visualización de la colonización bacteriana de sulfuros metálicos

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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIÓN DE INGENIERÍA DE MATERIALES
VISUALIZACIÓN DE LA COLONIZACIÓN BACTERIANA DE SULFUROS
METÁLICOS MEDIANTE SEM Y FE-SEM.
Por
Jessica Deus Couceiro
INFORME FINAL DE CURSOS DE COOPERACIÓN
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
Como Requisito Parcial para Optar al Título de
Ingeniero de Materiales
Sartenejas, Abril de 2011
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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIÓN DE INGENIERÍA DE MATERIALES
VISUALIZACIÓN DE LA COLONIZACIÓN BACTERIANA DE SULFUROS
METÁLICOS MEDIANTE SEM Y FE-SEM.
Por
Jessica Deus Couceiro
INFORME FINAL DE CURSOS DE COOPERACIÓN
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
Como Requisito Parcial para Optar al Título de
Ingeniero de Materiales
Realizado con la asesoría de
Tutor académico: Dr. Pedro Delvasto
Tutor industrial: Dr. Jesús Muñoz
Sartenejas, Abril de 2011
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VISUALIZACIÓN DE LA COLONIZACIÓN BACTERIANA DE SULFUROS
METÁLICOS MEDIANTE SEM Y FE-SEM.
Por
Jessica Deus Couceiro
RESUMEN
Los estudios de la técnica de biolixiviación son de gran importancia
dentro del campo de la hidrometalurgia debido a las numerosas ventajas
ambientales. Las investigaciones más recientes han demostrado que un
factor muy importante dentro de este proceso, es la formación de las
biopelículas, estas se encargan de propiciar las condiciones adecuadas para
que ocurra la lixiviación, así como de proteger los microorganismos de
agentes externos.
En el presente trabajo se realizó el estudio mediante microscopía
electrónica SEM y FE-SEM de muestras masivas de tres sulfuros metálicos:
calcopirita (CuFeS2), pirita (FeS2) y enargita (Cu3AsS4), atacadas con
microorganismos mesófilos, con el fin de visualizar la formación de colonias
bacterianas en cada uno de ellos.
La presencia de microorganismos se observó luego de 48 horas de
ataque en los tres sulfuros. En la superficie de la calcopirita la formación de
las colonias bacterianas se concentró en zonas agrietadas, en la enargita las
bacterias se dispersaron de manera uniforme ocupando toda la superficie
mineral, mientras que en la pirita estudiada no se presentó gran actividad
microbiológica. Estos resultados se deben a la diferencia topográfica entre
las superficies estudiadas; la enargita posee un alto grado de rugosidad, la
calcopirita posee grietas y un porcentaje de porosidad importante y la pirita,
por su parte, presenta una superficie bastante plana. La rugosidad y las
grietas exponen los granos minerales facilitando la extracción de los
nutrientes necesarios para las bacterias.
iv
v
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN .................................................................................................. iv
ÍNDICE GENERAL ....................................................................................... v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................ viii
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................... xi
ABREVIATURAS Y SIMBOLOS ................................................................... xii
CAPÍTULO I.1
INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1
CAPÍTULO II.3
OBJETIVOS ................................................................................................. 3
2. 1 Objetivo general .................................................................................... 3
2. 2 Objetivos específicos ............................................................................. 3
2.3 La empresa. ........................................................................................... 4
2.3.1 Reseña histórica. ................................................................................ 4
2.3.2 Grupo de Investigación en Metalurgia Extractiva/ Biohidrometalurgia
de la Universidad Complutense de Madrid. .................................................. 5
CAPÍTULO III.8
MARCO TEÓRICO ....................................................................................... 8
3.1 Sulfuros metálicos ................................................................................. 8
3.1.1 Calcopirita CuFeS2.............................................................................. 8
3.1. 2 Enargita Cu3AsS4 .............................................................................. 9
v
vi
3.1. 3 Pirita FeS2 ....................................................................................... 11
3. 2 Hidrometalurgia de los sulfuros metálicos ........................................... 12
3. 3 Principios de la microbiología .............................................................. 14
3.3.1 Clasificación de las bacterias ............................................................ 14
3.3.2 Bacterias de azufre. .......................................................................... 15
3.4 Biolixiviación (Lixiviación bacteriana) ................................................... 16
3.4.1 Biolixiviación de pirita ...................................................................... 18
3.4.2 Biolixiviación de calcopirita ............................................................... 18
3. 5 Biopelículas ........................................................................................ 19
3.5.1 Efecto del sustrato en la formación de biopelículas ........................... 21
3.5.2 Características del medio acuoso ...................................................... 21
3.5.3 Propiedades de las células ................................................................ 21
3.5.4 Las biopelículas en la biolixiviación ................................................... 21
3.6 Técnicas de microscopía electrónica. .................................................... 22
3.6.1 SEM ................................................................................................. 23
3.6.2 EDS .................................................................................................. 24
3.6.3 FE-SEM ............................................................................................ 25
3.7 Microscopía por fuerza atómica. ........................................................... 25
CAPÍTULO IV.27
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ........................................................... 27
4.1 Preparación y mantenimiento del cultivo mesófilo ................................ 27
vi
vii
4.2 Preparación superficial de las muestras de los sulfuros metálicos ........ 29
4.3 Procedimiento de ataque microbiológico de la superficie de los sulfuros
metálicos. .................................................................................................. 30
4.4 Preparación de las muestras para la observación mediante SEM, FESEM y AFM. .............................................................................................. 31
4.4.1 Observación de las muestras sin ataque (superficies originales) ........ 31
4.4.2 Observación del cultivo bacteriano .................................................... 32
4.4.3 Observación de las muestras atacadas microbiológicamente. ............ 34
CAPÍTULO V.36
RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................. 36
5. 1 Caracterización de los cultivos bacterianos ......................................... 36
5.2 Análisis de las superficies originales de los sulfuros metálicos sin ataque.
................................................................................................................. 40
5.3 Estudio de los sulfuros atacados microbiológicamente. ........................ 48
5.3.1 Estudio SEM-EDX de las muestras atacadas .................................... 48
5.3.2 Estudio FE-SEM de las muestras atacadas con microorganismos...... 64
CAPÍTULO VI. 71
CONCLUSIONES ....................................................................................... 71
CAPÍTULO VII. 72
RECOMENDACIONES ............................................................................... 72
CAPÍTULO VIII.
BIBLIOGRAFÍA …………………………………………………………………………. 73
vii
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 3. 1 Formación de Calcopirita
Figura 3. 2 Formación de Enargita
Figura 3. 3 Formación de Pirita
[6]. ...................................................... 9
[6].
....................................................... 10
[6]. ............................................................ 11
Figura 3. 4 Proceso básico de Hidrometalurgia
[8].
..................................... 13
Figura 3. 5 Diferencia entre Biolixiviación Directa y Biolixiviación indirecta
[14].............................................................................................................. 17
Figura 3. 6 Formación de la biopelícula
Figura 3. 7 Funcionamiento del SEM
[10]. ............................................... 20
[27].
.................................................. 24
Figura 4.1 Esquema general de la metodología experimental……………….. 27
Figura 4.2 Preparación y mantenimiento del cultivo bacteriano……………. 29
Figura 4.3 Preparación de las probetas para el proceso de desbaste…….. 30
Figura 4.4 Diagrama esquemático de ataque microbiológico…………………31
Figura 4.5 Microscopio de fuerza atómica (AFM) AUTOPROVE CP………… 32
Figura 4.6 Proceso de intercambio de agua de la células bacterianas por
acetona……………………………………………………………………………………..33
Figura 4.7 Proceso de preparación de muestras sólidas para secado por
punto crítico……………………………………………………………………………….35
Figura 5.1 (a) Microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FESEM) de la vista general del cultivo de bacterias mesófilas. (b) Acercamiento
del cultivo donde se observa la presencia de Fe (III). (c) y (d) Acercamiento de
la bacteria donde se destaca la forma bacilar y la presencia de Fe(III)
adherido a la superficie bacteriana………………………………………………….36
Figura 5.2 Imagen de las células bacterianas con medidas de largo y ancho.
(a) Imagen SEM de la forma bacilar y tamaño característico de las bacterias
Thiobacillus. (b) Imagen FE-SEM obtenida en el estudio………………………37
Figura 5.3 Evolución del potencial redox del cultivo bacteriano. C1 cultivo
inicial tomando como inóculo el cultivo crecido en suelo contaminado, C2,C3
y C4 cultivos donde se tomó como inóculo el cultivo inmediato anterior y C5
cultivo final………………………………………………………………………………..39
viii
ix
Figura 5.4 Imagen SEM de la muestra original de calcopirita………………..40
Figura 5.5 Espectro EDX típico de la superficie de calcopirita……………….41
Figura 5. 6 Imagen SEM de la muestra original de pirita……………………..43
Figura 5.7 Espectro EDX típico de la superficie de pirita……………………..43
Figura 5.8 Imagen SEM de la muestra original de enargita…………………..45
Figura 5. 9 Espectro EDX de la superficie típica de enargita ...................... 45
Figura 5.10 Imágenes topográficas AFM típicas de las superficies de los
sulfuros minerales (a) pirita, (b) calcopirita y (c) enargita………………………47
Figura 5. 11 Estudio SEM-EDX de la superficie de calcopirita atacada
microbiológicamente: (a) Imagen SEM de la superficie. (b) Espectro EDX de la
superficie................................................................................................... 49
Figura 5. 12 Estudio SEM de la superficie de calcopirita atacada
microbiológicamente donde se observa la formación de biopelículas. .......... 51
Figura 5. 13 Estudio SEM-EDX lineal de las zonas irregulares en la
superficie de calcopirita atacada microbiológicamente. (a) Micrografía donde
se indica la zona del estudio lineal. (b) Espectro EDX. ................................ 52
Figura 5. 14 Estudio SEM de la superficie de calcopirita atacada
microbiológicamente. (a) Micrografía de la matriz donde destaca la formación
de pirita. (b) Ampliación de la zona señalada en (a). ................................... 53
Figura 5. 15 Espectro EDX del precipitado de la figura 5.8........................ 54
Figura 5. 16 Estudio SEM-EDX de la muestra de pirita atacada
microbiológicamente: (a) Micrografía de electrones secundarios. (b) Espectro
EDX de la matriz de pirita.......................................................................... 56
Figura 5. 17 Imagen SEM de la superficie de la pirita atacada
microbiológicamente: Micrografía donde se observa la presencia de una
película que contiene precipitado. .............................................................. 57
Figura 5. 18 Estudio SEM-EDX de la superficie de la pirita atacada
microbiológicamente: (a) Espectro EDX precipitado 1. (b) Espectro EDX
precipitado 2. ............................................................................................ 58
Figura 5.19 Estudio SEM-EDX de la muestra de enargita atacada con
microorganismos: (a) Imagen SEM de la superficie y (b) Espectro EDX de la
matriz……………………………………………………………………………………….59
Figura 5.20 Imagen SEM de la superficie de enargita colonizada por
microorganismos…………………………………………..…………………………….62
ix
x
Figura 5. 21 Estudio FE-SEM de la superficie de la calcopirita atacada con
microorganismos: (a) Macrografía de la superficie don se observan colonias
bacterianas. (b) y (c) Acercamiento de distintas zonas con gran población
bacteriana. ................................................................................................ 65
Figura 5. 22 Estudio FE-SEM de la superficie de la calcopirita atacada con
microorganismos: (a) y (b) micrografías donde se observan los flagelos de las
bacterias. .................................................................................................. 65
Figura 5. 23 Estudio FE-SEM de la superficie de la pirita atacada con
microorganismos. ...................................................................................... 66
Figura 5. 24 Estudio FE-SEM de la superficie de la pirita atacada con
microorganismos: (a) y (b) Acercamiento de la superficie donde se observan
lo flagelos bacterianos. (c) y (d) Acercamiento de la superficie donde se
observa la formación de un precipitado. ..................................................... 67
Figura 5. 25 Estudio FE-SEM de la superficie de la enargita atacada con
microorganismos. ...................................................................................... 68
Figura 5. 26 Estudio FE-SEM de la superficie de la enargita atacada con
microorganismos: (a) Micrografía donde destaca la formación de una película
(zona clara). (b) Acercamiento de la micrografía a en la zona señalada. ....... 69
x
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 3. 1 Composición de la calcopirita. .................................................... 9
Tabla 3. 2 Composición de la enargita. ...................................................... 10
Tabla 3. 3 Composición de la pirita. .......................................................... 11
Tabla 4. 1 Composición química del medio de cultivo 0K a pH 1,8. ............ 28
Tabla 5. 1 Análisis elemental de la superficie de la calcopirita de dos zonas
alejadas entre sí. ....................................................................................... 41
Tabla 5. 2 Análisis elemental de la superficie de la pirita de dos zonas
alejadas entre sí. ....................................................................................... 44
Tabla 5. 3 Análisis elemental de la superficie de la enargita de dos ............ 46
Tabla 5. 4 Análisis elemental de la superficie de la calcopirita atacada
microbiológicamente. ................................................................................. 50
Tabla 5. 5 Análisis elemental del precipitado presente en la superficie de la
calcopirita atacada microbiológicamente. ................................................... 55
Tabla 5. 6 Análisis elemental de la matriz de la pirita atacada
microbiológicamente. ................................................................................. 57
Tabla 5. 7 Análisis elemental del precipitado 1 presente en la pirita atacada
microbiológicamente. ................................................................................. 59
Tabla 5. 8 Análisis elemental del precipitado 2 presente en la pirita atacada
microbiológicamente. ................................................................................. 59
Tabla 5. 9 Análisis elemental de la matriz de enargita atacada
microbiológicamente. ................................................................................. 61
xi
xii
ABREVIATURAS Y SIMBOLOS
µm: Micrómetros.
