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 Resumen de: Serpins Promote Cancer Cell Survival and Vascular Co-­‐Option in Brain Metastasis (Valiente et al. 2014) Natalia Pozuelo de Matos Resumen A continuación se presenta el resumen del artículo “Serpins Promote Cancer Cell Survival and Vascular Co-­‐Option in Brain Metastasis” de Valiente et al. (2014), en el que se presentan descubrimientos acerca de los mecanismos propios de las células tumorales presentes en los adenocarcinomas de pulmón y mama, y que les permiten a ciertas células metastatizar en el cerebro. Nos centramos en la acción de los inhibidores del activador de plasminógeno (PA) y en el ligando FasL, aunque también la plasmina tiene efecto sobre L1CAM (explicado brevemente) y por tanto las serpinas anti-­‐PA actuarán también sobre este factor. Introducción La metástasis supone la principal causa de muerte por cáncer, aunque la capacidad de las células de extravasarse y colonizar nuevos tejidos, es decir, de metastatizar, es muy baja, siendo por tanto la metástasis un proceso ineficiente. Las células que salen del tumor sólido suelen perecer en su circulación por los vasos o en su infiltración en los órganos. Aunque el crecimiento de las metástasis y los primeros pasos en la dispersión de las células cancerosas está muy estudiado, aquellos procesos que permiten la supervivencia y la adaptación de las células dispersadas en órganos diferentes al de su origen no se conocen. Estos factores son de vital importancia en la clínica y los autores deciden centrarse en la metástasis cerebral debido a la recaída que sufren estos, y a los síntomas tan dramáticos además de la alta mortalidad. La metástasis cerebral es muy frecuente comparada con el cáncer primario de este órgano, siendo el cáncer de pulmón y el de mama los principales tumores primarios que originan metástasis cerebral, casi 7un 66,6% de los casos. La cantidad de células que logran atravesar la barrera sangre-­‐cerebro (interfase celular que controla de forma selectiva las moléculas que pasan del torrente al cerebro) es mínima, y además muchas mueren en el intento de colonizar el órgano, es decir, tienen una alta tasa de desgaste (muerte al llegar al órgano). Por ello las metástasis cerebrales suelen darse de forma tardía en los pacientes clínicos. Todas estas premisas dan pie a pensar que las células cancerosas que circulan se enfrentan a mayores obstáculos para la colonización del cerebro que en otros órganos. Las pocas células cancerosas que logran atravesar esta barrera sangre-­‐cerebro (BBB; blood-­‐brain barrier) y proliferar, presentan la capacidad de adherirse a la superficie de los capilares y reproducirse formando una vaina alrededor de los vasos, obteniendo así suficiente suministro de sangre. A este proceso de adhesión y proliferación a lo largo de vasos sanguíneos se le denomina cooptación vascular, y permite a las células tener un suministro de sangre suficiente sin realizar angiogénesis. Las células cancerosas que fallan en la cooptación vascular en el cerebro perecen aun siendo capaces de infiltrarse por la BBB. Debido al gran interés clínico y biológico que suponen los mecanismos que permiten que algunas células metastaticen en el cerebro, pero que la mayoría sufran desgaste, Valiente et al. (2014) centran su investigación en vislumbrarlos. Para esta investigación los autores se centran en un conjunto de genes cuya expresión se asocia con fenotipos de metástasis cerebral en adenocarcinoma de pulmón y mama. Uno de los genes es SERPINI1 que codifica una neuroserpina inhibidora del activador de plasminógeno abreviada como NS y cuya expresión se da mayormente en cerebro. El PA de tejido (tPA; tissue PA) y uroquinasa PA (uPA) convierten el plasminógeno en plasmina, endopeptidasa que media la fibrinólisis en la resolución de coágulos de sangre además de estar implicada en la respuesta del estroma al cerebral. Los astrocitos reactivos (se vuelven reactivos ante un daño tisular en el sistema nervioso central) son las principales fuentes de PA en isquemia y lesiones neurodegenerativas. La