La cromatografia y sus aplicaciones

La cromatografia y sus aplicaciones
Bibliografía de consulta:
Cromatografia sobre papel y capa fina. Electroféresis. (I. Smith y J. Feinberg)
Quimica Analítica Cualitativa. (Burriel)
Vínculos Web en Internet
¿Qué es la cromatografia?
Es la técnica más desarrollada en los últimos años, empleada en la química
analítica.
Su empleo presenta notables ventajas:
1. Es sencilla, rápida y no requiere aparatos complicados.
2. Abarca escalas microanalíticas hasta escalas industriales.
3. Es una técnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias
lábiles.
Constituye una metodología imprescindible en estudios bioquímicos, toxicológicos,
estructurales, etc. No solo utilizando como técnica de separación e identificación,
sino como método preparatorio, incluso a escalas industriales.
La palabra cromatografia proviene de kromatos, color y graphos, escrito.
Una de las definiciones de la técnica más correcta seria, la dada por Keulemans:
"Método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen
en dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran
desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a traves o a lo largo del lecho
estacionario (fase móvil)."
En todo proceso cromatografico la fase móvil es la que provoca un movimiento de
las distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria
la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que
condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad.
CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS:
Son clasificados según el estado físico de la fase, el mecanismo de separación y
el tipo de soporte.
La fase móvil puede ser un gas o un líquido, y la estacionaria u líquido o un sólido.
Se pueden establecer cuatro tipos de cromatografia: gas-líquido, líquido-líquido,
gas-sólido, líquido-sólido.
Los mecanismos por los que los diferentes componentes son separados en los
procesos cromatograficos son variados. En algunos casos participan más de un
mecanismo en un mismo proceso de separación por lo que dificulta la
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clasificación. Los principales mecanismos que intervienen en la separación
cromatografica son:
Adsorción: Gases o líquidos contenidos en la fase móvil son retenidos por una
adsorción selectiva en la superficie del sólido que constituye la fase estacionaria.
En la interfase sólido-fase móvil hay un aumento de concentración respecto a la
inicial. Este mecanismo controla la cromatografia gas-sólido y líquido-sólido.
Reparto: Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase estacionaria
liquida en función de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un
proceso de extracción en continuo.
Intercambio Ionico: La fase estacionaria constituida por un sólido intercambiando
iones con iones contenidos en la fase móvil, liquida. El intercambio de iones
sólido-solución esta regulado por la afinidad quimica de los iones con ambas fases
y por sus respectivas concentraciones.
Tamaño Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser
separadas en virtud de su tamaño donde la fase estacionaria es un gel hidrofilico
altamente poroso que retiene las moléculas de menor tamaño al de los poros. Las
moléculas de mayor tamaño son retardadas en su paso por pequeñas fuerzas de
adsorción de la superfie externa del gel que luego son excluidas de la fase
estacionaria.
Migración Eléctrica: Los componentes iónicos de una muestra son separados por
su diferente velocidad y sentido con que se desplazan en un campo eléctrico. La
fase estacionaria puede ser un papel saturado por un electrolito. La aplicación de
un campo provoca un movimiento diferencial de los iones dependiendo de su
carga y de su movilidad ionica.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
¿Qué es la cromatografia en papel?
La cromatografia en papel es la técnica de separación e identificación de
sustancias químicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de
papel de filtro.
Se toma una pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita
una gota de la solución que contiene la mezcla de las sustancias que se quieren
separas. Se deja secar la gota y quedara la mancha de las sustancias mezcladas.
El extremo del papel mas proximo a la mancha se introduce en un disolvente
apropiado, pero sin que la mancha llegue a introducirse en él.
Existen muchos tipos de cromatografia sobre papel, una primera división de las
variadas clases podría ser:
1- Cromatografia ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del
recipiente que sostiene al papel y va subiendo a traves de el por capilaridad.
2- Cromatografia descendente: el disolvente esta en un recipiente esta en un
recipiente del que cuelga el papel, fluye por él hacia abajo por una combinacion
de capilaridad y gravedad.
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En ambos casos el disolvente avanza a lo largo del papel pasando por encima de
la mancha, al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha, cada una
de ellas se mueve, por lo general a distinta velocidad que las otras.
Se deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y se
observan las sustancias separadas si tienen color, o en caso de no tener color se
procede al revelado por una reacción quimica apropiada.
Esta técnica se conoce como cromatografìa monodimencional y el papel resultante
recibe el nombre de cromatograma monodimencional.