AFM: Atomic Force Microscopy.
Ec.: Ecuación.
EDS: Energy Dispersive X-ray Spectroscopy
EPS: Extracellular Polymeric Substance.
FESEM: Field Emission Scanning Electron Microscopy
hrs: horas.
Kg: Kilogramos
Kv: Kilobytes
nm: Nanómetros
pH: Potencial de Hidrógeno
SEM: Scanning Electron Microscopy
xii
1
CAPÍTULO I.
INTRODUCCIÓN
Actualmente, la extracción de metales contenidos en sulfuros se
realiza a escala industrial, fundamentalmente por métodos pirometalúrgicos,
sin embargo estos procesos son altamente contaminantes por la emisión de
SO2 que producen y a su vez conllevan a elevados costos de inversión y de
operación. Las nuevas políticas ambientales sumadas a la búsqueda de una
mayor rentabilidad en la industria minera impulsaron la investigación de
nuevos procesos de lixiviación.
La biolixiviación se presenta como una alternativa a los métodos de
pirometalurgia, considerada la técnica hidrometalúrgica del futuro para el
tratamiento de concentrados minerales debido a su bajo costo y a que los
niveles de contaminación en este proceso son bajos. Debido a que esta
técnica posee tiempos de reacción muy lentos, su implantación a nivel
industrial ha progresado paulatinamente. Esta problemática exige un mejor
conocimiento del mecanismo del proceso, lo que permitiría un mayor control
y mejor aprovechamiento de las posibilidades de esta técnica en las
diferentes aplicaciones de interés industrial
[1].
Un factor muy importante en los resultados de una eficiente
biolixiviación es la adecuada presencia de microorganismos, que son los
actores principales en la disolución de sulfuros. Durante este proceso, los
microorganismos se adhieren a la superficie de los minerales y generan una
sustancia polimérica extracelular (EPS) encargada de mantener un ambiente
adecuado, proteger las colonias bacterianas y concentrar los agentes
1
2
oxidantes regenerados por las bacterias cerca de la superficie mineral
acelerando el proceso de degradación
[1].
Con base en esta realidad, en el presente trabajo se realizará el ataque
microbiológico con un cultivo mesófilo de tres tipos de sulfuros metálicos
grado museo: pirita (FeS2), calcopirita (CuFeS2) y enargita (Cu3AsS4). Se
estudiarán mediante técnicas de microscopía electrónica con el fin de
visualizar la formación de las colonias bacterianas en la superficie mineral.
3
CAPÍTULO II.
OBJETIVOS
2. 1 Objetivo general
Estudiar la colonización bacteriana que se origina durante el proceso
de biolixiviación sobre la superficie de tres sulfuros metálicos: pirita (FeS2),
calcopirita (CuFeS2) y enargita (Cu3AsS4), utilizando un cultivo mesófilo.
2. 2 Objetivos específicos
Obtener y mantener cultivos microbiológicos de carácter mesófilo para
ser utilizados como inóculo en los ensayos de biolixiviación.
Realizar el ataque microbiológico a muestras de calcopirita, pirita y
enargita y observar las diferencias que se presentan en la superficie del
mineral.
Visualizar las fases de formación de biopelículas sobre la superficie de
los sulfuros metálicos, a través de técnicas de microscopia electrónica.
4
2.3 La empresa.
Por su tradición e historia, la Universidad Complutense de Madrid
(UCM) es una universidad de referencia en el Estado español. En sus aulas
se han formado decenas de miles de titulados universitarios.
Su gran potencial docente e investigador hace que la Universidad
Complutense sea una gran universidad. Cuenta con el mayor número de
estudiantes y de profesores en comparación con cualquier otra universidad
española, pero más que por sus aspectos cuantitativos resalta por la alta
cualificación de sus profesores, por la importancia de su investigación y por
sus instalaciones, entre las que se encuentran laboratorios de vanguardia.
La Universidad Complutense de Madrid es una Universidad Pública
que aspira a ofrecer a sus estudiantes la más alta calidad de formación y el
más amplio reconocimiento social de sus titulaciones.
2.3.1 Reseña histórica.
La Universidad Complutense fue fundada en Alcalá de Henares, la
antigua Complutum, por el Cardenal Cisneros, mediante Bula Pontificia
concedida por el Papa Alejandro VI en 1499. Sin embargo, su verdadero
origen se remonta al 20 de mayo de 1293, fecha en que el Rey Sancho IV de
Castilla crea el Estudio de Escuelas Generales de Alcalá, que daría lugar dos
siglos después a la Universidad Complutense de Cisneros.
En 1836, bajo el reinado de Isabel II, la Universidad fue trasladada a
Madrid, donde toma el nombre de Universidad Central y se emplaza en la
calle San Bernardo.
Posteriormente, en 1927, se planificó la construcción de un área
universitaria en la zona de Moncloa, en terrenos cedidos por el Rey Don
5
Alfonso XIII para tal fin. Durante esta etapa se constituyó en núcleo de la
denominada Edad de Plata de la cultura española.
La Guerra Civil convirtió a la Ciudad Universitaria en frente de batalla,
causando la destrucción de edificios de facultades e institutos ubicados en
su recinto, así como la pérdida de parte de su rico patrimonio científico,
artístico y bibliográfico. Se perdió con ello una buena parte del prestigioso
profesorado que hasta entonces había ejercido la docencia en la Universidad
Complutense.
En 1970 el Gobierno acomete planes de reforma de la Enseñanza
Superior, y la Universidad Central pasa a denominarse Complutense,
recuperando la denominación de su lugar de origen. Es por entonces cuando
se crea el campus de Somosaguas para albergar el grueso de las facultades
de Ciencias Sociales con el fin de descongestionar el Campus de Moncloa.
2.3.2
Grupo
de
Investigación
en
Metalurgia
Extractiva/
Biohidrometalurgia de la Universidad Complutense de Madrid.
Este Grupo de Investigación se formó al comienzo de los años 1980
con el fin de abordar distintos aspectos relacionados con la Metalurgia
Extractiva y, singularmente, con la Hidrometalurgia.
Después de unos años dedicados al tratamiento de algunos aspectos
relacionados con la metalurgia del mercurio y del plomo, en 1985, el grupo
optó por incorporar una nueva línea, en aquel momento en plena expansión
a nivel mundial, situada en la interfase entre los materiales y la
biotecnología. Se trataba de la Biohidrometalurgia y más concretamente de
su aplicación a la obtención de los materiales metálicos a través de lo que se
conoce como Biolixiviación o Lixiviación Bacteriana. En este campo, el grupo
ha realizado aportaciones interesantes, sobre todo a nivel de la catálisis del
6
proceso utilizando cationes en disolución; así, cabe mencionar el uso de la
plata como catalizador de la biolixiviación de la calcopirita.
A mediados de los años 1990, el Grupo amplía su campo de trabajo al
de la Bioadsorción, con un interés especial en tres aspectos que pueden
facilitar la aplicación comercial de esta nueva tecnología: su modelización,
considerando sistemas multimetálicos (hasta 4 metales), y el pretratamiento
e inmovilización de las biomasas utilizadas.
En esta época, también se incluye como línea de trabajo preferente el
estudio de la generación y control de drenajes ácidos de mina, realizándose
un estudio muy completo sobre el problema asociado a los vertidos de una
mina española de sulfuros complejos situada en la Faja Pirítica andaluza.
Ya a comienzos del nuevo siglo XXI, el grupo aborda una nueva línea
relativa a la descontaminación de suelos sometidos a la acción de residuos
conteniendo sulfuros metálicos pesados, a través de los denominados
procesos de Atenuación Natural de la contaminación, los cuales están
mediados por el mismo tipo de microorganismos que toman parte en los
procesos de biolixiviación.
Finalmente, durante los 2 últimos años, el grupo se ha dedicado al
campo de las pilas microbianas de energía. Aquí interesa, sobre todo,
conocer las interacciones de los microorganismos con los electrodos de las
celdas y el papel que juegan los materiales exopoliméricos en todo el
proceso.
A nivel humano, el Grupo está formado por 4 profesores (1 catedrático,
2 profesores titulares y 1 profesor contratado doctor) de la Universidad
Complutense de Madrid que son los que se encargan de la dirección y
coordinación de la investigación a través de una estructura organizativa de
carácter horizontal.
7
Paralela y periódicamente, se incorporan al grupo estudiantes de
tercer ciclo (doctorado) y de segundo ciclo realizando sus correspondientes
trabajos de investigación. Finalmente, durante los últimos años son muy
importantes las aportaciones de estudiantes a través de intercambios con
otras Universidades tanto europeas (programa Sócrates-Erasmus) como
iberoamericanas, financiados por las propias Universidades implicadas o por
proyectos concedidos por organismos internacionales.