plasmina impide que las células tumorales colonicen el cerebro provocando su apoptosis mediante el ligando FasL e impidiendo su cooptación vascular mediante la inactivación de L1CAM que de estar activo produce la migración y adhesión del tumor (Fig. 1 a). Estos efectos perjudiciales de la plasmina son evitados por las neuronas mediante la expresión de NS que inhibe a los PAs evitando que el plasminógeno se active formando plasmina. Valiente et al. (2014) encuentran en su investigación, que las células cancerosas que logran formar metástasis, lo hacen utilizando esta misma técnica, evitando la plasmina mediante la inhibición del PA, para lo que secretan diferentes serpinas inhibidoras de PA (serpinas anti-­‐PA) que truncan la acción de la plasmina (Fig. 1 b). La inhibición de FasL y la no inactivación de L1CAM son los dos hechos que permiten a las células tumorales cooptación vascular, y por tanto, son requerimientos básicos para la metástasis cerebral. Figura 1. a. El astrocito produce PA, enzima que cataliza la conversión de plasminógeno a plasmina, la cual induce la apoptosis de las células tumorales mediante el ligando de Fas, FasL e impide la cooptación vascular mediante la inactivación de L1CAM. b. Las células tumorales producen serpinas anti-­‐PA impidiendo la conversión a plasmina del plasminógeno, y truncando su acción, de forma que pueden seguir proliferando. Datos experimentales Asociación entre la expresión de serpinas anti-­‐PA, y el fenotipo de metástasis cerebral Con el objetivo de identificar los genes cuya expresión es compartida en metástasis cerebral, se compararon las expresiones génicas de subpoblaciones (metástasis cerebral) de células Figura 2. Niveles de mRNA de las aisladas de líneas celulares tumorales. Entre otros genes, se serpinas indicadas en la línea parental observó que 3 serpinas (NS, B2 y E2) que inhiben selectivamente MDA231 y sus derivadas. Intervalo de PA, se expresaban mayormente en la metástasis cerebral confianza 95%. comparado con la línea parental original (cáncer en su órgano primario). Además se vio una expresión aumentada de la serpina D1 que inhibe la trombina, la cual colabora con el plasminógeno en caso de lesión cerebral. Se utilizaron líneas de metástasis en pulmón (MDA231-­‐LM2) y de metástasis en hueso (MDA231-­‐BoM) observándose como en la metástasis cerebral derivada de la misma línea celular parental (MDA231-­‐BrM2; cáncer de mama) se expresaban mayormente las serpinas NS, B2 y D1 (Fig. 2). Para comprobar como la incidencia de la metástasis se relaciona con esta expresión diferencial, se utilizaron 4 líneas celulares provenientes de metástasis en ganglios linfáticos derivada de adenocarcinoma de pulmón: KrasG12D;p53-­‐/-­‐.Estas 4 líneas aunque altamente metastásicas, derivaban en su capacidad de metastatizar el cerebro. Se asoció una alta incidencia en metástasis cerebral, con una expresión diferencial de NS, B2, E2 y/o D1 (Fig. 3). Figura 3. C. Se muestra la carga tumoral y la incidencia de metástasis cerebral en las líneas celulares indicadas; bioluminiscencia de cerebros ex vivo de ratones inoculados con KrasG12D;p53 -­‐/-­‐. D. Se muestra la expresión diferencial según la línea celular. Para comprobar el efecto de estas serpinas sobre la actividad de la plasmina y su efecto en las líneas parentales y en las provenientes de metástasis cerebral, se midió la inhibición de la conversión de plasminógeno a plasmina (Fig. 4) observándose una clara diferencia, ya que en las líneas con metástasis cerebral, se observa una alta inhibición. Con estas evidencias se comprueba que la metástasis cerebral se relaciona con la expresión de serpinas anti-­‐PA, que no se sobreexpresan en otras metástasis como hueso y pulmón (Fig. 2). Estas serpinas anti-­‐PA permitirían a las células tumorales evitar la acción de la plasmina (Fig. 4), y por tanto, aquellos tumores capaces de sobreexpresarlas Figura 4. inhibición de la conversión de plasminógeno a plasmina mediante la medición de la actividad de la plasmina por un ensayo cromogénico tienen mayor incidencia de metástasis cerebral (Fig. 3). Serpinas