La resultante de las fuerzas:
Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las sustancias, comienzan a
actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que retardan.
Las fuerzas propulsoras actúan apartando las sustancias de su punto de origen y
desplasandolas en dirección del flujo de origen.
Las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de las sustancias,
llevándolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrás en el papel.
La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es
la resultante de estas dos clases de fuerzas.
Fuerzas propulsoras:
Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas propulsoras más
importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le
disolvente.
Flujo del disolvente:
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Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instantáneamente soluble
en el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azúcar, y no actuaran fuerzas de
retardo la sustancia ascenderá desde el origen hasta donde llega el diluyente. En
cambio si la sustancia fuera completamente insoluble en el disolvente en
movimiento no se movería del origen.
La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha,
así pues, si el disolvente fuese capaz de disolver instantánea y completamente
todas las sustancias, estas avanzarían juntas hasta el final de la trayectoria del
disolvente y terminaríamos donde empezamos con todas las sustancias juntas.
Solubilidad:
Una fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias
que ofrecen la misma solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad
de una sustancia en la corriente del disolvente es una fuerza propulsora que
tiende a desplazarla, manteniendola en movimiento a lo largo del papel.
Fuerzas retardantes:
Hay también dos fuerzas retardantes principales: la adsorción y el reparto.
Adsorción:
La celulosa de la que esta hecho el papel de filtro, posee propiedades
adsorbentes. Las sustancias depositadas en el papel, en cromatografía, pueden
ser más o menos adsorbidas en el papel.
La adsorción es otra de las fuerzas diferenciales, esto significa que unas
sustancias son adsorbidas más que otras y, por consiguiente, la liberación de las
sustancias de las manchas variará de una sustancia a otra. Esto contribuye de
nuevo a la separación. Mientras que se va realizando el cromatograma, las
sustancias mas fuertemente adsorvidas se van quedando atrás, mientras que las
adsorvidas con menos fuerza avanzan hacia el frente.
Reparto:
La cormatografia se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos
fases liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente
circulando por el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo
papel de filtro. Una hoja de papel de filtro aparentemente seca contiene entre un 6
y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. Aquí es donde entra en función
el reparto.
Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es
expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartirá entre ellos. La cantidad que se
encuentre en cada disolvente dependerá de la relativa solubilidad del soluto en
cada uno. El grado de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama
coeficiente de reparto o razon de distribución.
Constante Rf:
El último punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente del
disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias
relativas recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El símbolo
utilizado para designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante:
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distancia recorrida por el compuesto desde el origen
Rf =
Distancia del origen al frente del disolvente
Como el denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debería ser un
decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un porcentaje.
Asi un Rf de 50 indicaría que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del
frente del disolvente.
Cromatografía de adsorción en columna
La fase estacionaria está constituida por un sólido que se empaqueta en una
columna, normalmente de vidrio.
Los componentes a separar se añaden en forma soluble por la parte superior
de la columna, quedando retenidos en la misma. Posteriormente los componentes
se desplazan arrastrados por una fase móvil líquida. Dependiendo de la absorción
selectiva de cada uno de ellos por la fase estacionaria se desplazan a distinta
velocidad, efectuándose la separación.
Para que haya una separación efectiva de los componentes, su velocidad a
través de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la
columna, adecuada.
Por ejemplo, si por una columna con alúmina como absorbente se introduce
una disolución conteniendo nitratos de Fe (III), Cu (II) y Co (II) y posteriormente se
pasa agua ligeramente acidulada con ácido nítrico se observa la separación de
tres zonas diferenciadas (de arriba abajo) pardo- rojiza de Fe (III), azul de Cu (II) y
rosa de Co (II). Si se desean apreciar mejor las distintas bandas se puede
introducir una solución de ferrocianuro potásico como revelador. Se observan
entonces coloraciones más intensas; azul oscuro de Fe4 [Fe (CN)6]3, pardo- rojiza
de Cu2 [Fe (CN) 6] y verdosa de Co2 [Fe (CN) 6].
a) Análisis frontal.- Supongamos una disolución conteniendo tres componentes
A, B y C, que se introduce continuamente en una columna en la que la adsorción
sigue el orden C, B, A. La especie menos adsorbida, A, emerge la primera por la
parte inferior de la columna, y sigue saliendo indefinidamente. Después de un
período en que sólo sale A, comienza a salir también B, obteniendo una mezcla A
+ B. Finalmente sale el componente más retenido C, junto con A y B.
b) Análisis por desplazamiento.- La mezcla a ser separada se absorbe en una
pequeña zona en la parte superior de la columna. Posteriormente se introduce un
disolvente (o una disolución) que sea más fuertemente absorbido que cualquiera
de los componentes. El efecto resultante es que los componentes son
desplazados de la columna por el disolvente- desplazante y, además, cada uno de
ellos desplaza al inmediatamente menos absorbido.