`
La financiación del grupo, en la actualidad, proviene de proyectos de
investigación conseguidos en convocatorias públicas tanto del Ministerio de
Educación y Ciencia español como de la Comunidad Autónoma de Madrid.
8
CAPÍTULO III.
MARCO TEÓRICO
3.1 Sulfuros metálicos
Es un grupo de minerales relevantes, constituyen la mayor parte del
suministro de materia prima de metales no ferrosos y poseen aplicaciones
industriales importantes en el campo de la electrónica. Estos minerales
están dominados por compuestos binarios y ternarios de azufre unidos con
diversos metales como hierro, cobre, arsénico, plomo, plata, níquel, etc. Los
sulfuros metálicos juegan un papel importante en la forma de vida de la
humanidad. Desde la construcción hasta en los avances electrónicos se
pueden conseguir diversos minerales. Las menas metálicas y los minerales
industriales, son explotados en todos los continentes siendo la fuente
principal de extracción de metales en todo el mundo. De acuerdo con el
Bureau of Mines de los E.E.U.U “cada americano consume anualmente
20.000 Kg de minerales entre los que se tienen 350 Kg de plomo (entre
baterías y componentes electrónicos): 350 Kg de Zinc (en el latón,
recubrimientos de acero y compuestos químicos); 750 Kg de cobre (en
motores, generadores y cableados eléctricos); 1500 Kg de aluminio (en todo
tipo de utensilios) y el resto en hierro (para toda clase de fabricación).” Los
sulfuros metálicos a ser estudiados en la presente investigación se describen
a continuación.
[2, 3].
3.1.1 Calcopirita CuFeS2
Es un sulfuro de cobre con alto porcentaje de hierro (tabla 3.1), se
encuentra difundido en rocas ígneas y es muy abundante a nivel mundial.
9
Posee
una estructura
cristalina tetraédrica, octaédrica modificada o
escalonada (figura 3.1), una dureza de 4 en la escala de Mohs, es de color
amarillo latón, de fractura frágil y brillo metálico
[3].
Tabla 3. 1 Composición de la calcopirita
[4].
Hierro 30.43 % Fe
Cobre 34.63 % Cu
Azufre 34.94 % S
______
100.00 %
Figura 3. 1 Formación de Calcopirita
[6].
A pesar de que el porcentaje que posee de cobre no es muy elevado en
comparación con otros sulfuros, representa la principal mena de este
elemento debido a su gran abundancia, lo que lo convierte en el mineral de
cobre económicamente más importante
3.1. 1 Enargita Cu3AsS4
[3, 4].
10
Es un sulfuro de Arsénico de cobre (tabla 3.2) que se encuentra
alojado en cantidades significativas en depósitos volcánicos epitermales de
alta sulfuración. Posee un sistema de cristalización ortorrómbico piramidal,
es de color gris acero, negruzco y violeta oscuro (figura 3.2), tiene una
fractura desigual, brillo metálico y una dureza de 3 en la escala de Mohs
Tabla 3. 2 Composición de la enargita
[5].
[4].
Cobre
48.41 % Cu
Arsénico 19.02 % As
Azufre
32.57 % S
______
100.00 %
Figura 3.2 Formación de enargita[6]
La Enargita es un mineral de cobre de menor relevancia debido a que
no es muy abundante, además puede emitir sustancias tóxicas en su
oxidación por su contenido de Arsénico. Recientemente se han encontrado
yacimientos de importancia económica en varias zonas de Perú y Chile
[5].
11
3.1. 2 Pirita FeS2
Es el más común de los sulfuros minerales porque se puede encontrar
en muchas formaciones geológicas como: depósitos sedimentarios, vetas
hidrotermales, rocas metamórficas, capas de carbón y fósiles. Está formado
principalmente por hierro y azufre (tabla 2.3) aunque normalmente se
encuentra asociado con otros sulfuros u óxidos. Cristaliza en un sistema
isométrico diploide y suele tener una forma cúbica (figura 3.3). Posee un
color amarillo metálico muy parecido al oro, lo que lleva a confundirlo con él
en muchas ocasiones a pesar de ser mucho más ligero. Es de fractura
desigual, de baja tenacidad, pero de alta dureza, 6.5 en la escala de Mohs, lo
que dificulta su preparación metalográfica
[6].
Tabla 3. 3 Composición de la pirita [4].
Hierro
Azufre
46.55 %
53.45 %
______
100.00 %
Fe
S
Figura 3. 3 Formación de Pirita
[6].
12
La primera aparición notable de la pirita fue en los siglos XVI y XVII
como fuente de ignición de las primeras armas de fuego y para la producción
de sulfatos de hierro. Actualmente, a pesar de su gran contenido de hierro y
de su abundancia, la pirita no es una fuente significativa de obtención de
este elemento. Su propósito industrial es debido a su alto contenido de
azufre y se utiliza para la producción industrial de ácido sulfúrico y dióxido
de
azufre
[6].
3. 2 Hidrometalurgia de los sulfuros metálicos
En la actualidad, la hidrometalurgia se ha establecido como el
principal método de extracción de numerosos metales industrialmente
importantes. Comprende toda una serie de procesos cuya característica
común es la utilización de agua o de disoluciones acuosas para la extracción
de metales contenidos en los sulfuros
[7].
El proceso de hidrometalurgia incluye una serie de operaciones
tecnológicas básicas, entre las cuales están: el proceso mecánico de la mena,
que consiste en trabajar la mena mecánicamente hasta exponer la mayor
cantidad de granos de metal para ser extraídos, el ataque con la solución
química para alterar la composición del metal presente en el mineral ya sea
oxidándolo, sulfatándolo o reduciéndolo con el objetivo de conseguir una
forma soluble del metal, la lixiviación donde se transforma el metal sólido en
una solución acuosa para ser extraído, la separación del metal de la
disolución removiendo el agua y filtrando y la preparación de una solución
para separar metales bien sea por suspensión de partículas (purificación),
por precipitación química (electrólisis), por cementación, por absorción
usando resinas de intercambio iónico o por extracción de líquido de los
componentes metálicos utilizando solventes orgánicos (figura 3.4)
[8].
13
Solución lixiviada
Precipitado
Figura 3. 4 Proceso básico de Hidrometalurgia
[8].
El proceso de hidrometalurgia a pesar de ser un proceso líquido no
está exento de problemas ambientelas, sin embargo, estos problemas de
emisión de gases son mínimos comparados con las consecuencias que
pueden tener los desechos sólidos y líquidos provenientes de este proceso si
no son manejados adecuadamente.
El incremento en el costo de la energía ha dejado al proceso de
lixiviación en ventaja con respecto a otros procesos de extracción de metales
que representan la consumición de grandes cantidades de energía. A pesar
de las ventajas de la lixiviación también existen muchas desventajas como
una cinética de reacción lenta y una baja recuperación, para estos
problemas se han determinado ciertas bacterias que ayudan a acelerar los
tiempos de reacción en el proceso. Esta combinación de bacterias en el
proceso de lixiviación se conoce como biolixiviación
[8].
14
3. 3 Principios de la microbiología
La
microbiología
es
el
estudio
de
un
grupo
de
organismos
microscópicos que existen como una sola célula o como un conglomerado de
células. En la microbiología existe una rama llamada bacteriología que se
encarga del estudio de las bacterias. Las bacterias son microorganismos
unicelulares procariotas que presentan un gran rango de formas y
generalmente poseen un tamaño de entre 0,2µm-5µm de largo y 1µm de
diámetro. Se encuentran en todos los hábitats: desde desechos radioactivos
hasta materias orgánicas, por lo que no es de extrañarse que se estima que
existan aproximadamente 5x1030 bacterias en la Tierra. La movilidad de las
bacterias depende de la existencia de los flagelos, estos actúan como patas
en su desplazamiento [9].
3.3.1 Clasificación de las bacterias
Las bacterias se pueden clasificar de acuerdo con la siguientes
características de su metabolismo:
Por el mecanismo de respiración, pueden ser aerobias o anaerobias, las
primeras utilizan oxígeno para respirar mientras que las segundas
sustituyen el oxígeno por otras sustancias como nitrato, sulfato o hierro.
Según la temperatura a la cual operan: las psicrofílicas trabajan a
temperaturas inferiores a los 20°C, las mesófilas trabajan entre los 20 y los
40°C y las termófilas operan entre los 40 y los 80°C.
También existe una clasificación para las bacterias dependiendo de su
alimentación, estas pueden ser heterótrofas o autótrofas. Las heterótrofas se
alimentan de compuestos orgánicos elaborados por otro ser vivo, mientras
que las autótrofas son capaces de sintetizar las sustancias orgánicas a partir
15
de las minerales, un ejemplo son las quimiosintetizantes que obtienen la
energía a partir de reacciones químicas de oxidación, como las ferrobacterias
y las sulfobacterias que obtienen su energía del hierro y de diferentes
sulfuros respectivamente [10].
3.3.2 Bacterias de azufre.
Son microorganismos que toman parte en las transformaciones
bioquímicas de los sulfuros metálicos, se caracterizan por su capacidad
única para desarrollarse en ambientes extremos con pH bajo, temperaturas
elevadas y altas concentraciones de metales pesados. El área más
importante y significativa dentro del proceso biotecnológico de metales está
referida
a
la
oxidación
microbiana
de
sulfuros
minerales.
Los
microorganismos utilizan como fuente primaria de energía las especies
reducidas del azufre y ciertos metales en disolución, resultando la
solubilización de metales valiosos
[10].
Las bacterias del género Thiobacillus son un ejemplo de las
sulfobacterias. Las mismas se caracterizan por ser autótrofas, trabajar a
bajos valores de pH y a temperaturas entre los 20°C-40°C. Son capaces de
catalizar disoluciones de sulfuros metálicos a través de mecanismos
diferentes derivados de su habilidad para oxidar el hierro y compuestos
reducidos de azufre.
Representan el tipo más común de bacterias en las
pilas de desechos de las minas y también están presentes en la oxidación de
la pirita en los yacimientos de carbón. Tienen la capacidad de oxidar
compuestos
inorgánicos y sulfuros de hierro, aunque este proceso de
oxidación puede ser perjudicial para el ambiente debido a la producción de
ácido sulfúrico. Sin embargo, también puede ser beneficioso en la
recuperación de materiales como el cobre y el uranio
[10].
16
Dentro del género Thiobacillus se encuentra la especie Thiobacillus
ferrooxidans, que se considera autótrofa ya que utiliza el ión ferroso como
donador de electrones, aunque en algunos casos también puede utilizar el
azufre en sus formas reducidas. La reacción de oxidación del hierro
(Ecuación 3.1) es aeróbica, ocurre en condiciones ácidas (pH<2.5) y se
desenvuelve en el intervalo de temperatura entre 28°C-35°C
2Fe2+ + ½ O2 + 2H+
[11].
2Fe3+ + H20
(Ec. 3.1)
3.4 Biolixiviación (Lixiviación bacteriana)
Es el ataque y solubilización de un mineral mediante la acción directa
o indirecta de distintos microorganismos. Existen al menos 11 tipos de
bacterias distintas que pueden estar relacionadas con este fenómeno. Los
microorganismos utilizan los electrones del mineral como combustible para
su alimentación. En este proceso, realizan un trabajo útil liberando metales
y energía sin necesidad de un suministro externo, esta energía liberada es
reutilizada en un 50% en forma de trabajo o de unidades químicas
reciclables
[11].