anti-­‐PA en tejido metastásico cerebral humano Estudiando datos de 106 pacientes de adenocarcinomas primarios de pulmón que habían experimentado recaídas, vieron que la sobreexpresión de NS y B2 (solo estudiaban estas) se asociaba con recidiva cerebral. Por el contrario no se asoció esta sobreexpresión con metástasis en huesos o pulmones. En cuanto al estudio de tumores de mama, observaron que la expresión de NS y B2 en el tumor de mama no permitía predecir la metástasis cerebral, aunque en la mayoría de los casos se daba metástasis cerebral tardía, proveniente probablemente de otros órganos. Letalidad de la plasmina para las células cancerosas Se inocularon células de las líneas MDA231-­‐BrM2 y H2030-­‐BrM3 (Nguyen et al., 2009), ambas con tendencia a formar metástasis cerebral, en la circulación arterial de ratones inmunodeficientes a través del ventrículo cardiaco izquierdo, y se fijó el tejido cerebral en diferentes tiempos para contar las células cancerosas presentes en la red capilar (Fig. 5). Un día Figura 5. Análisis con microscopia confocal. Azul: tinción de núcleos. Rojo/Rosa Colágeno IV, Verde (GFP) células tumorales. A. Se observa como las células tumorales siguen unidas al capilar después de su extravasación. B. Etapas del proceso de extravasación. C. Cooptación vascular de las células tumorales. después de la inoculación se observaba como algunas células quedaban atrapadas dentro del capilar. Entre los días 2 y 7 se veía la transición desde el capilar al exterior de este, viéndose en el día 7 la extravasación (Fig. 5 B). A partir del día 7 toda célula que se encontrase en los capilares aun, inducía apoptosis, por lo que a partir de entonces no encontraban células intravasculares menos en el caso de MDA231-­‐BrM2 que por el día 16 volvían a aumentar. Las células que lograban la cooptación vascular formaban una vaina a lo largo del capilar y todas las células extravasadas crecían en su inicio de esta forma (Fig. 5 C). Más del 90% de las células cancerosas que entraron en el cerebro desaparecieron en días, lo que confirmaba resultados anteriores (Kienast et al., 2010). Mediante microscopía confocal se vio la estrecha proximidad de los astrocitos con la microglía y las neuronas (Fig. 6.). Los cortes de cerebro de ratón que contenían células metastásicas, mostraron tPA y uPA asociada con astrocitos (Fig. 7). Además, se asoció la inmunoreactividad del plasminógeno con Neuronas NeuN+ situadas en la proximidad de la metástasis en el cerebro del ratón (Fig. 7). Esto unido a que las neuronas producen plasminógeno para la formación de neuritas y sinapsis, permitió que los autores afirmasen que el microambiente de la metástais cerebral contiene los componentes necesarios para la producción de plasmina, descartando así que la inhibición de la actividad de la plasmina (vista anteriormente) se diese por causas del propio tejido. Figura 7. Células H2030-­‐BrM3 marcadas con GFP+, asociadas con astrocitos. Se observa con marcaje de inmunofluorescencia el tPA en F y uPA en G (flechas). H. Las flechas marcan el plasminógeno marcado con inmunoflurescencia en blanco, se observa que está Figura 6. Células H2030-­‐BrM3 asociadas con astrocitos reactivos (flechas) identificados mediante la proteína asociado a los cuerpos neuronales, cercanos a las células tumorales. GFAP y por su morfología estrellada. Para determinar lo perjudicial que es Figura 8. Técnica: se colocan las células cancerígenas sobre un la plasmina para las células metastásicas corte de cerebro de ratón en cultivo. Se observa como las usaron cortes de cerebro de ratón (Fig. 8) con células tumorales se infiltran adhiriéndose a los capilares. células cancerosas (cánceres organotópicos). Los resultados que obtuvieron fueron claros, las células parentales, (Fig. 9) no proliferan en gran cantidad, y tampoco se adhieren eficientemente a los capilares, dando por tanto una alta tasa de apoptosis. Si añadimos a estas α2-­‐antiplasmina se genera una adhesión y proliferación mucho mayor, habiendo un número de células similar al de la línea H2030-­‐BrM3 con mayor capacidad de