A la salida de la columna van saliendo consecutivamente todos los
componentes y el desplazador, separados pero uno junto al siguiente.
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c) Análisis por elución.- Después de fijar los componentes en la parte superior
se pasa un disolvente puro que no se adsorbe. Los componentes van avanzando
por la columna dependiendo de la fuerza con que son adsorbidos; cada uno de los
cuales es distribuido en una pequeña zona. Si la columna es suficientemente larga
y los valores de Rf difieren bastante, se puede lograr la separación de mezclas
bastante complejas. En la Fig. VIII-12 se muestra un cromatograma desarrollado
por este método. Cada componente puede ser recogido y analizado a la salida de
la columna.
Adsorbente y eluyentes
Son muchos los sólidos que se han utilizado como fase estacionaria en
cromatografía de adsorción. Los más importantes son alúmina, silicato de
aluminio, silicagel, óxido, silicato y carbonato de magnesio, óxido, carbonato y
fosfato de calcio, como inorgánicos; y carbón, almidón y azúcares como orgánicos.
Normalmente deben ser sometidos a un proceso térmico de activación superficial
antes de su utilización.
Como eluyentes se utilizan agua, alcoholes, cetonas, ésteres, cloroformo,
tetracloruro de carbono, etc. Su capacidad de elución depende de su polaridad,
del absorbente y de las especies a eluir.
Cromatografía de reparto en columna
Esta técnica es semejante a la mencionada anteriormente en cuanto a
materiales utilizados, métodos operativos, etc. La diferencia reside en la fase
estacionaria utilizada y, en consecuencia, en el mecanismo de separación.
En cromatografía de reparto la fase estacionaria es un líquido, poco miscible
con la fase móvil. Los solutos se distribuyen entre las dos fases dependiendo de
su solubilidad en cada una de ellas, es decir, según su coeficiente de reparto.
Aunque el mecanismo fundamental de la separación es la extracción o reparto,
es prácticamente imposible evitar adsorciones por parte del sólido soporte, por lo
que muchas de las separaciones son empíricas, no pudiendo realizarse un exacto
tratamiento teórico.
Los sólidos soportes más utilizados son el silicagel, el polvo de celulosa y la
tierra de diatomeas; menos aplicación tienen el almidón y el relleno de bolas de
vidrio.
Cromatografía sobre geles porosos
Es un tipo de cromatografía que se aplica, fundamentalmente, a la separación
de productos macromoleculares sobre geles hinchables por agua o por cualquier
otro líquido previamente escogido.
El fundamento de este tipo de cromatografía consiste en que al hincharse el
gel queda una cadena muy abierta con grupos terminales generalmente polares
que son capaces de adsorber agua u otros disolventes polares. Según el número
de ligaduras entre las grandes cadenas existe un tamaño crítico (límite de
exclusión) de molécula que puede entrar en el interior del gel, mientras que las
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moléculas de mayor tamaño pasarán a través del mismo, con lo que, en principio,
se origina una separación de moléculas de acuerdo con su diferente tamaño.
El fenómeno puede considerarse como una filtración a través de un tamiz
molecular y por eso a esta técnica se la llama también “cromatografía con tamiz
molecular” (ctm); así mismo se la ha denominado, Penetración sobre gel,
exclusión molecular y tamizado molecular.
Cromatografía de capa fina
La llamada “capa fina” consiste en una placa de vidrio, rectangular o cuadrada,
denominadas cromatoplacas, o simplemente placas sobre cuya superficie se
deposita una capa uniforme muy delgada (en ocasiones de algunas micras de
espesor) de una substancia absorvente, casi siempre silicagel o alúmina, en
condiciones tales que resulte uniformemente extendida y suficientemente
adherida. En general, de hace una papilla acuosa con el adsorbente, que se
deposita sobre la placa mediante un aplicador adecuado. Las placas se secan en
estufa para activar la superficie del adsorbente y se encuentran aptas para
efectuar la cromatografía.
A las ventajas de resistencia a la temperatura y a los reactivos agresivos de la
cromatografía en capa fina, hay que añadir una mayor nitidez y sensibilidad de los
cromatogramas, así como una mayor rapidez en su desarrollo. Además, los
cromatogramas obtenidos pueden conservarse indefinidamente y archivarse si se
pulveriza la placa revelada con una dispersión de un plástico transparente y
especial donde quede grabado el cromatograma sobre la película endurecida del
plástico, que se separa fácilmente del soporte.