La lixiviación bacteriana a escala comercial está restringida a
minerales pobres de cobre y a minerales de uranio. Aunque en la década de
los 80 se desarrollaron varios procesos que extienden su uso en el campo de
los minerales refractarios como la pirita y la enargita, sin embargo, estos
procesos aun no están optimizados para ser utilizados comercialmente. Sin
duda alguna, para que este proceso sea rentable debe utilizar equipos
simples, reactivos fáciles de adquirir y a la vez económicos, ser operable con
el mínimo consumo energético y transcurrir con una velocidad suficiente
como para obtener cantidades rentables en un tiempo razonable
[12, 13].
17
El
proceso
de
biolixiviación
se
puede
realizar
mediante
dos
mecanismos diferentes:
Biolixiviación por contacto directo
Es un mecanismo enzimático en el cual la bacteria debe estar adherida
a la superficie del mineral para que pueda ocurrir el transporte de
electrones, esta adhesión ocurre mediante pilis (apéndices bacterianos
adhesivos, estables al calor y a los ácidos), la capacidad de la bacteria para
fijarse al sustrato depende del número de pilis y la longitud de estos
[12].
Biolixiviación por contacto indirecto
El proceso indirecto tiene lugar por la interacción del mineral con
productos intermedios o finales del metabolismo. Este proceso no es
enzimático y el agente lixiviante es producido únicamente por el organismo.
Es por esto que la acción de los microorganismos se limita a la catálisis de
oxidación del Fe2+ a Fe3+
[12].
La diferencia entre los dos mecanismos descritos anteriormente se
puede observar en la figura 3.5.
Figura 3. 5 Diferencia entre Biolixiviación Directa y Biolixiviación indirecta
[14].
18
3.4.1 Biolixiviación de pirita
La pirita solo es atacable a través de un agente oxidante, como el
hierro (III) ya que no contribuye al enlace metal/azufre del sulfuro metálico.
Este enlace solo puede ser roto a través de varias etapas de oxidación con el
ión férrico. Dado esto, la pirita no se lixivia con soluciones ácidas sino que es
atacada exclusivamente a través de un agente oxidante como el Fe (III). La
reacción que describe la oxidación de la pirita desde el punto de vista
químico se representa en la ecuación 3.2
FeS2 + 14Fe3+ + 8H2O
[14, 15].
15 Fe2+ + 2SO42- + 16H+
(Ec. 3.2)
La lixiviación bacteriana de la pirita se ve notablemente afectada por el
estado de oxidación del hierro disuelto. La relación entre el ión ferroso y el
ión férrico controla las reacciones de oxidación en el proceso. Además, la
disolución de pirita está controlada por la quimioabsorción de Fe2+ y Fe3+ en
la superficie del mineral. La acumulación de iones ferrosos en la superficie
del mineral origina una barrera que impide el ataque férrico, produciendo un
aumento de la concentración del ion férrico en la solución que inhibe la
capacidad de oxidación microbiana en concentraciones superiores a los
16 g/L. Existe una relación entre las células de adhesión y la disolución de
minerales, esto se explica por la liberación de Fe2+ y su rápida oxidación
acumulada en la superficie del mineral por las bacterias adheridas en la
biolixiviación directa
[14].
3.4.2 Biolixiviación de calcopirita
La calcopirita presenta un comportamiento muy refractario en cuanto
a la biolixiviación debido a su particular estructura cristalina, sus
características electroquímicas y por la formación de una capa inhibidora en
19
la superficie durante la oxidación, que evita la difusión de iones entre la
superficie del mineral y el medio
[15].
Muchos estudios han mostrado que la disolución de cobre está
relacionada con el crecimiento de las bacterias y, sobretodo, con la adhesión
de las bacterias a la superficie. Sin embargo, no sólo las bacterias juegan un
rol importante en la disolución del cobre, la concentración del ácido sulfúrico
también afecta en la solubilidad del elemento
[16].
A pesar de que el mecanismo de biolixiviación más eficiente en el caso
de la calcopirita es el directo (Ec. 3.4), no se descarta la biolixiviación
indirecta (Ec. 3.5)
[16].
4CuFeS2 + 17O2 + 2H2SO4 → 4CuSO4 + 2Fe2(SO4)3 + 2H2O
CuFeS2 + 2Fe2(SO4)3 → CuSO4 + 5FeSO4
(Ec. 3.4)
(Ec. 3.5)
3. 1 Biopelículas
Las biopelículas están compuestas primordialmente por microcolonias
de diferentes especies de células microbianas (15% aproximadamente) y de
una sustancia polimérica extracelular (EPS por sus siglas en inglés) (85%
aproximadamente),
la
cual
está
constituida
principalmente
por
polisacáridos, aunque sus propiedades físicas y químicas pueden variar. La
cantidad de EPS que se forma depende de los microorganismos que la
formen y ésta aumenta con el tiempo. La capacidad de formación de
biopelículas no parece estar restringida a ningún grupo específico de
microorganismos. Se considera que bajo condiciones ambientales adecuadas
todos los microorganismos son capaces de formar biopelículas aunque su
composición y estructura depende directamente del microorganismo y de las
condiciones en las que se formen
[17].
20
Las EPS son producidas por los mismos microorganismos y presentan
características
como:
adherencia,
heterogeneidad,
diversidad
de
microambientes (pH, presión parcial de O2, concentración de iones y de otros
sustratos), proveen una especie de refugio para las bacterias presentes en
las biopelículas, a su vez, juegan un papel importante en la estructura y
funcionamiento de las comunidades microbianas, también previenen el
acceso de agentes antimicrobianos dentro de la matriz. La matriz posee unos
conductos de agua que proporcionan un intercambio de nutrientes entre la
biopelícula y el medio y expulsa los metabolismos tóxicos que puedan estar
dentro de la matriz, la existencia de estos canales no evita, sin embargo, que
dentro de la biopelícula se puedan encontrar ambientes diferentes con
concentración de nutrientes, pH u oxígeno diferente
[17-19].
La etapa inicial del proceso de formación de la biopelícula es la
adherencia de la bacteria sobre la superficie. Una vez que la bacteria se ha
adherido a la superficie se reproduce originando nuevas bacterias que
también se fijan sobre el sustrato alrededor del sitio de unión. A partir de
este momento las bacterias comienzan a secretar las EPS que constituye la
matriz de la biopelícula. Finalmente, algunas bacterias presentes en la
biopelícula, se liberan para colonizar nuevas superficies. En la figura 3.6 se
esquematiza este proceso
[20].
Figura 3. 6 Formación de la biopelícula
[10].
21
3.5.1 Efecto del sustrato en la formación de biopelículas
La superficie del sólido debe tener ciertas características que son
importantes en el proceso de adhesión. Estudios realizados anteriormente
muestran que la extensión de la colonización bacteriana parece aumentar a
medida que aumenta la rugosidad de la superficie. Esto se debe a que las
fuerzas cortantes disminuyen y hay mayor exposición de área en superficies
rugosas
[21].
3.5.2 Características del medio acuoso
El pH, niveles de nutrientes y temperatura, pueden jugar un rol
importante en la adhesión de los microorganismos al sustrato. Un
incremento en la concentración de nutrientes está relacionado directamente
con una mayor colonización del sustrato
[21].
3.5.3 Propiedades de las células
La hidrofobicidad de la superficie celular es importante en la adhesión
de las bacterias ya que las interacciones hidrofóbicas tienden a incrementar
con un crecimiento no polar en una o ambas superficies involucradas. La
mayoría de las bacterias están cargadas negativamente, pero sus superficies
contiene componentes hidrofóbicos, un ejemplo de estos son los apendios no
flagelados. Se cree que los flagelos son los responsables de superar la
barrera inicial de repulsión electrostática entre la célula y el sustrato
[21].
3.5.4 Las biopelículas en la biolixiviación
Como se mencionó anteriormente, una de las fases más importantes
en el proceso de biolixiviación es la adhesión de las bacterias a la superficie
mineral. El espacio de reacción entre los microorganismos y el mineral está
22
formado por la EPS. La disolución de los sulfuros metálicos y la liberación de
iones y compuestos de azufre se llevan a cabo dentro de este espacio de
reacción donde ocurre un proceso interfacial entre las células procariotas y
la superficie del sulfuro donde las células oxidan los iones de Fe (II).
La adhesión de las bacterias a la superficie mineral aumenta la
velocidad del proceso de lixiviación debido a la formación de un espacio de
reacción entre las células bacterianas y la superficie del sulfuro, esta
asociación es irreversible y el éxito del proceso depende de factores como la
pureza y cristalinidad del sulfuro y la capacidad de las bacterias de detectar
los lugares de adhesión más favorables para producir una biopelícula
[22].
Estudios realizados plantean la hipótesis de que el proceso de
biolixiviación de sulfuros metálicos es debido a la acción del ión férrico y/o
los protones en solución. La bacteria cumple la función de regenerar los
agentes oxidantes y concentrarlos en la interfase mineral/solución o
mineral/bacteria, a fin de mejorar la tasa de degradación del mineral. Se
establece que un factor determinante es la delgada capa de EPS producida
por las bacterias y que las circunda sobre la superficie del mineral. Es en
esta capa donde el proceso químico ocurre, causando la disolución del
sulfuro metálico. Debido a la concentración de los agentes oxidantes en la
interface se acelera el proceso de degradación en presencia de los
microorganismos de lixiviación.
La bacteria Thiobacillus ferrooxidans es capaz de oxidar sulfuros
minerales ya sea directamente en el punto donde la bacteria se adhiere al
mineral, o indirectamente por la producción de Fe (III) que actúa como
agente lixiviante ante el mineral
[23].
3.6 Técnicas de microscopía electrónica.
23
Es la técnica utilizada para la observación de muestras que no pueden
ser analizadas a simple vista. Existen dos tipos de microscopio electrónico: el
Microscopio Electrónico de Trasmisión (TEM, por sus siglas en inglés de
“Transmission Electron Microscopy”) y el Microscopio Electrónico de Barrido
(SEM, por sus siglas en inglés de “Scanning Electron Microscopy”). El TEM
posee mayor resolución y aumento, mientras que el SEM tiene la capacidad
de producir imágenes en tres dimensiones
[25].
Dentro de los microscopios de barrido se encuentran el SEM con
Microanálisis Químico (EDX, por sus siglas en inglés de “Energy Dispersive
X-ray Spectroscopy”) y el Microscopio Electrónico de Barrido por Emisión de
Campo (FE-SEM, por sus siglas en inglés de “Field Emission Scanning
Microscopy”). Existen también otras técnicas de microscopía basadas en el
barrido superficial. el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM, por sus siglas
en inglés “Atomic Force Microscope”)
3.6.1 SEM
Es una de las principales técnicas utilizadas en la caracterización de
materiales. El funcionamiento de este microscopio se basa en la interacción
de la energía de un haz de electrones con la superficie de la muestra, donde
se produce una emisión de electrones retrodispersados y de electrones
secundarios, generando señales que son captadas, procesadas y enviadas a
un tubo de rayos catódicos que traduce estas señales para ser mostradas en
un monitor, en la figura 3.4 se ilustra este procedimiento.