metástasis cerebral. Estos resultados sugieren que la capacidad de metástasis cerebral radicaría en la síntesis de serpinas anti-­‐PA. Figura 9. K. Imágenes confocales en las que se muestran tejido de cerebro de ratón infiltrado con las células indicadas. L. Cuantificación de células cancerígenas en el campo de visión según la línea celular que se indica. En cocultivos de células cancerosas con astrocitos y microglía, la adición de plasminógeno genera apoptosis de las células H2030 parentales, pero no de H2030-­‐BrM3. Cuando se adiciona α2-­‐antiplasmina a H2030 disminuye la muerte celular de forma muy similar a la muerte que padecen las células H2030-­‐BrM3 (Fig. 10). Además, es de destacar que al añadir plasmina directamente sobre tejido tumoral monocapa, este no sufrió apoptosis. Todos estos hechos, dan pie a deducir que la plasmina actúa matando las células tumorales, pero que no lo hace directamente, sino que es a través de otros sustratos como actúa ya que de no ser así, la adicción de plasmina al cultivo tumoral debería generar apoptosis. Figura 10. Cuantificación de células positivas al Basado en esto se experimentó con NS sobre ratón, marcaje con caspasa-­‐3, representativo de para comprobar si esta serpina estaba implicada apoptosis. especialmente en el modelo H2030-­‐BrM3 en el cual está sobreexpresada. Se observó que si NS se silenciaba mediante shRNAs se inhibía la actividad metastásica en gran medida (Fig. 11). Figura 11. Imágenes de bioluminiscencia, in vivo y ex vivo de ratones infiltrados con células H2030-­‐BrM3. La función inhibidora de PA de NS media la metástasis cerebral Para demostrar esta gran importancia de NS en la metástasis cerebral los autores utilizaron diferentes líneas de células cancerígenas caracterizadas por ser poco agresivas en su capacidad de metastatizar el cerebro. Una de ellas es H2030. Las células de esta línea entre otras fueron transfectadas con diferentes vectores; uno vacío para realizar un control, un vector con la secuencia NS de tipo salvaje (NSWT), y otro vector con la secuencia NS mutante (NSDloop) incapaz de realizar su función inhibitoria de PA. Cuando las células obtenidas se inoculaban y se obtenía el tejido cerebral, se marcaban con caspasa 3 (Fig. 12), observándose entonces, que las células parentales (control) tenían una mortalidad muy similar a Figura 12. Cuantificación de células positivas la del mutante NSDloop. En cambio, las células para el marcaje con caspasa 3 que implica transfectadas con NSWT reducían enormemente su apoptosis. mortalidad acercándose a la de las células BrM3 altamente metastásicas en el cerebro. Estos resultados junto a los anteriores supondrían que es mediante la inhibición de PA como actúa NS permitiendo la actividad metastásica cerebral ya que al silenciar NS mediante shRNAs se inhibe la actividad metastásica, y al sobreexpresar NS en una línea que no es metastásica cerebral, se consigue metástasis al permitir la supervivencia de las células tumorales en el cerebro. Papel de las serpinas anti-­‐PA en la metástasis cerebral por cáncer de mama La mayoría de modelos, sobreexpresan múltiples serpinas anti-­‐PA, por lo que los autores realizan un triple silenciamiento (B2, D1 y NS) mediante shRNAs en la línea celular MDA231-­‐
BrM2 que conlleva una inhibición completa de la actividad metastásica cerebral, en mayor medida, que de hacerse el silenciamiento de forma individual en cada serpina (Fig. 13). Además, sobreexpresando forzadamente NS en el caso del silenciamiento de shSB2 se recupera la actividad metastásica perdida por el silenciamiento. Se observó que los clones con altos niveles de las tres serpinas, eran más metastásicos en el cerebro que aquellos con menores niveles (Fig. 14). Estos resultados, junto con otros similares, dan a entender que la expresión de más serpinas anti-­‐PA, aportan una ventaja crítica para una mayor capacidad de metástasis cerebral al tumor. Figura 14. Cuantificación por Bioluminiscencia ex vivo de la carga tumoral según las serpinas expresadas. Figura 13. A. Células MDA231-­‐BrM2 transfectadas con los vectores