Las aplicaciones son semejantes a las de la cromatografía de papel.
Electroforesis
El fundamento de la técnica consiste en depositar sobre un medio poroso una
mezcla de especies cargadas (algunas pueden ser neutras). Por aplicación de un
campo eléctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en
función de su carga y su movilidad iónica en ese medio. Para favorecer el paso de
la corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos), que son
generalmente disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el
soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen precipitados con las
especies del problema.
Como soportes se han utilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar- agar,
gel de silice, etc. tanto en columna como en capa fina, pero quizás el método más
utilizado es el que emplea como soporte papel. Se suelen utilizar tiras de acetato
de celulosa, casi transparentes, que por poseer una estructura más uniforme y un
poro menor que el del papel filtro, tienen un mayor poder de resolución. A estas
ventajas del acetato de celulosa se añade su fácil solubilidad en ácidos, lo que
facilita la posterior determinación de las especies separadas.
La emigración de las distintas especies en el papel depende de la magnitud y
signo de su carga, del tamaño de la partícula, de las propiedades adsorbentes del
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soporte (que deben atenuarse en lo posible), del voltaje aplicado y de la intensidad
de corriente.
CROMATOGRAFIA DE GASES
Esta técnica es similar a la cromatografia de columna, con la diferencia de que el
sistema es cerrado y la fase móvil es un gas. La separación de los componentes
gaseosos se produce por adsorción selectiva sobre un sólido (C.G.S.) o por
reparto entre un gas inerte y un líquido no volátil que constituye la fase
estacionaria (C.G.L.). En la actualidad esta tecnica (C.G.L.) es la más empleada,
aplicandose el analisis de gases o de líquidos y sólidos que puedan volatilizarse a
temperatura no superior a 400°C.
L C.G.S. es análoga a la C.L.S.
Los componentes del gas problema son sostenidos selectivamente por un sólido
absorbente dispuestos en columna metálica, recta o en espiral. El gas problema
es inyectado en la corriente de un gas inerte que le conduce hasta la columna y
que hace la fase móvil. En la distribución de los componentes del problema entre
el gas portador y el sólido absorvervente se verifica una separación por lo que
emergen de la columna a distintos tiempos pasando finalmente por un detector
que los identifica y cuantifica.
En la C.G.L. la fase estacionaria es un líquido no volátil absorbido en un soporte
sólido que rellena la columna. Los componentes del gas problema son
desplazados selectivamente, como en la cromatografia de reparto, por el gas
portador que fluye de manera continua.
Los componentes de la muestra se separan de acuerdo con sus coeficientes de
reparto entre las dos fases.
INSTRUMENTACION
Esta cromatografia es tan sencilla como las demás, necesita un montaje
instrumental más complejo debido al trabajo con gases, lo que obliga a trabajar en
sistema cerrado y a controlar caudales, presión y temperatura.
FASES MOVILES: como gases inertes portadores se utilizan H, He, N y aire. La
elección del gas portador depende del sistema en estudio y sobre todo del
detector que se utilice.
FASE ESTACIONARIA: en C.G.S. los absorbentes mas utilizado son carbón,
alumina, silicagel y tamises moleculares. En el C.G.L. es necesario un sólido
soporte adsorvente y un líquido no volátil, el sólido soporte mas utilizado es la
tierra diatomeas. Los líquidos que constituyen la fase móvil son muchos, depende
de la mezcla a separar y de la temperatura de operación (esteres, polioles, aceite
de silicona, etc.).
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DETECTORES: son muchos tipos de detectores, estos actúan siempre por
comparación de alguna propiedad física o quimica (densidad, calor de combustión,
etc.) del gas portador solo (antes de la introducción de la muestra) y de la mezcla
de gas portados y componentes de problemas. Los detectores se diferencian
principalmente por su selectividad y sensibilidad, por destruir o no la muestra y por
ser integrales o diferenciales, los primeros miden continuamente la muestra
acumulada desde el principio del analisis y los segundos miden concentraciones
instantáneas. Se utilizan más los detectores diferenciales.
EVALUACION DE LOS CROMATOGRAMAS
Los distintos componentes de la muestra emergen de la columna a tiempos
diferentes dependiendo de su retención en la misma, definido como volumen de
retención el volumen de mezcla gaseosa que emerge de la columna entre la
introducción de la muestra y la aparición de un componente. Se calcula a partir
del tiempo transcurrido y de flujo gaseoso.