El microscopio opera bajo aceleraciones de voltaje entre 5Kv-45Kv en
condiciones
de
vacío,
por
lo que
la
pieza
a observar debe
estar
completamente seca. Si la muestra no es conductora, se requiere que esté
recubierta por grafito u oro para dispersar los electrones a través de la
superficie
[26].
24
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Imagen
Figura 3. 7 Funcionamiento del SEM
[27].
El SEM tiene varias ventajas: posee una resolución espacial alta
(1 nm), la preparación de las muestras es simple y tiene un alcance de
profundidad alrededor de 100 veces mayor que el alcance del microscopio
óptico. La resolución de la imagen a altos aumentos es mejor a medida que
la pieza se acerca a condiciones óptimas de preparación. Esta técnica es
utilizada en mineralogía debido a su efectividad en el estudio de la
morfología cristalina
[25].
3.6.2 EDS
El microscopio SEM posee una aplicación importante capaz de
determinar la composición química de la muestra empleando los electrones
retrodispersados. Estos son electrones primarios que han sido reflejados por
los átomos de la superficie produciendo un contraste en la imagen reflejada
en el monitor, el contraste depende del número atómico de los elementos
25
presentes en la superficie de la muestra y representa las diferentes fases
presentes.
La interacción del haz primario de electrones con los átomos de la
muestra causa la emisión de Rayos X, los cuales poseen una energía
característica, correspondiente a los elementos que componen la muestra. La
determinación y medida de la energía emitida por los Rayos X permite
realizar un análisis cualitativo y cuantitativo de la composición de la
muestra en una profundidad de 2µm, también se pueden obtener mapas o
perfiles lineales que muestren la distribución del elemento en la muestra
[28].
3.6.3 FE-SEM
Posee ciertas ventajas comparándolo con el tradicional SEM, siendo
una adaptación de éste que combina el sistema de emisión de electrones con
una fuente de emisión de barrido más pequeña que produce una resolución
mucho más alta (0.7 nm). Es el microscopio que utiliza los voltajes de
aceleración más bajos (>5 Kv) haciendo que el daño causado por la
incidencia del haz de electrones sobre la muestra sea menor, por lo que es
muy útil en el estudio de las membranas y de la estructura de las bacterias.
Al igual que en el SEM, la muestra debe estar recubierta por algún metal
para evitar la acumulación de cargas en la superficie
[26].
3.7 Microscopía por fuerza atómica.
El Microscopio de fuerza atómica (AFM por sus siglas en inglés “Atomic
Force Microscope”) es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar
fuerzas del orden de los piconewtons. Al rastrear una muestra, es capaz de
registrar continuamente su topografía mediante una sonda o punta afilada
de forma piramidal o cónica. La sonda va acoplada a un listón o palanca
microscópica muy flexible de sólo unos 200 µm.
26
El microscopio de AFM puede realizar dos tipos de medidas: imagen y
fuerza:
En el modo de imagen la superficie es barrida en el plano (X-Y) por la
punta. Durante el barrido la fuerza interatómica entre los átomos de la
punta y los átomos en la superficie provoca una flexión del listón. Esta
flexión es registrada por un sensor y la señal obtenida se introduce en un
circuito de realimentación. Representando la altura de la punta (Z) frente a
su posición sobre la muestra (X, Y) es posible trazar un mapa topográfico de
la muestra. La fuerza interatómica se puede detectar cuando la punta está
muy próxima a la superficie de la muestra.
En medidas de fuerza la punta se hace oscilar verticalmente mientras
se registra la flexión del listón. La medida se expresa representando fuerza
(F) frente a altura (Z) sobre la muestra
[29].
27
CAPÍTULO IV.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Para la elaboración del presente estudio se siguió la metodología
experimental esquematizada en la figura 4.1.
Figura 4. 1 Esquema general de la metodología experimental
4.1 Preparación y mantenimiento del cultivo mesófilo
Para lograr el crecimiento de los microorganismos se añadieron en un
matraz Erlenmeyer de 250 mL, 140 mL de medio de cultivo 0K (Ver
composición en tabla 4.1) a pH 1.8, Fe (II) con concentración 3 g/L en forma
de sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4•7H2O) y 10 ml de un cultivo
28
crecido a partir de un suelo contaminado de La Sierra de Cartagena – La
Unión en España
[30].
El ensayo se realizó en un régimen de agitación de 150
rpm a 35 ºC en un incubador orbital Know Brunswick Scientific.
Tabla 4. 1 Composición química del medio de cultivo 0K a pH 1,8.
Constituyentes
Concentración (g/L)
(NH4)SO4
3
MgSO4·7H2O
0.5
K2HPO4
0.5
El crecimiento de los microorganismos en el cultivo se controló
mediante medidas de potencial con un pH-metro Crison Basic 20 y
observaciones en el microscopio óptico cada 2 días durante 10 días para
confirmar la existencia y vida de bacterias. Al finalizar los 10 días, se
tomaron 10 mL de la fracción líquida de éste primer cultivo para ser
utilizados como inóculo de un nuevo cultivo que se realizó siguiendo el
procedimiento descrito anteriormente. Para lograr una adecuada población
bacteriana, se realizaron pases con las mismas condiciones nutricionales y
ambientales en intervalos de 10 días hasta la finalización de los ensayos.
En la figura 4.2 se esquematiza el proceso de preparación y
mantenimiento del cultivo mesófilo.
29
Figura 4. 2 Preparación y mantenimiento del cultivo mesófilo.
4.2 Preparación superficial de las muestras de los sulfuros metálicos
Los materiales empleados en este trabajo corresponden a muestras de
grado museo de 3 sulfuros metálicos; pirita (FeS2) proveniente de las minas
de Navajún, (La Rioja, España), calcopirita (CuFeS2) obtenida Río Tinto
(Huelva, España) y enargita (Cu3AsS4) de Huencavélica (Perú). A partir del
material suministrado se seccionaron con una cortadora de disco de
diamante muestras de dimensiones 5 x 5 x 20 mm aprox., para obtener un
tamaño de muestra adecuado para los ensayos se embutieron en resina
epoxi y se volvieron a cortar en probetas de 2 mm de espesor. Para facilitar el
manejo de las muestras, se fijaron en la parte plana de tochos cilíndricos de
aluminio de 6 mm de diámetro y 1,2 mm de alto, calentados previamente en
una placa RCT basic IKA WERWE con el fin de fundir el pegamento
polimérico (figura 4.3).
30
Figura 4. 3 Preparación de las probetas para el proceso de desbaste.
Todas las muestras fueron desbastadas con papel Buehler SiC hasta
grado P4000, utilizando agua como lubricante. Posteriormente, la calcopirita
y la enargita se pulieron con alúmina de 3µ, 1µ y 0.05µ, mientras que para
la pirita se utilizó pasta de diamante de 3µ y 1µ. Este proceso se realizó
hasta obtener una superficie lisa, tipo espejo.
Una vez obtenidas las superficies adecuadas, se volvieron a calentar
los tochos cilíndricos para fundir el pegamento y despegar las probetas. Para
eliminar el pegamento, se introdujeron las probetas despegadas en acetona.
Debido a que la acetona reacciona con la resina epoxi, el tiempo de
inmersión fue corto. Por último, las probetas fueron limpiadas en un baño de
ultrasonidos (5 minutos en alcohol isopropílico).
4.3 Procedimiento de ataque microbiológico de la superficie de los
sulfuros metálicos.
Se seleccionaron dos grupos de muestras de los tres sulfuros,
previamente preparados metalográficamente y fueron sumergidas en un
beaker que contenía una solución al 5% de concentración de cultivo mesófilo
(1.25 ml de cultivo y 24 ml de medio 0K). El beaker se colocó en una estufa a
35°C durante 48 horas. Transcurrido el tiempo de ataque, se sacaron las
probetas de la solución y se limpiaron con agua destilada a pH 1.8 para no
31
crear un cambio brusco que pudiese causar daños a las bacterias adheridas
a la superficie mineral. Finalmente se colocaron en una placa petri y se
dejaron en el desecador durante 24 horas (figura 4.4).
Figura 4. 4 Diagrama esquemático de ataque microbiológico.
4.4 Preparación de las muestras para la observación mediante SEM, FESEM y AFM.
4.4.1
Observación
de
las
muestras
sin
ataque
(superficies
originales)
SEM
A muestras masivas de grado museo de los tres sulfuros minerales
originales: calcopirita (CuFeS2), pirita (FeS2) y enargita (Cu3AsS4), se les
realizó el estudio SEM usando un microscopio JSM-6400 a un voltaje de
aceleración de 20 kV, complementado con microanálisis elemental por EDX
32
para caracterizar el material de partida. En todos los casos las superficies
minerales fueron preparadas siguiendo el apartado 4.2 y recubiertas
posteriormente con grafito.
AFM
Para realizar el estudio topográfico de las muestras de los tres sulfuros
metálicos se utilizó un microscopio de fuerza atómica AUTOPROVE CP. de la
casa Park Cientific Instruments (figura 4.5), operado en modo contacto con
una punta de nitruro de silicio (Si3N4). En todos los casos las probetas
fueron fijadas a un porta muestras especial para el microscopio.
Figura 4. 5 Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) AUTOPROVE CP.
4.4.2 Observación del cultivo bacteriano
Secado por punto Crítico.
Se tomó una muestra de 0.5mL de cultivo bacteriano con una jeringa
esterilizada y se pasó a través de un filtro milipore de 0.2µ colocado en el
33
interior de un soporte plástico hermético. El procedimiento se realizó
añadiendo la suspensión bacteriana gota a gota para evitar la rotura de la
membrana celular por efecto de la presión.
Con el objetivo de intercambiar progresivamente el agua de las células
bacterianas por acetona sin comprometer su forma y tamaño, se inyectaron
10mL de una disolución de acetona (Panreac) al 30% en un soporte
hermético dejando caer la acetona pasante en un beaker de 40mL (figura
4.6). Al terminar de pasar los 10mL, el soporte hermético se dejó en contacto
con la disolución del beaker durante 30 min. Este procedimiento se repitió
para concentraciones de 50%, 70%, 90% y 100% de acetona. Para la
concentración de 90% la muestra se mantuvo en el refrigerador durante 12
horas a 4 ̊C, 15 minutos antes de iniciar la deshidratación por punto crítico
se cambiaron a concentración del 100%.
Figura 4. 6 Proceso de intercambio del agua de las células bacterianas por acetona.
Una vez transcurridos los 15 min, el filtro milipore fue colocado en un
porta muestras cubierto completamente con acetona, luego se introdujo a la
cámara de presión de la secadora por punto crítico EMS 850. La cámara se
34
pre-enfrió para llenarla con CO2 líquido y luego se calentó hasta justo por
encima de la temperatura crítica del CO2 y se disminuyó la presión hasta la
presión crítica para una transformación líquido a gas sin pasar por una
interfase y obtener la muestra inmersa en gas.
FE-SEM
Una vez terminado el punto crítico, las muestras fueron recubiertas
con grafito y observadas mediante FE-SEM utilizando un microscopio JEOL
JSM-6330 F.
4.4.3 Observación de las muestras atacadas microbiológicamente.
SEM-EDX
Las muestras atacadas con microorganismos fueron observadas en el
Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) y analizadas por EDX, de la misma
forma que se estudiaron las muestras originales (apartado 4.4.1).