que contienen la información indicada. Vector control, TK/D con silenciamiento de las serpinas B2, D1 y NS, silenciamiento de shSB2, y el silenciamiento de shSB2 y sobreexpresión de NS . La carga tumoral es observada ex vivo y cuantificada en B. Efecto sobre FasL Para intentar vislumbrar a través de que sustratos actúa la plasmina, los autores se centraron primeramente en FasL, una citoquina proapoptótica, que se sitúa en la membrana y es ligando de Fas, un receptor que activa las caspasas proapoptóticas a través de la proteína adaptadora FADD (Fig. 14). FasL se sobreexpresa en astrocitos reactivos ante un daño, por ejemplo en trauma cerebral, esclerosis múltiple o Alzheimer. La plasmina fragmenta FasL en Arg144, liberando sFasL que actúa como una señal difusible de muerte celular. Los autores intentan vislumbrar si las serpinas anti-­‐PA actúan sobre la liberación de sFasL. Usando cultivos de Figura 14. Esquema que muestra FasL astrocitos se observaba que tanto los humanos como los de ratón unido a la membrana, uniéndose a Fas expresaban FasL, y la adición de plasminógeno en estos cultivos receptor que provoca apoptosis a través redujo la cantidad de FasL unido a la membrana pero aumentó la de FADD. La flecha roja muestra el corte cantidad de sFasL en el sobrenadante, dando a entender que la de la plasmina que libera sFasL de FAsL. plasmina es la que media la liberación de sFasL. Si se añadía a los TMD: dominio transmembrana, SA: cortes de cerebro serpinas anti-­‐PA, se reducía el nivel de sFasL dominio de autoensemblaje, y THD: significativamente (Fig. 15). Se demuestra entonces que la plasmina factor de necrosis tumoral. En la puede movilizar FasL del estroma en respuesta a la invasión segunda imagen al añadir plasmina metastásica del cerebro. Además, se deduce que las serpinas anti-­‐
sFasL se libera de a (astrocitos) generando apoptosis en c (células cancerosas). PA actúan sobre la plasmina impidiendo su acción sobre la liberación de sFasL. Figura 15. Western blot. D. Western de sobrenadantes de cultivos de células usando anticuerpo anti-­‐FasL. La expresión de sFasL se ve reducida en presencia de plasminógeno. E. Western de cortes de cerebro incubados con lo indicado. En presencia de serpinas anti-­‐PA, sFasL reduce su presencia. Hicieron otros experimentos con diferentes líneas celulares en los que la adición de anti-­‐FasL en líneas poco metastásicas en el cerebro, aumentaba significativamente el número de células cancerosas presentes en el corte de tejido cerebral, y en cambio, la adición de sFasL a líneas muy metastásicas en el cerebro, reducía drásticamente el numero de células. Al adicionar sFasL en cultivos monocapa de células tumorales, estas sufrían apoptosis, aun con presencia de α2-­‐antiplasmina. Estos datos confirmaban que es sFasL el elemento que genera apoptosis en las células tumorales. Por tanto, la inactivación de sFasL protege a las células de la apoptosis. Se hicieron también experimentos focalizados en una serpina anti-­‐PA, NS. Su silenciamiento generaba una alta mortalidad de células cancerosas, Figura 16. Cuantificación de que en parte disminuía ante la adicción de anti-­‐FasL. Además se realizó células apoptóticas marcadas una construcción con FADD truncado, (FADD-­‐DD) en su dominio efector mediante caspasa 3. Con la de apoptosis. Combinando esta construcción con el silenciamiento de NS, adicción de lo indicado. se producía una baja mortalidad de células tumorales, cercana a la normal (Fig. 16). Se demostraba así, que la actividad anti-­‐PA protege a las células metastásicas del ataque de FasL en el cerebro, porque al añadir anti-­‐FasL se recupera la actividad pérdida con el silenciamiento de NS, al igual que en el caso de FADD-­‐DD. Conclusión Estos autores logran vislumbrar dos mecanismos esenciales en la metástasis cerebral, como son el escape que logran hacer las células metastásicas a las señales de apoptosis del estroma reactivo cerebral, y la capacidad de estas células para expandirse y proliferar a lo largo de los capilares gracias a la inactivación de L1CAM (Fig. 17 y 18, Anexo). Aunque