MEMORIA PECUARIA - Universidad Veracruzana

XLIX REUNIÓN
NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN
VIII REUNIÓN
NACIONAL DE
INNOVACIÓN
VIII REUNIÓN
NACIONAL DE
INNOVACIÓN
PECUARIA
AGRÍCOLA
FORESTAL
IV REUNIÓN NACIONAL
DE INNOVACIÓN
ACUÍCOLA Y
PESQUERA
MEMORIA
XLIX REUNIÓN NACIONAL
DE INVESTIGACIÓN
PECUARIA
XXVI REUNIÓN CIENTÍFICA-TECNOLÓGICA,
FORESTAL Y AGROPECUARIA VERACRUZ 2013
V REUNIÓN DE INVESTIGACIÓN AGRÍCOLA, PECUARIA,
FORESTAL Y ACUÍCOLA EN EL TRÓPICO MEXICANO
XLIX Reunión Nacional de Investigación Pecuaria
Veracruz 2013
ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES METODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN EN FOLICULO
PILOSO BOVINO.
COMPARATIVE STUDY OF ADN EXTRACTION FOR THREE METHODS IN BOVINE PILOSE
FOLLICLE.
Castro FE, Cervantes AP, Hernández BA, Salazar CM, Domínguez MB, Barrientos MM.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana.
[email protected]
La amplificación de genes a través de la técnica de PCR, requiere contar con ADN de excelente
calidad. El uso de técnicas no invasivas como la obtención de pelo con folículo piloso garantiza la
cantidad adecuada de células nucleadas para la extracción del material genético, con ventajas en su
manejo. El objetivo de este trabajo fue evaluar tres protocolos de extracción de ADN nuclear desde
folículo piloso, determinar su concentración y calidad por electroforesis, cuantificación y comprobación
con ensayo por PCR. Se obtuvieron muestras de pelo arrancadas de raíz sin cortar desde 7 bovinos
jóvenes y adultos. Se utilizaron 3 métodos de no afinidad: método 1, con tampón de extracción
alcalino/precipitación salina (10 pelos), método 2, con tampón de extracción alcalino/precipitación
salina/proteinasa K (10 pelos), y método 3, con tampón de extracción alcalino/ congelación (-20
grados Celsius) (30 pelos). La cuantificación fue por espectrofotometría UV/Luz Visible (260/280 nm).
La integridad y calidad del ADN se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las
muestras de ADN obtenidas en cada técnica (n=21), se utilizaron para amplificar por PCR fragmentos
del locus ATP1 A1 exón 14 (320 pb) y exón 19 (265 pb). Para cada ensayo se utilizó un ADN testigo
obtenido en glóbulos blancos. La amplificación del locus ATP 1 A1 exones 14 y 19 fue verificada por
®
electroforesis en agarosa al 1.5%, teñido con SYBR Safe (Invitrogen ) y TBE 1X como buffer de
corrida. Las tres técnicas presentaron desviación estándar alta, que se asoció al número de muestras
y calidad de folículo piloso. Tanto la técnica de extracción alcalina con precipitación salina, como la
pero con mayor pureza que el método de extracción alcalina y congelación a -20 grados centígrados.
La variabilidad por muestra se asoció a la cantidad y el tamaño del folículo piloso, en los métodos 1 y
2 dos muestras con características de tamaño mayor de folículo tuvieron concentración de ADN más
alta; mientras que el método 3 con mayor número de muestras y mejores folículos, fue el más eficiente
en 3 de las muestras. En los métodos 1 y 3 el problema común fueron las impurezas presentes en el
ADN, que al análisis del cociente 260/280 nm, el valor fue menor a 1.7. Con los tres métodos fue
posible obtener ADN de calidad para PCR, la concentración aumenta cuando el folículo piloso posee
las características de tamaño para contar con el número de células nucleadas. La amplificación y
visualización de fragmentos de los exones 14 y 19 de ATP1 A1 confirmó que el ADN obtenido
corresponde a los bovinos muestreados y no a otra especie biológica.