FE-SEM
Para la observación de las muestras por FE-SEM, también se realizó la
deshidratación por medio de la técnica del punto crítico. Para esto, se
introdujeron las muestras en una placa petri donde se pusieron en contacto
con disoluciones de acetona al 30%, 50%, 70%, 90% y 100%. Este
procedimiento se realizó siguiendo los mismos pasos del apartado 4.4.2 y se
esquematiza en la figura 4.7.
35
Figura 4. 7 Proceso de preparación de muestras sólidas para secado por punto crítico
36
CAPÍTULO V.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
5. 1 Caracterización de los cultivos bacterianos
Se realizó la observación morfológica de los microorganismos de
cultivos bacterianos mediante imágenes FE-SEM previamente preparados
con la técnica de punto crítico descrita en el apartado 4.4.2. Las imágenes se
muestran en la figura 5.1.
Fe (III)
(b)
(a)
Fe (III)
(c)
Fe (III)
(d)
Figura 5. 1 (a) Microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FE-SEM) de la
vista general del cultivo de bacterias mesófilas. (b) Acercamiento del cultivo donde se
observa la presencia de Fe (III). (c) y (d) Acercamiento de la bacteria donde se destaca la
forma bacilar, el crecimiento en cadenas y la presencia de Fe (III) adherido a la superficie
bacteriana.
37
La observación del cultivo microbiano con la técnica FE-SEM muestra
un crecimiento en pares o cadenas, la forma bacilar de las células
bacterianas y un tamaño de entre 1 y 2 µm de largo y 0,5 µm de ancho
acorde al rango mostrado por los microorganismos Thiobacillus [10].
La figura 5.2 muestra una imagen de células Thiobacillus donde se
pueden observar las características morfológicas antes descritas y realizar
una comparación con los resultados obtenidos.
Figura 5. 2 Imagen de células bacterianas con medida de largo y ancho. (a) Imagen SEM de
la forma bacilar y tamaño característico de las bacterias Thiobacillus.
[31],
(b) Imagen FE-
SEM obtenida en el estudio.
Se midieron las células bacterianas de la figura 5.2 utilizando como
patrón la micromarca de cada imagen, la cual es de 1µm en ambos casos. El
tamaño obtenido en la figura 5.2 (b) (resultados de la experimentación) es
aproximadamente 2µm de largo y 0.5µm de ancho, en la figura 5.2 (a) el
tamaño de las bacterias presentes está entre 1 y 2 µm de largo y 0.5 µm de
ancho (aprox.). Estos resultados apoyan la suposición de que las células
utilizadas en el estudio pertenecen al género de las Thiobacillus.
Adicionalmente, tomando en cuenta las condiciones de desarrollo de
las bacterias (pH, temperatura y oxigenación de partida) se puede decir que
38
los microorganismos presentes son mesófilos, acidófilos y de naturaleza
hierro-oxidante
y
pueden
pertenecer
al
género
de
las
Thiobacillus
ferrooxidans. Esta afirmación se corresponde con resultados obtenidos en
investigaciones anteriores donde se ha demostrado que este género de
bacterias es obligatoriamente acidófila, posee capacidades autótrofas, es
aerobea y puede utilizar hierro soluble o sulfuros insolubles como fuente de
energía. Sin embargo, se podría realizar un análisis de microbiología
molecular al cultivo para determinar con exactitud el tipo de bacterias
presentes en él
[32, 33].
En la figura 5.1 se observa la abundante presencia de partículas
sólidas dispersas en la muestra y adheridas a la superficie de la célula
bacteriana. Estas partículas se suponen de Fe (III) debido a una
comparación
hecha con
los resultados
obtenidos
en investigaciones
anteriores donde se realizó el estudio de la EPS desarrollada en bacterias
hierro-oxidantes, determinando que las células crecidas en sustratos de Fe
(II) presentan Fe (III) en la biopélicula.
[34-36]
La presencia de las partículas evidencia la oxidación del ión ferroso
utilizado como fuente energética del cultivo bacteriano para la fijación del
CO2.
[10]
Para asegurar las condiciones establecidas inicialmente, el cultivo se
pesó periódicamente para reponer la cantidad de agua destilada evaporada,
se observó el movimiento de la población bacteriana al microscopio óptico y
se midió el potencial redox con un intervalo de 2 días. Los resultados de este
último parámetro se graficaron (figura 5.3) para 5 cultivos: el inicial (C1),
cultivos intermedios (C2, C3 y C4) y el cultivo final (C5).
La evolución del potencial redox (figura 5.3) parece indicar la
existencia de un período de incubación en el cultivo inicial (C1), en el cual se
utilizó como inóculo el cultivo crecido en suelo contaminado. Esto se puede
deber a que las bacterias se encuentren en período de adaptación al medio
39
ya que estuvieron más de dos meses en el incubador si habérseles realizado
ningún pase
[37].
Figura 5. 3 Evolución del potencial redox del cultivo bacteriano. C1 Cultivo inicial tomando
como inóculo el cultivo crecido en suelo contaminado, C2, C3 y C4 cultivos donde se tomó
como inóculo el cultivo inmediato anterior y C5 cultivo final.
En todos los casos existió un aumento del potencial redox, el cual se
atribuye a la acción bacteriana durante su proceso metabólico donde los
iones de Fe (II) (utilizado como fuente energética del cultivo) son
transformados por las bacterias en iones de Fe (III)
[12].
Al hacer una comparación entre las curvas se puede observar que el
potencial redox evoluciona mejor a medida que se realizan los pases de los
cultivos. Esto indica un desarrollo positivo de bacterias con la sucesión de
pases, lo que se puede deber a la adaptación completa de las bacterias al
40
nuevo medio y por lo tanto, a un aumento en su actividad metabólica que da
origen a la reproducción
[9, 37].
5.2 Análisis de las superficies originales de los sulfuros metálicos sin
ataque.
SEM
Se realizó un estudio en las muestras masivas de grado museo por
SEM-EDX de los tres sulfuros minerales originales: calcopirita (CuFeS2),
pirita (FeS2) y enargita (Cu3AsS4). En todos los casos, las superficies
minerales fueron preparadas como se indica en el apartado 4.2. El estudio se
completó con el análisis EDX puntual o de área de las muestras.
Calcopirita
Los resultados obtenidos para la superficie de la calcopirita original se
muestran en la figura 5.4. y 5.5. La tabla 5.1 muestra los resultados del
análisis puntual de dos zonas alejadas de esta superficie.
Figura 5. 4 Imagen SEM de la muestra original de calcopirita
41
En la imagen SEM de la figura 5.4 se puede observar que la muestra
de calcopirita presenta un alto grado de porosidad, esta característica está
ligada a factores que pueden influir en la biolixiviación como lo son la
absorción y retención de líquidos. También se puede apreciar una grieta de
tamaño superior a los 500µm, este tipo de grietas se presentan a través de
toda la superficie del mineral y son de consideración ya que se ha
determinado la preferencia de los microorganismos de atacar estas zonas
38].
Figura 5. 5 Espectro EDX típico de la superficie de calcopirita.
Tabla 5. 1 Análisis elemental de la superficie de la calcopirita de dos zonas
alejadas entre sí.
[21,
42
El espectro EDX de la matriz de calcopirita se corresponde con el
espectro EDX típico de este mineral. El análisis puntual realizado (tabla 5.1)
muestra correlación entre los dos puntos estudiados (figura 5.4) y es
coherente con la composición elemental de la calcopirita indicada en la tabla
3.1, por lo que se puede decir que este mineral posee un porcentaje de
pureza alto. Sin embargo, no se descarta la presencia de otros elementos ya
que la calcopirita está comúnmente contaminada con níquel (Ni), magnesio
(Mn) o zinc (Zn) como sustituyentes del hierro (Fe) y el cobre (Cu), arsénico
(As) o hierro sustituyendo al azufre, o con impurezas de plata (Ag), plomo
(Pb), antimonio (Sb) y aluminio (Al). Estos elementos pueden formar también
otras fases como la pirítica o inclusiones de cuarzo, este último se encuentra
en casi todas las vetas minerales debido a que se puede formar en un rango
de temperatura y presión muy amplio
[39-41].
Pirita
En el estudio realizado al mineral de pirita se obtuvieron las imágenes
mostradas en la figura 5.6 y 5.7. y la composición elemental producto del
análisis químico de dos puntos de la matriz de pirita también, los resultados
se muestran en la tabla 5.2
Como se puede observar en la figura 5.6, el grado de porosidad de la
superficie de la pirita es muy inferior al grado de porosidad presentado en la
calcopirita (figura 5.4), esta diferencia tiene que ver con la naturaleza de
ambos minerales, las condiciones bajo las cuales crecieron y las condiciones
climatológicas a las cuales estuvieron expuestos antes de su extracción
[3].
También se visualiza una fractura de tamaño importante que se puede
haber formado debido a la alta dureza del mineral durante la preparación
metalográfica de la muestra, en donde se requerían probetas muy delgadas
(1,5 mm de espesor).
43
Figura 5. 6 Imagen SEM de la muestra original de pirita.
Figura 5. 7 Espectro EDX típico de la superficie de pirita.
44
Tabla 5. 2 Análisis elemental de la superficie de la pirita de dos zonas alejadas entre sí.
Para el caso de la pirita también se obtuvo un espectro EDX típico de
este mineral (figura 5.7) y valores coherentes en el estudio realizado en dos
zonas distantes entre sí indicando homogeneidad de la matriz (tabla 5.2). La
composición química de la muestra utilizada también se corresponde con la
composición típica del mineral presentada en la tabla 3.2. Sin embargo, la
pirita suele contener impurezas de cuarzo, óxidos, carbono y distintos
materiales orgánicos, así como también es común encontrar oro (Au) y As
como sustituyentes en su estructura
[42].
Enargita
Las figura 5.8 muestra la imagen SEM obtenida para el sulfuro
original de enargita donde se observa que el grado de porosidad es también
muy inferior al obtenido en la calcopirita (figura 5.4) y muy similar al
presente en la superficie de la pirita.
En el espectro EDX (figura 5.9) se observa un pico correspondiente al
antimonio (Sb) que no pertenece a la estructura original de la enargita. En el
análisis elemental de los dos puntos distantes en la matriz (tabla 5.3) se
obtuvo correlación en los resultados, pero esta composición no coincide con
la composición típica de la enargita (tabla 3.3) en la presencia de Sb. Este
pequeño porcentaje de Sb es común en la estructura del mineral en donde
entra como sustituto del As; se ha encontrado que esta sustitución puede
ser de hasta el 6 %, el Fe y el Zn también se pueden presentar como
sustitutos en la matriz pero en menor medida que el Sb.
45
Figura 5. 8 Imagen SEM de la muestra original de enargita.
Figura 5. 9 Espectro EDX de la superficie de enargita
Figura 5. 9 Espectro EDX de la muestra original de enargita.
46
Tabla 5. 3 Análisis elemental de la superficie de la enargita de dos
zonas alejadas entre sí.
AFM
Se realizó el estudio topográfico de los tres sulfuros minerales
siguiendo las indicaciones del apartado 4.4.1 para AFM. En la figura 5.10 se
presentan las imágenes de cada muestra donde se observan los valores de la
altura máxima de los picos (Z) y la diferencia entre la rugosidad superficial.