los autores demuestran sus hechos sobre adenocarcinomas de pulmón y de mama, los resultados sugieren un proceso general en metástasis cerebral. Este estudio junto con otros previos muestran que las células metastásicas no solo interaccionan con los capilares durante la extravasación, sino que posteriormente crecen como una vaina a lo largo de los capilares. Las células metastásicas se ven sometidas a las señales perjudiciales de los atrocitos de las cuales deben protegerse para formar metástasis. La expresión de serpinas anti-­‐PA supone una protección ante tales efectos y proporciona una ventaja prometastásica a las células tumorales. Aunque en el presente trabajo los autores se centran en las serpinas anti-­‐PA sobreexpresadas en la metástasis cerebral, estas también se sobreexpresan en otros órganos en un menor nivel. Queda demostrado que los astrocitos producen PA que cataliza la conversión de plasminógeno a plasmina, y FasL unido a la membrana dependiendo los niveles de sFasL de la plasmina presente. Se evidencia que sFasL genera apoptosis en las células metastásicas de cáncer de pulmón o mama a menos que posean serpinas anti-­‐PA de forma que estas serpinas protegen de la liberación de sFasL pero no de la acción de este directamente. Las serpinas anti-­‐PA son las responsables de evitar el desgaste de las células metastásicas en el cerebro. Sobre L1CAM, no tratada en profundidad en este resumen, se llevan a cabo experimentos que demuestran que media la propagación de las células metastásicas sobre la vasculatura e interacciones entre células cancerosas. Su activación promueve la metástasis ayudando a la cooptación vascular debido a su implicación en procesos de adhesión. Los procesos moleculares de la cooptación vascular son desconocidos y esta implicación de L1CAM da pie al descubrimiento del proceso. Los presentes descubrimientos abren posibilidades a la terapia de la metástasis cerebral, un tipo de metástasis especialmente dramática por su mortalidad y síntomas, además de por su recidiva. Actuando clínicamente sobre los mecanismos que permiten al cáncer realizar metástasis cerebral, se podría actuar sobre tumores ortotópicos con conocimiento de una alta probabilidad de metástasis cerebral. En cuanto a las limitaciones del estudio, es de destacar el uso de ratones inmunodeprimidos, aunque los procesos de estos serán probablemente similares a los ratones salvajes, quizá los datos estén sobrestimados, como la proliferación de las células metastásicas. Además no se estaría mostrando enteramente las interacciones tumor-­‐células del entorno cerebral. Del mismo modo ocurre con la inoculación de células tumorales directamente en el torrente sanguíneo; no se registra la probabilidad de salida de las células desde el tumor ortotópico por ejemplo. Aun con estos detalles, los datos son sólidos y explican la diferencia en la capacidad de metástasis cerebral de diferentes tumores. Bibliografía ERLER, J. T. Disabling defences in the brain. Nature. 508: 46-­‐47. KIENAST, Y., VON BAUMGARTEN, L., FUHRMANN, M., KLINKERT, W.E., GOLDBRUNNER, R., HERMS, J., AND WINKLER, F. 2010. Real-­‐time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116–122. NGUYEN, D.X., CHIANG, A. C., ZHANG, X. H. F., KIM, J. Y., KRIS, M. G., LADANYI, M., GERALD, W. L., MASSAGUÉ, J. 2009. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138 (1): 51-­‐62. VALIENTE, M., ABENAUF, A. C., JIN, X., CHEN, Q., ZHANG, X., H-­‐F., LEE, D. J., CHAFT, J. E., KRIS, M. G., HUSE, J. T., BROGI, E., MASSAGUÉ, J. 2014. Serpins Promote Cancer Cell Survival and Vascular Co-­‐Option in Brain Metastasis. Cell. 156: 1002-­‐1016. ANEXO Explicación general del proceso descubierto Figura 17. Pasos iniciales en la interacción de las células metastásicas con los capilares cerebrales. Figura 18. Modelo. Astrocitos reactivos producen Pas en presencia de células cancerosas, y si la célula cancerosa no puede producir serpinas anti-­‐PA no se producirá metástasis. Si la célula cancerosa produce serpinas anti-­‐PA se producirá metástasis debido a la inhibición de la acción de la plasmina.