b) Determinación de HPV. Aprobados, No aprobados por la FDA
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Métodos de determinación del virus del papiloma humano (HPV) en cribado de cáncer de cérvix Beatriz Bellosillo Servicio de Anatomía Patológica Hospital del Mar, Barcelona Virus del Papiloma Humano- HPV – El virus del Papiloma pertenece a un grupo diverso de virus DNA – infectan a piel y a membranas mucosas de humanos y una variedad de animales – cerca de 150 tipos de papilomavirus afectan a humanos – 40 de ellos se localizan en el tracto ano-genital, y pueden ser: • alto riesgo • bajo riesgo Virus del Papiloma Humano- HPV •El HPV se infecta por transmisión sexual, un 80% de las mujeres podrían haber sido infectadas por al menos un tipo de HPV antes de cumplir los 50 años •A menudo no se observan síntomas, especialmente en el caso de HPV de alto riesgo •Mayoría de las infecciones de HPV son transitorias y asintomáticas y se solucionan sin tratamiento. El 91/% puede revertirse en dos años •Otras permanecen en estado latente durante largos periodos •La mujeres con riesgo de cancer de cérvix son aquellas en las que persiste la infección de un HPV de alto riesgo (HR) Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Hibridación + Amplificación de señal Southern Blot Hibridación in situ Hybrid Capture®2 (hc2) Hibridación dot blot Cervista®HPV Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip® Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Hibridación + Amplificación de señal Southern Blot Hibridación in situ Hybrid Capture®2 (hc2) Hibridación dot blot Cervista®HPV Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip® Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Hibridación + Amplificación de señal Southern Blot Hibridación in situ Hybrid Capture®2 (hc2) Hibridación dot blot Cervista®HPV Ensayos aprobados por la FDA para determinación de HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip® Hybrid Capture®2 (hc2) DNA de HPV Unión de sondas de RNA que hibridan con DNA de HPV Unión de Ac que reconocen los híbridos DNA- RNA Unión de Ac secundario Emisión de luz Formación de hídridos DNA-RNA Test Cervista™ HPV HR Resumen del Flujo de trabajo MAGNET Botón celular Alícuota 2ml de muestra desde el Vial Extracción Agencourt Preparación de la Reacción Incubación Leer & Analizar Cervista®HPV Clasificación de ensayos para determinación de HPV Hibridación de ácidos nucleicos Amplificación de señal Southern Blot Hibridación in situ Hybrid Capture®2 (hc2) Hibridación dot blot Cervista®HPV Amplificación de ácidos nucleicos PCR PCR-RFLP PCR en tiempo real Secuenciación Microarray COBAS®4800 Abbott real time PapilloCheck® CLART HPV 2® INNO-LiPA® Linear Array® MCHA® PreTect®Proofer APTIMA®HPV Assay FlowChip® La reacción en cadena de la polimerasa • Amplificación de secuencias específicas de DNA • Diseño de dos oligonucleótidos “primers” complementarios a los extremos del fragmento a amplificar y que actúan como cebadores de la reacción Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 1- Desnaturalización 94ºC-96ºC 2- Hibridación 55ºC-70ºC 3- Extensión 72ºC Original DNA target region Thermal cycle Thermal cycle En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean 1.07 billones de copias del ADN de interés Detección de HPV mediante PCR CLART® HPV2 tubo microarray FLOWCHIP® cobas® 4800 cobas x 480 Configuración Equipo para la extracción de ácidos nucléicos cobas z 480 PCR en tiempo real cobas® 4800 Kit multiplex cualitativo en un único tubo para la detección simultánea de14 genotipos de alto riesgo e identificación de los tipos 16 & 18 de HPV con ßglobina como control interno 4 canales de detección para medir los diferentes objetivos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 – Canal 1 = panel AR HPV l (12 de 14 tipos de alto riesgo – Canal 2 = HPV genotipo 16 GT 18 – Canal 3 = HPV genotipo 18 High HR Risk Panel – Canal 4 = beta-globin GT 18 GT 16 Diferentes tipos de muestra – PreservCyt – cobas® PCR media HPV HR 16 18 Cont Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 APTIMA®HPV Assay HPV assay Targeted HPV genotypes Detection technology DNA/RNA, target HPV gene Controls Certificates 13 HR Sandwich capture molecular DNA, whole genome Batch control for process FDA, IVD, CE 14 HR Signal amplification DNA, whole genome Sample by sample Reaction HIST2H2BE for sample sufficiency FDA, IVD, CE 13 HR + 22 LR Polymerase chain reaction/ DNA, L1 Sample by sample hCFTR microarray gene for sample sufficiency IVD, CE 18 HR + 18 LR PCR + dot blot DNA Sample by sample housekeeping gene for sample sufficiency IVD, CE 14 HR Real-time polymerase chain DNA, L1 Sample by sample reaction b-globin for sample sufficiency FDA, IVD, CE 14 HR MMLV reverse transcriptase and T7 RNA polymerase mediated amplification RNA, E6/E7 Spiked control for sample process validity FDA, IVD, CE Hybrid Capture 2 Cervista CLART Flow CHIP Cobas APTIMA 5064 muestras- 33.2% positivas con ≥ 1 técnica (41% positivas con los 4 ensayos). Menos concordancia en : Mujeres mayores (>30 años): 30% vs 49% Muestras cribado primario (29%) vs muestras de seguimiento (38%) Citología normal (22%) vs mujeres con citología anormal (68%) Rebolj et al, PLOS One, January 2014 Elección de los ensayos de detección de HPV – requisitos a considerar - Sensibilidad clínica adecuada - Controles internos (evitar falsos negativos) - Procesamiento de elevado número de muestras - Automatizable - Tiempos de respuesta adecuados - Genotipado – no es imprescindible en estos momentos Servei de Patologia Francesc Alameda Mercè Muset Belén Lloveras Sergi Serrano