La superficie de la pirita es la que posee el pico de menor tamaño
siendo Z igual a 107,0nm, seguido por la calcopirita con un Z de 200,6nm y
por último la enargita con Z igual a 394.3nm. La diferencia entre las alturas
de los picos de las distintas muestras es bastante marcada y se puede
expresar de la forma que sigue:
Estudio topográfico de los sulfuros:
Z
Enargita
> Z Calcopirita > Z
Z
Enargita
≈4Z
Z
Enargita
≈ 2 Z Calcopirita
Pirita
Pirita
La rugosidad de las muestras se calculó con un método aproximado de
conteo de picos en las superficies dadas (figura 5.10) obteniendo una
densidad de: 68 picos/100µm2 para la pirita, 60 picos/100µm2 para la
calcopirita y 204 picos/100 µm2 para la enargita. En este caso la rugosidad
que presenta la superficie de la enargita es casi cuatro veces la rugosidad
presentada por los otros dos sulfuros.
47
(a)
(b)
(c)
Figura 5. 10 Imágenes topográficas AFM típicas de las superficies de los sulfuros minerales
(a) pirita, (b) calcopirita y (c) enargita.
48
La rugosidad de los minerales se puede expresar de la siguiente
manera:
Enargita > Calcopirita ≈ Pirita.
La diferencia superficial presentada por los sulfuros utilizados se
puede deber a las características de cada uno, como por ejemplo: la dureza y
la
estructura
cristalina,
también
pudieron
climatológicas a las cuales estuvieron expuestos
influir
las
condiciones
[3].
5.3 Estudio de los sulfuros atacados microbiológicamente.
Se realizó el ataque con microorganismos mesófilos a cada uno de los
sulfuros metálicos siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 4.3.
Todas las muestras fueron previamente preparadas superficialmente como
se explica en el procedimiento 4.2
5.3.1 Estudio SEM-EDX de las muestras atacadas
Se realizó un estudio SEM-EDX de los tres sulfuros después de
haberlos atacado microbiológicamente.
Calcopirita
Se realizó el estudio SEM-EDX de la matriz de la calcopirita con el fin
de detectar irregularidades en la superficie, observar la presencia y
formación de las colonias bacterianas o biopelículas y determinar la
homogeneidad química de la matriz y la composición de los precipitados que
su pudiesen formar.
La figura 5.11 (a) muestra la imagen obtenida de la superficie de
calcopirita después de haber sido ataca microbiológicamente durante 48
49
horas y la 5.11 (b) El análisis EDX de la matriz del mineral con el fin de
determinar los cambios químicos que se hayan podido presentar durante el
proceso lixiviante al que estuvo sometido.
(a)
(
(b)
(
Figura 5. 11 Estudio SEM-EDX de la superficie de calcopirita atacada microbiológicamente:
(a) Imagen SEM de la superficie. (b) Espectro EDX de la superficie.
50
Tabla 5. 4 Análisis elemental de la superficie de la calcopirita atacada microbiológicamente.
Elemento
SK
Fe K
Cu K
Total
% Peso
32.68
31.04
36.28
100.00
% Atómico
47.50
25.90
26.61
En los resultados obtenidos mediante SEM-EDX de la calcopirita
atacada
microbiológicamente,
se
observa
la
presencia
de
colonias
bacterianas dispersas en la superficie (figura 5.11). El análisis de la matriz
(tabla 5.4) resulta muy parecido al de la muestra original sin ataque (tabla
5.1). La coherencia en la composición elemental de la matriz original con la
matriz atacada indica que no ha habido una lixivición importante del sulfuro
metálico. Los tiempos de biolixiviación de la calcopirita son muy lentos
debido a que presenta un comportamiento muy refractario frente a la
biolixiviación por su especial estructura cristalina, sus características
electroquímicas y por la formación de una capa inhibidora en la superficie
durante la oxidación que evita la formación de iones entre la calcopirita y el
medio. Estos tiempos mejoran dependiendo del tipo de microorganismos que
se utilicen para el ataque, las condiciones de pH y la temperatura a la cual
se realice. Se ha determinado que la plata (Ag) actúa como catalizador en el
proceso de biolixiviación
[43, 44].
La figura 5.12 muestra una diferencia de tonalidad en la superficie de
la calcopirita. Para identificar estas zonas aparentemente diferentes, se
realizó el estudio EDX lineal abarcando las dos tonalidades (figura 5.13) con
el fin de obtener la composición respectiva. Sin embargo, se obtuvo que
presentan la misma composición, descartando la posible presencia de fases
diferentes. Esto induce a pensar que esta diferencia de tonalidad es debida a
la formación de una película en la superficie de la matriz que puede haber
51
sido afectada por la incidencia de los electrones durante el estudio SEM.
Esta película pudiese estar constituida por las bacterias adheridas a la
superficie del mineral, geles y exopolímeros, producidos por las bacterias
para crear condiciones adecuadas para la realización de su metabolismo y
protectoras de agentes antimicrobianos.
[17]
Figura 5. 12 Estudio SEM de la superficie de calcopirita atacada microbiológicamente
donde se observa la formación de biopelículas.
Además, se observó la presencia de un precipitado concentrado
alrededor de una grieta presente en la superficie de la calcopirita (figura
5.14) al cual se le hizo el análisis EDX puntual (figura 5.15). Según estudios
realizados anteriormente por FU Jian-hua y col., se ha observado que las
bacterias mesófilas poseen una cierta preferencia por adherirse a superficies
de pirita en vez de superficies de calcopirita cuando se presentan ambos
sulfuros en la misma matriz. Esto debido a que la pirita posee un porcentaje
de Fe mucho mayor al que posee la calcopirita (tablas 3.1 y 3.2
respectivamente)
sumado
a
todas
las
complicaciones
mencionadas
52
anteriormente que presenta la calcopirita para ser lixiviada. Contrario a esto,
en la figura 5.14 se observa la presencia de pirita dentro de la matriz de
calcopirita, pero sin embargo, la zona con mayor actividad microbiana se
registra en una grieta de la matriz de calcopirita.
[24, 31, 43]
(a)
(b)
Figura 5. 13 Estudio SEM-EDX lineal de las zonas irregulares en la superficie de calcopirita
atacada microbiológicamente. (a) Micrografía donde se indica la zona del estudio lineal. (b)
Espectro EDX.
53
(a
(b
Figura 5. 14 Estudio SEM de la superficie de calcopirita atacada
microbiológicamente. (a) Micrografía de la matriz donde destaca la formación de
pirita. (b) Ampliación de la zona señalada en (a).
54
La preferencia de las bacterias por estas zonas agrietadas se puede
deber a que los granos de calcopirita en la grieta están más expuestos que
los granos en la fase pirítica y pueden ser abarcados por las bacterias de
manera más fácil. La adhesión de las bacterias al sustrato depende de varios
factores como por ejemplo: la geometría de la superficie y la forma de la
bacteria. Para incrementar la cantidad de superficie de adhesión, la bacteria
tiene que deformarse incrementando la energía vinculada al proceso, por
esta razón las bacterias buscan superficies más acordes a su forma
manteniendo la energía del proceso lo más baja posible [38].
El análisis EDX (figura 5.15) del precipitado presente en la superficie
de la calcopirita (figura 5.14) muestra la presencia de P, O y Fe (tabla 5.5).
Estos elementos pueden ser indicativos de la presencia de bacterias en esa
zona ya que este tipo de bacterias posee una envoltura celular externa donde
se cree que ocurre la oxidación del Fe, aparte, utilizan el fósforo (P) para
formar agregados vesiculares los cuales ayudan en la solubilización y
oxidación de los sulfuros
[32].
Figura 5. 15 Espectro EDX del precipitado de la figura 5.8.
55
Tabla5. 5 Análisis elemental del precipitado presente en la superficie de la calcopirita
atacada microbiológicamente.
Elemento
OK
PK
SK
Fe K
Cu K
% Peso
26.75
4.49
23.37
25.65
19.74
Total
100.00
% Atómico
50.42
4.37
21.98
13.85
9.37
Pirita
Se realizó la observación y el análisis de la matriz de pirita (figura
5.16). En los resultados obtenidos se observa la presencia de colonias
bacterianas dispersas en la superficie del mineral. El análisis de la matriz
(tabla 5.6) resulta muy parecido al de la muestra original sin ataque (tabla
3.2) esto indica que para los tiempos de ataque utilizados, la biolixiviación de
la pirita no es homogénea. La lixiviación de la pirita por medio de las
bacterias es un proceso lento ya que durante la oxidación del mineral a
pH<2 y en presencia de microorganismos hierro oxidantes (como es el caso),
se produce S0 en cantidades significativas (10-20%) las cuales se pueden
acumular y formar una capa en la superficie del mineral que puede actuar
como barrera en contra de la difusión del oxigeno y el Fe (III) afectando la
reactividad y retardando el proceso
[45].
En un acercamiento a la superficie de la pirita también se observó le
presencia de una película contenedora de precipitados y de colonias
bacterianas (figura 5.17). Se realizó el análisis EDX (figura 5.18) de estos
precipitados obteniendo una composición un poco diferente, estas se pueden
observar en las tablas 5.7 y 5.8.
56
(a)
(b)
Figura 5. 16 Estudio SEM-EDX de la muestra de pirita atacada
microbiológicamente: (a) Micrografía de electrones secundarios. (b) Espectro
EDX de la matriz de pirita.
57
Tabla 5. 6 Análisis elemental de la matriz de la pirita atacada microbiológicamente.
Elemento
SK
Fe K
Total
% Peso
49.77
50.23
100.00
% Atómico
63.32
36.68
Precipitado 1
Precipitado 2
Figura 5. 17 Imagen SEM de la superficie de la pirita atacada microbiológicamente:
Micrografía donde se observa la presencia de una película que contiene precipitado.
58
(a
(b)
Figura 5. 18 Estudio SEM-EDX de la superficie de la pirita atacada
microbiológicamente: (a) Espectro EDX precipitado 1. (b) Espectro EDX
precipitado 2.
59
Tabla 5. 7 Análisis elemental del precipitado 1 presente en la pirita atacada
microbiológicamente.
Elemento
OK
Al K
Si K
PK
SK
Cl K
Fe K
Total
Peso %
28.40
7.73
1.71
9.72
13.39
7.63
31.42
100.00
Atómico %
48.88
7.89
1.67
8.64
11.50
5.92
15.49
Tabla 5. 8 Análisis elemental del precipitado 2 presente en la pirita atacada
microbiológicamente.
Elemento Peso %
OK
39.46
Al K
24.28
Si K
5.34
PK
9.70
SK
1.52
Cl K
2.44
KK
0.16
Fe K
17.10
Total
100.00
En
este
caso,
los
precipitados
Atómico%
57.41
20.95
4.42
7.29
1.10
1.60
0.10
7.13
también
presentan
elementos
indicadores de la existencia de bacterias como el P, Fe y el O discutidos
anteriormente. La presencia de Al y Si se puede deber a inclusiones en la
matriz del material de minerales como cuarzo u óxidos como alúmina. Como
ya se sabe, los minerales son formaciones naturales por lo que es casi
imposible conseguir un mineral 100% puro
Enargita
[3].
