de información efectiva y certera a cerca de la Producción
de Insulina Recombinante a través de técnicas de Ingeniería Genética, alcanzando a
tener nuevos conocimientos para mi desarrollo y adelanto profesional, como personal.
ESPECIFÍCAS
 Conseguí una concepción específica de algunas
fundamentales de Ingeniería Genética y Biotecnología.
definiciones
 Amplié mis conocimientos sobre todo lo que es insulina y su desempeño
en el organismo humano.
 Describí como se realiza la producción de la Insulina Recombinante, sus
técnicas y metodología.
 Logré explicar cómo es la influencia
industria y sociedad.
Jimena Moreno O.
de la Ingeniería genética en la
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BIBLIOGRAFÍA
 JÓSE LUQUE - ÁNGEL HERRÁEZ. Texto ilustrado de Biología
Molecular e Ingeniería Genética, Publicación ELSEVIER SCIENCE,
Madrid-España 2002.
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http://www.uco.es/
Jimena Moreno O.
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