V r = tr F
El volumen de retención, asi como el tiempo de retención (para un flujo constante)
son variables cualitativas que permiten la identificación de especies. Normalmente
se utilizan los valores respecto al máximo del aire (V'r) o valores relativos frente a
una especie patron. Estas variables cualitativas solo son constantes cuando se
producen exactamente las condiciones, por lo que no son muy utilizadas para
identificaciones directas. Utilizando muestra patrones, la cromatografia de gases
constituye el método rápido y excelente para confirmar la presencia concreta en
una muestra. Adicionando un patrón al problema, no deben aparecer nuevos picos
en el cromatograma y deberá observar el área que constituye la muestra patrón.
La evaluación cuantitativa se basa en que, en determinadas condiciones, el área
del pico (detector diferencial) y la altura del escalón (detector integral) son
proporciones a la concentraciones de especies.
APLICACIONES
La cromatografia de gases constituye el mejor método analítico ideado para la
separación de gases, líquido o sólidos que pueden pasar fácilmente al estado de
vapor o transformándolos previamente en otros estados volátiles Ej. metilación de
ácidos grasos en el analisis de aceite y a resuelto problemas de muy difícil
solución para la quimica analítica empleada hace una década. Por eso su
utilización es indispensable en analisis industriales, forenses bromatologicos,
toxicologicos, clínicos y de contaminación ambiental.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
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En las cromatografías clásicas, en las que la fase móvil es un líquido que fluye a
traves de un sólido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolución seria
necesario emplear columnas excesivamente largas, lo que se traduciría en un
desarrollo muy lento de los cromatogramas.
Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografia de alta resolución, en la
que se trabaja con pequeñas columnas, muy empaquetadas y forzando el paso de
la fase móvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones
muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo.
Dependiendo de la fase estacionaria, el mecanismo de separación puede ser
reparto, adsorción, tamaño molecular (geles) e incluso cambio ionico, aunque los
métodos mas utilizados están basados en reparto y adsorción.
El esquema fundamental de un cromatografo de alta resolución esta constituido
por un deposito y un dispositivo de bombeo de la fase móvil que opera a elevada
presión (hasta 500 atm.), un sistema de inyección de la muestra, columnas
resistentes, generalmente e acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria, un
detector y un sistema de registro gráfico. La columna y los detectores van
introducidos en termostatos.
Los detectores más utilizados en esta técnica están basados en absorciometria
UV y en medida de índices de refracción, siendo los cromatogramas obtenidos
semejantes a los de cromatografia gaseosa con detector diferencial.
APLICACIONES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Concentración de trazas
Separación de iones interferentes en analisis clásico
Separaciones de iones de características similares
Desmineralización del agua
Preparación de disoluciones patrón
Disolución de sustancias insolubles.
CLASIFICACION DE LAS CROMATOGRAFIAS
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA ABIERTA
Nombre de la
Técnica
Fase estacionaria Fase móvil
Desplazamiento
fase móvil
Mecanismo de
separación
C. sólido-líquido
C. líquido-sólido
Gravedad
Gravedad
C. sobre geles
Sol. absorbente
Líquido
Liq. Absorbido en Líquido
soporte sol.
Sol. Gel poroso
Líquido
Adsorción
Reparto,
Adsorción
Tamaño
Electroferesis
Sol. polímero
Emigración iónica Emigración iónica
Liq. ionico
C.
intercambio Sol. Cambiador Líquido
ionico
ionico
Gravedad
Gravedad
Afinidad quimica
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CROMATOGRAFIA EN COLUMNA CERRADA
C. de gases
Sol. Absorbente Gas
Liq. Absorbido en
soporte sol.
C. liquida de alta Sol. Diversos y Liq.
resolución
liq.
Absorbidos
en soporte sol.
Presión
Adsorción
Presión
Adsorción,
reparto, afinidad
quimica, tamaño
Capilaridad
(gravedad)
Adsorción
Capilaridad
(gravedad)
Reparto
(adsorción,
af.
Quimica)
Afinidad quimica
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
C. adsorción en Sólido (papel)
papel
Líquido polar
C. de reparto en Liq.
Polar Líquido no polar
papel
absorbido
en
papel sólido
C. cambio iónica Sólido
Líquido
en papel
Electroferesis en Sólido (papel)
Líquido iónico
papel
Capilaridad
(gravedad)
Emigración
iónica
Emigración
iónica
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