60
El estudio SEM-EDX también fue realizado para la superficie atacada
microbiológicamente de enargita. Los resultados se muestran en la figura
5.19 y la tabla 5.9.
(a
(b
Figura 5. 19 Estudio SEM-EDX de la muestra de enargita atacada con microorganismos: (a)
Imagen SEM de la superficie. (b) espectro EDX de la matriz.
61
Tabla 5. 9 Análisis elemental de la matriz de enargita atacada microbiológicamente.
Elemento
SK
Mn K
Fe K
Cu K
As L
Ag L
Sb L
Total
Peso %
26.50
1.22
4.49
47.45
17.75
0.99
1.60
100.00
Atómico %
42.71
1.15
4.15
38.59
12.24
0.47
0.68
La imagen SEM obtenida para la enargita (figura 5.19) también
muestra zonas de distintas tonalidades, pero al igual que en el caso de la
calcopirita, no se trata de fases diferentes, se puede tratar de una película
producida por las bacterias formada en la superficie del mineral que haya
sido afectada por los electrones en el momento del estudio.
El análisis de la matriz de enargita (tabla 5.9), presentó ciertas
diferencias en comparación con la superficie de enargita original sin atacar
(tabla 5.3). El Mn puede pertenecer al medio 0K utilizado en el cultivo
bacteriano, mientras que la Ag puede ser una impureza que presente el
material. El Fe, a pesar de que puede provenir del compuesto de Fe (II)
utilizado como fuente energética del cultivo, también puede indicar que ha
ocurrido un ataque microbiano sobre la matriz del mineral. En estudios
realizados anteriormente por Sasaki y col. se determinó que durante el
proceso de biolixiviación de la enargita utilizando microorganismos A.
ferrooxidans, se forma una fase amorfa de hierro y arsénico
[46].
La figura 5.20 es un acercamiento a la superficie de la enargita donde
se pueden observar colonias bacterianas que abarcan gran parte de la
superficie.
62
Figura 5. 20 Imagen SEM de la superficie de la enargita colonizada por microorganismos.
La presencia de colonias bacterianas, en comparación con la
colonización ocurrida para los otros dos sulfuros, se presenta de manera
dispersa sobre la superficie del mineral. Como ya se ha discutido, las
bacterias tienden a colonizar las zonas de que resulten de mayor beneficio y
menor consumo energético. En este caso, esa preferencia no se ve tan
marcada. Este comportamiento de las bacterias sobre esta superficie de la
enargita se puede deber al nivel de rugosidad homogéneo presentado por el
mineral (figura 5.10). Las superficies que facilitan el mayor contacto entre el
sulfuro y la bacteria serán las preferidas para la colonización ya que
implican un menor esfuerzo par parte de las bacterias al momento de la
adhesión. En este caso, las bacterias tienen una forma bacilar por lo que se
ven beneficiadas ante una superficie rugosa
[38]
La presencia de biopelículas ocurrió en los tres sulfuros minerales.
Para el caso de la biolixiviación este fenómeno es positivo ya que concentra
63
los agentes oxidantes (como el Fe (III)) regenerados por las bacterias
mesófilas cerca de la superficie del sustrato acelerando el proceso de
degradación. Según estudios realizados anteriormente, la formación de las
EPS producidas por las bacterias, son determinantes para que ocurra el
proceso de lixiviación, por lo que se puede argumentar que desde este punto
de vista la biolixiviación con este cultivo sería factible.
[47]
La mayor colonización de bacterias se observó en las grietas presentes
en la superficie de la calcopirita y en toda la superficie de la enargita. Sin
embargo, el cambio de la composición sufrido por la matriz de enargita en
donde se observa la presencia de Fe (III) puede indicar una degradación más
rápida sobre este mineral. Habría que realizar un estudio acerca de la
velocidad del proceso de biolixiviación sobre superficies de distinta rugosidad
de estos dos minerales.
En estudios realizados acerca de la adhesión de los microorganismos a
las superficies minerales, se observó que este fenómeno es afectado por
varios factores, pero que en general, la adhesión ocurre más fácilmente y en
mayor cantidad a medida que aumente la superficie de contacto entre el
sulfuro y la bacteria
[46].
Haciendo una comparación de la composición obtenida por los
precipitados presentes en la calcopirita y la enargita, se tiene como factor
común la presencia de oxígeno (O), este elemento es esencial para la
producción del ión férrico (agente oxidante) en ambientes de pH ácidos,
además de ser un buen aceptor de electrones, por estas razones, su
presencia es favorable dentro del mecanismo de biolixiviación. A pesar de
esto, también puede estar presente en forma de óxidos o formando fases
diferentes a las del mineral, como el caso del cuarzo en la pirita.
[1]
64
5.3.2 Estudio FE-SEM de las muestras atacadas con
microorganismos.
Se realizó el ataque de los tres sulfuros metálicos con una disolución
del cultivo mesófilo siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 4.3.
Posterior al ataque, se procedió a preparar las muestras minerales para el
punto crítico como se describe en el apartado 4.4.3.
Calcopirita
La figura 5.21 (a) muestra las colonizaciones bacterianas dispersas
sobre la superficie de calcopirita, al hacer un acercamiento a las zonas de
mayor población (figuras 5.21 (b) y 5.21 (b)) se puede observar que las
bacterias tienen preferencia a adherirse en las superficies agrietadas del
mineral. Este suceso ya ha sido observado anteriormente y se debe a que las
grietas poseen mayor rugosidad que la superficie pulida del sulfuro, dejando
más expuestos los elementos nutrientes necesarios para las bacterias que
posee el mineral
[21, 38, 48].
Estudios han demostrado que el ataque microbiano sobre la superficie
de la calcopirita está formado por cuatro etapas: en la etapa 1 las bacterias
presentes en la solución se transfieren a la superficie de mineral, en la etapa
2 las bacterias se adhieren a la superficie mineral (en esta etapa el 98% de
las bacterias se adhieren a la superficie), en la etapa 3 comienza la
formación de la EPS y en la etapa 4 las colonias formadas se expanden y
forman la biopelícula sobre la superficie
[24].
Una vez formada la biopelícula uniformemente sobre toda la superficie,
el movimiento de las bacterias se ve limitado y el trabajo de lixiviación pasan
a realizarlo los iones de Fe (III) disueltos en la biopelícula
[24].
65
(a)
(b)
(c)
Figura 5. 21 Estudio FE-SEM de la superficie de la calcopirita atacada con
microorganismos: (a) Micrografía de la superficie don se observan colonias bacterianas. (b)
y (c) Acercamiento de distintas zonas con gran población bacteriana.
66
Flagelos
Apéncices
(a
Flagelos
Apéncices
(b)
Figura 5. 22 Estudio FE-SEM de la superficie de calcopirita atacada con microorganismos
donde se observa la presencia de microorganismos
Pirita
En la superficie de la pirita también se pudo observar la colonización
de las bacterias pertenecientes al cultivo mesófilo (figura 5.23 y 5.24).
Figura 5. 23 Estudio FE-SEM de la superficie de la pirita
atacada con microorganismos.
67
Flagelos
Apéndices
Apéndices
Flagelos
Bacterias
(a
(b
Precipitado
Precipitado
(c
(d
Figura 5. 24 Estudio FE-SEM de la superficie de la pirita atacada con microorganismos:
(a) y (b) Acercamiento de la superficie donde se observan lo apéndices bacterianos. (c) y
(d) Acercamiento de la superficie donde se observa la formación de un precipitado.
En la superficie de la pirita la presencia de colonias bacterianas no fue
muy evidente, aun así, es posible observar algunas bacterias aisladas (figura
5.23). La observación de los apéndices y la formación de precipitados (figura
5.24) son indicadores de una interacción entre las bacterias y la superficie
mineral.
Estudios
realizados
anteriormente
sobre
la
formación
de
biopelículas durante la biolixiviación de pirita, muestran que las bacterias
forman una biopelícula de entre 30µm-50µm de espesor y que en la etapa
68
inicial del crecimiento, las biopelículas no se forman uniformemente sobre la
superficie del mineral, sino que se forman microcolonias aisladas separadas
por canales de agua. Después de unos días, una significativa cantidad de Fe
(III) se forma en toda la superficie mineral y la biopelícula se hace más
uniforme
[23].
Enargita
La presencia de colonias bacterianas también se obtuvo en la
superficie de la enargita como se muestra en la figura 5.25. Se puede
observar que esta colonización no se produjo de manera concentrada en
zonas específicas, sino que se produjo en toda la superficie.
Figura 5. 25 Estudio FE-SEM de la superficie de la enargita
atacada con microorganismos.
69
En la figura 5.26 se puede observar la presencia de una película que
contiene microorganismos (zona clara)
Películ
(a
(b
Figura 5. 26 Estudio FE-SEM de la superficie de la enargita atacada con
microorganismos: (a) Micrografía donde destaca la formación de una película (zona clara).
(b) Acercamiento de la micrografía a en la zona señalada.
En la micrografía anterior se puede observar que existe gran población
de bacterias distribuidas de manera homogénea sobre la superficie del
mineral e incluso parece apreciarse la formación de EPS sobre las bacterias
y el sulfuro (figura 5.26 (a)), indicando que hubo una adhesión adecuada de
las bacterias a la superficie.
Al hacer una comparación entre los resultados obtenidos para la
calcopirita, pirita y enargita, se puede observar que la mayor colonización se
presentó en la superficie de la calcopirita, mientras que la superficie de la
pirita y la enargita presenta una escasa concentración de microorganismos
colonizadores.
Las imágenes de la colonización bacteriana de la enargita no se
corresponden con los resultados obtenidos en el estudio SEM-EDX en donde
se obtuvo que este mineral había sufrido el mayor ataque. Esto puede
deberse a que las imágenes obtenidas por FE-SEM, muestran una
70
magnificación que el SEM, por lo que pudiese obviarse la cantidad total de
microorganismos presentes en la superficie.
71
CAPÍTULO VI
CONCLUSIONES
La población de bacterias utilizadas en el estudio son mesófilas,
acidófilas y de caráter hierro oxidantes.
La formación de biopelículas ocurrió sobre la superficie de los tres
sulfuros metálicos estudiados: calcopirita, pirita y enargita.
Se encontró que para los tres sulfuros estudiados las bacterias
tuvieron preferencia a colonizar zonas con mayor exposición de
superficies o muy rugosas, debido a que en estas zonas las bacterias
necesitan una menor deformación para colonizar mayor superficie.
En la superficie de calcopirita, la colonización bacteriana ocurrió en
mayor cantidad sobre las grietas del sulfuro en vez de sobre la fase
pirítica presente en la matriz.
La matriz de la enargita fue la más afectada por el ataque
microbiológico debido a la abundante población bacteriana y la
disposición homogénea de biopelículas en su superfcie.
Los resultados confirman que la rugosidad juega un papel importante
al momento de la selección de la zona de adhesión por parte de las
bacterias.
72
CAPÍTULO VII
RECOMENDACIONES
Realizar un análisis de microbiología molecular para determinar el tipo
específico de bacterias utilizadas.
Estudiar la relación directa entre la rugosidad y los tiempos de ataque
para la calcopirita, pirita y enargita.
Comparar
el
ataque
sobre
microorganismos termófilos.
las
superficies
minerales
de
73
CAPÍTULO VIII
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